ES2948791T3 - Vacuna de ácido nucleico contra el virus de la hepatitis C - Google Patents

Abstract

La presente invención presenta construcciones de ácido nucleico que pueden usarse como vacuna de ácido nucleico contra el VHC, componente de vacuna o en la producción de una vacuna contra el VHC. Las construcciones descritas incluyen aquellas: (1) que codifican un polipéptido quimérico del VHC que contiene una región NS3-4A basada en una primera cepa del VHC y una región NS3-NS4A-NS4B-NS5A o una región NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B basada en una segunda cepa; y (2) un adenovector basado en chimpancé que codifica un polipéptido del VHC. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna de ácido nucleico contra el virus de la hepatitis C

Antecedentes de la invención

Aproximadamente el 3 % de la población mundial está infectada por el virus de la hepatitis C (VHC). (Wasley et al., Semin. Liver Dis. 20, 1-16, 2000). La exposición al VHC provoca una enfermedad aguda manifiesta en un pequeño porcentaje de casos, mientras que en la mayoría de los casos el virus establece una infección crónica que causa inflamación hepática y progresa lentamente hacia la insuficiencia hepática y la cirrosis. (Iwarson, FEMS Microbiol. Rev.

14, 201-204, 1994). De manera adicional, los estudios epidemiológicos indican que el VHC desempeña un papel importante en la patogénesis del carcinoma hepatocelular. (Kew, FEMS Microbiol. Rev. 14, 211-220, 1994, Alter, Blood 85, 1681-1695, 1995).

Antes de la implementación del análisis sistemático rutinario de la sangre del VHC en 1992, la mayoría de las infecciones se contraían por una exposición inadvertida a sangre contaminada, productos sanguíneos u órganos trasplantados. En las áreas donde se realiza el análisis sistemático de la sangre del VHC, el VHC se contrae principalmente por el consumo de drogas por vía intravenosa. Métodos de transmisión menos frecuentes incluyen exposición perinatal, hemodiálisis y contacto sexual con una persona infectada por VHC. (Alter et al., N. Engl. J. Med.

341(8), 556-562, 1999, Alter, J. Hepatol. 31 Suμl. 88-91, 1999, Wasley et al., Semin. Liver. Dis. 201, 1-16, 2000).

El genoma del VHC consiste en un ARN monocatenario de aproximadamente 9,5 kb que codifica una poliproteína precursora de aproximadamente 3000 aminoácidos. (Choo et al., Science 244, 362-364, 1989, Choo et al., Science 244, 359-362, 1989, Takamizawa et al., J. Virol. 65, 1105-1113, 1991). La poliproteína del VHC contiene las proteínas víricas en el orden: C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NSSA-NSSB.

Se menciona el uso de una secuencia de ácido nucleico del VHC que proporcione uno o más antígenos no estructurales del VHC para generar una respuesta CMI, por ejemplo, por parte de Cho et al., Vaccine 17:1136-1144, 1999; Paliard et al., Publicación Internacional Número w O 01/30812; Coit et al., Publicación Internacional Número WO 01/38360; y Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.

Catalucci et al., J. Virol. 79, 6400-6409, 2005 divulgan una línea celular de empaquetamiento basada en amplicones de adenovirus tipo 5.

Figueredo et al., Molecular Therapy, 11, 56, 2005 divulgan vectores derivados de chimpancé. Soumitra et al., Human Gene Therapy, 15, 519-530, 2004 divulgan la secuencia de tres vectores adenovirales derivados de chimpancé. El N.° de acceso del EBI GSP:ABP56662 divulga una proteína de fibra L5 de adenovirus C68 de chimpancé. El N.° de acceso del EBI. UNIPROT:Q5VHB3 divulga una proteína de hexón del serotipo E4 del adenovirus.

El N.° de acceso del EBI GSP:AAW79538 divulga una proteína de hexón del serotipo 2 de adenovirus.

El documento WO 2004/099422 divulga vectores de adenovirus y la producción de dichos vectores.

El documento WO 98/44121 divulga una fibra de adenovirus modificada por la mutación de uno o más residuos.

Sumario de la invención

La referencia a una "secuencia sustancialmente similar" con respecto a una secuencia de aminoácidos indica una identidad de al menos aproximadamente el 70 % con una secuencia de referencia. El porcentaje de identidad (también denominado porcentaje idéntico) con respecto a una secuencia de referencia se determina alineando la región polipeptídica con la región de referencia correspondiente para obtener el número máximo de aminoácidos idénticos y determinando el número de aminoácidos idénticos en las regiones correspondientes. Este número se divide por el número total de aminoácidos en la región de referencia y, a continuación, se multiplica por 100 y se redondea al número entero más próximo. Por ejemplo, las regiones NS3-4A, NS3-NS4A-NS4B-NS5A y NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC, pueden ser la región correspondiente del VHC presente en diferentes cepas del VHC.

Una secuencia NS3-4A diferente presente en las regiones primera y segunda se refleja en una o más diferencias de aminoácidos. Cada diferencia de aminoácidos es independientemente una adición, sustitución o deleción.

Un vector de expresión contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido junto con elementos reguladores para su correcta transcripción y procesamiento. Los elementos reguladores que pueden estar presentes incluyen aquellos asociados naturalmente con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y elementos reguladores exógenos no asociados naturalmente con la secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores exógenos, tales como un promotor exógeno, pueden ser útiles para la expresión en un huésped particular, tal como en una célula humana.

Un vector de expresión preferido es un genoma de adenovirus recombinante que tiene una o más regiones delecionadas. El genoma de adenovirus recombinante puede contener diferentes regiones sustancialmente similares a uno o más serotipos de adenovirus. La referencia a una región delecionada indica una deleción de la totalidad o parte de la región indicada.

Un aspecto de la presente invención describe un adenovector recombinante que comprende:

a) un casete de expresión que codifica un polipéptido del VHC, en donde dicho polipéptido del VHC comprende NS3-NS4A-NS4B-NS5A del VHC; y

b) un genoma de adenovirus que contiene una deleción de E1, una deleción de E3, y una deleción de E4 opcional; siempre que dicho genoma codifique:

i) una región de hexón con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11;

ii) una región de fibra con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y

iii) una región de pentón con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 7 o

i) una región de hexón con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 5;

ii) una región de fibra con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 3; y

iii) una región de pentón con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 7,

en donde dicho casete de expresión se ubica en la deleción de E1 o E3.

La referencia a polipéptido del VHC de una secuencia de aminoácidos incluye secuencias de VHC de origen natural, derivados de secuencias de origen natural que son sustancialmente similares a una secuencia de origen natural o a una secuencia indicada, y polipéptidos quiméricos del VHC.

La referencia a "tratamiento" incluye un tratamiento de un paciente infectado por VHC o el tratamiento profiláctico de un paciente para reducir la probabilidad o gravedad de una infección activa por VHC. Un "paciente" se refiere a un mamífero que puede estar infectado por VHC. Un paciente puede o no puede estar infectado por VHC. Los ejemplos de pacientes son seres humanos y chimpancés.

Para un paciente infectado por VHC, una cantidad eficaz es suficiente para lograr uno o más de los siguientes efectos: reducir la capacidad de replicación del VHC, reducir la carga del VHC, aumentar la depuración vírica, y aumentar una o más respuestas CMI específicas del VHC.

Para un paciente no infectado por VHC, una cantidad eficaz es suficiente para lograr uno o más de lo siguiente: un aumento de la capacidad de producir uno o más componentes de una respuesta CMI específica del VHC frente a una infección por VHC, una susceptibilidad reducida frente a la infección por VHC, y una capacidad reducida del virus infeccioso para establecer una infección persistente para la enfermedad crónica.

La referencia a términos abiertos como "comprende" permite incluir elementos o etapas adicionales. Ocasionalmente se utilizan expresiones como "uno o más" con o sin términos abiertos para resaltar la posibilidad de elementos o etapas adicionales.

A menos que se indique explícitamente, la referencia a términos tales como "un" o "uno/a" no se limita a uno. Por ejemplo, "una célula" no excluye "células". Ocasionalmente se utilizan expresiones como uno o más para resaltar la posible presencia de una pluralidad.

Otras características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de las descripciones adicionales proporcionadas en el presente documento, incluyendo los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodología útiles en la práctica de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Los aminoácidos 1-686 proporcionan una región NS3-NS4A, que se basa en 3a del VHC. Los aminoácidos 687-690 proporcionan los 4 primeros aminoácidos de la región NS4B del 3a del VHC y proporcionan una unión de escisión para la región NS3-NS4A del 3a del VHC. Los aminoácidos 691-2675 proporcionan una región NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B basada en el 1b del VHC. La región NS3-NS4A y la región NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B también contienen una adición de una metionina inicial.

Las Figuras 2A-2C proporcionan la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2.

Los nucleótidos 318-10182 proporcionan un casete de expresión que contiene:

Promotor de HCMV: nt 318-905

Int A: nt 1040-1865

Secuencia de Kozaq: nt 1885-1890

Met-NS3-NS4A del VHC (basado en 3a, optimizado): nt 1891-3948

4 primeros aminoácidos de NS4B del VHC (basado en 3a): nt 3949-3960

Met-NS3-5B del VHC (basado en 1b, cepa Bk, optimizado): nt 3961-9915

Terminador TAAA: nt 9916-9919

BGH: nt 9956-10179.

La Figura 3 proporciona una secuencia met-NS3-5B (SEQ ID NO: 16).

Las Figuras 4A-4J proporcionan la secuencia de aminoácidos para la fibra de ChAd3 (Fig. 4A, SEQ ID NO: 3), hexón de ChAd3 (Fig. 4B, SEQ ID NO: 5), pentón de ChAd3 (Fig. 4C, SEQ ID NO:7), fibra de ChAd63 (Fig. 4D, SEQ ID NO:9), hexón de ChAd63 (Fig. 4E, S^e Q ID NO: 11); y ácido nucleico codificante de la fibra de ChAd3 (Fig. 4F, SEQ ID NO: 4), hexón de ChAd3 (Fig. 4G, SEQ ID NO: 6), pentón de ChAd3 (Fig. 4H, SEQ ID NO:8), fibra de ChAd63 (Fig. 4I, SEQ ID NO: 10), y hexón de ChAd63 (Fig. 4J, SEQ ID NO: 12).

Las Figuras 5A-5H proporcionan la secuencia de ácido nucleico de ChAd3AE1,3,4, E4orf6 de Ad5, NSmut - 35.890 pb (ChAd3NSmut, SEQ ID NO: 13). Las coordenadas de deleción del genoma de tipo silvestre son: Deleción de E1 del nt 461 al nt 3541 (3080 pb), Deleción de E3 del nt 28644 al nt 32633 (3989 pb), Deleción de E4 del nt 34634 al nt 37349 (2715 pb). Las diferentes regiones son las siguientes:

ITR izquierda de ChAd3+señal de empaquetamiento: nt 1-460

Promotor de HCMV: nt 467-1257

Secuencia consenso Kozak: nt 1263-1268

NS3-5B del VHC (cepa BK): nt 1269-7223

Terminador TAA: nt 7224-7226

poliA de BGH: nt 7234-7452

Cadena principal de ChAd3: nt 7468-35890

E4orf6 de Ad5: nt 34601-35482.

Las Figuras 6A-6H proporcionan la secuencia de ácido nucleico para ChAd3 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 14). Las Figuras 7A-7H proporcionan la secuencia de ácido nucleico para ChAd63 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 15). La Figura 8 muestra una comparación de la expresión de la proteína NS del VHC en células HeLa infectadas por ChAd3NSmut (SEQ ID NO: 13) y MRKAd6NSmut.

La Figura 9 muestra una comparación de la capacidad de ChAd3NSmut (SEQ ID NO: 13) y MRKAd6NSmut para inducir una inmunidad mediada por células en ratones C57/B6.

Las Figuras 10A-10H proporcionan la secuencia de ácido nucleico de ChAd63AE1,3,4, E4orf6 de Ad5, NSmut (SEQ ID NO: 17). Las coordenadas de las deleciones del genoma de tipo silvestre son: Deleción de E1 del nt 455 al nt 3421 (2967 pb), Deleción de E3 del nt 27207 al nt 31778 (4582 pb), Deleción de E4 del nt 33825 al nt 36215 (2390 pb). Las diferentes regiones son las siguientes:

ITR izquierda de ChAd63+señal de empaquetamiento: nt 1-454

Promotor de HCMV: nt 458-1248

Secuencia consenso Kozak: nt 1254-1259

NS3-5B del VHC (cepa BK): nt 1260-7214

Terminador TAA: nt 7215-7217

poliA de BGH: nt 7227-7447

Cadena principal de ChAd63: nt 7458-34658

E4orf6 de Ad5: nt 33316-34197.

La Figura 11 ilustra la evolución temporal de la respuesta inmunitaria medida mediante ELISPOT de IFN-^y expresada como la suma de las respuestas observadas en los diferentes grupos de péptidos NS del VHC en cualquier punto temporal dado.

La Figura 12 ilustra diferentes componentes de 3a-1b de pV1JnsNSOPTmut.

La Figura 13 ilustra la estructura genética del casete de expresión de 3a-1b de pV1JnsNSOPTmut que codifica un polipéptido quimérico del VHC. Las diferentes regiones nucleotídicas son:

- promotor de CMV humano: 318-905;

- Intrón A: 1040-1865;

- Secuencia de Kozaq: 1885-1894;

- MetilS3-NS4A del VHC (genotipo 3a): 1891-3960;

- MetilS3-NS5BOPTmut del VHC (genotipo 1b): 3961-9915;

- Terminador TAAA: 9916-9919; y

- PoliA de BGH: 9965-10182.

La Figura 14 muestra el número de linfocitos T secretores de IFN-gamma (expresado como células formadoras de manchas por millón de esplenocitos) en respuesta a la proteína NS3 del 1b y 3a del VHC en animales (ratones CD1) inmunizados con el plásmido quimérico (3a-1b de pV1Jns-NSOPTmut) o con pV1Jns-NSOPTmut.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación incluye ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico del VHC que proporciona proteínas no estructurales del VHC basadas en diferentes cepas del VHC y el uso de un adenovector de chimpancé para expresar polipéptidos del VHC. Los usos del ácido nucleico descrito incluyen el uso como un componente de vacuna para introducir en una célula un polipéptido del VHC que proporcione una amplia gama de antígenos para generar una respuesta CMI contra el VHC, y como intermediario para producir dicho componente de vacuna.

La respuesta inmunitaria celular adaptativa puede funcionar para reconocer antígenos víricos en células infectadas por VHC en todo el organismo debido a la distribución ubicua de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II, inducir una memoria inmunológica y mantener una memoria inmunológica. Estas funciones se atribuyen a los linfocitos T auxiliares (Th) CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ específicos de antígeno.

Tras la activación a través de sus receptores de linfocitos T específicos, las células Th específicas del VHC cumplen una serie de funciones inmunorreguladoras, la mayoría de ellas mediadas por citocinas Th1 y Th2. Las células Th específicas del VHC contribuyen a la activación y diferenciación de las células B y a la inducción y estimulación de los linfocitos T citotóxicos específicos del virus. Junto con los CTL, las células Th también pueden secretar IFN-^y y TNF-a que inhiben la replicación y la expresión génica de varios virus. Adicionalmente, las células Th y CTL, las principales células efectoras, pueden inducir la apoptosis y la lisis de las células infectadas por virus.

Los CTL específicos del VHC se generan en respuesta a antígenos procesados por células presentadoras de antígenos profesionales (pAPC). Los antígenos pueden sintetizarse en las pAPC o introducirse en ellas. La síntesis de antígenos en una pAPC puede realizarse introduciendo en la célula un casete de expresión que codifique el antígeno.

Una vía preferida de administración de una vacuna de ácido nucleico es una vía intramuscular. La administración intramuscular parece ser el resultado de la introducción y expresión del ácido nucleico en células somáticas y pAPC. Los antígenos del VHC producidos en las células somáticas pueden transferirse a las pAPC para su presentación en el contexto de las moléculas del MHC de clase I. (Donnelly et al., Annu. Rev. Immunol. 15:617-648, 1997).

Las pAPC procesan antígenos de mayor longitud en antígenos peptídicos más pequeños en el complejo proteasoma. El antígeno se transloca en la vía secretora del retículo endoplásmico/complejo de Golgi para su asociación con proteínas del MHC de clase I. Los linfocitos T CD8+ reconocen el antígeno asociado al MHC de clase I a través del receptor de linfocitos T (TCR) y la proteína de superficie celular CDS.

El uso de un vector basado en adenovirus de chimpancé como vehículo para introducir antígenos del VHC proporciona una alternativa a un adenovector humano. El vector basado en adenovirus de chimpancé es particularmente útil cuando se utiliza junto con una estrategia de inmunización múltiple, donde el paciente que está siendo tratado ha desarrollado una respuesta inmunitaria a un adenovector empleado inicialmente. La exposición repetida al mismo tipo de vector basado en adenovirus puede provocar una disminución de la eficacia debido a una respuesta inmunitaria frente a las proteínas del adenovirus. Parte de la exposición inicial puede ser el resultado de una infección por adenovirus, posiblemente complementada con el uso de un adenovector para tratar una enfermedad distinta del v Hc .

Basándose en las orientaciones proporcionadas en el presente documento, puede generarse una respuesta inmunitaria suficientemente fuerte para lograr un efecto beneficioso en un paciente. La directriz proporcionada incluye información relativa a la selección de la secuencia del VHC, a la selección del vector, a la producción del vector, al tratamiento de combinación y a la administración.

I. Secuencias quiméricas

Un polipéptido quimérico del VHC que proporcione regiones con diferentes secuencias NS3-4A puede utilizarse como componente de una vacuna para proporcionar antígenos dirigidos a diferentes cepas del VHC. Una característica importante del VHC es la heterogeneidad de su genoma. (Pawlotsky, Clin. Liver Dis, 7:45-66, 2003, Simmonds, J. General. Virol, 85:3173-3188, 2004). De manera adicional, las mutaciones resultantes de la polimerasa de ARN dependiente de ARN propensa a errores típica y carente de actividad de corrección de lecturas común a los virus de ARN, así como del huésped, son responsables de que el VHC circule en el huésped como una población vírica compleja denominada cuasiespecie. (Blight et al., Science 290:1972-1974, 2000).

Una secuencia NS3-4A diferente presente en distintas regiones de una construcción quimérica se refleja en una o más diferencias de aminoácidos. Cada diferencia de aminoácidos es independientemente una adición, sustitución o deleción. En diferentes realizaciones, las secuencias NS3-4A de las regiones primera y segunda difieren en al menos aproximadamente un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %; o hay al menos 1, 5, 10, 15, 20 o 25 alteraciones de aminoácidos. Además de la secuencia NS3-4A, una región NS3-4A puede contener aminoácidos adicionales, como una metionina aminoterminal y/o un sitio de escisión introducido.

El porcentaje de diferencia puede determinarse restando la identidad de secuencia de 100. Por ejemplo, una identidad de secuencia del 85 % proporciona una diferencia del 15 %.

La primera región y las segundas regiones polipeptídicas presentes en un polipéptido quimérico pueden producirse fácilmente basándose en numerosos ejemplos de aislados de VHC de origen natural. Los aislados de VHC pueden clasificarse en los siguientes seis genotipos principales que comprenden uno o más subtipos: HCV-1/(1a, 1b, 1c), HCV-2/(2a, 2b, 2c), HCV-3/(3a, 3b, 10a), HCV-4/(4a), HCV-5/(5a) y HCV-6/(6a, 6b, 7b, 8b, 9a, 11a). (Simmonds, J. Gen. Virol., 693-712, 2001). Secuencias particulares del VHC, tales como HCV-BK, HCV-J, HCV-N, y HCV-H, han sido depositadas en GenBank y descritas en diversas publicaciones. (Por ejemplo, Chamberlain et al., J. Gen. Virol., 1341-1347, 1997).

Preferentemente, tanto la primera como la segunda región son procesadas in vivo por la proteasa del VHC para proporcionar proteínas individuales correspondientes a la proteína individual presente en el polipéptido quimérico del VHC. Las proteínas individuales del VHC pueden ser procesadas posteriormente por la célula.

En diferentes realizaciones relativas a la primera región, la región es o contiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la región NS3-NS4A presente en: aminoácidos 1-686 de la SEQ ID NO: 1; 1a del VHC (Acc. N.° M62321); 2a del VHC (Acc. N.° D00944; 3a del VHC (Acc. N.°: D28917); 4a del VHC (Acc. N.°: Y11604); 5a del VHC (Acc. N.°: Y13184) o 6a del VHC (Acc. N.°: D84264).

En diferentes realizaciones relativas a la segunda región, la región es o contiene una secuencia NS3-NS4A-NS4B-NS5A o NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B* sustancialmente similar a la región correspondiente presente en: aminoácidos 686-2675, aminoácidos 691-2675, o aminoácidos 692-2675, de la SEQ ID NO: 1; 1a del ^{V h C} (Acc. N.° M62321); 2a del VHC (Acc. N.° D00944; 3a del VHC (Acc. N.°: D28917); 4a del VHC (Acc. N.°: Y11604); 5a del VHC (Acc. N.°: Y13184) o 6a del VHC (Acc. N.°: D84264). La referencia a una "NS5B*", indica una NS5B inactiva.

Preferentemente, la segunda región contiene un sitio de escisión de aminoácidos compatible con la actividad proteasa de la primera región. Puede añadirse un sitio de escisión basado en secuencias de escisión conocidas.

La referencia a una "secuencia sustancialmente similar" con respecto a las secuencias de aminoácidos indica una identidad de al menos aproximadamente el 70 % con una secuencia de referencia. El porcentaje de identidad (también denominado porcentaje idéntico) con respecto a una secuencia de referencia se determina alineando la región polipeptídica con la región de referencia correspondiente para obtener el número máximo de aminoácidos idénticos y determinando el número de aminoácidos idénticos en las regiones correspondientes. Este número se divide por el número total de aminoácidos en la región de referencia y, a continuación, se multiplica por 100 y se redondea al número entero más próximo.

En diferentes realizaciones, las secuencias sustancialmente similares tienen una identidad de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %; o difieren en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 alteraciones de aminoácidos. Cada alteración es independientemente una inserción, sustitución o adición.

Pueden producirse modificaciones en las secuencias del VHC de origen natural para obtener secuencias diferentes sustancialmente similares. Las diferencias en los aminoácidos de origen natural se deben a las diferentes cadenas laterales de los aminoácidos (grupos R). Un grupo R afecta a las diferentes propiedades del aminoácido, tales como el tamaño físico, la carga y la hidrofobicidad. Los aminoácidos se pueden dividir en diferentes grupos como sigue: neutros e hidrófobos (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, triptófano, fenilalanina y metionina); neutros y polares (glicina, serina, treonina, tirosina, cisteína, asparagina y glutamina); básicos (lisina, arginina e histidina); y ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico).

Generalmente, al sustituir diferentes aminoácidos para mantener la actividad, es preferible intercambiar aminoácidos que tengan propiedades similares. La sustitución de diferentes aminoácidos dentro de un grupo particular, como la sustitución de valina por leucina, arginina por lisina, y asparagina por glutamina son buenos candidatos para no provocar un cambio en la estructura terciaria del polipéptido.

Las modificaciones de aminoácidos mantienen o añaden preferentemente regiones de antígenos de linfocitos T. Se pueden realizar diferentes modificaciones en las secuencias polipeptídicas del VHC de origen natural para producir polipéptidos capaces de provocar una amplia gama de respuestas de linfocitos T. Los factores que influyen en la capacidad de un polipéptido para provocar una amplia respuesta de linfocitos T incluyen la conservación o introducción de regiones de antígenos de linfocitos T específicos del VHC y la prevalencia de diferentes regiones de antígenos de linfocitos T en diferentes aislados del VHC.

Los antígenos de linfocitos T del VHC pueden identificarse mediante, por ejemplo, experimentación empírica. Una forma de identificar antígenos de linfocitos T consiste en generar una serie de péptidos cortos superpuestos a partir de un polipéptido de mayor longitud y, a continuación, analizar de forma sistemática las poblaciones de linfocitos T de pacientes infectados en busca de clones positivos. Los clones positivos son activados/cebados por un péptido en particular. Técnicas tales como ELISPOT de IFN^y, tinción intracelular de IFN^y y ensayos de CTL a gran escala pueden usarse para medir la actividad peptídica. Se puede considerar que los péptidos así identificados representan epítopos de linfocitos T del patógeno respectivo.

La capacidad de un polipéptido del VHC para procesarse y producir una respuesta CMI puede determinarse mediante técnicas descritas en el presente documento o bien conocidas en la técnica. (Véase, por ejemplo, Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.) Tales técnicas incluyen el uso de ELISPOT de IFNy, tinción intracelular de IFNy y ensayos de CTL a gran escala para medir una respuesta CMI específica del VHC.

Se pueden realizar pequeñas modificaciones en NS5B para producir una polimerasa inactiva al dirigirse a motivos esenciales para la replicación. Lohmann et al., describen ejemplos de motivos críticos para la actividad de NS5B y las modificaciones que pueden realizarse para producir una NS5B inactiva, Journal of Virology 71:8416-8426, 1997, Kolykhalov et al., Journal of Virology 74:2046-2051, 2000, y Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.

Los factores adicionales que deben tenerse en cuenta al producir modificaciones en un polipéptido quimérico del VHC incluyen el mantenimiento de la capacidad de autoprocesamiento y el mantenimiento de los antígenos de linfocitos T. La capacidad del polipéptido para transformarse viene determinada en gran medida por la actividad proteasa funcional. Las modificaciones que mantienen la actividad proteasa pueden obtenerse teniendo en cuenta la proteasa NS3, NS4A que sirve de cofactor para NS3, y los sitios de reconocimiento de proteasas presentes en el polipéptido del VHC.

II. NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B* 2 quimérica

Un polipéptido quimérico preferido del VHC es NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B* 2, donde los subíndices 1 y 2 denotan secuencias de regiones sustancialmente similares a la región correspondiente en diferentes cepas del VHC y "NS5B*" denota NS5B enzimáticamente inactiva. NS31-NS4A1 y NS32-NS4A2 difieren en al menos un aminoácido. En diferentes realizaciones, NS31-NS4A1 y NS32-NS4A2 difieren en al menos un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %; o hay al menos 1, 5, 10, 15, 20 o 25 alteraciones de aminoácidos.

Preferentemente, el polipéptido NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2* proporciona suficiente actividad proteasa in vivo para que las regiones primera y segunda produzcan, cada una, uno o más péptidos individuales del VHC. En una realización preferida, el polipéptido puede producir como péptidos individuales NS31, NS4A1, NS32, NS4A2, NS4B2, NS5A2 y NS5B/ .

Se pueden proporcionar diferentes regiones NS31-NS4A1 y NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2* como se describe en la Sección I supra. En diferentes realizaciones, la región NS31-NS4A1 es o contiene una secuencia sustancialmente similar a los aminoácidos 1-686, o a los aminoácidos 2-686, de la SEQ ID NO:1; la región NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2* es o contiene una secuencia sustancialmente similar a los aminoácidos 687-2675, 691-2675, o 692-2675, de la SEQ ID NO: 1; o NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2* en su conjunto es sustancialmente similar a la SEQ ID NO 1. En diferentes realizaciones, cada región es sustancialmente similar a la región correspondiente en la SEQ ID NO: 1 en al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %; o difieren en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 alteraciones de aminoácidos.

III. Casetes de expresión génica

Un casete de expresión génica que codifica un polipéptido contiene elementos necesarios para la expresión del polipéptido. La referencia a "polipéptido" puede ser un polipéptido quimérico.

III.A. Secuencia polipeptídica codificada

Las secuencias polipeptídicas codificadas del VHC descritas en el presente documento pueden utilizarse en diferentes vectores. Los ejemplos específicos incluyen secuencias polipeptídicas quiméricas tales como las descritas en las Secciones I y II supra, y secuencias polipeptídicas del ^{V h C} Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B* tales como secuencias sustancialmente similares a la SEQ ID NO: 16 (Véase, Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588). Puede utilizarse una secuencia sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, junto con un vector de chimpancé descrito en la Sección V infra.

En diferentes realizaciones, la secuencia sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 16 tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16 de al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %; o difiere en 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 alteraciones de aminoácidos.

III. B. Secuencia polipeptídica codificada

Los elementos reguladores presentes en un casete de expresión génica generalmente incluyen: (a) un promotor acoplado transcripcionalmente a una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido, (b) un sitio de unión al ribosoma 5' acoplado funcionalmente a la secuencia nucleotídica, (c) un terminador unido al extremo 3' de la secuencia nucleotídica, y (d) una señal de poliadenilación 3' acoplada funcionalmente a la secuencia nucleotídica. También pueden estar presentes elementos reguladores adicionales útiles para potenciar o regular la expresión génica o el procesamiento de polipéptidos.

Los promotores son elementos genéticos que son reconocidos por una ARN polimerasa y median la transcripción de las regiones corriente abajo. Los promotores preferidos son los promotores fuertes que permiten aumentar los niveles de transcripción. Los ejemplos de promotores fuertes son el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) y el CMV con intrón A. (Chapman et al, Nucl. Acids Res. 19:3979-3986, 1991). Los ejemplos adicionales de promotores incluyen promotores de origen natural tales como el promotor de EF1 alfa, el promotor del CMV murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, y los promotores temprano/tardío del SV40 y el promotor de la p-actina; y los promotores artificiales tales como un promotor sintético específico del músculo y un promotor quimérico específico del músculo/CMV (Li et al., Nat. Biotechnol. 17:241-245, 1999, Hagstrom et al., Blood 95:2536-2542, 2000).

El sitio de unión al ribosoma se encuentra en el codón de iniciación o cerca del mismo. Los ejemplos de sitios de unión al ribosoma incluyen CCACCAUGG, CCGCCAUGG, y ACCAUGG, donde AUG es el codón de iniciación. (Kozak, Cell 44:283-292, 1986). Otro ejemplo de sitio de unión al ribosoma es proporcionado por la SEQ ID NO: 18.

La señal de poliadenilación es responsable de la escisión del ARN transcrito y de la adición de una cola de poli (A) al ARN. La señal de poliadenilación en eucariotas superiores contiene una secuencia AAUAAA de aproximadamente 11­ 30 nucleótidos del sitio de adición de poliadenilación. La secuencia AAUAAA está implicada en la señalización de la escisión del ARN. (Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY, 1990.) La cola de poli (A) es importante para el procesamiento del ARNm.

Las señales de poliadenilación que pueden utilizarse como parte de un casete de expresión génica incluyen la señal mínima de poliadenilación de la p-globina de conejo y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). (Xu et al., Gene 272:149-156, 2001, Post et al., Patente de EE. UU. N.° 5.122.458). Los ejemplos adicionales incluyen la señal de poliadenilación sintética (SPA) y la señal de poliadenilación SV40. La secuencia de SPA se proporciona mediante la SEQ ID NO: 19.

La referencia a "acoplado transcripcionalmente" indica que el promotor está colocado de tal manera que la transcripción de la secuencia nucleotídica puede producirse mediante la unión de la ARN polimerasa al promotor. Acoplado transcripcionalmente no requiere que la secuencia que está transcribiendo sea adyacente al promotor.

La referencia a "acoplado funcionalmente" indica la capacidad de mediar un efecto en la secuencia nucleotídica. Acoplado funcionalmente no requiere que las secuencias acopladas sean adyacentes entre sí. Una señal de poliadenilación 3' acoplada funcionalmente a la secuencia nucleotídica facilita la escisión y la poliadenilación del ARN transcrito. Un sitio de unión al ribosoma 5' acoplado funcionalmente a la secuencia nucleotídica facilita la unión al ribosoma.

Los ejemplos de elementos reguladores adicionales útiles para potenciar o regular la expresión génica o el procesamiento de polipéptidos que pueden estar presentes incluyen un potenciador, una secuencia líder y un operador. Una región potenciadora aumenta la transcripción. Los ejemplos de regiones potenciadoras incluyen el potenciador de CMV y el potenciador de SV40. (Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7:13-30, 1995, Xu, et al., Gene 272:149-156, 2001). Una región potenciadora puede estar asociada a un promotor.

Una secuencia líder es una región de aminoácidos en un polipéptido que dirige el polipéptido en el proteasoma. El ácido nucleico que codifica la secuencia líder se encuentra en 5' de un gen estructural y se transcribe a lo largo del gen estructural. Un ejemplo de una secuencia líder es tPA.

Se puede utilizar una secuencia operadora para regular la expresión génica. Por ejemplo, la secuencia operadora Tet puede utilizarse para reprimir la expresión génica.

IV. Secuencia de ácido nucleico codificante

Una secuencia de ácido nucleico codificante proporciona codones que codifican una secuencia particular de aminoácidos. Partiendo de una secuencia particular de aminoácidos y de la conocida degeneración del código genético, se puede obtener un gran número de secuencias de ácido nucleico codificantes diferentes. La degeneración del código genético se debe a que casi todos los aminoácidos están codificados por diferentes combinaciones de tripletes de nucleótidos o "codones".

La traducción de un codón particular en un aminoácido particular es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Lewin GENES IV, pág. 119, Oxford University Press, 1990). Los aminoácidos están codificados por codones de la siguiente manera:

A=Ala=Alanina: codones GCA, GCC, GCG, GCU

C=Cys=Cisteína: codones UGC, UGU

D=Asp=Ácido aspártico: codones GAC, GAU

E=Glu=Ácido glutámico: codones GAA, GAG

F=Phe=Fenilalanina: codones UUC, UUU

G=Gly=Glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU

H=His=Histidina: codones CAC, CAU

I=Ile=Isoleucina: codones AUA, AUC, AUU

K=Lys=Lisina: codones AAA, AAG

L=Leu=Leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU

M=Met=Metionina: codón AUG

N=Asn=Asparagina: codones AAC, AAU

P=Pro=Prolina: codones CCA, CCC, CCG, CCU

Q=Gln=Glutamina: codones CAA, CAG

R=Arg=Arginina: codones AGA, ^{A g G ,} CGA, CGC, CGG, CGU

S=Ser=Serina: codones AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU

T=Thr=Treonina: codones ACA, ACC, ACG, ACU

V=Val=Valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU

W=Trp=Triptófano: codón UGG

Y=Tyr=Tirosina: codones UAC, UAU.

Los nucleótidos 1269-7223 de la SEQ ID NO: 13 proporcionan un ejemplo de una secuencia NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B*. Las secuencias sustancialmente similares a los nucleótidos 1269-7223 de la SEQ ID NO: 13 pueden utilizarse como parte de un componente de vacuna. (Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.) Por ejemplo, tales secuencias sustancialmente similares pueden utilizarse como parte de un adenovector basado en ChA3 o ChA63.

La referencia a una "secuencia sustancialmente similar" con respecto a las secuencias nucleotídicas indica una identidad de al menos aproximadamente el 70 % con una secuencia de referencia. El porcentaje de identidad (también denominado porcentaje idéntico) con respecto a una secuencia de referencia se determina alineando una región de nucleótidos con la región de referencia correspondiente para obtener la máxima identidad y determinando el número de nucleótidos idénticos en las regiones correspondientes. Este número se divide por el número total de nucleótidos de la región de referencia y, a continuación, se multiplica por 100 y se redondea al número entero más próximo.

Las secuencias de ácido nucleico pueden optimizarse para mejorar la expresión en un huésped. Entre los factores a tener en cuenta se incluyen el contenido C:G, codones preferidos y la evitación de estructuras secundarias inhibidoras. Estos factores pueden combinarse de diferentes maneras para intentar obtener secuencias de ácido nucleico que mejoren la expresión en un huésped en particular. (Véase, por ejemplo, Donnelly et al., Publicación Internacional Número WO 97/47358.)

La optimización del ácido nucleico que codifica el VHC también se describe en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588. El documento WO 03/031588 proporciona ejemplos de diferentes secuencias optimizadas que codifican NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B*.

Un ejemplo de una secuencia optimizada por codones para NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2* se proporciona mediante los nucleótidos 1891-9915 de la ^{s E q} ID NO: 2. Los nucleótidos 1891-1893 proporcionan un codón de metionina para la región NS31-NS4A1. Los nucleótidos 3949-3960 proporcionan la región NS32-NS4A2 con los cuatro primeros aminoácidos basados en 3a del VHC, seguidos de una metionina.

En diferentes realizaciones de la presente invención, la región codificante NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2* es sustancialmente similar a los nucleótidos 1891-9915 o 1894-9915 de la SEQ ID NO: 2. En diferentes realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad con los nucleótidos 1891-9915 o 1894-9915 de la SEQ ID NO: 2 de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %; o difiere en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 1-50 nucleótidos.

V. Vectores de ácido nucleico

El ácido nucleico que codifica un polipéptido del VHC puede utilizarse como vectores terapéuticos o en la producción de vectores terapéuticos. Los vectores utilizados en la producción de vectores terapéuticos incluyen vectores lanzadera y plásmidos del genoma de adenovirus.

Los vectores terapéuticos se utilizan para introducir y expresar un polipéptido del VHC en una célula. Los vectores adecuados pueden introducir ácido nucleico en una célula diana sin provocar un efecto secundario inaceptable. La expresión celular se consigue utilizando un casete de expresión génica que codifica el polipéptido del VHC.

Los ejemplos de vectores que pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas incluyen los adenovectores de primera y segunda generación, adenovectores dependientes de auxiliar, vectores víricos adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores de virus alfa, vector del virus de la encefalitis equina venezolana y vectores plasmídicos. (Hitt, et al., Advances in Pharmacology 40:137-206, 1997, Johnston et al., Patente de Estados Unidos Número 6.156.588, Johnston et al., Publicación Internacional Número WO 95/32733, Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.)

V.A. Adenovectores

Los adenovectores emplean un genoma de adenovirus recombinante para la expresión de una proteína o polipéptido deseado en una célula diana. Un adenovirus de tipo silvestre tiene un genoma lineal bicatenario con repeticiones terminales invertidas en ambos extremos. Durante la replicación vírica, el genoma se empaqueta dentro de una cápside vírica para formar un virión. El virus entra en la célula diana a través de la adhesión vírica seguido de internalización. (Hitt et al., Advances in Pharmacology 40:137-206, 1997).

El genoma del adenovirus proporciona diferentes elementos necesarios para la replicación y el procesamiento del adenovirus. Cada extremo del genoma adenoviral contiene repeticiones terminales invertidas (ITR), que son necesarias para la replicación vírica. El virus también codifica la actividad proteasa necesaria para procesar algunas de las proteínas estructurales requeridas para producir viriones infecciosos.

La estructura del genoma adenoviral puede describirse basándose en el orden de expresión de los genes víricos tras la transducción de la célula huésped. Los genes víricos se denominan genes tempranos (E) o tardíos (L) en función de si la transcripción se produce antes o después del inicio de la replicación del ADN. En la fase temprana de la transducción, los genes de E1, E2, E3 y E4 se expresan para preparar a la célula huésped para la replicación vírica. La replicación del virus puede volverse defectuosa por una deleción de la región temprana 1 (El) esencial del genoma vírico. (Brody et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 716:90-101, 1994).

Durante la fase tardía, se activa la expresión de los genes tardíos L1-L5, que codifican los componentes estructurales de las partículas del virus. Todos los genes tardíos están bajo el control de un único promotor y codifican proteínas que incluyen el pentón (L2), el hexón (L3), la proteína de andamiaje de 100 kDa (L4) y la proteína de fibra (L5), que forman la nueva partícula vírica en la que se encapsula el ADN adenoviral. En definitiva, el proceso de replicación adenoviral de tipo silvestre provoca la lisis celular.

Los adenovectores pueden basarse en diferentes serotipos de adenovirus, como los que se encuentran en seres humanos o animales. Los ejemplos de adenovirus animales incluyen bovino, porcino, de chimpancé, murino, canino y aviar (CELO). Los adenovirus humanos incluyen los serotipos del grupo B, C, D, o E como el tipo 2 ("Ad2"), 4 ("Ad4"), 5 ("Ad5"), 6 ("Ad6"), 24 ("Ad24"), 26 ("Ad26"), 34 ("Ad34") y 35 ("Ad35"). Los adenovectores pueden contener regiones de un único adenovirus o de dos o más adenovirus diferentes.

En diferentes realizaciones, los adenovectores se basan en Ad5, Ad6, ChAd3, ChAd63 o una combinación de los mismos. Ad5 está descrito por Chroboczek, et al., J. Virology 186:280-285, 1992. Los vectores basados en Ad5 y Ad6 se describen en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588. La secuencia completa de ácido nucleico de ChAd3 se proporciona en las Figuras 6A-6H. La secuencia completa de ácido nucleico de ChAd63 se proporciona en las Figuras 7A-7H.

En la presente invención, el adenovector contiene proteínas estructurales de chimpancé ChAd3 o ChAd63 expuestas en superficie. Las proteínas expuestas en superficie incluyen fibra, hexón y pentón. Un adenovector que incluye dichas proteínas, a diferencia de las proteínas de adenovirus humano, tiene menos probabilidades de verse afectado por la respuesta inmunitaria cuando el paciente ha estado expuesto previamente a un adenovirus humano.

V. A. 1 Adenovectores de primera generación

Los adenovectores de primera generación contienen un genoma de adenovirus recombinante que tiene una deleción de E1, una deleción de E3, una deleción de E4 opcional, y un casete de expresión. La extensión y la combinación de las deleciones son lo suficientemente grandes como para hacer que la replicación del virus sea incompetente y para recibir un casete de expresión génica que codifique un producto deseado. El virus puede volverse incompetente para la replicación mediante la deleción de E1.

Las deleciones de E1 pueden obtenerse a partir de aproximadamente el par de bases 342 hasta aproximadamente el par de bases 3523 de Ad5, o una región correspondiente de otros adenovirus. Preferentemente, la región delecionada implica la eliminación de una región desde aproximadamente el par de bases 450 hasta aproximadamente el par de bases 3511 de Ad5, o una región correspondiente de otros adenovirus. Las deleciones de la región de E1 de mayor tamaño que comienzan aproximadamente en el par de bases 341 eliminan elementos que facilitan el empaquetamiento del virus.

Las deleciones de E3 pueden obtenerse a partir de aproximadamente el par de bases 27865 hasta aproximadamente el par de bases 30995 de Ad5, o la región correspondiente de otros adenovectores. Preferentemente, la región de deleción implica la eliminación de una región desde aproximadamente el par de bases 28134 hasta aproximadamente el par de bases 30817 de Ad5, o la región correspondiente de otros adenovectores.

Las deleciones de E4 pueden obtenerse a partir de aproximadamente el par de bases 34634 de ChAd3 hasta aproximadamente el par de bases 37349 o una región correspondiente de otros adenovirus. Una deleción de E4 debe conservar el E4orf6 nativo, o puede insertarse un E4orf6 de un adenovirus diferente. Bett et al., Publicación Internacional Número WO2004/018627 ilustran el uso de of6 de E4 heterólogo.

La combinación de deleciones en E1, E3 y E4 debe ser suficientemente grande para que el tamaño global del genoma recombinante que contiene el casete de expresión génica no supere aproximadamente el 105 % del genoma de adenovirus de tipo silvestre. Por ejemplo, a medida que el genoma de un adenovirus recombinante Ad5 aumenta de tamaño por encima de aproximadamente el 105 %, el genoma se vuelve inestable. (Bett et al., Journal of Virology 67:5911-5921, 1993).

Preferentemente, el tamaño del genoma del adenovirus recombinante que contiene el casete de expresión génica es de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 105 % del tamaño del genoma del adenovirus de tipo silvestre. En diferentes realizaciones, el tamaño del genoma del adenovirus recombinante que contiene el casete de expresión es de aproximadamente el 100 % a aproximadamente el 105,2 %, o de aproximadamente el 100 %, del tamaño del genoma de tipo silvestre.

Aproximadamente 7.500 kb pueden insertarse en un genoma de Ad5 o Ad6 con una deleción de E1 y E3. Sin ninguna deleción, el genoma de Ad5 es de 35.935 pares de bases y el genoma de Ad6 es de 35.759 pares de bases.

Los vectores ChAd3 y ChAd63 tienen una mayor capacidad de inserción de ácido nucleico en comparación con Ad5, debido a su mayor tamaño genómico y a la presencia de una región de E3 más grande que puede ser delecionada. El genoma de ChAd3 es de 37.741 pares de bases, y el de ChAd63 es de 36.643 pares de bases.

Aproximadamente hasta 10.800 pb pueden insertarse en un adenovector ChAd3 y ChAd63 que lleve la deleción de E1, E3, y la sustitución de E4 por of6 de E4 de Ad5. La sustitución del E4 por of6 de E4 de Ad5 es tanto una deleción como una sustitución, en el sentido de que el E4orf6 de Ad5 sustituido es menor que el delecionado. Un inserto de 10.800 pb para estos vectores alcanza el límite del 105 % del tamaño del genoma de tipo silvestre.

La replicación de los adenovectores de primera generación puede realizarse suministrando el producto génico de E1 en trans. El producto génico de E1 puede suministrarse en trans, por ejemplo, utilizando líneas celulares transformadas con la región de E1 del adenovirus. Los ejemplos de células y líneas celulares transformadas con la región de E1 del adenovirus son las células HEK 293, células 911, células PERC.6™, y células de aminocitos humanos primarios transfectadas. (Graham et al., Journal of Virology 36:59-72, 1977, Schiedner et al., Human Gene Therapy 11:2105-2116, 2000, Fallaux et al., Human Gene Therapy 9:1909-1917, 1998, Bout et al., Patente de EE. UU. N.° 6.033.908).

La sustitución en cis de la región de E4 nativa del adenovirus de chimpancé con of6 de E4 de Ad5 debería facilitar el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de los vectores adenovirales de chimpancé de diversos serotipos propagados en la línea celular complementaria de Ad5. Las secuencias de E1 de Ad5 en células 293 y PER.C6 no complementan totalmente la replicación de serotipos ajenos a los adenovirus humanos pertenecientes al grupo C como los adenovirus de chimpancé.

Debe insertarse un casete de expresión en un genoma de adenovirus recombinante en la región correspondiente a la región de E1delecionada o a la región de E3 delecionada. El casete de expresión puede tener una orientación paralela o antiparalela. En una orientación paralela, la dirección de transcripción del gen insertado es la misma que la del gen de E1 o E3 delecionado. En una orientación de transcripción antiparalela, la cadena opuesta sirve como plantilla y la dirección de transcripción se encuentra en la dirección opuesta.

En una realización de la presente invención, el adenovector contiene una deleción de E4 y una inserción de una secuencia sustancialmente similar a la secuencia de E4orf6 de Ad5 proporcionada por los nucleótidos 34601-35482 de la SEQ ID NO: 13. En diferentes realizaciones, la identidad de secuencia es de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %; o difiere de los nucleótidos 34601-35482 de la SEQ ID NO: 13 en 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 1-50 nucleótidos.

En una realización de la presente invención, la cadena principal del adenovector tiene una identidad de secuencia nucleotídica con los nucleótidos 1-460 y 7468-35890 de la Se Q ID NO: 13, o con los nucleótidos 1-454 y 7458-34658 de la SEQ ID NO: 17, de al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %; o difiere de los nucleótidos 1-460 y 7468-35890 de la SEQ ID NO: 13, o de los nucleótidos 1-454 y 7458-34658 de la SEQ ID NO: 17, en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 1­ 50 nucleótidos.

En otra realización, el adenovector que contiene un casete de expresión tiene una identidad de secuencia nucleotídica con la SEQ ID NO: 13 o 17 de al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %; o difiere de la SEQ ID NO: 13 o 17 en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 1-50 nucleótidos.

V.A.2 Adenovectores de segunda generación

Los adenovectores de segunda generación contienen menos genoma adenoviral que los vectores de primera generación y pueden utilizarse junto con líneas celulares complementarias y/o vectores auxiliares que suministran proteínas adenovirales. Los adenovectores de segunda generación en general se describen en diferentes referencias como Russell, Journal of General Virology 81:2573-2604, 2000; Hitt et al., 1997, Human Ad vectors for Gene Transfer, Advances in Pharmacology, Vol. 40 Academic Press, Catalucci et al. Journal of Virology 79: 6400-6409, 2005. Los adenovectores de segunda generación pueden basarse en distintos tipos de adenovirus, incluidos los adenovirus humanos y de chimpancé.

VI. Producción de vectores

Los vectores pueden producirse utilizando técnicas de ácido nucleico recombinante como las que implican el uso de enzimas de restricción, ligamiento de ácidos nucleicos y recombinación homóloga. Las técnicas de ácido nucleico recombinante son bien conocidas en la técnica. (Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987­ 1998 y Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Los vectores intermedios se utilizan para derivar un vector terapéutico o para transferir un casete de expresión o una parte del mismo de un vector a otro. Los ejemplos de vectores intermedios incluyen plásmidos del genoma de adenovirus y vectores lanzadera.

Los elementos útiles en un vector intermedio incluyen un origen de replicación, un marcador seleccionable, regiones de recombinación homóloga y sitios de restricción convenientes. Los sitios de restricción convenientes pueden utilizarse para facilitar la clonación o la liberación de una secuencia de ácido nucleico.

Las regiones de recombinación homólogas proporcionan regiones de secuencia de ácido nucleico que son homólogas a una región diana en otra molécula de ácido nucleico. Las regiones homólogas flanquean la secuencia de ácido nucleico que se inserta en la región diana. En diferentes realizaciones, las regiones homólogas tienen una longitud de entre 150 y 600 nucleótidos, o de entre 100 y 500 nucleótidos.

Una realización de la presente invención describe un vector lanzadera que contiene un casete de expresión que expresa el polipéptido del VHC, un marcador seleccionable, un origen bacteriano de replicación, una primera región homóloga de adenovirus y una segunda región homóloga de adenovirus que dirigen el casete de expresión para que se inserte en una región de E1 o la sustituya. Las regiones homólogas primera y segunda flanquean el casete de expresión. La primera región homóloga contiene al menos aproximadamente 100 pares de bases sustancialmente homólogos con al menos el extremo derecho (extremo 3') de una región de adenovirus de tipo silvestre de aproximadamente los pares de bases 4-450. La segunda homología contiene al menos aproximadamente 100 pares de bases sustancialmente homólogos con al menos el extremo izquierdo (extremo 5') de Ad5 de aproximadamente los pares de bases 3511-5792, o la región correspondiente de otro adenovirus.

La referencia a "sustancialmente homóloga" indica un grado suficiente de homología para recombinarse específicamente con una región diana. En diferentes realizaciones, sustancialmente homóloga se refiere a al menos el 85 %, al menos el 95 % o el 100 % de identidad de secuencia.

Un método de producción de adenovectores consiste en la creación de un plásmido de genoma preadenoviral que contenga un casete de expresión. El plásmido de preadenovirus contiene todas las secuencias de adenovirus necesarias para la replicación en la línea celular complementaria deseada. A continuación, el plásmido de preadenovirus se digiere con una enzima de restricción para liberar las ITR víricas y se transfecta en la línea celular complementaria para rescatar el virus. Las ITR deben liberarse de las secuencias plasmídicas para permitir la replicación. El rescate de adenovectores da lugar a la producción de un adenovector que contiene el casete de expresión. (Véase, por ejemplo, Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.)

VI.A. Plásmidos del genoma de adenovirus

Los plásmidos del genoma de adenovirus contienen una secuencia de adenovector dentro de un plásmido de mayor longitud (que puede ser un cósmido). El plásmido de mayor longitud puede contener elementos adicionales, como los que facilitan el crecimiento y la selección en células eucariotas o bacterianas, dependiendo de los procedimientos empleados para producir y mantener el plásmido. Los plásmidos genómicos de adenovirus tienen preferentemente un casete de expresión génica insertado en una región delecionada de E1 o E3.

Las técnicas para producir plásmidos del genoma de adenovirus incluyen las que implican el uso de vectores lanzadera y recombinación homóloga, y las que implican la inserción de un casete de expresión génica en un cósmido de adenovirus. (Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7:13-30, 1995, Danthinne et al., Gene Therapy 7:1707-1714, 2000).

Una realización de la presente invención describe un método de fabricación de un adenovector que incluye una etapa de recombinación homóloga para producir un plásmido del genoma de adenovirus y una etapa de rescate de adenovirus. La etapa de recombinación homóloga implica el uso de un vector lanzadera que contiene un casete de expresión del polipéptido del VHC flanqueado por regiones homólogas de adenovirus. Las regiones homólogas de adenovirus dirigen el casete de expresión a la región delecionada de E1 o E3.

VI.B. Rescate de adenovectores

Un adenovector puede ser rescatado de un plásmido del genoma de adenovirus recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la técnica o descritas en el presente documento. Hitt et al. proporcionan ejemplos de técnicas de rescate de adenovirus bien conocidas en la técnica, Methods in Molecular Genetics 7:13-30, 1995, y Danthinne et al., Gene Therapy 7:1707-1714, 2000.

Un ejemplo de método de rescate de un adenovector consiste en reforzar la replicación adenoviral. Se puede reforzar la replicación adenoviral, por ejemplo, suministrando funciones adenovirales como las proteínas de E2 (polimerasa, proteína preterminal y proteína de unión al ADN), así como of6 de E4 en un plásmido separado. (Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.)

VIII. Tratamiento de combinación contra el VHC

Una vacuna de ácido nucleico contra el VHC puede utilizarse por sí sola para tratar a un paciente, puede utilizarse junto con otras terapias contra el VHC, y puede utilizarse con agentes dirigidos a otros tipos de enfermedades. Las terapias adicionales incluyen agentes terapéuticos para tratar el VHC y enfermedades con una alta prevalencia en personas infectadas por VHC. Los agentes dirigidos a otros tipos de enfermedades incluyen vacunas contra el VIH y el VHB.

Las terapias adicionales para tratar el VHC incluyen vacunas y agentes diferentes a una vacuna. (Zein, Expert Opin. Investig. Drugs 10:1457-1469, 2001). Los ejemplos de vacunas adicionales contra el VHC incluyen vacunas diseñadas para provocar una respuesta inmunitaria contra el núcleo del VHC, región de E1, E2 o p7. Los ejemplos de componentes de vacunas incluyen polipéptidos del VHC de origen natural, polipéptidos mimotópicos del VHC o ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos.

Las referencias que describen técnicas para producir mimotopos en general y que describen diferentes mimotopos del VHC se proporcionan en Felici et al. Patente de EE. UU. N.° 5.994.083 y Nicosia et al., Publicación Internacional Número WO 99/60132. Un mimotopo del VHC puede fusionarse con un antígeno del VHC de origen natural.

Los agentes anti-VHC aprobados actualmente son el interferón alfa y el interferón alfa en combinación con ribavirina. Diferentes formas de interferón alfa, como el interferón recombinante y los interferones pegilados, pueden utilizarse para tratar las infecciones por VHC. (De Francesco et al., Antiviral Therapy 58:1-16, 2003, Walker et al., Antiviral Chemistry & Chemotherapy 14:1-21,2003).

Una variedad de diferentes agentes anti-VHC se encuentran en diferentes fases de desarrollo clínico. Los distintos agentes anti-VHC que se están desarrollando incluyen agentes dirigidos contra diferentes dianas del VHC. Los ejemplos de diferentes dianas de VHC incluyen polimerasa del VHC y proteasa NS3-NS4A del VHC. (De Francesco et al., Antiviral Therapy 58:1-16, 2003, Walker et al., Antiviral Chemistry & Chemotherapy 14:1-21, 2003).

VIII. Administración farmacéutica

Las vacunas contra el VHC pueden formularse y administrarse a un paciente utilizando las directrices que se proporcionan en el presente documento junto con técnicas bien conocidas en la técnica. Las directrices para la administración farmacéutica en general se proporcionan en, por ejemplo, Modem Vaccinology, Ed. Kurstak, Plenum Med. Co. 1994; Remington's Pharmaceutical Sciences 18a Edición, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 1990; y Modern Pharmaceutics 2a Edición, Eds. Banker y Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990,

Las vacunas contra el VHC pueden administrarse por diferentes vías, tales como intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intradérmica, impresión a través de la piel, o nasal. Una vía preferida es la intramuscular.

La administración intramuscular puede realizarse mediante diferentes técnicas, como la inyección con o sin uno o más impulsos eléctricos. La transferencia mediada por electricidad puede ayudar a la inmunización genética estimulando las respuestas inmunitarias humoral y celular.

La inyección de la vacuna puede realizarse utilizando diferentes técnicas, como el empleo de una aguja o un sistema de inyección sin aguja. Un ejemplo de sistema de inyección sin aguja es un dispositivo de inyección por chorro. (Donnelly et al., Publicación Internacional Número WO 99/52463.)

La transferencia mediada eléctricamente o electrotransferencia génica (GET) puede realizarse mediante la administración de impulsos eléctricos adecuados después de la inyección del ácido nucleico. (Véanse Mathiesen, Publicación Internacional Número WO 98/43702 y Emini et al. Publicación Internacional Número WO 03/031588).

VIII.A. Vehículos farmacéuticos

Los vehículos farmacéuticamente aceptables facilitan el almacenamiento y la administración de una vacuna a un sujeto. En el presente documento se describen ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales son bien conocidos en la técnica.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener diferentes componentes, tales como un tampón, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, sales y polisorbato. Un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable es: Tampón TRIS 2,5-10 mM; NaCl 25-100 mM; sacarosa al 2,5-10 %; MgCh 0,01-2 mM; y polisorbato 80 al 0,001 %-0,01 % (derivado de plantas). El pH puede ser de aproximadamente 7,0-9,0. Un ejemplo específico de vehículo contiene TRIS 5 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5 %, MgCh 1 mM, polisorbato 80 al 0,005 % a pH 8,0.

VIII.B. Pautas posológicas

Las pautas posológicas adecuadas pueden determinarse teniendo en cuenta la eficacia de una vacuna en particular y factores como la edad, el peso, el sexo y el estado médico del paciente; la vía de administración; el efecto deseado; y el número de dosis. La eficacia de una vacuna en particular depende de diferentes factores, como la capacidad de una vacuna determinada para producir polipéptido que se exprese y procese en una célula y se presente en el contexto de los complejos MHC de clase I y II.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido del VHC administrado a un paciente puede formar parte de diferentes tipos de vectores, incluyendo vectores víricos como el adenovector, y vacunas con plásmidos de ADN. En diferentes realizaciones relativas a la administración de un plásmido de ADN, se administran a un paciente de aproximadamente 0,1 a 10 mg de plásmido, y de aproximadamente 1 a 5 mg de plásmido. En diferentes realizaciones relativas a la administración de un vector vírico, preferentemente un vector adenoviral, se administran de aproximadamente 105 a 1011 partículas víricas a un paciente, y de aproximadamente 107 a 1010 partículas víricas a un paciente.

Las vacunas de vectores víricos y las vacunas de plásmidos de ADN pueden administrarse individualmente, o pueden formar parte de un régimen de administración de sensibilización y refuerzo. Una inoculación de sensibilización y refuerzo de modalidad mixta implica la sensibilización con una vacuna de ADN y el refuerzo con una vacuna de vector vírico, o la sensibilización con una vacuna de vector vírico y el refuerzo con una vacuna de ADN.

La sensibilización múltiple, por ejemplo, de aproximadamente 2-4 veces o más puede ser utilizada. El periodo de tiempo entre la sensibilización y el refuerzo puede variar normalmente de aproximadamente cuatro meses a un año, pero se pueden usar otros plazos. El uso de un régimen de sensibilización con una vacuna de ADN puede ser preferible en situaciones en las que una persona tiene una respuesta inmunitaria preexistente contra el adenovirus.

En una realización de la presente invención, la vacunación inicial se realiza con una vacuna de ADN directamente en el tejido muscular. Tras la vacunación inicial, se realiza un refuerzo con un adenovector o una vacuna de ADN.

Agentes como la interleucina-12, GM-CSF, B7-1, B7-2, IP10 y Mig-1 pueden coadministrarse para reforzar la respuesta inmunitaria. Los agentes pueden coadministrarse como proteínas o mediante el uso de vectores de ácido nucleico.

VIII.C. Sensibilización-refuerzo heterólogo

La sensibilización-refuerzo heterólogo es una modalidad mixta que implica el uso de un tipo de vector vírico para la sensibilización y otro tipo de vector vírico para el refuerzo. La sensibilización-refuerzo heterólogo puede implicar vectores relacionados, como vectores basados en diferentes serotipos de adenovirus y virus relacionados más distantemente, como adenovirus de un animal diferente y poxvirus. Gilbert et al. ilustran el uso de poxvirus y adenovectores para proteger a ratones contra la malaria, Vaccine 20:1039-1045, 2002. Los adenovectores de chimpancé que expresan un polipéptido del VHC proporcionan un vector que puede utilizarse en una sensibilizaciónrefuerzo heterólogo.

El periodo de tiempo entre la sensibilización y el refuerzo varía normalmente de aproximadamente cuatro meses a un año, pero se pueden usar otros plazos. El plazo mínimo debe ser suficiente para permitir un descanso inmunológico. En una realización, este descanso es de al menos 6 meses. La sensibilización puede implicar múltiples sensibilizaciones con un tipo de vector, como 2-4 sensibilizaciones.

Los casetes de expresión presentes en un vector de poxvirus deben contener un promotor nativo o derivado de, poxvirus de interés o de otro miembro del poxvirus. Diferentes estrategias para construir y emplear distintos tipos de vectores basados en poxvirus, incluyendo los basados en el virus vaccinia, virus vaccinia modificado, avipoxvirus, poxvirus de mapache, virus vaccinia Ankara modificado, virus de la viruela canaria (como ALVAC), virus de la viruela de las aves de corral, virus de la viruela vacuna, y NYVAC son bien conocidas en la técnica. (Moss, Current Topics in Microbiology and Immunology 158:25-38, 1982; Earl et al., In Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., Nueva York: Greene Publishing Associates & Wiley Interscience; 1991:16.16.1-16.16.7; Childs et al., Virology 174(2):625-9, 1990; Tartaglia et al., Virology 188:217-232, 1992; Patentes de los Estados Unidos N.°, 4.603.112, 4.722.848, 4.769.330, 5.110.587, 5.174.993, 5.185.146, 5.266.313, 5.505.941, 5.863.542, y 5.942.235).

VIII.D. Adyuvantes

Las vacunas contra el VHC pueden formularse con un adyuvante. Los adyuvantes son sustancias que pueden ayudar a un inmunógeno a producir una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden funcionar por diferentes mecanismos, como aumentar la semivida biológica o inmunológica, proporcionar agentes inmunomoduladores o inducir la producción de citocinas inmunomoduladoras. Se pueden utilizar diferentes adyuvantes en combinación.

Las vacunas contra el VHC pueden formularse con un adyuvante. Los ejemplos de adyuvantes son alumbre, AlPÜ4, alhidrogel, lípido-A y derivados o variantes de los mismos, adyuvante incompleto de Freund, liposomas neutros, liposomas que contengan la vacuna y citocinas, copolímeros en bloque no iónicos, quimiocinas y agentes inmunoduladores.

Los polímeros en bloque no iónicos que contienen polioxietileno (POE) y polipropileno (POP), como los copolímeros en bloque POE-POP-POE, pueden utilizarse como adyuvantes. (Newman et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142, 1998). La respuesta inmunitaria de un ácido nucleico puede potenciarse utilizando un copolímero en bloque no iónico combinado con un tensioactivo aniónico.

Pueden utilizarse diferentes tipos de compuestos como agentes inmunoduladores, como una citocina, una hormona, un derivado lipídico y una molécula pequeña. Los ejemplos de los agentes inmunomoduladores incluyen anti-CTLA-4, anti-CD137, anti-CD40, anti-CD28, anti-CD4, anti-CD25, antiPD1, anti-PD-L1, anti-PD-L2, agentes bloqueadores de FOXP3, ligando Flt-3, imiquimod, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), sargramostina, agonistas del receptor tipo Toll (TLR)-7 y agonista del TLR-9.

Un ejemplo específico de formulación adyuvante es el que contiene CRL-1005 (CytRx Research Laboratories), ADN y cloruro de benzalconio (BAK). Puede prepararse una formulación de CRL-1005, por ejemplo, según lo descrito por Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.

VIII.E. Almacenamiento de vacunas

Las vacunas pueden almacenarse utilizando diferentes tipos de tampones. Por ejemplo, puede emplearse el tampón A105 descrito en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588.

El almacenamiento del ADN puede mejorarse mediante la eliminación o quelación de iones metálicos traza. Pueden utilizarse reactivos como el ácido succínico o málico y quelantes para mejorar la estabilidad de la vacuna de ADN. Los ejemplos de quelantes incluyen ligandos fosfato múltiples y EDTA. La inclusión de depuradores de radicales libres no reductores, como etanol o glicerol, también puede ser útil para prevenir el daño del plásmido de ADN por la producción de radicales libres. Asimismo, el tipo de tampón, pH, concentración de sal, exposición a la luz, así como el tipo de proceso de esterilización utilizado para preparar los viales, pueden controlarse en la formulación para optimizar la estabilidad de la vacuna de ADN.

IX. Ejemplos

A continuación se proporcionan ejemplos para ilustrar mejor diferentes características de la presente invención. Los ejemplos también ilustran una metodología útil para poner en práctica la invención.

Ejemplo 1: Anotación de las secuencias genómicas de ChAd63 y ChAd3

ChAd63 y ChAd3 se alinearon por blast con una base de datos local construida con todas las secuencias de proteínas del grupo "Adenovirus C humano" (HAdV-C; ID taxonomía: 129951). Las secuencias de proteínas se descargaron del servidor del NCBI buscando las ID taxonómicas específicas. La búsqueda por blast se realizó con el programa blastx. El número de secuencias a mostrar en el alineamiento se fijó en 1000 y el filtro se desactivó. Los resultados de blast se analizaron luego con MSPcrunch, una herramienta de mejora de BLAST para el análisis de similitud de secuencias a gran escala.

Cada anotación de CDS resultante en las dos secuencias genómicas se confirmó manualmente observando la posición de los codones ATG y TERMINACIÓN y, cuando fue necesario, en la posición de los sitios de corte y empalme. Todos los productos se buscaron con blastp en la base de datos de proteínas adenovirales construida previamente para validar la predicción de dichos productos por homología. Las secuencias genómicas simples de ChAd63 y ChAd3 se anotaron con VNTI de acuerdo con los resultados de MSPcrunch y la revisión manual. ChAd3 y ChAd63 de productos génicos se proporcionan en las Tablas 1 y 2.

T l 1 Pr ni hA

Ejemplo 2: Construcción del vector ChAd3

La construcción del vector ChAd3 AE1,E3,E4, E4Ad5orf6 consistió en las siguientes etapas:

I. Construcción de un vector lanzadera del subgrupo C

Se secuenció completamente el genoma vírico de ChAd3 (SEQ ID NO: 14) y se utilizó la información para construir un vector lanzadera que facilitara la clonación por recombinación homóloga de todo el genoma. Brevemente, el vector lanzadera utilizado para clonar el adenovirus 3 de chimpancé del subgrupo C, denominado en el presente documento pChAd3EGFP, fue construido de la siguiente manera: un fragmento de ADN de ChAd3 (nt 3542-4105) que contiene la región codificante de pIX se amplificó por PCR con los cebadores de las SEQ ID NO: 20 y 21, se digirió con SgfI-AscI y luego se clonó en pARSCV32-3 y se digirió con SgfI-AscI generando pARS-ChAd3D. El extremo derecho de ChAd3 (nt 37320-37441) se amplificó mediante PCR con cebadores de las ^s E^q ID NO: 22 y 23, se dirigió con XbaI y BamHI y luego se ligó a pARS-ChAd3D restringido con Xbal y BamHI, generando pARS-ChAd3RD. El extremo izquierdo del ADN vírico de ChAd3 (nt 1-460) se amplificó por PCR con cebadores de las SEQ ID NO: 24 y 25, se digirió con EcoRI y SgfI y luego se clonó en pARS-ChAd3RD y se digirió con EcoRI y SgfI, generando de este modo pARS-ChAd3RLD. El casete de ADN vírico también se diseñó para que contuviera sitios de enzimas de restricción (PmeI) situados al final de ambas ITR, de modo que la digestión liberara el ADN vírico del ADN plasmídico.

II. Construcción del vector AE1 ChAd3

El vector ChAd3 se construyó mediante recombinación homóloga en la cepa de E. coli BJ5183. Las células BJ5183 se cotransformaron con ADN vírico purificado de ChAd3 y el vector lanzadera pChAd3EGFP se digirió con BstEII y Bst1107I. La recombinación homóloga entre genes pIX, las secuencias de a Dn de ITR derecha presentes en los extremos de pChAd3EGFP linealizado y el ADN genómico vírico permitieron su inserción en el vector plasmídico, delecionando al mismo tiempo la región de E1 que fue sustituida por el casete de expresión de EGFP. El casete de expresión de la región NS del VHC basado en el promotor del citomegalovirus humano (HCMV) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (poliA de Bgh) se construyó como se describe en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588 y se insertó en el vector ChAd3AE1 EGFP mediante recombinación homóloga en la cepa de E. coli BJ5183 aprovechando las homologías entre las secuencias de ADN de HCMV y poliA de Bgh.

III. Deleción de la región de E3

Para introducir la deleción de toda la región de E3 en la cadena principal del vector ChAd3, las dos regiones de ADN que flanquean los genes E3 se amplificaron por PCR obteniéndose dos fragmentos de ADN. Un fragmento de 486 pb que abarcaba desde el nt 28159 al nt 28644 (3' del gen pVIII, corriente arriba de la región de E3) y un fragmento de ADN de 474 pb que contenía el extremo 3' del gen de fibra (pb 32633 a pb 33106, corriente abajo de la región de E3). Se introdujeron sitios de restricción EcoRI en el extremo 3' del primer fragmento de ADN y en el extremo 5' del segundo fragmento. Los dos fragmentos de PCR se digirieron con EcoRI y se unieron mediante ligamiento in vitro. El fragmento de ADN obtenido (988 pb) se amplificó posteriormente utilizando el oligo directo pVIII y el oligo inverso de fibra.

El fragmento de ADN de 988 pb que contenía las regiones flanqueantes de ADN 3' y 5' de la región de E3 unidas se recombinó con pChAd3AE1/EGFp linealizado con Hpal (corte dentro de la región de E3 a 32384 pb en ChAd3 de tipo silvestre) mediante la cotransformación de células BJ5183, introduciendo así la deleción de E3. El producto final de recombinación fue el plásmido preadeno pChAd3AE1,E3/EGFP.

IV. Deleción de la región de E4 e inserción de E4orf6 de Ad5

Con el fin de sustituir la región de E4 de ChAd3 por E4orf6 de Ad5, E4orf6 de Ad5 se introdujo en un plásmido lanzadera que contenía los últimos 393 pb derivados del extremo derecho del genoma de ChAd3 (pb 37349 a pb 37741). Posteriormente, se introdujo un fragmento de ADN de 144 pb derivado del extremo 3' de fibra y que incluía la poliA de E4 (de pb 34491 a pb 34634 del mapa de ChAd3) corriente abajo de Ad5E4orf6 generando el plásmido pARSChAd3Ad5E4orf6-2.

Finalmente, un fragmento de ADN de pARSChAd3Ad5E4orf6-2 que contenía en los límites el extremo 3' de fibra/poliA de E4 y el extremo derecho de ChAd3 se introdujo por recombinación homóloga en pChAd3 AE1,E3/EGFP linealizado con la enzima de restricción PacI (sitio de PacI, nt 36924 de ChAd3 ts) mediante cotransformación de la cepa de E. coli BJ5183, generando así pChAd3 AE1,3,4 Ad5orf6 EGFP.

Siguiendo esta estrategia, se delecionó toda la región codificante de E4 de ChAd3 y se sustituyó por el gen Ad5E4orf6 clonado 62 pb corriente abajo de la señal TATA de E4 putativa bajo el control del promotor de e4 de ChAd3.

Ejemplo 3: Construcción del vector ChAd63

Se construyó un vector ChAd63 análogo al vector ChAd3 AE1,E3,E4, E4Ad5orf6 como sigue

I. Construcción de un vector lanzadera del subgrupo E

Se secuenció completamente el genoma vírico de ChAd63 y se utilizó la información para construir un vector lanzadera que facilitara la clonación por recombinación homóloga de todo el genoma. Brevemente, el vector lanzadera utilizado para clonar el adenovirus 63 de chimpancé del subgrupo E, denominado pARSChAd63_EGFP, se construyó como se describe a continuación.

El extremo derecho de ChAd63 (nt 36216-36643) se amplificó mediante PCR con cebadores de las SEQ ID NO: 26 y 27, se digirió con XbaI y BamHI y luego se ligó a pARSChAd3-RLD restringido con Xbal y BamHI, generando pARS-ChAd63R. Un fragmento de ADN de ChAd63 (nt 3422-3814) que contiene la región codificante de pIX se amplificó por PCR con los cebadores de las SEQ ID NO: 28 y 29, se digirió con SgfI-AscI y luego se clonó en pARS-ChAd63R y se digirió con SgfI-AscI, generando pARS-ChAd63RD. El extremo izquierdo del ADN vírico de ChAd63 (nt 1-455) se amplificó por PCR con cebadores de las SEQ ID NO: 30 y 31, se digirió con EcoRI y EcoRV y luego se clonó en pARS-ChAd63RD y se digirió con EcoRI y EcoRV, generando de este modo pARS-ChAd63RLD. El casete HCMV-E^g FP-poliA de bgh se amplificó por PCR utilizando los cebadores de las SEQ ID NO: 32 y 33, se digirió con EcoRV y luego se clonó en pARS-ChAd63RLD y se digirió con EcoRV, generando pARS-ChAd63RLD-EGFP. El casete de A^d N vírico también se diseñó para que contuviera sitios de enzimas de restricción (Pmel) situados al final de ambas ITR, de modo que la digestión liberara el ADN vírico del ADN plasmídico.

II. Construcción del vector AE1 ChAd63

El vector ChAd63 se construyó mediante recombinación homóloga en la cepa de E. coli BJ5183. Las células BJ5183 se cotransformaron con ADN vírico purificado de ChAd63 y pARS-ChAd63RLD-EGFP se digirió con AscI. La recombinación homóloga entre genes pIX, las secuencias de ADN de ITR derecha presentes en los extremos de pARS-ChAd63RLD-EGFP linealizado y el ADN genómico vírico permitieron su inserción en el vector plasmídico, delecionando al mismo tiempo la región de E1 que fue sustituida por el casete de expresión de EGFP.

III. Deleción de la región de E3 y construcción del vector ChAd63NSmut

Para introducir la deleción de toda la región de E3 en la cadena principal del vector ChAd63, las dos regiones de ADN que flanquean los genes E3 se amplificaron por PCR obteniéndose dos fragmentos de ADN. Un fragmento de 567 pb que abarcaba desde el nt 26665 al nt 27207 (3' del gen pVIII, corriente arriba de la región de E3) y un fragmento de ADN de 563 pb que contenía el extremo 3' del gen de fibra (pb 31788 a pb 32326, corriente abajo de la región de E3). Se introdujeron sitios de restricción PacI en el extremo 3' del primer fragmento de ADN y en el extremo 5' del segundo fragmento. Los dos fragmentos de PCR se digirieron con PacI y se unieron mediante ligamiento in vitro. El fragmento de ADN obtenido (1112 pb) se amplificó posteriormente utilizando los oligonucleótidos directo pVIII e inverso de fibra.

El fragmento de ADN de 1112 pb que contenía las regiones flanqueantes de ADN 3' y 5' de la región de E3 unidas se recombinó con pChAd63AE1/EGFP linealizado con Hpal (corte dentro de la región de E3 a 30168 pb en ChAd63 de tipo silvestre) mediante la cotransformación de células BJ5183, introduciendo así la deleción de E3. El producto final de recombinación fue el plásmido preadeno pChAd63AE1,E3/EGFP.

El casete de expresión de la región NS del VHC basado en el promotor del citomegalovirus humano (HCMV) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (poliA de Bgh) se construyó como se describe en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588 y se insertó en el vector pChAd63AE1,E3/EGFP mediante recombinación homóloga en la cepa de E. coli BJ5183 aprovechando las homologías entre las secuencias de ADN de HCMV y poliA de Bgh generando así ChAd63NSmut.

IV. Deleción de la región de E4 e inserción de E4orf6 de Ad5

Con el fin de sustituir la región de E4 de ChAd63 por E4orf6 de Ad5, E4orf6 de Ad5 se introdujo en pARS-ChAd63RLD-EGFP corriente abajo que contenía los 428 pb del extremo derecho del genoma de ChAd63 (pb 36216 a pb 36643). Posteriormente, se introdujo un fragmento de ADN de 200 pb derivado del extremo 3' de fibra y que incluía la poliA de E4 (de pb 33624 a pb 33823 del mapa de ChAd63) corriente abajo de Ad5E4orf6 generando el plásmido pARSChAd63Ad5E4orf6-2. Finalmente, un fragmento de ADN de pARSChAd63Ad5E4orf6-2 que contenía en los límites el extremo 3' de fibra/poliA de E4 y el izquierdo de ChAd63 se introdujo por recombinación homóloga en pChAd63 AE1,E3/EGFP digerido con la enzima de restricción Pmel (liberación de ADN vírico del ADN plasmídico) mediante cotransformación de la cepa de E. coli BJ5183, generando así pChAd63 AE1,3,4 Ad5orf6 EGFP.

Siguiendo esta estrategia, se delecionó toda la región codificante de E4 de ChAd63 y se sustituyó por el gen Ad5E4orf6 clonado 131 pb corriente abajo de la señal TATA de E4 putativa bajo el control del promotor de E4 de ChAd63.

Ejemplo 4: Expresión de ChAd3NSmut (SEQ ID NO: 13)

Se comprobó la expresión de proteínas del VHC en ChAd3NSmut mediante técnicas similares a las líneas descritas en Catalucci et al., Journal of Virology 79: 6400-6409, 2005. Se infectaron células HeLa con ChAd3NSmut y MRKAd6NSmut. MRKAd6NSmut está descrito por Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588. Los extractos celulares se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia con un anticuerpo monoclonal anti-NS5A. Como se muestra en la Figura 8, las proteínas del VHC son expresadas por ChAd3 NSmut de forma similar al vector humano basado en Ad6 (MRKAd6NSmut).

Ejemplo 5: Estabilidad de ChAd3NSmut (SEQ ID NO: 13)

Se comprobó la estabilidad genética de ChAd3NSmut mediante técnicas similares a las líneas descritas en Catalucci et al., Journal of Virology 79:6400-6409, 2000. Se realizó un análisis de restricción del ADN vírico extraído de 5 clones independientes (en el pasaje 10). Se incluyó el plásmido ChAd3 NSmut como control positivo. ChAd3NSmut fue genéticamente estable durante el pasaje en células PerC.6.

Ejemplo 6: ChAd3NSmut (SEQ ID NO: 13) y ChAd63NSmut (SEQ ID NO: 17) indujeron CMI en ratones

La capacidad de ChAd3NSmut y ChAd63NSmut para inducir inmunidad mediada por células se analizó en ratones C57/B6 utilizando técnicas según las líneas descritas en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588. La Figura 9 muestra una comparación de la capacidad de ChAd3NSmut (SEQ ID NO: 13), ChAd63NSmut (SEQ ID NO: 17) y MRKAd6NSmut para inducir una inmunidad mediada por células en ratones C57/B6. La Figura 9 muestra un experimento por ELIspot de IFN-^y (con un péptido H₂Kb restringido, mapeado en la proteasa NS3), realizado 3 semanas después de la inyección (los datos se muestran como promedio; N=5). La CMI es provocada en ratones a 108 y 109 dosis por ChAd3NSmut y ChAd63NSmut es comparable a MRKAd6NSmut.

Ejemplo 7: CMI inducida por ChAd3NSmut y ChAd63NSmut en Rhesus.

La capacidad de ChAd3NSmut (SEQ ID NO: 13) y ChAd63NSmut (SEQ ID NO: 17) para inducir una CMI se confirmó en primates no humanos inmunizando macacos rhesus utilizando técnicas según las líneas descritas en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588 y Cirillo et al. Publicación Internacional Número WO 2005/071093. Los vectores se evaluaron en un grupo de tres monos inmunizados con un régimen de estabilización/refuerzo heterólogo basado en la inyección en serie de tres vectores diferentes de reactividad no cruzada. Los tres animales fueron estabilizados con dos inyecciones de ChAd3NSmut a la dosis de 1010 vp/mono en las semanas 0 y 4, seguido de inyecciones de MRKAd6NSmut en la semana 22 y de ChAd63NSmut en la semana 42. En la Figura 11 se indica la evolución temporal de la respuesta inmunitaria medida mediante ELISPOT de IFN-y, expresada como la suma de las respuestas observadas en los diferentes grupos de péptidos NS del VHC en cualquier punto temporal. Los resultados mostraron que se obtuvo una estabilización eficaz en todos los animales mediante la inyección de ChAd3NS y que la CMI puede reforzarse intensamente mediante la administración tanto de MRKAd6NSmut como de ChAd63NSmut.

Ejemplo 8: Construcción de ADN plasmídico que codifica un polipéptido quimérico del VHC (SEQ ID NO: 1)

El plásmido que codifica un polipéptido quimérico del VHC que contiene una región NS3-4A basada en 3a de VHC y una región NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B basada en 1b VHC, denominado en el presente documento pVIJnsNSOPTmut 3a-1b (Figuras 12 y 13), se obtuvo mediante recombinación homóloga en la cepa de E. coli BJ5183.

Se generó sintéticamente un plásmido que codifica una NS3-4a totalmente optimizada por codones de 3a del VHC con una secuencia óptima de iniciación de la traducción (Kozak) y un codón de inicio de metionina fusionado con el primer aminoácido de la secuencia NS3 madura. La secuencia codificante NS3-4a está flanqueada por dos regiones de recombinación para la inserción en el plásmido aceptor pV1JnsNSOPTmut (Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588) homóloga a la secuencia Intrón A y al principio de la secuencia codificante NS3 (1b del VHC). Se introdujeron sitios de restricción HindIII en ambos extremos de la nueva secuencia NS3-4a para la escisión del inserto a partir del plásmido original.

El plásmido pV1JnsOPTmut se linealizó mediante la digestión del sitio único HpaI. El plásmido pV1JnsOPTmut linealizado y el inserto NS3-4a (3a) digerido con HindIII se cotransformaron en la cepa bacteriana BJ5183, para generar pV1JnsNSOPTmut 3a-1b. La estructura genética mostrada en la Figura 13 del pV1JnsNSOPTmut 3a-1 b resultante se verificó mediante análisis de enzimas de restricción y secuencias de ADN.

Ejemplo 9: El ADN plasmídico que codifica un polipéptido quimérico del VHC induce CMI en ratones

Se analizó en ratones la capacidad de un ADN plasmídico que codifica un polipéptido quimérico del VHC para inducir inmunidad mediada por células frente a diferentes genotipos del VHC. El polipéptido quimérico (SEQ ID NO: 1) contenía una región NS3-4A basada en 3a VHC y una región NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B basada en 1b del VHC (pV1Jns-NSOPTmut 3a-1b).

Se inyectaron por vía intramuscular tres cepas diferentes de ratones (dos consanguíneas: Balb/c, C57B1/6 y una no consanguínea: CD1) con 50 μg de ADN seguido de impulsos eléctricos. Cada animal recibió dos dosis del plásmido quimérico (pV1Jns-NSOPTmut 3a-1b) o del plásmido pV1Jns-NSOPTmut (Emini et al., Publicación Internacional Número w O 03/031588) que codifica una región NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B basada en 1b VHC. La CMI específica para proteínas víricas de 1b y 3a del VHC se midió utilizando técnicas descritas en Emini et al., Publicación Internacional Número WO 03/031588. La Figura 14 muestra el número de linfocitos T que secretan IFN-^y (expresado como células formadoras de manchas por millón de esplenocitos) en respuesta a la proteína NS3 de 1b y 3a del VHC en ratones CD1 (cepa no consanguínea). La respuesta específica de los linfocitos T contra la proteína NS3 de 1b es similar con ambos plásmidos, mientras que la construcción quimérica induce una mayor respuesta contra la proteína NS3 de 3a (p=0,04 mediante la prueba de la T de Student). La CMI inducida en las dos cepas consanguíneas de ratones (Balb/c y C57B1/6) en respuesta a la proteína NS3 de 1b y 3a del VHC fue similar con ambas construcciones.

Las realizaciones se incluyen en las siguientes reivindicaciones.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un adenovector recombinante que comprende:

a) un casete de expresión que codifica un polipéptido del VHC, en donde dicho polipéptido del VHC comprende NS3-NS4A-NS4B-NS5A del VHC; y

b) un genoma de adenovirus que contiene una deleción de E1, una deleción de E3, y una deleción de E4 opcional; siempre que dicho genoma codifique:

i) una región de hexón con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11;

ii) una región de fibra con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y

iii) una región de pentón con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 7, o

i) una región de hexón con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 5;

ii) una región de fibra con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 3; y

iii) una región de pentón con una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95 % con la SEQ ID NO: 7,

en donde dicho casete de expresión se ubica en la deleción de E1 o E3.

2. El vector de la reivindicación 1, en donde dicho vector comprende un ácido nucleico que consiste en una secuencia nucleotídica que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 13.

3. El vector de la reivindicación 1, en donde dicho vector comprende un ácido nucleico que consiste en una secuencia nucleotídica que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 17.

4. El vector de la reivindicación 2, en donde dicho vector consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13.

5. El vector de la reivindicación 3, en donde dicho vector consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 17.

6. El adenovector recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el casete de expresión codifica un polipéptido del VHC que tiene al menos el 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16.

7. El adenovector recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso como una vacuna contra el VHC.