ES2387141T3 - Composición que comprende la proliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5B del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y su utilización terapéutica - Google Patents

Composición que comprende la proliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5B del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y su utilización terapéutica Download PDF

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Abstract

Principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:- una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como unpolipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 delvirus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitisC; y- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 delvirus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión quecomprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C, así comolos medios necesarios para su expresión,para su utilización en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de la infección persistente por VHC ocáncer hepático en pacientes infectados con VHC, o para disminuir o ralentizar la inflamación hepática, la esteatosiso la fibrosis asociada a la infección por VHC, en el que el tratamiento comprende por lo menos tres administracionessecuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.

Description

Composición que comprende la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y su utilización terapéutica.
La presente invención se define en las reivindicaciones, y se refiere al campo de la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra el virus de la hepatitis C (VHC). Se refiere en particular a una nueva composición que contiene una poliproteína que corresponde a las dos proteínas colineales NS3 y NS4 (denominadas en adelante poliproteína NS3/NS4) y un polipéptido constituido por NS5b, los vectores, tales como adenovirus o poxvirus, capaces de expresar esta composición y su utilización como vacuna.
La hepatitis C es la causa principal de las hepatitis adquiridas por transfusión. La hepatitis C se puede transmitir asimismo por otras vías percutáneas, por ejemplo por inyección de drogas por vía intravenosa. Además, el riesgo de contaminación de los profesionales de la salud no es despreciable. La transmisión sexual ya ha sido descrita.
La hepatitis C se distingue de las demás formas de enfermedades del hígado asociadas a virus, tales como la hepatitis A, B o D. Las infecciones por el virus de la hepatitis C (VHC o HCV) son mayoritariamente crónicas, dando como resultado enfermedades del hígado, tales como hepatitis, cirrosis y carcinoma en un gran número de casos (5 a 20%) y representan en los países desarrollados 30% de los transplantes hepáticos.
Aunque el riesgo de transmisión del virus por transfusión haya disminuido por el establecimiento de ensayos de cribado en los años 1990, la frecuencia de nuevas infecciones por la hepatitis C sigue siendo elevada. A título de ejemplo, un estudio reciente indica que existen todavía en la actualidad 10.000 a 15.000 nuevos casos de infección por año en Francia (S. Deuffic et al., Hepatology 1999; 29: 1596-1601). Actualmente, aproximadamente 170 millones de personas en todo el mundo están infectadas de manera crónica por el VHC (Hepatitis C: Global prevalence (actualización), 2000, Weekly Epidermiological Record, Vol. 75(3)). Las poblaciones con riesgo elevado son principalmente el personal hospitalario y los usuarios de drogas intravenosas, pero existen donantes de sangre asintomáticos que no pertenecen a estos grupos de riesgo elevado y en los que se han encontrado anticuerpos anti-VHC circulantes. Para estos últimos, no se ha identificado todavía la vía de infección. Existen por lo tanto unas infecciones por VHC (estimación de entre 5 y 10%), denominadas infecciones esporádicas, cuya etiología no se conoce y que no pueden ser controladas.
El VHC ha sido el primer virus hepatótropo aislado por medio de técnicas de biología molecular. Las secuencias del genoma vírico fueron clonadas antes de que la partícula vírica fuese visualizada.
El VHC pertenece a un nuevo género de la familia de las Flaviviridae, los hepacivirus. Es un virus de ARN monocatenario positivo, de 9,5 kb, que se replica mediante una copia de ARN complementario, y cuyo producto de traducción es un precursor poliproteico de aproximadamente 3.000 aminoácidos. El extremo 5’ del genoma del VHC corresponde a una región no traducida adyacente a los genes que codifican para las proteínas estructurales, la proteína nuclear de la nucleocápside, las dos glicoproteínas de cubierta, E1 y E2, y una pequeña proteína denominada p7. La región no traducida 5’ y el núcleo génico están relativamente bien conservados en los distintos genotipos. Las proteínas de cubierta E1 y E2 están codificadas por regiones que son más variables de un aislado a otro. La proteína p7 es una proteína extremadamente hidrófoba que constituiría un canal iónico. El extremo 3’ del genoma del VHC contiene los genes que codifican para las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4, NS5) y para una región 3’ no codificante que posee un dominio bien conservado (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, junio de 1997, 25(6):1527-1538).
En la actualidad, la terapia más eficaz para el tratamiento de la hepatitis C asocia el interferón pegilado y la ribavirina (Manns MP et al., The Lancet, 22 de septiembre de 2001, Vol. 358, 958-965). Mientras que esta terapia es particularmente eficaz en el caso de pacientes infectados por cepas víricas que pertenecen a los genotipos 2 y 3, ésta tiene solamente un efecto limitado sobre los genotipos 1a, 1b y 4 (Manns MP, obra citada). Menos del 50% de los pacientes tratados resultan unos “respondedores a largo plazo”. Por otra parte, esta terapia es una intervención costosa (10.000 a 15.000 euro/paciente/año) y está asociada con unos efectos tóxicos. De hecho, 5 a 10% de los pacientes están obligados a interrumpir el tratamiento antes del final.
Por lo tanto, es necesario desarrollar una composición vacunal que tiene como diana todos los genotipos.
Varios estudios muestran que el control de una infección debida al VHC, ya sea naturalmente (“resolución espontánea”) o bien después del tratamiento (“resolución terapéutica”), está asociada a la inducción o la potencialización de respuestas inmunitarias mediadas celularmente, implicando los linfocitos T-CD4+ y T-CD8+ (tal como se describe, por ejemplo, en LECHNER, F. et al., Eur. J. Immunol., 30:2479-2487 (2000) y en Thimme R. et al., 2001, J. Exp. Med., 194(10): 1395-1406).
Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, también denominado HLA en seres humanos) son denominadas de clase I o de clase II. Las moléculas de clase I se expresan en la casi totalidad de las células nucleadas y son capaces de presentar epítopos o péptidos a los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Las moléculas
de clase II son capaces de presentar epítopos a las células T CD4+, pero su expresión está restringida a las células presentadoras de antígeno.
Las vacunas contra el virus de la hepatitis C previstas actualmente se basan en la utilización de proteínas recombinantes adyuvantes, de péptidos, de vectores de expresión entre los cuales se pueden citar los vectores de origen vírico o bacteriano o de ADN desnudo. En este caso, se usa una o más proteínas víricas o uno o más genes que codifican estas proteínas víricas.
Cuando se seleccionan varias proteínas víricas o uno o más genes que codifican estas proteínas víricas, están frecuentemente constituidas por una parte o por todas las proteínas estructurales (Makimura et al., 1996, Vaccine,
14: 28-34; Fournillier A., et al, 1999, J. Virology, 73: 7497-7504), o bien por proteínas no estructurales individuales o que comprenden por lo menos dos proteínas contiguas (Brinster et al., 2001, Hepatology, 34: 1206-1217), o bien por una mezcla de proteínas estructurales y no estructurales (Pancholi et al., 2003, J. Virology, 77:382-390).
La solicitud de patente WO 99/38880 describe el uso de tres genes que codifican separadamente las tres proteínas NS3, NS4 y NS5 (a y b) en una composición vacunal que comprende tres vacunas ADN que expresan cada una separadamente estas tres proteínas. Los autores muestran en ratones la inducción de linfocitos T específicos de los tres antígenos. Sólo la vacuna que expresa NS5a y b ha sido ensayada in vivo en un ensayo de protección.
La solicitud de patente WO 01/30812 describe el uso de una proteína de fusión constituida por las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5a, llegado el caso en asociación con la proteína no estructural NS5b. Los autores han indicado que esta combinación permitía activar las células T específicas de VHC. Esta solicitud de patente describe simplemente la capacidad de formulaciones vacunales (tipo ADN desnudo, adenovirus recombinante o virus de la vacuna recombinante) que expresan la proteína de fusión NS3, NS4 y NS5a o la proteína NS5a para inducir unas respuestas inmunitarias específicas mediadas por linfocitos T específicos.
El documento WO04/111082 describe que una combinación particular de las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5b, siendo NS3 y NS4 expresadas de manera colineal, tuvo un mejor poder inmunógeno y protector superior al obtenido con una vacuna que también incluye, además de estas proteínas no estructurales, la proteína NS5a y/u otras proteínas estructurales del VHC tal como core, E1 o E2, y tuvo un efecto sobre la capacidad de las células que proceden de pacientes infectados por cepas víricas para inducir respuestas inmunitarias específicas.
La presente invención ha identificado un uso optimizado de la combinación particular descrita en el documento WO04/1110 para la administración a un sujeto infectado por VHC para proporcionar una estimulación eficaz de una respuesta inmunitaria contra el VHC y una respuesta biológica sostenida para el tratamiento de patologías asociadas con VHC.
De este modo, se describe en la presente memoria un principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:
-
una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C; y
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión; para su utilización en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C,
-
siendo su administración tal que proporcione una exposición a dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo que es
(a)
continua, o por lo menos una vez al día, durante un período de un día,
(b)
descontinuar después dicha administración por medio de una falta continua de tratamiento o una falta de tratamiento durante días consecutivos durante un período de 3 a 10 días, y
(c)
repetir por lo menos dos veces el patrón de administración (a) y descontinuación de la administración (b), para lograr o mantener una respuesta biológica sostenida en el sujeto,
-
correspondiendo dicho patrón de repetición de administración y descontinuación de la administración preferentemente a por lo menos 3 administraciones secuenciales, preferentemente separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
La invención proporciona un principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por: 5
-
una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C; y
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión que
15 comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión,
para su utilización en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de patologías asociadas con VHC, preferentemente infección persistente por VHC o cáncer hepático en pacientes infectados por VHC, o para disminuir
o ralentizar la inflamación hepática, esteatosis o fibrosis asociada con infección por VHC, en el que el tratamiento comprende por lo menos 3 administraciones secuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
También se describe un principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por: 25
-
una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C; y
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión que
35 comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión, para su utilización en una cantidad terapéuticamente eficaz para estimular una respuesta inmunitaria celular específica para VHC de dicho sujeto en el tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C, siendo su administración tal que proporcione una exposición a dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo que es
(a)
continua, o por lo menos una vez al día, durante un período de un día,
(b)
descontinuar después dicha administración por medio de una falta continua de tratamiento o una falta de
tratamiento durante días consecutivos durante un período de 3 a 10 días, y 45
(c) repetir por lo menos dos veces el patrón de administración (a) y descontinuación de la administración (b), para lograr o mantener una respuesta inmunitaria celular sostenida en el sujeto,
-
correspondiendo dicho patrón de repetición de administración y descontinuación de la administración preferentemente a por lo menos 3 administraciones secuenciales, preferentemente separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
También se describe una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, para su utilización para estimular una respuesta inmunitaria celular específica para VHC de dicho sujeto en
55 el tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C, en el que dicho tratamiento comprende por lo menos 3 administraciones secuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
Un objeto de la invención es también una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:
-
una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;
65 - un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis
C; y
-
un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión,
para la administración secuencial de dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo para su utilización en el tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C, preferentemente infección persistente por VHC o cáncer hepático en pacientes infectados por VHC, o para disminuir o ralentizar la inflamación hepática, esteatosis o fibrosis asociada con infección por VHC, en particular en la forma de por lo menos 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días,
siendo dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo tal que está acondicionada preferentemente para 3 administraciones, más preferentemente en 3 viales diferentes, separándose preferentemente dichas administraciones entre sí por un período de tiempo que varía desde 3 a 10 días.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “un” y “una” se usan en el sentido de que significan “al menos un”, “al menos un primer”, “uno o más”, o “una pluralidad” de los compuestos o etapas citados, excepto que el contexto dicte otra cosa. Por ejemplo, la expresión “una célula” incluye una pluralidad de células, incluyendo una mezcla de las mismas.
El término “y/o”, siempre que se use en la presente memoria, incluye el significado de “y”, “o” y “todas o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.
La expresión “alrededor de” o “aproximadamente”, tal como se utilizan en la presente memoria, significa en 20%, preferentemente en 10%, y más preferentemente en 5% de un valor o intervalo dado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, cuando se use para definir productos, composiciones y métodos, la expresión “que comprende” quiere decir que los productos, composiciones y métodos incluyen los componentes o etapas citados, pero sin excluir otros. “Que consiste esencialmente en” debería significar que excluye otros componentes o etapas de cualquier significación esencial. De este modo, una composición que consiste esencialmente en los componentes mencionados no excluiría contaminantes en trazas ni vehículos farmacéuticamente aceptables. “Que consiste en” debe significar que excluye más de elementos en trazas de otros componentes o etapas. Por ejemplo, un polipéptido “consiste en” una secuencia de aminoácidos cuando el polipéptido no contiene ningún aminoácido sino la secuencia de aminoácidos citada. Un polipéptido “consiste esencialmente en” una secuencia de aminoácidos cuando tal secuencia de aminoácidos está presente junto con sólo unos pocos restos de aminoácidos adicionales, típicamente de alrededor de 1 a alrededor de 50 restos adicionales más o menos. Un polipéptido “comprende” una secuencia de aminoácidos cuando la secuencia de aminoácidos es por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos final del polipéptido. Tal polipéptido puede tener unos pocos hasta varios cientos de restos de aminoácidos adicionales. Tales restos de aminoácidos adicionales pueden desempeñar un papel en el tráfico de polipéptidos, facilitar la producción o purificación de polipéptidos, prolongar la semivida, entre otros. Lo mismo se puede aplicar para las secuencias nucleotídicas.
La presente descripción propone por lo tanto un nuevo principio activo y una nueva composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición peptídica constituida por una poliproteína NS3/NS4 y por un polipéptido NS5b del VHC o vector o vectores de expresión del mismo, principio activo o composición la cual tiene la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria mediada por células específica del VHC, de manera que sea útil en el campo de la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra el virus de la hepatitis C.
La poliproteína NS3/NS4 de la composición peptídica en uso en la invención está constituida por la proteína NS3 y por la proteína NS4a y b, sin interrupción en la secuencia peptídica, tal como en la poliproteína nativa. En efecto, tal como se ha indicado anteriormente, el genoma del VHC contiene un solo marco de lectura abierto que está transcrito en una poliproteína. Esta poliproteína del VHC puede ser escindida para producir por lo menos diez partes distintas, en el orden NH2-Core-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH.
Para guía general, la proteína NS3 es una proteína de 630 aminoácidos que aparece aproximadamente del aminoácido 1027 al aminoácido 1657 de la poliproteína. La proteína NS4, una proteína de 314 aminoácidos, aparece aproximadamente del aminoácido 1658 al aminoácido 1972 (numerando con respecto al VHC-1) (Choo et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 88:2451-2455). La poliproteína NS3/NS4 aparece por lo tanto aproximadamente del aminoácido 1027 al aminoácido 1972.
Con respecto al polipéptido NS5b contenido asimismo en la composición en uso en la invención, está constituido por 590 aminoácidos y aparece aproximadamente del aminoácido 2421 al aminoácido 3011 de la poliproteína (Choo et al., 1991, obra citada).
En aras de la claridad, los tramos de aminoácidos mencionados en la presente memoria en relación con las proteínas NS3, NS4 y NS5b se dan con respecto a sus posiciones en el precursor de la poliproteína de HCV-1 (como se describe por Choo et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455 o en GenBank con el número de acceso M62321). Sin embargo, la presente invención también comprende proteínas NS3, NS4 y NS5b de otras cepas y aislados de VHC, así como sus análogos o muteínas.
La proteína NS3 comprende dos dominios estructurales distintos, a saber, un dominio N-terminal provisto de una actividad proteásica con serina activa implicada en la maduración de la poliproteína vírica, y un dominio C-terminal que comprende una actividad helicasa asociada a una actividad NTPásica que ejerce un papel en la replicación del genoma viral.
Mediante las expresiones “poliproteína NS3/NS4” y “polipéptido NS5b” se hace referencia evidentemente a las poliproteínas y los polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos nativas, que proceden de cualquier cepa y aislado del VHC, así como sus análogos, muteínas y homólogos.
Mediante “análogos” o “muteínas” de la poliproteína y del polipéptido, se hace referencia a los derivados biológicamente activos de las moléculas de referencia que presentan la actividad deseada, a saber, la capacidad para estimular una respuesta inmunitaria mediadas por células tal como se ha definido anteriormente.
De manera general, el término “análogo” se refiere a compuestos que tienen una secuencia y una estructura polipeptídica nativa que presenta una o más adiciones, sustituciones (generalmente conservativas en términos de naturaleza) y/o supresiones de aminoácidos, con respecto a la molécula nativa, en la medida en que las modificaciones no destruyan la actividad inmunógena. Por el término “muteína” se entienden los péptidos que presentan uno o más elementos que imitan al péptido (“peptoides”), tales como los descritos en la solicitud de patente PCT WO91/04282. Preferentemente, el análogo o la muteína tiene por lo menos la misma inmunoactividad que la molécula nativa. Los procedimientos para preparar análogos y muteínas polipeptídicos son conocidos por el experto en la materia y se describen a continuación.
Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones de naturaleza conservadoras, es decir, las sustituciones que tienen lugar en una familia de aminoácidos. Específicamente, los aminoácidos están divididos generalmente en 4 familias, a saber, (1) los aminoácidos ácidos, tales como aspartato y glutamato, (2) los aminoácidos básicos, tales como lisina, arginina e histidina, (3) los aminoácidos no polares, tales como la alanina, la leucina, la isoleucina, la prolina, la fenilalanina, la metionina y el triptófano, y (4) los aminoácidos no cargados polares, tales como la glicina, la asparagina, la glutamina, la cisteína, la serina, la treonina y la tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, se puede predecir de manera razonable que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, de un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina, o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una relación estructural, no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. El experto en la materia determinará fácilmente las regiones de la molécula peptídica de interés que pueden tolerar un cambio haciendo referencia a las gráficas de Hopp/Woods y Kyte-Doolite, bien conocidas en la técnica.
Por la expresión “homología” se entiende el porcentaje de identidad entre dos moléculas peptídicas, tales como poliproteínas y polipéptidos. Dos secuencias de aminoácidos son “más o menos homólogas” entre sí cuando las secuencias presentan por lo menos 60%, preferentemente por lo menos 75%, más preferentemente por lo menos 80-85%, aún más preferentemente por lo menos 90%, y todavía más preferentemente por lo menos 95-98% o más de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas peptídicas.
De manera general, el término “identidad” se refiere a una correspondencia exacta de aminoácido por aminoácido de dos secuencias peptídicas. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de desemparejamientos entre las dos secuencias alineadas, dividiendo entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100. El porcentaje de identidad se puede determinar asimismo con la ayuda de programas de ordenador tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 1981, 5 Supl., 3: 482-489.
Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de un cierto número de cepas y de aislados del VHC, y en particular de la proteína NS3, de la proteína NS4 y del polipéptido NS5b, ya han sido determinadas.
Por ejemplo, el aislado HCV-J1 se describe en Okamoto H. et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20: 6410-6410. Las secuencias codificantes completas de dos aislados independientes del VHC, a saber, los aislados HCV-J y -BK, han sido descritas respectivamente en Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acda., Sci., 87:9524-9528 y en Takamizawa et al., 1991, J. Virol., 65: 1105-1113. Con respecto al aislado HCV-1, se describe en Choo et al., 1990, Brit. Med. Bull., 46: 423-441 y en Choo et al., 1991, obra citada. El aislado HVC-H ha sido descrito en Inchauspe G. et al; 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10292-10296. El aislado HCV-G9 ha sido descrito en Okamoto H., et al., 1994, J. Gen. Virol.,
45: 629-635. Los aislados HCV-J6 y -J8 han sido descritos respectivamente en Okamoto H., et al., 1991, J. Gen.
Virol., 72: 2697-2704 y Okamoto H., et al., 1992, Virology, 188: 331-341. El aislado HVC-BEBE1 ha sido descrito en Nako H., et al., 1996, J. Gen. Virol., 141: 701-704, y el aislado HCV-NZL1 ha sido descrito en Sakamoto M., et al., 1994, J. Gen. Virol., 75: 1761-1768. Con respecto al aislado HCV-Tr, se ha descrito en Chayama K., et al., 1994, J. Gen. Virol., 75: 3623-3628. Los aislados HCV-ED43 y -EUH1480 han sido descritos respectivamente en Chamberlain R.W., et al., 1997, J. Gen. Virol., 78:1341-1347 y Chamberlain RW., et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 236: 44-49. El aislado HCV-EUHK2 ha sido descrito en Adams A., et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 393-396. Los aislados HCV-VN235, -VN405 y -VN004 han sido descritos en Tokita H., et al, 1998, J. Gen. Virol., 79: 1847. Por último, con respecto a los aislados HCV-JK049 y -JKD46, han sido descritos en Tokita H. et al., 1996, J. Gen. Virol., 77: 293-301.
Las cepas y aislados del VHC, tal como se han ilustrado anteriormente, pueden presentar unos genotipos diferentes, a saber, genotipos 1a (aislados HCV-1, -J1 y -H), 1b (aislados HCV-J y BK), 1c (aislado HCV-G9), 2a (aislado HCV-J6), 2b (aislado HCV-J8), 2c (aislado HCV-BEBE1), 3a (aislado HCV-NZL1), 3b (aislado HCV-Tr), 4a (aislado HCV-ED43), 5a (aislado HCV-EUH1480), 6a (aislado HCV-EUHK2), 7b (aislado HCV-VN235), 8b (aislado HCV-VN405), 9a (aislado HCV-VN004), 10a (aislado HCV-JK049) y 11a (aislado HCV-JK046).
Ventajosamente, NS3 y/o NS4 y/o NS5b proceden de virus de genotipos diferentes. Por ejemplo, la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b se pueden originar a partir de virus de diferentes genotipos, por ejemplo originándose NS3/NS4 a partir de un genotipo 1b y NS5b a partir de un genotipo 4 o viceversa, o, como alternativa, originándose NS3/NS4 a partir de un genotipo 1a y NS5b a partir de un genotipo 1b o viceversa.
Según otra alternativa, NS3 y/o NS4 y/o NS5b proceden de virus del mismo genotipo, preferentemente de genotipo 1b. Una forma de realización preferida de la presente invención usa una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 así como un polipéptido NS5b que se origina a partir del genotipo 1b de la cepa JA de VHC (Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad., Sci. 87, 9524-9528). Más preferentemente, la poliproteína NS3/NS4 comprende,
o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 2, y/o el polipéptido NS5b comprende, o como alternativa consiste esencialmente, o como alternativa consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 4.
La poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b contenidos en la composición peptídica de utilización en la invención pueden ser de origen nativo o bien de origen recombinante.
La poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b de origen nativo se obtienen a partir de las cepas o aislados del VHC, a través del uso de cebadores oligonucleotídicos sintéticos que servirán para amplificar las secuencias víricas nativas, bien a partir de sueros de pacientes infectados por el o los genotipos víricos buscados o bien a partir de ARN vírico ya purificado, que procede por ejemplo de sangre o de hígado de pacientes, o de ADN complementario que está libre o se ha clonado previamente en un vector de expresión, o también de partículas víricas purificadas a partir de muestras biológicas o sistema de propagación in vitro.
La poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b de utilización en la invención también pueden ser de origen recombinante, y se pueden obtener mediante la técnica de ingeniería genética, que comprende las etapas siguientes:
-
cultivar un microorganismo o célula o células eucariotas transformados con la ayuda de una secuencia nucleotídica que codifica dicha poliproteína NS3/NS4 o dicho polipéptido NS5b, y
-
recuperar el péptido producido por dicho microorganismo o dichas células eucariotas.
Esta técnica es bien conocida por el experto en la materia. Para más detalles sobre ella, se podrá hacer referencia al trabajo siguiente: Recombinant DNA Technology I, Editores Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York Academy of Sciences, Volumen 646, 1991.
Las secuencias nucleotídicas que codifican la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b se pueden preparar mediante síntesis química conjuntamente con un enfoque de ingeniería genética o mediante ingeniería genética sola, utilizando las técnicas bien conocidas por un experto en la materia y descritas por ejemplo en Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Las secuencias nucleotídicas que codifican la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b se pueden insertar en un sistema de expresión adecuado, a fin de obtener la composición peptídica o el vector o vectores de expresión usados según la presente invención.
La expresión “vector de expresión”, como se usa en la presente memoria, se refiere a vectores víricos así como no víricos, incluyendo vectores extracromosómicos (por ejemplo plásmidos de múltiples copias) y vectores integrantes diseñados para ser incorporados en el cromosoma o cromosomas del hospedante. Particularmente importantes en el contexto de la invención son los vectores para su utilización en terapia génica que son capaces de suministrar las secuencias nucleotídicas que codifican NS3/NS4 y NS5b a un organismo hospedante, así como vectores de
expresión para su utilización en diversos sistemas de expresión. Cuando se hace referencia a un “vector vírico”, esta expresión comprende cualquier vector que comprenda por lo menos un elemento de origen vírico, incluyendo un genoma vírico completo, una porción del mismo o un genoma vírico modificado como se describe a continuación, así como partículas víricas generadas del mismo (por ejemplo vector vírico empaquetado en una cápside vírica para producir partículas víricas infecciosas).
Por supuesto, las secuencias nucleotídicas se pueden insertar en un solo vector de expresión o en dos vectores de expresión diferentes. En este último caso, la secuencia que codifica la poliproteína NS3/NS4 se inserta en uno de los dos vectores, y la secuencia que codifica el polipéptido NS5b se inserta en el otro vector, siendo estos dos vectores de naturaleza idéntica o diferente.
El vector o vectores de expresión para su utilización según la presente invención comprende(n) una secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 y una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5b, así como los medios necesarios para su expresión.
Se entiende por medio necesario para la expresión de un péptido, siendo el término péptido usado para cualquier molécula peptídica, tal como proteína, poliproteína, polipéptido, etc., cualquier medio que permite obtener el péptido, tal como en particular un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación y un marcador de selección.
Los medios necesarios para la expresión de un péptido están relacionados de manera operacional con la secuencia nucleotídica que codifica el péptido de interés. Por “relacionados de manera operacional” se entiende una yuxtaposición de dichos elementos necesarios para la expresión y del gen que codifica el péptido de interés, los cuales están en una relación tal que es posible que funcionen de manera esperada. Por ejemplo, pueden existir bases adicionales entre el promotor y la secuencia nucleotídica en la medida en que se conserve su relación funcional.
Los medios necesarios para la expresión de un péptido pueden ser medios homólogos, es decir, incluidos en el genoma del vector usado, o heterólogos. En este último caso, dichos medios están clonados con el péptido de interés a expresar.
Los ejemplos de promotores heterólogos incluyen (i) los promotores víricos tales como el promotor SV40 (virus del simio 40), el promotor del gen de la timidina cinasa del virus del herpes simple (TK-HSV-1), la LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor primero inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor tardío mayor adenovírico (MLP), así como (ii) cualquier promotor celular que controle la transcripción de los genes que codifican péptidos en eucariotas superiores, tal como el promotor constitutivo del gen de fosfoglicerato cinasa (PGK) (Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74), el promotor de los genes específicos del hígado alfa-1 antitripsina y FIX, y el promotor SM22 específico de las células del músculo liso (Moessler et al., 1996, Development, 122: 2415-2425).
Según una alternativa, las secuencias nucleotídicas que codifican dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b proceden de genotipos diferentes.
Según otra alternativa, las secuencias nucleotídicas que codifican dicha poliproteína y dicho polipéptido proceden de un virus del mismo genotipo, preferentemente el genotipo 1b. En una forma de realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en la secuencia como se muestra en SEC ID nº: 1, y la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5b comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en una secuencia como se muestra en SEC ID nº: 3.
En este caso también, por “secuencia nucleotídica” se entienden todas las secuencias que codifican la poliproteína nativa NS3/NS4 y el polipéptido nativo NS5b, así como sus análogos, muteínas y homólogos, como se definen anteriormente.
Dichas secuencias contenidas en el vector de expresión pueden estar relacionadas directamente entre sí bajo el control de un solo promotor y/o de un solo elemento regulador de la expresión, o pueden estar separadas, estando cada una bajo la dependencia de promotores y/o reguladores de la expresión independientes, idénticos o diferentes.
Como vectores de expresión que son adecuados en el contexto de la invención, se pueden citar por ejemplo los plásmidos, los vectores víricos de tipo adenovirus, los poxvirus, los virus de la vacuna, los baculovirus, los vectores bacterianos de tipo salmonela, y BCG.
Los adenovirus han sido detectados en numerosas especies animales, no se integran y son sólo ligeramente patógenos. Son capaces de infectar una variedad de tipos celulares, células en división y células en reposo. Poseen un tropismo natural para los epitelios bronquiales. Además, se han usado como vacunas entéricas vivas durante numerosos años con un excelente perfil de seguridad. Por último, se les puede hacer crecer fácilmente y purificarlos en grandes cantidades. Estas características han hecho que los adenovirus sean particularmente apropiados para
su utilización como vectores de expresión y en particular como vectores de terapia génica con fines terapéuticos y vacunales.
Según una forma de realización preferida, el vector de utilización en la invención es un adenovirus.
Los ejemplos de adenovirus que se deben utilizar en la presente invención pueden derivar de cualquier fuente de origen humano o animal, en particular de origen canino (por ejemplo CAV-1 o CAV-2; referencia Genbank CAV 1 GENOM y CAV77082, respectivamente), de origen aviar (referencia Genbank AAVEDSDNA), de origen bovino (tal como BAV3, Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol., 72: 1394-1402), de origen ovino, felino, porcino, de origen simio,
o de uno de sus híbridos. Se puede usar cualquier serotipo. Sin embargo, se prefieren los adenovirus de origen humano y en particular el adenovirus 5 (Ad5), adenovirus 2 (Ad2) y adenovirus 35 (Ad35).
De manera general, los virus citados están disponibles en las colecciones ATCC y han sido objeto de numerosas publicaciones que describen su secuencia, su organización y su biología, lo cual permite que el experto en la materia los aplique fácilmente. Por ejemplo, la secuencia del adenovirus de tipo 5 se describe en la base de datos Genbank (M73260 y M29978), y se incorpora en la presente memoria a título de referencia.
El genoma de los adenovirus está constituido por una molécula de ADN lineal bicatenario de aproximadamente 36 kb que contiene más de aproximadamente 30 genes necesarios para terminar el ciclo vírico. Los primeros genes están divididos en 4 regiones dispersas en el genoma del adenovirus (E1 a E4). Las regiones E1, E2 y E4 son esenciales para la replicación vírica. La región E3 está considerada como una región no esencial en base a la observación de que los virus mutantes aparecen naturalmente o los virus híbridos que han perdido esta región E3 continúan replicándose como virus de tipo salvaje en células cultivadas (Kelly y Lewis, 1973, J. Virol., 12:643-652). Los últimos genes (L1 a L5) codifican en su mayoría las proteínas estructurales que constituyen la cápside vírica. Solapan por lo menos en parte las primeras unidades de transcripción y son trascritos a partir de un promotor único (MLP). Además, el genoma adenovírico contiene en los dos extremos de las regiones que acúan en cis esenciales para la replicación del ADN, respectivamente las repeticiones terminales invertidas 5’ y 3’ (ITR) y una secuencia de empaquetamiento.
Los adenovirus usados actualmente en los protocolos de terapia génica están desprovistos de la mayoría de la región E1, lo cual hace que los virus sean deficientes a nivel de su replicación para evitar su diseminación en el entorno y en el organismo hospedante. Además, la mayoría de los adenovirus están desprovistos asimismo de la región E3, con el fin de incrementar su capacidad de clonación. La factibilidad de la transferencia génica usando estos vectores ha sido demostrada en una variedad de tejidos in vivo (véase por ejemplo Yei et al., 1994, Hum. Gene Ther., 5: 731-744; Dai et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92: 1401-1405; US nº 6.099.831; y US nº 6.013.638).
Preferentemente, los promotores usados en los adenovirus como vectores de expresión son unos promotores heterólogos tales como los promotores CMV y SV40.
Preferentemente también, el promotor CMV es el promotor de la poliproteína NS3/NS4, y el vector de expresión comprende como secuencia nucleotídica que codifica dicha poliproteína el casete de expresión CMV-NS3/NS4.
Por “casete de expresión” se entiende una secuencia de ADN que contiene un promotor y un marco de lectura abierto para la expresión del péptido de interés, a insertar en un vector.
Preferentemente también, el promotor SV40 es el promotor del polipéptido NS5b, y el vector de expresión comprende como secuencia nucleotídica que codifica dicho polipéptido el casete de expresión SV40-NS5b.
Según una forma de realización de la invención, el genoma del adenovirus está modificado para sustituir la región E1 por el casete de expresión CMV-NS3/NS4 y sustituir la región E3 por el casete de expresión SV40-NS5b.
Los métodos de supresión y de inserción de secuencias de ADN en vectores de expresión son ampliamente conocidos por el experto en la materia y consisten en particular en etapas de digestión enzimática y ligación o recombinación homóloga (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70,4805-4810).
Otro vector de expresión particularmente apropiado en el contexto de la invención es un poxvirus, que constituye otra forma de realización de la invención.
Los poxvirus constituyen un grupo de virus complejo con cubierta, que difieren principalmente en su morfología inhabitual, su gran genoma de ADN y su sitio citoplásmico de replicación. El genoma de varios elementos de los poxviridae, que comprende la cepa Copenhagen del virus de la vacuna (VV) (Goebel et al., 1990, Virol. 179: 247-266 y 517-563) y la cepa Ankara del virus de la vacuna modificado (MVA) (Antoine et al, 1998, Virol., 244:635-396), ha sido cartografiado y secuenciado. La cepa VV posee un genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 192 kb que codifica aproximadamente 200 proteínas, de las cuales aproximadamente 100 están implicadas en el ensamblaje del virus. La cepa MVA es una cepa del virus de la vacuna muy atenuada, generada por más de 500
pasadas en serie de la cepa Ankara del virus de la vacuna (CVA) sobre fibroblastos de embriones de pollo (Mayr et al., 1975, Infection, 3: 6-16). El virus MVA ha sido depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) con el número I-721. La determinación de la secuencia completa del genoma del MVA y la comparación con el del VV permite la identificación precisa de las alteraciones que han aparecido en el genoma vírico y la definición de siete supresiones (I a VII) y de numerosas mutaciones que conducen a marcos de lectura abiertos fragmentados (Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396).
Otros ejemplos de poxvirus que son apropiados en el contexto de la invención comprenden el pox del canario, el pox de aves de corral, el pox de vaca, el entomopox, el pox de simio, el pox de cerdo y el pox de pingüino.
El poxvirus se encuentra en dos formas morfológicamente distintas, denominadas virus maduro intracelular (IMV) y virus extracelular recubierto (EEV).
El poxvirus usado como vector de expresión de la invención presenta por lo menos una de las características siguientes, consideradas solas o en asociación:
(i)
el poxvirus es un virus MVA,
(ii)
el poxvirus está en la forma morfológica IMV, y
(iii) el genoma del poxvirus se modifica a fin de insertar el casete de expresión NS3/NS4 e insertar el casete de expresión NS5b.
Preferentemente, los promotores usados en vectores poxvíricos como vectores de expresión son promotores homólogos (por ejemplo de origen poxvírico). Los ejemplos representativos incluyen, sin limitación, los promotores vacunales 7.5K, H5R, TK, p28, p11 y K1L, promotores quiméricos entre los promotores poxvíricos tempranos y tardíos, así como promotores sintéticos tales como los descritos en Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 10941097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) y Kumar y Boyle (1990, Virology 179, 151-158). Cuando el genoma del poxvirus se modifica para insertar los dos casetes de interés, los medios necesarios para su expresión son ambos homólogos. Así, en el caso en el que se use el virus MVA, la expresión de NS3/NS4 puede estar por ejemplo bajo el control del promotor ph5r, de manera que el casete de expresión correspondiente es ph5r-NS3/NS4, y la expresión de NS5b puede estar por ejemplo bajo el control del promotor p7.5, de manera que el casete de expresión correspondiente es p7.5-NS5b, y viceversa. Los casetes de expresión se pueden insertar en la misma localización o en una localización diferente en el genoma poxvírico. En una realización preferida, los casetes de expresión ph5r-NS3/NS4 y p7.5-NS5b se insertan ambos en la supresión II o en la supresión III de un genoma de MVA, con preferencia especial por la supresión III.
Según una forma de realización particular, cuando el genoma del poxvirus se modifica para insertar los dos casetes de interés, dichos dos casetes de expresión están orientados en la misma dirección.
Según otra forma de realización particular, están orientados en la dirección opuesta.
En este caso también, los casetes de expresión se insertan en el genoma del poxvirus de manera conocida por el experto en la técnica, tal como se ha indicado anteriormente.
Los vectores en uso en la invención pueden comprender asimismo secuencias necesarias para dianizar péptidos hacia compartimientos celulares particulares. Un ejemplo de dianización puede ser la dianización hacia el retículo endoplásmico obtenido usando secuencias de direccionamiento del tipo de secuencia líder procedente de la proteína E3 del adenovirus (Ciernik I.F., et al., The Journal of Immunology, 1999, 162, 3915-3925).
Pueden comprender asimismo secuencias necesarias para la dianización hacia las células dendríticas y para la dianización en la membrana de las células.
Los microorganismos y células eucariotas transformados por un vector de expresión se pueden usar, por ejemplo, para proporcionar los principios activos en uso según la invención.
A título de ejemplos de microorganismo que son adecuados en el contexto de la invención, se pueden citar las levaduras, tales como las de las familias siguientes: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarrowia, Schwantomyces, Zygosaccharomyces, prefiriéndose Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia pastoris y Kluveromyces lactis; y las bacterias, tales como E. coli y las de las familias siguientes: Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus y Streptomyces.
A título de ejemplos de células eucariotas, se pueden citar las células que proceden de animales tales como los mamíferos, los reptiles, los insectos y equivalentes. Pueden ser de un único tipo de células o un grupo de diferentes tipos de células, y engloban estirpes celulares cultivadas, células primarias y células proliferativas. Las células
eucariotas preferidas son células que proceden del hámster chino (células CHO), del mono (células COS y Vero), de riñón de hámster neonato (células BHK), de riñón de cerdo (células PK 15) y de riñón de conejo (células RK13), las estirpes celulares humanas de osteosarcoma (células 143 B), las estirpes celulares humanas HeLa y las estirpes celulares humanas de hepatoma (células del tipo Hep G2), así como las estirpes celulares de insecto (por ejemplo de Spodoptera frugiperda).
Las células hospedantes pueden ser suministradas en cultivos en suspensión o en matraces, en cultivos de tejidos, cultivos de órgano y equivalentes. Las células hospedantes pueden ser asimismo animales transgénicos.
Ventajosamente, la secuencia o secuencias nucleotídicas que codifican la NS3/NS4 y/o el NS5b se pueden optimizar independientemente para proporcionar una expresión de nivel elevado en una célula hospedante particular, por ejemplo células hospedantes de mamíferos, de levaduras o bacterianas. De hecho se ha observado que, cuando existe más de un codón para codificar un aminoácido dado, los patrones de uso de codones de los organismos son enormemente no aleatorios (véase, por ejemplo, Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20, 21112118) y pueden ser notablemente diferentes entre diferentes hospedantes (véase, por ejemplo, Nakamura et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24, 214-215). De este modo, las secuencias nucleotídicas de origen vírico (VHC) pueden tener un patrón de uso de codones inapropiado para la expresión eficiente en células hospedantes, especialmente células bacterianas o de levaduras. Típicamente, la optimización de los codones se lleva a cabo sustituyendo uno o más codones “nativos“ (por ejemplo VHC) que corresponden a un codón usado de forma infrecuente en esta célula hospedante particular por uno o más codones que codifican el mismo aminoácido que se usan más frecuentemente. Esto se puede lograr mediante mutagénesis convencional o mediante técnicas de química sintética (por ejemplo dando como resultado una molécula de ácido nucleico sintética). No es necesario sustituir todos los codones nativos correspondientes a los codones usados de forma infrecuente, puesto que se puede lograr una mayor expresión incluso con una sustitución parcial. Además, se pueden realizar algunas desviaciones de la adhesión estricta al uso optimizado de codones, para adecuar la introducción del sitio o sitios de restricción en la secuencia nucleotídica resultante.
Además de la optimización del uso de codones, la expresión en la célula hospedante se puede mejorar adicionalmente a través de modificaciones adicionales. Por ejemplo, la secuencia nucleotídica que codifica NS3/NS4 y/o NS5b se puede modificar para evitar el agrupamiento de codones raros, no óptimos, que están presentes en áreas concentradas, y/o para suprimir o modificar elementos de secuencias por lo menos parcialmente negativos que se espera que influyan negativamente en los niveles de expresión (por ejemplo tramos de secuencias ricas en AT o ricas en GC; secuencias de repeticiones directas o invertidas inestables; estructuras de ARN secundarias; y/o elementos reguladores crípticos internos tales como cajas TATA internas, sitios chi, sitios de entrada al ribosoma, y/o sitios donantes/aceptores de ayuste).
Según una forma de realización, las composiciones peptídicas, los vectores de expresión y las secuencias nucleotídicas que codifican dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b como se definen en la presente memoria, son particularmente eficaces para la inhibición, la prevención y el control de la infección de pacientes portadores del virus del VHC, de manera que su uso para la preparación de un medicamento constituye otro objeto de la invención.
La presente descripción se refiere asimismo a una composición farmacéutica, en particular a una vacuna, que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por la composición peptídica como se define en la presente memoria, o un vector de expresión como se define en la presente memoria, o un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5b, colocado bajo el control de elementos necesarios para una expresión constitutiva y/o inducible a partir de dichos péptidos; para la administración secuencial de dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo en el tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C, en particular bajo la forma de por lo menos 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
Por elementos necesarios para una expresión constitutiva de los péptidos, se entiende un promotor ubicuo o específico de las células eucariotas.
Como elementos necesarios para una expresión inducible a partir de los péptidos, se pueden citar los elementos de regulación del operón de E. coli para la resistencia a tetraciclina (Gossen M. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89:55475551 (1992).
Según una forma de realización particular, la composición farmacéutica contiene asimismo un vehículo farmacéuticamente apropiado. Por supuesto, el experto en la materia determinará fácilmente la naturaleza del vehículo farmacéuticamente apropiado y la cantidad de principio activo a usar en función de los constituyentes de la composición farmacéutica.
La cantidad y la naturaleza del vehículo farmacéuticamente apropiado pueden ser fácilmente determinadas por el experto en la materia. Éstas se seleccionan según la forma farmacéutica y el método de administración deseados.
Además, según la descripción, el principio activo se puede usar en combinación con uno o más adyuvantes adecuados para la aplicación sistémica o mucosal en seres humanos. Preferentemente, el adyuvante es capaz de estimular la inmunidad frente a una proteína de VHC o un epítopo, especialmente una inmunidad mediada por linfocitos T. Los ejemplos representativos de adyuvantes adecuados, especialmente para su utilización en combinación con la composición peptídica de la invención, incluyen sin limitación alumbre, emulsión de aceite mineral tal como completo e incompleto de Freund (IFA), lipopolisacárido o un derivado del mismo (Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419), saponinas tales como QS21 (Sumino et al., 1998, J.Virol. 72, 4931-4939; documento WO 98/56415), compuestos de imidazoquinolina tales como Imiquimod (Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43, S6-S11) y compuesto relacionado S-27609 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12, 1324-1332), oligodesoxinucleótidos de citosina fosfato guanosina tales como CpG (Chuet al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547) y péptidos catiónicos tales como IC-31 (Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-270).
Según la presente invención, el principio activo se administra preferentemente mediante administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica, local, intratraqueal, intranasal, transdérmica, rectal, intraocular, intra-ventricular, pudiendo ser administrado dicho principio activo en forma de administración de dosificación unitaria.
Las formas de administración de dosificación unitaria pueden ser, por ejemplo, comprimidos, cápsulas de gelatina, gránulos, polvos, disoluciones o suspensiones orales inyectables, sellos transdérmicos (“parche”), formas de administración sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, intraventricular, o por inhalación, formas de administración tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa, formas de administración rectal, o implantes. Para la administración tópica, se pueden prever cremas, geles, pomadas, lociones o colirios.
Estas formas galénicas se preparan según los métodos habituales de los campos considerados.
Según la práctica habitual, la dosis del principio activo de utilización en la presente invención, apropiada para cada paciente, se determina por el médico en función de diversos parámetros, en particular el método de administración, la edad, peso, y la respuesta del paciente, el principio activo empleado, la naturaleza y grado de síntomas, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia de tratamiento, y/o la necesidad de prevención o terapia. Como guía general, la composición que comprende adenovirus y los vectores adenovíricos se pueden usar en dosis que comprenden de aproximadamente 105 a aproximadamente 1013 ui (unidades infecciosas), de forma deseable de aproximadamente 107 a aproximadamente 1012 ui, y preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1011 ui. La dosis adecuada para una composición que comprende poxvirus o vectores poxvíricos varía de aproximadamente 104 a aproximadamente 1010 pfu (unidades formadoras de placas), de forma deseable de aproximadamente 105 a aproximadamente 109, y preferentemente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 pfu. Las dosis de 107 pfu, 5x107 pfu o 108 pfu son preferidas para una administración. Los plásmidos vectoriales se pueden administrar en dosis entre 10 μg y 20 mg, ventajosamente de aproximadamente 100 μg a aproximadamente 2 mg. Una composición peptídica se puede administrar en una o más dosis de entre 10 ng y 20 mg, con especial preferencia por una dosis de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 2 mg del principio activo por kg de peso corporal. La administración puede tener lugar en una única dosis o en una dosis repetida una o varias veces después de un cierto intervalo de tiempo. Un patrón preferido de administración es tal que proporcione una exposición a la cantidad terapéuticamente eficaz del principio activo que es:
(a)
continua, o por lo menos una vez al día, durante un período de un día,
(b)
descontinuar después dicha administración por medio de una falta continua de tratamiento o una falta de tratamiento durante días consecutivos durante un período de 3 a 10 días, y
(c)
repetir por lo menos dos veces el patrón de administración (a) y descontinuación de la administración (b), para lograr o mantener una respuesta biológica sostenida en el sujeto,
correspondiendo dicho patrón de repetición de la administración y descontinuación de la administración preferentemente a por lo menos 3 administraciones secuenciales, preferentemente separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
Preferentemente, el principio activo para su utilización según la presente invención es uno de los vectores definidos en la presente memoria, o un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5b, de manera que son útiles en vacunación profiláctica y terapéutica.
La vacunación profiláctica y terapéutica se puede realizar mediante inyección de uno o varios vectores de expresión como se definen en la presente memoria, en la medida en la que el o los vectores de expresión codifican finalmente la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b como principio activo, estando dicha inyección seguida de revacunaciones o no. Se puede realizar asimismo inyectando una o más dosis de dos tipos diferentes de vectores
de expresión como se definen en la presente memoria, en primer lugar un adenovirus, para iniciar la respuesta inmunitaria del hospedante, y después un poxvirus, para reforzar la respuesta inmunitaria iniciada, simultáneamente
o a diferentes tiempos, y viceversa (por ejemplo, un vector poxvírico como iniciador, y un vector adenovírico como refuerzo).
Estos vectores pueden estar contenidos en un kit farmacéutico.
Asimismo, otro objeto de la descripción consiste en unos kits farmacéuticos, en particular vacunales, que están acondicionados preferentemente para por lo menos 3 administraciones de una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, más preferentemente en por lo menos 3 viales diferentes, separándose preferentemente dichas administraciones entre sí por un período de tiempo que varía desde 3 a 10 días.
Según una forma de realización, el kit farmacéutico de la invención comprende por lo menos 3 viales que comprenden como principio activo un vector de expresión de tipo adenovirus como se define previamente.
Según otra forma de realización, el kit farmacéutico de la invención comprende por lo menos 3 viales que comprenden como principio activo un vector de expresión de tipo poxvirus como se define previamente.
Según otra forma de realización, el kit farmacéutico de la invención comprende por lo menos 3 viales que comprenden como principio activo un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5b.
La vacunación profiláctica y terapéutica se puede implementar preferentemente mediante la inyección de una vacuna a base de por lo menos un vector de expresión en uso en la invención, o un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5b, y por lo menos una composición farmacéutica de la invención constituida por la composición peptídica en uso en la invención.
También, otro objeto de la descripción son kits farmacéuticos, que comprenden por lo menos 4 viales diferentes que comprenden una cantidad eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, en los que 3 viales son para 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, y el cuarto vial es para una administración de recuerdo llevada a cabo por lo menos 4 semanas después de la última de las 3 administraciones secuenciales.
También, otro objeto de la descripción son kits farmacéuticos, que comprenden por lo menos 5 viales diferentes que comprenden una cantidad eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, en los que 3 viales son para 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, y el cuarto y quinto vial son para administraciones de recuerdo llevadas a cabo por lo menos 4 semanas después de la última de las 3 administraciones secuenciales.
Según una forma de realización preferida, el principio activo es el vector de expresión para su utilización según la invención, o un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5b.
Según otra forma de realización preferida, las 3 administraciones secuenciales están separadas por un intervalo de aproximadamente una semana.
Según otra forma de realización preferida, la administración de recuerdo se lleva a cabo adecuadamente por lo menos 6 semanas después de la última de las 3 administraciones secuenciales, por ejemplo aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 3,5 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 4,5 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 5,5 meses o aproximadamente 6 meses, preferentemente de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 6 meses después de la primera serie, con preferencia especial por aproximadamente 4 meses. Cuando se ponen en práctica dos administraciones de recuerdo, las administraciones primera y segunda se llevan a cabo de forma adecuada como se describe anteriormente. Preferentemente, la primera administración de recuerdo se lleva a cabo de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 4 meses después de la primera serie, y la segunda es preferentemente de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 6 meses después de la primera serie.
También se describe en la presente memoria un método de tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C, que comprende por lo menos una administración a un organismo hospedante de una dosis eficaz de cualquiera de los principios activos descritos anteriormente (composición peptídica, vector, anticuerpos y/o composición farmacéutica de la invención) o cualquier combinación de los mismos. También se describe el uso de por lo menos uno de los principios activos descritos anteriormente, o cualquier combinación de los mismos, para la preparación de un medicamento para tratar una o más patologías asociadas con el virus de la hepatitis C. El término
“tratamiento” o “tratar”, como se usa en la presente memoria, comprende la vacunación profiláctica y terapéutica de un organismo hospedante infectado con un virus de la hepatitis C. La expresión “organismo hospedante” pretende comprende cualquier mamífero, tal como cualquier sujeto murino, rata, bovino, porcino, canino, felino, simio o humano, por ejemplo un ser humano infectado con VHC.
El método o la utilización descritos en la presente memoria es especialmente útil para tratar infección persistente por VHC y cáncer hepático en pacientes infectados con VHC. El término “cáncer” comprende cualesquiera afecciones cancerosas, incluyendo tumores difusos o localizados, metástasis, pólipos cancerosos así como lesiones preneoplásicas (por ejemplo cirrosis). De forma deseable, la dosis eficaz de la composición peptídica, vector, composición farmacéutica y/o anticuerpos de la invención es tal que proporciona un beneficio terapéutico al organismo hospedante en el que se administra. El beneficio terapéutico se puede evidenciar de muchas maneras, por ejemplo una disminución de la viremia de VHC detectada en sangre, plasma o sueros del organismo tratado en comparación con antes del tratamiento, y/o mediante la detección de una respuesta inmunitaria anti-VHC (por ejemplo producción de anticuerpos anti-VHC y/o inmunidad celular) o mediante el retraso de los síntomas asociados con una infección por VHC (por ejemplo retraso en el desarrollo de cirrosis hepática o cáncer), o mediante una disminución o ralentización de afecciones de inflamación/esteatosis/fibrosis hepáticas, típicamente asociadas con infección por VHC, o mediante una respuesta mejorada del individuo a terapias convencionales.
Preferentemente, la poliproteína NS3/NS4 y eventualmente el polipéptido NS5b comprendidos o codificados por la composición peptídica, por el vector de expresión para su utilización según la invención, y/o en la composición farmacéutica para su utilización según la invención, se originan a partir del genotipo 1b, y se usa según la modalidad descrita en la presente memoria para tratar las patologías asociadas con un virus de la hepatitis C de genotipo 1b. Como alternativa, se originan a partir del genotipo 1b, y se usan según la modalidad descrita en la presente memoria para tratar las patologías asociadas con un genotipo distinto de 1b, tal como un genotipo 1a, 3 ó 4 del virus de la hepatitis C, con especial preferencia por el genotipo 1a.
Si se desea, el método o la utilización descritos en la presente memoria se puede llevar a cabo conjuntamente con una o más modalidades terapéuticas convencionales (por ejemplo radiación, quimioterapia y/o cirugía). En una forma de realización, el método o la utilización descritos en la presente memoria está asociado con quimioterapia con uno o más fármacos que se usan convencionalmente para tratar o prevenir infecciones por VHC, patologías asociadas a VHC. Los ejemplos representativos de fármacos contra VHC incluyen, sin limitación, antivirales, inhibidores de proteasas (por ejemplo inhibidores de serina proteasas tales como VX950 de Vertex), inhibidores de polimerasas, inhibidores de helicasas, antifibrósicos, análogos nucleosídicos, agonistas de TLR, inhibidores de la Nglucosilación, ARNip, oligonucleótidos antisentido, moduladores inmunitarios, vacunas terapéuticas y agentes antitumorales usados habitualmente en el tratamiento de hepatocarcinomas asociados a VHC (por ejemplo adriamicina o una mezcla de adriamicina, lipiodol y spongel, administrada habitualmente mediante quimioembolización en la arteria hepática). Tales fármacos contra VHC se pueden proporcionar en una única dosis o, como alternativa, en múltiples dosis según protocolos, dosificaciones y regímenes estándar, durante varias horas, días y/o semanas. Su administración puede anteceder, ser concomitante, o ser posterior al uso según la invención para la administración de la composición peptídica, vector o vectores de expresión, y/o composición farmacéutica como se define en la presente memoria como ingrediente activo. Una combinación preferida incluye tratamiento del organismo hospedante con IFN-α2a o IFN-α2b pegilado (por ejemplo a una dosis de 10 μg/semana), eventualmente en combinación con ribavirina (por ejemplo a 800 a 1200 mg/día) durante 24 a 48 semanas, antes, paralelamente o subsiguientemente al método o uso de la invención. El principio activo en uso en la presente invención también se puede administrar en combinación con otros tratamientos diseñados para intensificar respuestas inmunitarias, por ejemplo mediante coadministración con adyuvantes o citocinas (o vectores que codifican citocinas), como es bien conocido en la técnica.
En otra forma de realización, el método o uso descrito en la presente memoria se lleva a cabo según un programa de inmunización acelerado que comprende por lo menos tres (por ejemplo de 3 a 10) administraciones secuenciales de la composición peptídica, vector o vectores de expresión o composición farmacéutica como se define en la presente memoria. Preferentemente, las por lo menos res administraciones secuenciales están separadas independientemente por un período de tiempo que varía desde 3 días a 10 días, pero no más de 15 días. El método
o uso descrito en la presente memoria comprende preferentemente tres administraciones secuenciales de un principio activo como se define en la presente memoria, cada uno a un intervalo de aproximadamente una semana. Incluso más preferentemente, el método o uso descrito en la presente memoria comprende tres administraciones secuenciales, mediante la vía intramuscular o subcutánea, a un intervalo de aproximadamente una semana, de un vector de expresión poxvírico (por ejemplo un MAV que codifica NS3/NS4 y NS5B) como se define anteriormente, o la composición farmacéutica que comprende tal vector. Como alternativa, el método o uso descrito en la presente memoria comprende tres administraciones secuenciales, mediante la vía intramuscular o subcutánea, a un intervalo de aproximadamente una semana, de un vector de expresión adenovírico (por ejemplo un vector adenovíciro al que se le ha suprimido E1 y E3 y que expresa NS3/NS4 y NS5B) como se define anteriormente, o la composición farmacéutica que comprende tal vector.
En todavía otra forma de realización, el método o uso descrito en la presente memoria puede incluir además por lo menos una administración de “recuerdo” al final de las por lo menos tres administraciones secuenciales. El número
de administraciones de recuerdo puede variar de uno a 10, y el intervalo de tiempo entre la última de la primera serie de administraciones secuenciales y la primera administración de recuerdo es una cuestión de por lo menos aproximadamente 4 semanas. La administración de recuerdo se puede llevar a cabo de forma adecuada aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 3,5 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 4,5 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 5,5 meses, aproximadamente 6 meses, o incluso más, después de la última de la primera serie de administraciones secuenciales. Ventajosamente, el método o uso comprende tres administraciones secuenciales a un intervalo de aproximadamente una semana, y una administración de recuerdo que tiene lugar desde aproximadamente 2 meses a aproximadamente 6 meses después de la última de las por lo menos tres administraciones secuenciales, con preferencia por aproximadamente 4 meses. Como alternativa, el método o uso descrito en la presente memoria, comprende dos administraciones de recuerdo, siendo la primera de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 meses, y la segunda de aproximadamente 4 meses a aproximadamente 6 meses después de la última de la primera serie de administraciones secuenciales, teniendo una preferencia especial por la primera administración de recuerdo a aproximadamente 4 meses, y administrándose la segunda administración de recuerdo a aproximadamente 6 meses. La administración o administraciones de recuerdo pueden usar el mismo principio activo o uno diferente de la primera serie de administraciones secuenciales, y pueden usar la misma vía o una vía diferente de administración. Según un aspecto, la administración o administraciones de recuerdo se administran usando el mismo principio activo y mediante la misma vía que la primera serie de administraciones secuenciales. Un método o uso preferido comprende tres administraciones secuenciales a aproximadamente una semana de intervalo, y una o dos administraciones de recuerdo aproximadamente 4 meses y/o aproximadamente 6 meses después de la tercera administración secuencial, todas ellas mediante vía subcutánea y con un vector de expresión poxvírico (por ejemplo un MVA que codifica NS3/NS4 y NS5B) como se define anteriormente, o la composición farmacéutica que comprende tal vector.
Según otro aspecto, las administraciones secuenciales y la administración o administraciones de recuerdo pueden usar principios activos diferentes y/o vías de administración diferentes. Por ejemplo, las por lo menos tres administraciones secuenciales se pueden realizar mediante la vía subcutánea o intramuscular con un vector de expresión poxvírico (por ejemplo un MVA que codifica NS3/NS4 y NS5B), o la composición farmacéutica que comprende tal vector como se define anteriormente, y la administración o administraciones de recuerdo mediante la vía subcutánea o intramuscular con un polipéptido de la técnica anterior que comprende NS3, NS4 y/o NS5b, tal como el polipéptido descrito en la solicitud de patente europea nº EP 06 36 0014.2.
La presente descripción también proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 3 administraciones secuenciales de dicho principio activo, separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, correspondiendo dichas por lo menos 3 administraciones secuenciales de dicho principio activo a un conjunto de administraciones, siendo dicho conjunto de administraciones susceptible de ser repetido por lo menos una vez, y separándose cada conjunto de administraciones entre sí por un período de tiempo que varía de 4 semanas a 6 meses.
La presente descripción también se refiere al uso de o a un método de uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para la administración a un sujeto infectado con VHC para estimular una respuesta inmunitaria celular específica de VHC de dicho sujeto en el tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C,
siendo dicha administración tal que proporciona una exposición a dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo que es
(a)
continua, o por lo menos una vez al día, durante un período de un día,
(b)
descontinuar entonces dicha administración por medio de una falta continua de tratamiento o una falta de tratamiento durante días consecutivos a lo largo de un período de 3 a 10 días, y
(c)
repetir por lo menos dos veces el patrón de administración (a) y descontinuación de la administración (b), para lograr o mantener una respuesta inmunitaria celular sostenida en el sujeto,
correspondiendo dicho patrón de repetición de la administración y descontinuación de la administración preferentemente a por lo menos 3 administraciones secuenciales, preferentemente separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
También se describe en la presente memoria un método de tratamiento mediante administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, a un sujeto infectado con VHC, para estimular una respuesta inmunitaria celular específica de VHC de dicho sujeto, en el tratamiento de una o más patologías asociadas con un virus de la hepatitis C,
siendo dicha administración tal que proporciona una exposición a dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo que es
(a)
continua, o por lo menos una vez al día, durante un período de un día,
(b)
descontinuar entonces dicha administración por medio de una falta continua de tratamiento o una falta de tratamiento durante días consecutivos a lo largo de un período de 3 a 10 días, y
(c)
repetir por lo menos dos veces el patrón de administración (a) y descontinuación de la administración (b), para lograr o mantener una respuesta inmunitaria celular sostenida en el sujeto,
correspondiendo dicho patrón de repetición de la administración y descontinuación de la administración preferentemente a por lo menos 3 administraciones secuenciales, preferentemente separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
También se describe en la presente memoria el uso de o un método de uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, para estimular una respuesta inmunitaria celular específica de VHC de dicho sujeto en el tratamiento de una o más patologías asociadas a un virus de la hepatitis C, en el que dicho tratamiento comprende por lo menos 3 administraciones secuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
Según una realización preferida, el uso o método descrito en la presente memoria comprende tres administraciones secuenciales a aproximadamente una semana de intervalo, y una o dos administraciones de recuerdo con el mismo principio activo o uno diferente como se define en la presente memoria y por la misma vía de administración o una diferente. Un uso preferido pone en práctica tres administraciones subcutáneas secuenciales, a un intervalo de una semana, de un vector de expresión poxvírico (por ejemplo un MVA que codifica NS3/NS4 y NS5B), o la composición farmacéutica que comprende tal vector como se define anteriormente, seguido de una administración de recuerdo del mismo principio activo por vía subcutánea desde aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 6 meses después de la tercera inyección, con preferencia especial por aproximadamente 4 meses después de la tercera inyección.
La respuesta inmunitaria estimulada es preferentemente una respuesta inmunitaria mediada por células T, y en particular una respuesta de células T CD8+, una respuesta de células T CD4+, o tanto respuestas de células T CD8+ como CD4+. De forma deseable, la respuesta inmunitaria mediada por células T, estimulada por el método o uso de la presente invención, permite seleccionar como diana por lo menos un epítopo situado en una proteína NS3, y/o NS3 y/o NS5B presente en el virus de la hepatitis C infectante. Preferentemente, la respuesta inmunitaria medida por células T, proporcionada por el método o uso de la invención, es específica para por lo menos un epítopo restringido a HLA-B, y en particular por lo menos un epítopo HLA-B7 situado en el polipéptido NS3 del virus de la hepatitis infectante. Como alternativa, o en combinación, la respuesta inmunitaria mediada por células T estimulada es específica para por lo menos un epítopo restringido a HLA-A2, y en particular por lo menos un epítopo HLA-A2 situado en la proteína NS3 y/o NS5b del virus de la hepatitis infectante.
En una realización preferida, el principio activo para su utilización según la invención se proporciona al organismo hospedante según el programa de inmunización acelerado descrito anteriormente, y comprende por lo menos tres administraciones secuenciales de un principio activo como se define en la presente memoria, y opcionalmente una o dos administraciones de recuerdo.
De forma deseable, la respuesta inmunitaria estimulada es de larga duración, y se puede detectar en el organismo hospedante tratado durante el menos un mes tras la última administración del ingrediente activo. Preferentemente, la respuesta inmunitaria estimulada se puede detectar durante por lo menos 2 meses, de forma deseable durante por lo menos 3 meses, y preferentemente durante por lo menos 6 meses.
La capacidad del método o uso descrito en la presente memoria para estimular una respuesta inmunitaria celular anti-VHC se puede evaluar ya sea in vitro o in vivo usando una variedad de ensayos que son estándar en la técnica. Para una descripción general de técnicas disponibles para evaluar el comienzo y activación de una respuesta inmunitaria, véase, por ejemplo Coligan et al. (1992 y 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health). La medida de la inmunidad celular se puede llevar a cabo a través de la medida de perfiles de citocinas segregadas por células efectoras activadas que incluyen las derivadas de células T CD4+ y CD8+ (por ejemplo, cuantificación de células productoras de IL-10 o IFNg mediante ELIspot), mediante determinación del estado de activación de las células efectoras inmunitarias (por ejemplo ensayos de proliferación de células T mediante una captación clásica de [3H]-timidina), estudiando en un ensayo linfocitos T específicos de antígenos en un sujeto sensibilizado (por ejemplo lisis específica de péptidos en un ensayo de citotoxicidad). El método descrito en la presente memoria también se puede validar adicionalmente en modelos de animales expuestos a un agente infeccioso apropiado (por ejemplo una bacteria o un virus de la vacuna que expresa genes de VHC), para determinar la neutralización del agente infeccioso y eventualmente la resistencia parcial a los síntomas asociados, reflejando una inducción o una intensificación de una respuesta inmunitaria celular anti-VHC. En la sección de Ejemplos aneja se ilustran también el ensayo y la validación de las composiciones de vectores.
La presente descripción también describe el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 3 administraciones secuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, correspondiendo dichas por lo menos 3 administraciones secuenciales de dicho principio activo a un conjunto de administraciones, siendo factible
5 que dicho conjunto de administraciones se repita por lo menos una vez, y separándose cada conjunto de administraciones entre sí por un período de tiempo que varía de 4 semanas a 6 meses.
La presente invención se pondrá más claramente de manifiesto mediante los ejemplos siguientes proporcionados únicamente a título ilustrativo y no limitativo, así como con usando las figuras 1 a 16 adjuntas, en las que:
-
las figuras 1A a 1K representan los mapas de los diferentes plásmidos usados para obtener un adenovirus AdNS3NS4NS5b según la invención, en los que se indican los sitios de las diferentes enzimas de restricción y el emplazamiento de los fragmentos de secuencia que codifican NS3/NS4 y NS5b,
15 - las figuras 2A a 2H representan los mapas de los diferentes plásmidos usados para obtener un MVA poxvírico NS3NS4NS5b según la invención, en los que se indican los sitios de las diferentes enzimas de restricción y el emplazamiento de los fragmentos de secuencia que codifican NS3/NS4 y NS5b,
-
la figura 3 proporciona la respuesta celular inducida por el adenovirus AdNS3NS4, ya sea según el ensayo de CTL (figura 3A), en el que se usó el epítopo GLL para estimular los esplenocitos en cultivo y para cargar las dianas de los CTL, y cuyo resultado se expresa como un porcentaje de lisis específica en función de la relación de células efectoras/diana, o según el ensayo ELISPOT (figura 3B), específico para el epítopo GLL, en el que el resultado se proporciona en número de puntos/106 células,
25 - la figura 4 proporciona la respuesta celular inducida por el adenovirus AdNS5b según el ensayo ELISPOT, específico de los epítopos ALY y KLQ,
-
la figura 5 proporciona la respuesta celular inducida por el adenovirus AdCE1E2 según el ensayo de CTL, en el que se usó el epítopo DLM para estimular los esplenocitos en cultivo y para cargar las dianas de los CTL, y cuyo resultado se expresa como un porcentaje de lisis específica en función de la relación de células efectoras/diana,
-
la figura 6 proporciona el título del virus recombinante de la vacuna, que resulta del ensayo de prueba, en pfu/ml/mg de ovario, para los 4 grupos de 8 ratones inmunizados por las diferentes combinaciones de
35 adenovirus: AdNS3NS4 + AdNS5b (1er grupo), los adenovirus AdNS3NS4 + AdNS5b + AdNS5a (2º grupo), los adenovirus AdNS3NS4 + AdNS5b +AdCE1E2 (3er grupo) y el adenovirus AdβGal (4º grupo), y
-
la figura 7 proporciona el título del virus recombinante de la vacuna, que resulta del ensayo de prueba, en pfu/ml/mg de ovario, para los 3 grupos de 8 ratones inmunizados por las diferentes combinaciones de adenovirus siguientes: AdNS3NS4NS5b (1er grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b (2º grupo) y AdβGal (3er grupo).
-
la figura 8 ilustra el análisis in vitro de la expresión de NS3, NS4 y NS5B mediante citometría de flujo tras la infección de Huh-7 por NS3/4-NS5B de MVA. Células Huh-7 infectadas con NS3/4-NS5B de MVA se cosecharon 24 h después de la infección con una MOI de 1, y se tiñeron usando anticuerpos monoclonales
45 de ratón anti-NS3 (8D8E1), anti-NS4B (1B12A3) y anti-NS5B (5B12B7). Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas en comparación con células infectadas con N33 de MVA (tipo salvaje de MVA). Líneas en negrita: células infectadas con NS34-NS5B de MVA, líneas delgadas: células infectadas con N33 de MVA, histograma sombreado: células no infectadas. MFI: intensidad media de la fluorescencia.
-
la figura 9 proporciona una comparación de las frecuencias de células T CD8+ productoras de IFNγ específicas de epítopos restringidos a HLA-A2 de NS3 que se inducen en animales transgénicos HLA-A2 siguiendo dos programas de inmunización diferentes con la NS34-NS5B de MAV. Programa 1: 3 inyecciones subcutáneas (sc) administradas a la semana 1, 4, 7. Programa 2: 4 inyecciones sc administradas a la semana 1, 2, 3 y 6. (A) Ensayos DELISPOT de IFNγ llevados a cabo en la semana 6 (programa 1) o en la semana 5
55 (programa 2). (B) Ensayos ELISPOT de IFNγ llevados a cabo en la semana 9 (programa 1) o en la semana 8 (programa 2). Los ensayos ELISPOT de IFNγ se llevaron a cabo como se describe en Materiales y Métodos. M1, M2 y M3 representan 3 ratones inmunizados con la NS34-NS5B de MVA. N33 es un ratón de control representativo inyectado con N33 de MVA. Para la reestimulación se usaron los epítopos restringidos a HLA-A2 de NS3, GLL y KLT, o un péptido irrelevante. Cada barra representa la respuesta de un ratón inmunizado individual. La línea horizontal discontinua representa el corte por encima del cual la frecuencia de las células T productoras de IFNγ se considera positiva.
-
la figura 10 ilustra respuestas de células T CD8+ citotóxicas específicas de epítopos restringidos a HLA-A2 de NS3 o NS5B que se inducen en animales transgénicos HLA-A2 tras la administración de NS3/4-NS5B de 65 MVA según dos programas de inmunización diferentes. Programa 1: 3 inyecciones sc administradas en la
semana 1, 4, 7. Programa 2: 4 inyecciones sc administradas en la semana 1, 2, 3 y 6. (A) Ensayos de CTL llevados a cabo en la semana 6 (programa 1) o en la semana 5 (programa 2). (B) Ensayos de CTL llevados a cabo en la semana 9 (programa 1) o en la semana 8 (programa 2). Los ensayos de CTL se llevaron a cabo como se describe en Materiales y Métodos. Los datos representan el % de lisis específica obtenido a
5 diferentes relaciones de células efectoras a células diana (E/T). Los péptidos restringidos a HLA-A2 usados para pulsar células diana se indican en la parte superior de cada gráfica: GLL para NS3, ALY para NS5B. Cada barra representa la respuesta de un ratón inmunizado individual.
-
la figura 11 ilustra respuestas de células T CD8+ caracterizadas por ensayos de ICS y CTL tras la administración en ratones transgénicos HLA-A2 de NS3/4-NS5B de MVA según el programa de inmunización acelerado. (A) Ensayo de ICS. La parte izquierda de la figura representa gráficas de puntos de células IFNγ+CD8+ representativas de animales inmunizados con NS34-NS5B de MVA y con N33 de MVA y tras la clasificación acotada en células CD3+CD4+ llevada a cabo como se describe en Materiales y Métodos. Para la reestimulación se usó el péptido GLL, o TT (estímulo irrelevante). El histograma en la derecha representa
15 el porcentaje de células IFNγ+CD8+ detectadas para 4 ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA y 2 ratones inmunizados con N33 de MVA tras la reestimulación con GLL. Barras en blanco: respuesta de un ratón inmunizado individual, barras en negro: mediana de los valores. (B) Ensayo de CTL in vivo. Se inyectaron células diana con CFSE elevado pulsadas con GLL, y células con CFSE bajo no pulsadas, en ratones receptores como se describe en Materiales y Métodos. Veinticuatro horas más tarde, se evaluó en el bazo el porcentaje de células diana exterminadas. Los porcentajes de lisis específica se indican para cada ratón inmunizado con NS34-NS5B de MVA (M1 a M4).
-
la figura 12 ilustra las respuestas de células T productoras de IFNγ tras la administración de NS3/4-NS5B de MVA en ratones transgénicos HLA-B7 según el programa de inmunización acelerado. Se llevaron a cabo
25 ensayos ELISPOT de IFNγ como se describe en Materiales y Métodos. M1-5 representa 5 ratones inmunizados con la NS34-NS5B de MVA, y M6-7 representan 2 ratones inmunizados con la N33 de MVA. Las barras de líneas oblicuas, las barras de puntos y las barras en blanco representan valores obtenidos para un ratón individual y específicos de epítopos restringidos a HLA-B7 WPA10, LSP10 o de péptido irrelevante, respectivamente. La mediana de los valores se representa, para ratones inyectados con NS34-NS5B de MVA, con barras en negro (péptido WPA10) y en gris (péptido LSP10). La línea horizontal discontinua representa el corte por encima del cual se considera positiva la frecuencia de células T productoras de IFNγ.
-
la figura 13 ilustra las respuestas de células T IFNγ+CD4+ específicas de antígenos NS3, NS4 y NS5B tras la administración de NS3/4-NS5B de MVA en ratones Balb/C según el programa de inmunización acelerado.
35 Las células T CD4+ se seleccionaron positivamente a partir de esplenocitos de ratones individuales inmunizados con NS34-NS5B de MVA o con N33 de MVA. Se generaron los esplenocitos totales, la fracción de CD4+ y la fracción de efluente, y se llevaron a cabo ensayos ELISPOT de IFNγ sobre cada fracción para ratones individuales como se describe en Materiales y Métodos. Para la reestimulación se usaron antígenos recombinantes NS3, NS4 y NS5B de VHC, o TT (estímulo irrelevante). Los resultados se muestran como barras que representan la mediana de los valores de puntos detectados para 106 esplenocitos, obtenidos para grupos de 4 ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA (barras de líneas oblicuas) o 2 ratones inmunizados con N33 de MVA (barras en blanco). Dentro de las barras, los resultados obtenidos para cada ratón se representan como puntos negros. La línea horizontal discontinua representa el corte por encima del cual se considera positiva la frecuencia de las células T productoras de IFNγ.
-
la figura 14 ilustra la longevidad de respuestas de CTL tras la administración de NS3/4-NS5B de MVA en ratones transgénicos HLA-A2 según el programa de inmunización acelerado. Los ratones recibieron 4 inyecciones de NS34-NS5B de MVA en la semana 1, 2, 3 y 27, y se llevaron a cabo ensayos de CTL como se describe en Materiales y Método en la semana 5, 10, 27 y 29. Para cada punto de tiempo analizado, se sacrificaron 4 ratones a los que se les inyectó NS34-NS5B de MVA y 2 ratones a los que se les inyectó N33 de MVA. Barras oblicuas: mediana del % de los valores de la lisis para ratones inyectados con NS34-NS5B de MVA, barras en blanco: mediana del % de los valores de lisis para ratones inyectados con N33 de MVA, a diferentes relaciones de células efectoras a células diana (E/T).
55 - la figura 15 ilustra la longevidad de respuestas de ELISPOT de IFNγ en ratones transgénicos HLA-A2 tras la administración de NS34-NS5B de MVA según el programa de inmunización acelerado. Los ratones recibieron 4 inyecciones de NS34-NS5B de MVA en la semana 1, 2, 3 y 27, y se llevaron a cabo ensayos Elispot en la semana 5, 10, 27 y 29, como se describe en Materiales y Métodos. Para cada punto de tiempo analizado, se sacrificaron 4 ratones a los que se les inyectó NS34-NS5B de MVA y 2 ratones a los que se les inyectó N33 de MVA. Para la reestipulación, se usaron péptidos restringidos a HLA-A2 de NS3: GLL (A), CVN (B) o KLT (C), o un péptido irrelevante. Las barras oblicuas y las barras en blanco representan valores obtenidos para ratones individuales para péptido específico y un péptido irrelevante, respectivamente. La mediana de los valores se representa, para ratones inyectados con NS34-NS5B de MVA, con barras negras (péptido específico) y con puntos (péptido irrelevante). La línea horizontal discontinua representa el corte por encima
65 del cual se considera positiva la producción de IFNγ.
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la figura 16 ilustra los títulos bacterianos residuales en bazo e hígado de ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA expuestos a bacterias TC-LNS3. (A) Títulos bacterianos en ratones transgénicos HLA-A2 vacunados. Se inmunizaron cuatro ratones, bien con la NS34-NS5B de MVA o bien con la N33 de MVA (control negativo), según el programa “acelerado” de vacunación, o con TC-LNS3 dos veces a un intervalo de 2 semanas usando una dosis de baja inmunización (0,05 a 0,1 LD50) (control positivo), 15 días antes de la exposición. La exposición se llevó a cabo con una dosis de 1 LD50 de bacterias TC-LNS3, y los ratones se sacrificaron 2 días más tarde. Los títulos bacterianos residuales se evaluaron mediante titulaciones de diluciones en serie de hígados y bazos. Los ratones individuales en cada grupo se representan mediante símbolos circulares, y la mediana del valor obtenido para cada grupo se representa mediante la línea negra y gruesa. Los valores P se calculan según el ensayo no paramétrico de Mann Whitney, y los valores se consideran estadísticamente diferentes cuando p<0,05. (B) Títulos bacterianos en ratones Balb/c vacunados. La exposición se llevó a cabo como se describe en (A), excepto que se incluyeron 6 ratones en cada grupo de animales.
Ejemplo 1: Preparación de un adenovirus según la invención que permite la expresión de las proteínas NS3/NS4 y NS5b
1.
Adenovirus
Los adenovirus recombinantes se generan por transfección (CaPO3) de la línea de complementación 293 (Graham, Smiley, et al. 1977) después de la linealización de los genomas mediante Pacl. Los virus recombinantes se propagan y se amplifican en esta misma línea, y su purificación se lleva a cabo a partir de las células infectadas. Las células se recuperan por centrifugación (1500 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante 3 ciclos de congelación/descongelación. El lisado celular se clarifica mediante dos centrifugaciones (2000 rpm, 10 minutos; 8000 rpm, 15 minutos), y después se purifica mediante dos ultracentrifugaciones sucesivas. La primera se lleva a cabo en un gradiente de cloruro de cesio (densidad 1,4 y 1,25) a 30.000 rpm durante 1 hora. La segunda se lleva a cabo en un cojín de cloruro de cesio (densidades 1,34) a 35.000 rpm durante 18 horas. Las fases que contienen los viriones se eliminan y se diluyen a la mitad en un tampón de sacarosa al 60%. Las suspensiones víricas se dializan entonces contra un tampón de formulación (para 10 litros: 3423 g de sacarosa; 12,11 g de Tris; 2,033 g de MgCl2; 87,7 g de NaCl), y después se reparten en alícuotas. Su titulación se lleva a cabo mediante inmunofluorescencia indirecta sobre células 293 infectadas por diferentes diluciones víricas y marcadas por un anticuerpo específico de la proteína de unión a ADN adenovírica (α72K B6-8) (Reich, Sarnow, et al., 1983).
2.
Preparación del adenovirus AdNS3NS4
Este adenovirus permite la expresión del gen que codifica la poliproteína NS3/NS4 (SEC ID nº 1 y 2) bajo el control del promotor CMV.
2.1 Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4
Para hacer esto, se usaron los oligonucleótidos siguientes:
oIV166: 5’-GGG GGG GCT ATG GCG CCT ATC ACG GCC TA-3’ (SEC ID nº 9)
oIV171: 5’-GGG GGG ACG CGT TTA GCA TGG CGT GGA GCA GT-3’ (SEC ID nº 10)
así como los reactivos siguientes:
Taq ADN polimerasa, tampón de PCR, MgCl 1,5 mM y dNTP 10 mM (Invitrogen).
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
5 minutos a 94ºC, y después
30 ciclos de la serie: 45 segundos a 94ºC, 45 segundos a 62ºC y 1 minuto a 72ºC, y después
10 minutos a 72ºC.
2.2 Inserción del fragmento de PCR NS3/NS4 en el plásmido de transferencia pTG13387
Se llevaron a cabo las etapas siguientes:
-
Digestión enzimática del plásmido pTG13387 (figura 1A, Transgene) por Nhel/Mlul (NheI, Invitrogen en React 4 Buffer, y MluI, Invitrogen en React 3 Buffer)
-
Digestión enzimática del fragmento NS3/NS4 por NheI/MluI
-
Ligación (T4 DNA Ligase (Invitrogen) en Reaction Buffer (Invitrogen)),
-
Transformación bacteriana (cepa 5K, Transgene)
-
Selección de los clones bacterianos en medio LB (Difco) + ampicilina (100 μg/ml, Duchefa)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen, según el protocolo del farbicante) de un clon positivo después del análisis de restricción
-
Análisis de restricción: digestión mediante SmaI (Invitrogen en React 4 Buffer) y obtención de fragmentos de: 5450, 2164, 909, 214 y 180 pb
-
Obtención del plásmido pIV315 al que se ha suprimido su región E1 y que contiene la secuencia NS3/NS4 bajo el control del promotor CMV (figura 1B).
2.3 Recombinación homóloga con el genoma adenovírico completo al que se ha suprimido su región E3 contenida en el plásmido pTG6624
Se llevaron a cabo las etapas siguientes:
-
Digestión enzimática del plásmido obtenido anteriormente pIV315 por PacI/PvuI (PacI en tampón NEB1, Biolabs, y PvuI en React 7 Buffer, Invitrogen); aislamiento sobre gel de agarosa del fragmento que contiene el casete pCMV-NS3-NS4
-
Digestión enzimática del plásmido pTG6624 (figura 1C) por ClaI (en React 1 Buffer, Invitrogen)
-
Transformación bacteriana (cepa BJ, Transgene) para llevar a cabo la recombinación homóloga entre los dos fragmentos plasmídicos
-
Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 μg/ml)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción
-
Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 2263, 621, 3814, 214, 2164, 909, 180, 2463, 6480, 1398, 4456, 1455, 3540, 3386, 230 y 3685 pb
-
Obtención del genoma adenovírico completo Adenovirus AdNS3NS4, al que se ha suprimido sus regiones E3 y E1, habiendo sido sustituidas estas últimas por el casete de expresión pCMV-NS3-NS4 (pIV317, figura 1D).
3. Preparación del adenovirus AdNS3NS4NS5b
Este adenovirus permite la expresión del gen que codifica la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor CMV y la expresión del gen que codifica el polipéptido NS5b bajo el control del promotor SV40.
3.1 Construcción del plásmido de transferencia que permite la clonación en la región E3 del adenovirus de una secuencia codificante bajo el control del promotor CMV
Se realizaron las etapas siguientes:
-
Digestión enzimática del plásmido pTG4664 (figura 1E, Transgene) por BglII (en React 3 Buffer, Invitrogen)
-
Digestión enzimática del plásmido pTG13074 (figura 1F, Transgene) por BamHI/BglII (en React 3 Buffer, Invitrogen)
-
Ligación (T4 ADN Ligasa), transformación bacteriana (cepa 5K)
-
Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 μg/ml)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción
-
Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 4940, 1305 y 230 pb
-
Obtención del plásmido pIV267 (figura 1G)
-
Digestión del plásmido así obtenido pIV267 por Clal/MunI (en React 1 Buffer, Invitrogen)
- Tratamiento por la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (en React 2 Buffer, Invitrogen) 20
-
Ligación (T4 ADN Ligasa)
-Transformación bacteriana (cepa 5K) 5
-
Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 μg/ml)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen)
-
Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 4692, 1305 y 230 pb
-
Obtención del plásmido pIV270, plásmido de transferencia que permite la clonación en la región E3 del adenovirus de una secuencia codificante bajo el control del promotor CMV (figura 1H).
15 3.2 Sustitución del promotor CMV por el promotor SV40 en plV270 Se llevaron a cabo las etapas siguientes:
-
Amplificación mediante PCR del fragmento nucleotídico que corresponde al promotor SV40, a partir del plásmido comercial pcDNAHygro (Clonetech) usando los oligonucleótidos siguientes:
-
oIV232: 5’-GGG GGG AGA TCT CCA GCA GGC AGA AGT ATG-3’ (SEC ID nº 11) -oIV233: 5’-GGG GGG GTC GAC CGA AAA GGG ATA TAC AAG CTC-3’ (SEC ID nº 12)
25 y según el procedimiento descrito en el punto 2.1 anterior, excepto que se usó una temperatura de 58ºC en lugar de 62ºC
-
Digestión enzimática de pIV270 por BglII/SalI (en React 10 Buffer, Invitrogen)
-
Digestión enzimática del fragmento de PCR por BglII/SalI
-
Ligación (T4 ADN Ligasa), transformación bacteriana (cepa 5K)
-
Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 μg/ml) 35
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción
-
Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 4692, 719, 80 y 230 pb
-
Obtención del plásmido pIV330, plásmido de transferencia que permite la clonación en la región E3 del adenovirus de una secuencia codificante bajo el control del promotor SV40 (figura 1I).
3.3 Inserción del fragmento de PCR NS5b en el plásmido de transferencia plV330 45 Se llevaron a cabo las etapas siguientes:
-
Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica la proteína NS5b (SEC ID nº 3 y 4) usando los oligonucleótidos siguientes:
-
oIV212: 5’-GGG GGG TCT AGA ATG TCA ATG TCC TAC ACA TGG AC-3’ (SEC ID nº 13) -oIV218: 5’-GGG GGG TCT AGA TTA CCG GTT GGG GAG CAG GT-3’ (SEC ID nº 14)
y según el procedimiento descrito en el punto 2.1 anterior, excepto que se usó una temperatura de 60ºC en lugar de 62ºC 55
-
Digestión enzimática del plásmido pIV330 obtenido anteriormente por XbaI (en React 2 Buffer, Invitrogen)
-
Digestión enzimática del fragmento de PCR por XbaI
-
Ligación (T4 ADN Ligasa), transformación bacteriana (cepa 5K)
-
Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 μg/ml)
-Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción 65
-
Análisis de restricción: digestión por Smal y obtención de fragmentos de: 4692, 1505, 760, 719 y 230 pb
-
Obtención del plásmido pIV336, plásmido de transferencia en la supresión E3 que contiene la secuencia NS5b bajo el control del promotor SV40 (figura 1J)
3.4 Recombinación homóloga con el genoma adenovírico recombinante plV317 para obtener el adenovirus del título Se realizaron las etapas siguientes:
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Digestión del plásmido pIV317 obtenido en el punto 2.3 anterior por SrfI (en Universal Buffer, Stratagene)
-
Digestión del plásmido pIV336 obtenido en el punto 3.3 por NheI/SacII (en BufferT, Amersham Pharmacia Biotech) y aislamiento sobre gel de agarosa del fragmento que contiene el casete pSV40-NS5b
-
Transformación bacteriana (cepa BJ) para llevar a cabo la recombinación homóloga entre los dos fragmentos plasmídicos
-
Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 μg/ml)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción
-
Análisis de restricción: digestión por Smal y obtención de fragmentos de: 6480, 4456, 3814, 3540, 3386, 2739, 2463, 2263, 2164, 1455, 1398, 1105, 909, 760, 719, 621, 230, 214 y 180 pb
-
Obtención del genoma adenovírico completo deseado, suprimido de la región E1, habiendo sido sustituida esta última por el casete de expresión pCMV-NS3-NS4, y suprimido de la región E3, habiendo sido sustituida esta última por el casete de expresión pSV40-NS5B (plásmido pIV342, figura 1K)
4. Confirmación de la expresión de los antígenos insertados en los diferentes adenovirus
La expresión de los antígenos del VHC codificados por los adenovirus AdNS3NS4, AdNS5b y AdNS3NS4NS5b ha sido verificada mediante transferencia Western después de la infección de células Huh7. Tal como se esperaba, se expresaron todos los antígenos.
Ejemplo 2: Preparación de un poxvirus según la invención que permite la expresión de las proteínas NS3/NS4 y NS5b
1.
Poxvirus MVA La cepa MVATG N33 del virus Ankara modificado fue suministrada por TRANSGENE S.A. (Estrasburgo, Francia).
2.
Preparación del plásmido de transferencia que permite la expresión del gen NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r
2.1 Construcción del vector plV250 que contiene los brazos de recombinación BRG2 y BRD2 del MVA, así como el gen de selección GPT bajo el control del promotor ph5r (MVA) seguido de un segundo promotor ph5r para permitir la expresión del gen de interés
En este punto, se desea la inserción del fragmento ph5r-GPT-BRG3-ph5r (que procede del plásmido pTG9997, Transgene) en el plásmido pTG6018 (Transgene) que contiene los brazos de recombinación BRG2 y BRD2.
Para ello, se llevaron a cabo las etapas siguientes:
-
Digestión enzimática por BamHI/SacI (en React 2 Buffer, Invitrogen) del vector pTG6018 (figura 2A)
-
Digestión enzimática por BamHI, y después digestión parcial por SacI del plásmido pTG9997 (figura 2B)
-
Purificación según el protocolo de QIAGEN del fragmento de restricción de 1047 pb que contiene la secuencia que codifica ph5r-GPT-BRG3-ph5r
-
Ligación (T4 ADN Ligasa), transformación bacteriana (cepa TGI, Statagene)
-
Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 μg/ml)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción (EcoRV+HindIII (en React 2 Buffer, Invitrogen): fragmentos de 246, 439, 476, 826 y 2789 pb; SacI: fragmentos de 915 y 3861 pb)
-
Obtención del plásmido previsto (pIV250, figura 2C).
5 2.2 Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3/NS4 Se usaron los oligonucleótidos siguientes: oIV225: 5’- GGG GGG CTG CAG ATG GCG CCT ATC ACG GCC TA -3’ (SEC ID nº 15) oIV226: 5’- GGG GGG TCT AGA TTA GCA TGG CGT GGA GCA GT -3’ (SEC ID nº 16)
y según el procedimiento descrito en el ejemplo 1, punto 2.1 anterior, excepto que se usó una temperatura de 52ºC en lugar de 62ºC.
15 2.3 Inserción del fragmento de PCR NS3-NS4 en el plásmido pIV250 Para ello, se llevaron a cabo las etapas siguientes:
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Digestión enzimática del plásmido pIV250 obtenido en el punto 2.1 anterior por PstI (en React 2 Buffer, Invitrogen)/XbaI
-
Digestión enzimática del fragmento de PCR NS3/NS4 por PstI/XbaI
-
Ligación (T4 ADN Ligasa), transformación bacteriana (cepa TG1) 25
-
Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 μg/ml)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción: (HindIII (en React 2 Buffer, Invitrogen): fragmentos de 4763 y 2789 pb; SphI (en React 6 Buffer, Invitrogen): 1534 y 5991 pb; NcoI (en React 3 Buffer, Invitrogen): 2764 y 4761 pb)
-
Obtención del plásmido de transferencia que contiene la secuencia que codifica la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r (pIV327, figura 2D).
35 3. Preparación del plásmido pIV328 que permite la expresión de la proteína NS5b bajo el control del promotor p7,5
3.1 Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica la proteína NS5b Se usaron los oligonucleótidos siguientes: oIV227: 5’- GGG GGG GTC GAC ATG TCA ATG TCC TAC ACA TGG AC -3’ (SEC ID nº 17) oIV228: 5’- GGG GGG GCA TGC TTA CCG GTT GGG GAG CAG GT -3’ (SEC ID nº 18)
y según el modo de realización descrito en el ejemplo 1, punto 2.1 anterior, excepto que usó una temperatura de 45 52ºC en lugar de 62ºC.
3.2 Obtención del plásmido Se llevaron a cabo las etapas siguientes:
-
Digestión enzimática del fragmento de PCR que codifica NS5b por SalI/SphI
-
Digestión enzimática de pTG186 (figura 2E, Transgene) por SalI/SphI 55 -Desfosforilación del vector pTG186 (fosfatasa alcalina de ROCHE)
-
Ligación (T4 ADN Ligasa), transformación bacteriana (cepa TG1)
-
Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 μg/ml)
-
Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción: (HindIII: fragmentos de 1984, 2627 y 4437 pb; BglII: fragmentos de 321, 557, 1361, 1451, 2237 y 3121 pb; KpnI (en React 4 Buffer, Invitrogen): fragmentos de: 2787 y 6261 pb)
65 -Obtención del plásmido de transferencia que contiene la secuencia que codifica el polipéptido NS5b bajo el control del promotor p7.5 (pIV328, figura 2F)
4. Preparación de los plásmidos de transferencia pIV329 y pIV344 que permiten la expresión del gen que codifica la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r, y del gen que codifica la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor p7.5
5 Para eso, se realizaron las etapas siguientes:
-
Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica la proteína NS5b a partir del plásmido pIV328 obtenido en el punto 3.2 anterior usando los oligonucleótidos siguientes:
oIV229: 5’- GGG GGG TCT AGA CCG GTA GTT CGC ATA TAC ATA -3’ (SEC ID nº 19)
oIV218: 5’- GGG GGG TCT AGA TTA CCG GTT GGG GAG CAG GT-3’ (SEC ID nº 14)
y según el procedimiento descrito en el ejemplo 1, punto 2.1 anterior, excepto que se usó una temperatura de 15 50ºC en lugar de 62ºC
-
Digestión enzimática del fragmento de PCR por XbaI
-
Digestión enzimática del plásmido pIV327 obtenido en el punto 2.3 anterior por XbaI
-
Ligación (T4 ADN Ligasa), transformación bacteriana (cepa TG1)
-
Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 μg/ml)
25 - Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de 2 clones positivos después del análisis de restricción: (PstI: pIV329: fragmentos de 3033 y 6466 pb, pIV344: 4641 y 4858 pb; ApaI (en React 4 Buffer, Invitrogen): pIV329: 454, 960 y 8085 pb, pIV344: 454, 1418 y 7627 pb; NcoI: pIV329: 4269, 469 y 4761 pb, pIV344: 3053, 1685 y 4761 pb; SmaI: pIV329: 214, 2164, 1444 y 5677 pb, pIV344: 214, 2164, 928 y 6193 pb)
-
Obtención del plásmido de transferencia que permite la expresión de la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r y de la proteína NS5b bajo el control del promotor p7.5, estando los 2 casetes de expresión orientados en el mismo sentido (pIV329, figura 2G), o del plásmido de transferencia que permite la expresión de la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r y de la proteína NS5b bajo el control del promotor p7.5, estando los 2 casetes de expresión orientados en sentidos opuestos (pIV344, figura 2H).
5. Confirmación de la expresión de los antígenos insertados en los diferentes poxvirus
Se ha verificado mediante transferencia Western, después de la infección de células Huh7 con los poxvirus en cuestión, que los poxvirus pIV329 y pIV344, que contienen las secuencias que codifican la poliproteína NS3NS4 y el polipéptido NS5b, expresaban dichos antígenos del VHC.
Ejemplo 3: Demostración de la inmunogenicidad de la combinación NS3/NS4 y NS5b
1. Inmunización de los ratones
45 Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2.1, una vez, mediante inyección intramuscular de por lo menos un adenovirus escogido de los adenovirus siguientes:
-
AdNS3NS4 preparado en el ejemplo 1 anterior (punto 2.3),
-
AdNS5b preparado en el ejemplo 1 anterior (punto 3.3),
-
AdNS5a preparado según el procedimiento del ejemplo 1, punto 2, excepto que se usaron los cebadores
nucleotídicos siguientes para amplificar la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido NS5a (SEC ID nº 55 5 y 6):
oIV172: 5’-GGG GGG GGT ACC ATG TCC GGC TCG TGG CTA AGG-3’ (SEC ID nº 20), oIV173: 5’-GGG GGG TCT AGA TTA GCA GCA GAC GAT GTC GTC-3’ (SEC ID nº 21),
en la PCR la temperatura de 62ºC se sustituyó por 56ºC, la digestión enzimática de pTG13387 y del fragmento NS5a se realizó por KpnI/XbaI, el análisis de restricción por digestión por SmaI de pTG13387 produce los fragmentos de 180 y 7251 pb, y de pTG6624 produce los fragmentos de 2263, 621, 5615, 180, 2463, 6480, 1398, 4456, 1455, 3540, 3386, 230 y 3685 pb.
65 - AdCE1E2 según el modo de realización del ejemplo 1, punto 2, excepto que se usaron los cebadores nucleotídicos siguientes para amplificar la secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína core-E1-E2 (también denominada CE1E2) (SEC ID nº 7 y 8):
oIV62: 5’-GGG GGG GCT AGC ATG AGC ACA AAT CCT AAA CCT-3’ (SEC ID nº 22) oIV68: 5’-GGG GGG TCT AGA TCA GGC CTC AGC CTG GGC TAT-3’ (SEC ID nº 23),
5 en la PCR la temperatura de 62ºC se sustituyó por 56ºC, la digestión enzimática de pTG13387 y del fragmento CE1E2 se realizó por NheI/XbaI, el análisis de restricción por digestión por SmaI de pTG13387 produjo los fragmentos de 163, 435, 2270, 180 y 5254 pb, y de pTG6624 produjo los fragmentos de 2263, 621, 3618, 163, 435, 2270, 180, 2463, 6480, 1398, 4456, 1455, 3540, 3386, 230 y 3685 pb,
-
AdNS3NS4NS5b preparado en el ejemplo 1 anterior (punto 3) y
-
AdβGal (Transgene),
15 según el protocolo siguiente:
-
109 pfu de AdNS3NS4 o
-
109 pfu de AdNS5b o
-
109 pfu de AdCE1E2 o
-
109 pfu de AdNS3NS4 y 109 pfu de AdNS5b o
-
109 pfu de AdNS3NS4, 109 pfu de AdNS5b y 109 pfu de AdNS5a
-
109 pfu de AdNS3NS4, 109 pfu de AdNS5b y 109 pfu de AdCE1E2
-
109 pfu AdNS3NS4NS5b o
-
109 pfu de Adβ-Gal como control.
25 Antes de la inmunización, se verificó mediante transferencia Western la expresión de los antígenos del VHC y de β-Gal por los diferentes adenovirus usados para la inmunización.
2. Ensayos de CTL y ELISPOT
Quince días después de la inyección, se analizó la respuesta celular aislando las células del bazo (esplenocitos) de los ratones, y se llevó a cabo un ensayo de CTL y un ensayo de ELISPOT según lo siguiente:
Para el ensayo de CTL, se cultivaron estos esplenocitos en placas de 24 pocillos en presencia de: 35
-
5 μM del epítopo GLL (GLLGCIITSL, SEC ID nº 24) en el caso de los esplenocitos que proceden de ratones que recibieron AdNS3NS4, 5 μM del epítopo ALY (ALYDVVSTL, SEC ID nº 25), o 5 μM del epítopo KLQ (KLQDCTMLV, SEC ID nº 26) en el caso de los esplenocitos que proceden de ratones que han recibido AdNS5b, o de 5 μM del epítopo DLM (DLMGYIPLV, SEC ID nº 27) en el caso de los esplenocitos que proceden de ratones que han recibido AdCE1E2, estando estos epítopos en forma de péptido sintético (Eurogentex), y
-
10 U de interleucina 2 recombinante murina (Brinster et al., Hepatology 2001) por ml en un medio mínimo esencial alfa (αMEM) durante 5 días. El 5º día, se llevó a cabo la etapa de reestimulación, que consiste en
45 añadir esplenocitos de ratones sin tratamiento previo a los esplenocitos en cultivo en presencia de dichos epítopos durante 2 días. El 7º día, se llevó a cabo el ensayo de CTL, que consiste en poner en contacto los esplenocitos de los ratones inmunizados después de 7 días de cultivo (células efectoras) y células EL4 S3-Rob HDD cargadas con 10 μM de dichos epítopos y marcadas con Cr51 (células diana). Se ha determinó la actividad citotóxica específica de las células efectoras midiendo, después de 4 h de incubación con las células diana, el Cr51 liberado tras la lisis de las células dianas, usando un aparato de recuento γ-Cobra II (Packard, Rungis, Francia). Se determinó la liberación espontánea máxima a partir de pocillos que contienen un medio solo o bien un tampón de lisis (HCl 1N). Se calculó el porcentaje específico de citotoxicidad mediante la fórmula:
55 (liberación en el ensayo - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) X 100. Se determinó la lisis específica del epítopo mediante la diferencia entre el porcentaje de lisis específica obtenido en presencia o en ausencia de dichos epítopos.
El ensayo ELISPOT se llevó a cabo cultivando los esplenocitos durante 48 horas en placas de 96 pocillos Multiscreen (Millipore) previamente recubiertas con un anticuerpo anti-interferón gamma (IFNγ (10 μg/ml final). Los esplenocitos se cultivaron en presencia de 10 μM de los epítopos apropiados, tal como se ha indicado anteriormente, y de 10 U de interleucina 2 recombinante murina por ml en αMEM. Para el control positivo, los esplenocitos se cultivaron en presencia de concanavalina A (5 μg/ml). Para el control negativo, los esplenocitos se cultivaron en presencia de un péptido no específico que pertenece a la proteína de cápside del VHC, de secuencia 65 DLMGYIPLV (asimismo denominado péptido irrelevante), o bien en medio solo sin epítopo. Los pocillos se lavaron
tres veces, respectivamente con 0,05% de PBS-Tween y después PBS, operación seguida de una incubación de 2 horas con anticuerpos anti-IFNγ de ratones biotinilados. Después de lavar, los pocillos se incubaron durante 1 hora con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante, y la actividad enzimática se reveló mediante degradación del sustrato AEC (aminoetilcarbazol). Los puntos obtenidos se contaron usando un lector ELISpot Zeiss (microscopio Zeiss con el programa KS-ELISpot).
Los resultados se indican en las figuras 3 a 5, en las que M corresponde a ratón y ratón Mneg corresponde al ratón de control.
Estos resultados demuestran que
-
AdNS3NS4 induce claramente una respuesta mediada por células específica de los antígenos expresados, tal como se ilustra en las figuras 3A y 3B, mediante la detección de linfocitos T específicos del epítopo GLL contenido en NS3.
-
AdNS5b induce claramente una respuesta mediada por células específica de los antígenos expresados, tal como se ilustra en la figura 4, mediante la detección de linfocitos T específicos del epítopo ALY y KLQ contenidos en NS5b.
-
AdCE1E2 induce claramente una respuesta mediada por células específica de los antígenos expresados, tal como se ilustra en la figura 5, mediante la detección de linfocitos T específicos del epítopo DLM contenidos en la proteína Core.
3. Ensayo de prueba in vivo usando un virus de vacuna recombinante
Con el fin de evaluar si las respuestas inmunitarias específicas inducidas por los diferentes adenovirus fueron capaces de inducir protección contra una prueba de enfermedad infecciosa (“protección in vivo”), los ratones vacunados se sometieron a dicha prueba.
Como el ratón no se puede infectar directamente por el VHC, para relacionar la inducción de una respuesta inmunitaria específica y la resistencia a una infección, se usó un virus de vacuna recombinante (cepa WR) que codifica las proteínas no estructurales del VHC (NS2 a NS5b) a fin de llevar a cabo esta prueba. Este virus recombinante de la vacuna, después de una inyección intraperitoneal de 107 pfu al ratón, se replicará en el animal. La replicación de este virus induce una respuesta inmunitaria tanto específica de los antígenos de la vacuna como específica de los antígenos del VHC, puesto que expresa asimismo las proteínas NS del VHC. Esta respuesta específica de los antígenos del VHC será lo más eficaz y vigorosa por cuanto que los ratones habrán recibido ya una vacuna que expresa los antígenos del VHC. En otras palabras, cuanto más eficaz (es decir, el sistema inmune de los ratones ha sido “cebado” eficazmente por la vacuna) haya sido la vacunación (en el presente caso, realizada con los adenovirus recombinantes), más fuerte será la respuesta anti-VHC generada después de la prueba por el virus recombinante de la vacuna y, en consecuencia, más “protegidos” estarán los ratones contra esta prueba. En la práctica, cuanto más bajo sea el recuento de virus residual de la vacuna en los ratones, más eficaz habrá sido la protección o la neutralización debida a la vacunación.
La neutralización del virus de la vacuna refleja tanto la respuesta celular inducida por las proteínas del VHC como por las proteínas de la vacuna. La neutralización se evalúa mediante titulación del virus residual de la vacuna a partir de los ovarios de los animales, según lo siguiente: los ovarios se extraen 4 días después de la prueba, se someten a ultrasonidos, se congelan-descongelan 3 veces y, después de la centrifugación, se titulan diluciones sucesivas de sobrenadante según la técnica de las placas de lisis (Murata et al., PNAS, vol. 100, p. 6753-6758) sobre células Hutk-. Los títulos víricos se determinan en pfu/ml/mg de ovario.
4. Demostración de una protección superior de una vacunación que combina la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b
El título de virus recombinante de la vacuna se determinó para 4 grupos de 8 ratones inmunizados mediante las combinaciones de adenovirus siguientes: AdNS3NS4 + AdNS5b (1er grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b + AdNS5a (2º grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b +AdCE1E2 (3er grupo) y AdβGal (4º grupo).
Los resultados, presentados en la figura 6, se tratan de manera estadística basándose en el ensayo no paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney (Méthodes Statistiques a l’usage des médecins et des biologistes, Collection Statistique en Biologie et en Médecine, Flammarion Medecine Sciences, (D. Schwartz), 1977) que se basa en una comparación de las medias, y permite la comparación de los valores de dos muestras x e y independientes.
Este ensayo se realiza como sigue: todos los valores de los dos grupos x e y a comparar se clasifican de manera creciente. Después, se atribuye un rango a cada valor, y se calcula la suma de los rangos. Se obtienen entonces Wx y Wy. Se calcula entonces un valor de referencia denominado (Wx)t (valor teórico en la hipótesis nula en la que Wx no es diferente de Wy) y se relaciona mediante la relación: n(N+1)/2, siendo n = número de ratones ensayados en el
grupo x y N = número de ratones ensayados en los grupos x e y.
Si Wx es inferior a (Wx)t (nivel residual bajo de virus de la vacuna en los ratones), entonces se puede concluir que la neutralización debida a la vacunación es significativamente eficaz. Si se considera el ejemplo del grupo AdNS3NS4S5b representado por x en comparación con el grupo AdβGal
representado por y, se obtienen los valores siguientes: Wx = 1+2+4+6+8+11+13+14= 59 (8 ratones ensayados)
Wy = 3+5+7+9+10+12+15+16= 77 (8 ratones ensayados) Bajo la hipótesis nula, Wx no es diferente de Wy, y el valor esperado es: (Wx)t = (1/2)*8*17= 68. Wx < (Wx)t, lo cual significa que los valores obtenidos en el grupo AdNS3NS4NS5b son más pequeños que aquellos
obtenidos en el grupo AdβGal, y que la neutralización debida a la vacunación es significativamente eficaz. Los valores estadísticos para los otros grupos de ratones se indican en la tabla 1 siguiente: Tabla 1
Grupo/AdβGal
Wx (Wx)t
AdNS3NS4 + NS5b
52 68
AdNS3NS4 + NS5b + NS5a
68 68
AdNS3NS4 + NS5b + CE1E2
74 68
Los valores en la tabla 1 anterior muestran que sólo una vacunación de los ratones mediante la combinación de los adenovirus NS3NS4 y adenovirus NS5b es capaz de inducir una neutralización significativa de la replicación del virus de la vacuna usado en la prueba con respecto al grupo de ratones de control vacunados mediante AdβGal. Las vacunaciones llevadas a cabo usando las combinaciones que comprenden (AdNS3NS4 + AdNS5b + AdNS5a) o (AdNS3/NS4 + AdNS5b + AdCE1E2), no dan como resultado una diferencia significativa con respecto al grupo de ratones de control inmunizados mediante AdβGal.
Estos resultados permiten por lo tanto demostrar, de manera inesperada, la protección superior de una vacunación que combina la poliproteína NS3NS4 y el polipéptido NS5b.
5. Confirmación de la protección de una vacunación que combina la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b expresados conjuntamente por el mismo vector
El título de virus recombinante de la vacuna se determinó para 3 grupos de 8 ratones inmunizados por las combinaciones de adenovirus siguientes: AdNS3NS4NS5b (1º grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b (2º grupo) y AdβGal (3º grupo).
Los resultados, daos en la figura 7, se tratan de manera estadística basándose en el ensayo no paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney, como se describe en el experimento anterior.
Los valores estadísticos para los grupos 1 y 2, comparados con el grupo de control AdβGal, se indican en la tabla 2 siguiente:
Tabla 2
Grupo/AdβGal
Wx (Wx)t
AdNS3NS4NS5b
49 68
AdNS3NS4 + NS5b
53 68
Los valores en la tabla 2 anterior muestran que la vacunación de los ratones por un adenovirus que codifica tanto los tres antígenos NS3, NS4 y NS5b, como la combinación de los adenovirus NS3NS4 y adenovirus NS5b, es capaz de inducir una neutralización significativa de la replicación del virus de la vacuna usado en la prueba, con respecto al grupo de ratones de control vacunados mediante el AdenoβGal. Este resultado confirma la protección de una vacunación que combina la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b expresados conjuntamente por un mismo vector.
Ejemplo 4: Programa de inmunización acelerado induce una respuesta de células T potente, de laga duración y de protección cruzada
La vacuna vectorizada en MVA candidata, que expresa tres antígenos víricos descritos en el ejemplo 2, se evaluó en modelos de ratón transgénico HLA clase I de un virus de la hepatitis C (VHC) para determinar su capacidad para
estimular respuestas mediadas por CD8+ y CD4+. Una vacunación acelerada (a base de tres semanas) indujo células T CD8+ específicas que poseen dos funciones efectoras (actividad citolítica -tanto in vitro como in vivo- y producción de IFNγ) así como células T CD4+ específicas que reconocen los tres antígenos víricos. Las respuestas fueron de larga duración (6 mees), revacunables mediante una cuarta vacunación de MVA, y de protección cruzada, como se demuestra en el ensayo de exposición a base de Listeria sucedánea.
1. Introducción
Aproximadamente el 3% de la población mundial está infectada con el virus de la hepatitis C (VHC) (Shepard et al., 2005, Lancet 5558-5567), y alrededor de 80% de las personas infectadas desarrollan una infección crónica que conduce a insuficiencia hepática en el 4% de los casos. El tratamiento estándar que combina interferón α (IFN-α) y ribavirina es eficaz en alrededor de la mitad de los pacientes tratados; sin embargo, está asociado con una toxicidad y coste significativos, y sigue estando contraindicado en un número no insignificante de casos. Se están desarrollando nuevas terapias, principalmente dirigidas a proteasa o polimerasa vírica (Dev et al., 2004, Current Gastroenterology Reports 677-686). Sin embargo, los datos clínicos preliminares indican que estos nuevos antivirales presentan una baja eficiencia cuando se usan como una terapia por sí sola, y parece claro que el campo terapéutico contra VHC se dirige a una asociación compleja de múltiples fármacos caros. La necesidad de estrategias terapéuticas alternativas, que se basan en mecanismos complementarios a los explotados actualmente por moléculas antivíricas candidatas, está bien reconocido.
Los estudios en seres humanos y en chimpancés han indicado que el fracaso para generar respuestas inmunitarias amplias y de larga duración mediadas por linfocitos T CD4+ y CD8+ específicas de VHC durante la fase aguda de la infección se correlaciona con el desarrollo de cronicidad (Shoukry et al., 2004, Annual Review of Microbiology , 58391-58424). Por el contrario, los pacientes que presentan una respuesta funcional y mantenida mediada por linfocitos T Th1 CD4+, asociada con el montaje de linfocitos T CD8+ efectores madurados y multifuncionales, ejercen un control más eficiente de la viremia, y tienen tendencia a evolucionar hacia la recuperación (Lauer et al., 2004, Gastroenterology 127(3), 924-936); Urbani et al., 2001, Hepatology 33, 1533-1543; Lechner et al., 2000, J. Exp. Med. 191, 499-512; Thimme et al., 2001, J. Exp. Med. 194, 1395-406; Bowen et al., 2005, Nature 436, 946-52; Cox et al., 2005, Hepatology 42, 104-112). Múltiples estudios han establecido que antígenos no estructurales, y en particular NS3, son las dianas preferentes de respuestas asociadas con aclaramiento vírico natural o terapéutico (Vertuani et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 144-54; Diepolder et al., 1997, J. Virol. 71, 6011-9; Smyk-Pearson et al., 2006, J. infect. Dis. 194, 454-63). Por el contrario, aunque el campo está avanzando rápidamente debido a nuevos ensayos desarrollados recientemente, la contribución de anticuerpos anti-VHC en el resultado de la infección sigue siendo controvertida, puesto que estos anticuerpos están presentes típicamente como consecuencia de la cronicidad continuada (Bartosch et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 14199-204; Logvinoff et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 10149-54 ; Maunier et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 4560-5).
Durante los últimos diez años, se han realizado un amplia variedad de esfuerzos de vacunas contra VHC. Se han ensayado diversas formulaciones, comprendidas entre las proteínas recombinantes con adyuvante clásicas y vacunas a base de células dendríticas, en ratones, macacos y, para unos pocos, en chimpancés (Martin et al., 2006, Drug Discovery Today 3206-9). Es sorprendente observar que sólo se han evaluado hasta ahora unas pocas vacunas a base de vectores, tales como ADN recombinante (Foms et al., 1999, Vaccines 17, 1992-2002; Rollier et al., 2004 J. Virol. 78, 187-96), bacterias recombinantes (Wedemeyer et al., 2001, Gastroenterology 121, 1158-66) o adenovirus (Arribillaga et al., 2002, Vaccine 21, 202-210; Folgori et al., 2006, Nature Medicine 12, 190-7). Lo más sorprendente, uno de los vectores de vacuna conocidos más seguros usados hasta la fecha en clínica, a saber, la cepa Ankara del virus de la vacuna no replicativo modificado (MVA), rara vez se ha evaluado con respecto al desarrollo de vacunas contra VHC. Esta cepa tremendamente atenuada del virus de la vacuna, que se ha usado en la campaña de erradicación de la viruela, ha demostrado un perfil de seguridad en más de 10.000 personas (Mayr et al., 1978, Zentralbl. Bakteriol. 167, 375-90; Mahnel et al., 1994, Bert. Muench. Tieraerztl. Wochenschr. 107, 253-6). En el caso de VHC, hasta ahora sólo se han dado a conocer dos estudios preclínicos basados en vacunas de MVA: uno que describe candidatos de MVA que expresan las glucoproteínas E1 y E2 de la cubierta del VHC, ya sea como inmunógenos dirigidos contra el tipo salvaje o contra la membrana (Abraham et al., 2004, Vaccine 22, 3917-28), y el otro que da a conocer una vacuna que combina dos MVA que expresa las tres proteínas estructurales (Core, E1 y E2), así como la proteína 3 no estructural (Rollier et al., 2004, J. Virol 78, 187-96). Sin embargo, se han observado resultados alentadores con vacunas a base de MVA en el campo del desarrollo de vacunas contra el VIH o la malaria, en el que numerosos estudios implican a vacunas de MVA candidatas ya sea usadas solas o en combinaciones sensibilización-revacunación (Hanke et al., 1998, J. Gen. Virol; 79, 83-90; Gilbert et al., 2002, Vaccine 20, 1039-45; Prieur et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 290-5). Estos estudios han pasado desde evaluaciones llevadas a cabo en modelos murinos transgénicos HLA-A2 hasta pequeños primates no humanos y a ensayos clínicos (Hanke et al., 2007, J. Gen. Virol. 88, 1-12; Webster et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 4836-41). Otro poxvirus que se ha ensayado en el campo de las vacunas de VHC es un virus recombinante de VHC de la viruela del canario, que se informó que inducía respuestas inmunitarias de células T potentes, aunque este candidato sólo se ha ensayado en un régimen de sensibilización a ADN-revacunación con virus de la viruela del canario (Pancholi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182, 18-27). El perfil de seguridad superior de MVA, combinado con su potencial inmunógeno poderoso, argumenta de forma no ambigua a favor de desarrollar una vacuna potente a base de MVA de VHC, tanto para aplicación profiláctica como terapéutica.
Con el fin de desarrollar una vacuna de VHC segura, poliantigénica, a base de células T, se ha manipulado mediante ingeniería y se ha evaluado preclínicamente una vacuna de MVA recombinante candidata que codifica las proteínas no estructurales (NS) del VHC: NS3, NS4 y NS5B. Se informa en la presente memoria de que un programa acelerado de vacunación usando esta vacuna es capaz de inducir respuestas mediadas por linfocitos T CD4+ y CD8+ dirigidas a los tres inmunógenos de la vacuna y que reconocen epítopos de células T de clase I reconocidos durante la infección natural. Las respuestas potentes y específicas mediadas por células T CD8+ son de larga duración (detectables hasta 6 meses), y se pueden recordar eficientemente cuando se revacunan en un momento posterior con la NS34-NS5B de MVA original. Usando un modelo de exposición basado en Listeria monocytogenes recombinante de VHC que puede infectar al hígado, se demuestra que el programa acelerado de vacunación con la NS34-NS5B de MVA da como resultado respuestas in vivo de protección cruzada.
2. Materiales y Métodos
2.1. Péptidos sintéticos y proteínas recombinantes
Todos los péptidos sintéticos y proteínas recombinantes usados se derivaron de una secuencia del genotipo 1b (HCV-JA) (Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9524-8). Los péptidos (Eurogentec) derivaron de los antígenos de NS3: CVNGVCWTV (denominado CVN, que corresponde a los aa 1073 a 1081 en la poliproteína del HCV; SEC ID nº: 28), GLLGCIITSL (GLL, aa 1038 a 1047; SEC ID nº: 24), KLTGLGLNAV (KLT, aa 1406 a 1415; SEC ID nº: 29), WPAPPGARSM (WPA10, aa 1111 a 1121: SEC ID nº: 30), LSPRPVSYLK (LSP10, aa 1152 a 1162; SEC ID nº: 31) o NS5B: ALYDVVSTL (ALY, aa 2594 a 2602; SEC ID nº: 25). Como péptido irrelevante, se usó un péptido derivado del Core de VHC: HCV DLMGYIPLV (DLM, aa 132 a 140; SEC ID nº: 27). Los péptidos se disolvieron en 100% de DMSO a una concentración de 10 mM, y se almacenaron a -20ºC hasta su uso. Las proteínas recombinantes de NS3 helicasa (aa 1192 a 1457) y NS5B (aa 2420 a 2989) se expresaron en el laboratorio en E. coli, y se produjeron libres de endotoxinas con una pureza de >95%. La proteína de NS4 recombinante se obtuvo de Mikrogen. Como proteína irrelevante, se usó el toxoide tetánico (TT, Sanofi Pasteur).
2.2. Construcción de NS34-NS5B de MVA recombinante
El plásmido usado para la recombinación homóloga en el sitio correspondiente a la denominada supresión III del genoma de MVA se basó en el plásmido pTG1E (Braun et al., 2000, Gene Ther. 7, 1447-57). Las secuencias de flanqueo (BRG3 y BRD3) que rodean a la supresión III se amplificaron mediante PCR a partir de ADN de N33 de MVA (Sutter y Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51). El plásmido de transferencia también contuvo una fusión entre la proteína fluorescente verde potenciada con Aequorea victoria (gen eGFP, aislado de pEGP-C1, Clontech) y el gen de xantina-guanina fosforribosiltransferasa de E. coli (gen gpt) bajo el control del promotor sintético del virus de la vacuna temprano-tardío p11K7.5 (regalado amablemente por R. Wittek, Universidad de Lausanne). La síntesis de xantina-guanina fosforribosiltransferasa permitió que MVA recombinante GPT+ formara placas en un medio selectivo que contiene ácido micofenólico, xantina, e hipoxantina. eGFP permite la visualización de las placas de MVA recombinante. Cuando se logró la selección de clones, el marcador de selección eGFP-GPT, colocado entre dos secuencias homólogas en la misma orientación, se eliminó mediante varias pasadas sin selección. Las secuencias que codifican los genes de NS3NS4 y NS5B a partir de la cepa HCV-JA del genotipo 1b de VHC se amplificaron mediante PCR. El gen de NS3NS4 se insertó en el plásmido de transferencia en dirección 3’ del promotor pH5R (Rosel et al., 1986, J. Virol. 60 436-49), dando lugar a pTG16639. El gen de NS5B se insertó en dirección 3’ del promotor p7.5K (Cochran et al., 1985, J. Virol. 54, 30-7) en la misma orientación que el gen de NS3NS4 en pTG16639, dando lugar al plásmido de transferencia final pTG16643. La generación de NS34-NS5B de MVA (MVATG16643) se llevó a cabo mediante recombinación homóloga en fibroblastos de embriones de pollo primarios (CEF). pTG16643 se transfectó según la precipitación de ADN con fosfato de calcio estándar sobre CEF previamente infectado con N33 de MVA a una MOI de 0,1 pfu/célula. La selección vírica se llevó a cabo mediante tres rondas de purificación en placa en presencia de un medio selectivo que contiene ácido micofenólico, xantina e hipoxantina sobre CEF, y después el marcador de selección se eliminó mediante pasada en medio no selectivo. La ausencia de contaminación mediante MVA progenitora se verificó mediante PCR.
2.3. Estudios de expresión in vitro
La expresión de los antígenos de NS3, NS4 y NS5B se examinó mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo tras la infección con NS34-NS5B de MVA de células de hepatoma Huh-7 humanas. Para el análisis de inmunofluorescencia, se colocaron cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos tratadas con 0,2% de gelatina durante 10 minutos antes de colocar las células Huh-7 (106 por pocillo) en los pocillos. Las monocapas celulares se infectaron con vectores de MVA (NS34-NS5B de MVA, o N33 de MVA como control negativo) a una MOI de 0,33. Veinticuatro horas más tarde, los cubreobjetos se lavaron en PBS, se fijaron con 4% de PFA y se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 en PBS. Los anticuerpos primarios se aplicaron durante 1 h a temperatura ambiente (suero anti-NS4B policlonal de conejo y anticuerpo anti-NS5B monoclonal murino 5B12b7, proporcionados amablemente por R. Bartenschlager y D. Moradpour respectivamente). Entonces se añadieron durante 30 minutos anti-IgG de ratón de pollo conjugado con Alexa-Fluor 488 (Molecular Probes) y (Fab)2 de oveja anti-IgG de conejo conjugado con Cy3 (Sigma). Los cubreobjetos se montaron en glicerol al 80% en presencia de 10 μg/ml de Hoechst,
y las tiras se observaron con un microscopio Carl Zeiss Axioplan. Las imágenes se tomaron con una cámara digital AxioCam Color. Para el análisis de citometría de flujo, se infectaron 106 células Huh-7 por pocillo, sembradas en placas de 6 pocillos, con vectores de MVA a una MOI de 1. Veinticuatro horas más tarde, las células se recogieron, se fijaron con reactivo Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson) durante 10 minutos y se lavaron con reactivo PermWash (Becton Dickinson). La tinción se llevó a cabo usando anticuerpo monoclonal anti-NS3 8D8E1 (bioMerieux), anticuerpo anti-NS4B 1B12A3 (bioMerieux) y anticuerpo anti-NS5B 5B12b7 (proporcionado por D. Moradpour) añadidos a 2.105 células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se añadió anti-IgG de ratón de conejo conjugado con RPE (Dako) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se resuspendieron en 1% de FCS-PBS, y se analizaron mediante citometría de flujo usando un citómetro FacsCalibur (Becton Dickinson).
2.4 Ratones
Se usaron ratones Balb/c comerciales (Charles River) y transgénicos HLA-A2.1 y HLA-B7.2 eliminados en H-2 clase
I. Los ratones HLA-A2.1 expresaron una molécula de histocompatibilidad clase I monocatenaria transgénica, en la que el término C de la β2m humana está enlazado covalentemente al término N de una cadena pesada quimérica (dominios transmembránicos e intracitoplásmicos de HLA-A2.1 α1-α2, H-2Db a3 (Pascolo et al., 1997, J. Exp. Med. 185, 2043-51). Los ratones HLA-B7.2 expresaron una cadena pesada HLA-B*0702 quimérica compuesta de los dominios α1-α2 de HLA-B*0702 humana con un dominio H-2Db a3 murino (Rohrlich et al., 2003, International Immunol. 15, 765-72). Los ratones se alojaron en PBES (Plateau de Biologie Experimentale de la Souris, Lyon) en instalaciones apropiadas para el cuidado de animales, y se manipularon según las guías internacionales requeridas para los experimentos con animales.
2.5. Protocolos de inmunización
En cada experimento se usaron ratones de 6 a 8 semanas (2 a 6 por grupo). En primer lugar, se compararon dos programas de inmunización de MVA. Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas (sc) en la base de la cola con 107 pfu de NS34-NS5B de MVA o N33 de MVA, ya sea 3 inyecciones a un intervalo de 3 semanas (programa 1) o 4 inyecciones, 3 a un intervalo de 1 semana y la cuarta 3 semanas más tarde (programa 2). Entonces se seleccionó para experimentos adicionales que incluye 3 inyecciones a un intervalo de 1 semana. Para el análisis de respuestas de memoria de recuerdo, los ratones recibieron una cuarta inyección de MVA a los 6 meses (semana 27) después de la primera inmunización.
2.6 Ensayos de ELISPOT
Se cultivaron esplenocitos (2x105 células por pocillo), tratados con tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma), en pocillos triplicados durante 40 h en placas con fondo de nitrocelulosa de múltiples tamices (Millipore) revestidas con un anticuerpo monoclonal anti-IFNγ de ratón (Pharmingen) en medio de cultivo αMEM completo (GIBCO BRL) suplementado con IL-2 recombinante murino a 10 μg/ml (Pedro-Tech EC LTD) sólo como control negativo, o con 10 μM de péptido o 2 μg/ml de proteína o 5 μg/ml de concavalina A como control positivo. Las células productoras de IFNγ se cuantificaron mediante ensayo de inmunomancha enlazado a enzima específico de IFNγ (ELISPOT) como se describe previamente (Martin et al., 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405). La selección positiva de células T CD4+ se llevó a cabo mediante clasificación celular magnética usando microperlas de CD4(L3T4) (Myltenyi Biotech) según las instrucciones del fabricante, y la eficiencia de la selección positiva se evaluó mediante citometría de flujo, y el porcentaje de células T CD4+ se encontró siempre superior a 88% con menos de 2,1% de células T CD8+. Las fracciones total de CD4+ y del efluente se analizaron separadamente. El número de manchas, que corresponde a las células T productoras de IFNγ, detectadas en pocillos de control negativo, se restó del número de manchas detectadas en pocillos experimentales. Los resultados se muestran como el valor medio obtenido para pocillos triplicados. Una respuesta se considera positiva si el número de manchas fue mayor que 40 manchas por 106 células.
2.. Tinción de citocinas intracelulares (ICS)
Se llevó a cabo ICS sobre esplenocitos procedentes de animales individuales. De forma breve, tras la lisis de glóbulos rojos, se incubaron 2x106 células por pocillo de placa de 96 pocillos de fondo plano en medio de cultivo completo αMEM suplementado con IL-2 recombinante murina, a 10 μg/ml sólo como control negativo o con 10 μM de péptido o 2 μg/ml de proteína. Tras la incubación durante toda la noche, se añadió GolgiStop (Becton Dickinson) a una concentración final de 0,67 μl/ml durante 6 h. Las células se cosecharon entonces en placas de 96 pocillos de fondo en V, y se lavaron con 1% de FCS-PBS. La tinción se llevó a cabo usando anticuerpos monoclonales (Mab) contra CD3 (Mab de hámster anti-CD3e-PE) y CD8 (Mab de rata anti-CD8a-APC) (todos ellos de Becton Dickinson) en 1% de FCS-PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras lavar, las células se fijaron y permeabilizaron con Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson), y se lavaron dos veces con disolución Perm/Wash. Se añadieron anticuerpos anti-IFNγ de ratón conjugado con Alexa488 (Becton Dickinson) durante 15 minutos a temperatura ambiente, y, después de lavar, las células se resuspendieron en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células CD3e+, CD8a+ se clasificaron acotadamente y se representaron en una gráfica de puntos de dispersión lateral de IFNγ y se determinaron los porcentajes de población de células T IFNγ+ CD8+.
2.8. Ensayos in vitro e in vivo de células T citotóxicas (CTL)
Las condiciones para los ensayos de CTL in vitro se han descrito previamente (Brinster et al., 2001, Hepatology 34, 1206-17). De forma breve, tras la reestimulación en el día 5, se llevaron a cabo ensayos de CTL en el día 7 usando como efectoras células estimuladas. Como células diana, se usaron células EL4S3-Rob HHD teñidas con 51Cr cargadas con 10 μm del péptido seleccionado, o no cargadas (control negativo). Las lisis espontánea y total se determinaron a partir de pocillos que contienen células diana, cargadas con péptido o no, ya sea en medio sólo o en tampón de lisis (HCL 1N), respectivamente. La citotoxicidad específica se calculó usando la fórmula: (liberación en el ensayo – liberación espontánea) / (lisis total – liberación espontánea) x 100. Para cada relación de células efectoras/células diana, los datos se expresan como la media de resultados duplicados. Una respuesta se considera positiva si el porcentaje de lisis específica fue mayor que 20% y por lo menos 10% superior al obtenido para ratones inmunizados con N33 de MVA.
Los ensayos de CTL in vivo se llevaron a cabo como se describió (Beloeil et al., 2003, J. Immunol. 171, 2995-02), con modificaciones pequeñas. De forma breve, se obtuvieron suspensiones de esplenocitos a partir de ratones singénicos, y se ajustó a 20x106 células/ml después de la lisis de glóbulos rojos. La mitad de las células se incubó con péptido GLL a 10 μM de concentración final durante 1 h a 37°C, mientr as que la segunda fracción se dejó sin pulsar. Entonces se añadió éster succinimidílico de diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína (CFSE) (Molecular Probes) a 1 μM (CFSEbajo) a las células no pulsadas y a 10 μM (CFSEelevado) a células pulsadas con el péptido, durante 10 minutos. Después de lavar, ambas poblaciones se mezclaron y se transfirieron 20x106 células totales a ratones
CFSEelevado
mediante inyección intravenosa retroorbital. De este modo, la población de representó dianas específicas que se supone que serían lisadas por CTL, y la población de CFSEbajo fue una referencia interna que permite la normalización del ensayo. Los esplenocitos procedentes de ratones receptores se analizaron 24 h más tarde mediante citometría de flujo, para detectar las células diana marcadas con CFSE. Se calculó la relación entre las dianas pulsadas con el péptido y las dianas no pulsadas inyectadas en un ratón dado (relación R = número de células de CFSEelevado / número de células de CFSEbajo). El porcentaje de lisis específica, aquella actividad citolítica normalizada entre ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA y con N33 de MVA (control), se determinó mediante la siguiente fórmula: % de lisis específica = [1-(R inmunizado / R control)] x 100%, en la que R control es la relación R más elevada obtenida para 2 ratones inyectados con N33 de MVA.
2.9. Inmunidad protectora en modelo de exposición sucedánea
La protección se evaluó usando un modelo de exposición sucedánea basado en la cepa recombinante de Listeria monocytogenes que produce una proteína NS3 de VHC derivada de una secuencia del genotipo 1a (aislado HCV-1) TC-LNS3 (Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80). Los ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA recibieron una inyección i.v. con 1 LD50 (9.107 unidades formadoras de colonias (CFU) para ratones con antecedentes genéticos de C57BL6 como ratones HLA-A2, 3.107 CFU para ratones Balb/c) de TC-LNS3 en 100 μl de PBS 2 semanas después de la última inmunización con MVA. Como grupo de control negativo, se usaron ratones inmunizados con N33 de MVA, y, como control positivo, se usaron ratones que se inmunizaron 1 ó 2 veces a un intervalo de 2 semanas con 0,05 a 0,1 LD50 de TC-LNS3 (dosis de inmunización). Dos días después de la exposición bacteriana, se retiraron los bazos e hígados de los ratones individuales, se pesaron, se homogeneizaron y se diluyeron en serie en PBS/0,1% de Triton. Estas diluciones se colocaron en placas sobre agar de infusión de cerebro-corazón. Después de 2 a 3 días a temperatura ambiente, se calculó el número de CFU, los resultados se dieron en valores de Log CFU / mg de tejido procedentes de un ratón individual.
2.10.
Análisis estadístico.
Se llevaron a cabo análisis de las respuestas de CTL, respuestas de ELISPOT de IFNγ, y del efecto protector, usando un ensayo de Mann-Whitney.
3.
Resultados
3.1. Diseño y expresión in vitro de un único MVA recombinante que codifica las proteínas NS3, NS4 y NS5B de VHC
Se diseñaron dos vectores de MVA recombinantes, que codifican cada uno las proteínas NS3NS4 de VHC bajo el promotor de ph5r, y la proteína NS5B bajo el promotor p7.5. Ambos casetes de expresión se clonaron en la supresión III de la cadena de MVA, ya sea en la misma orientación o en una orientación opuesta. El análisis de transferencia Western reveló una expresión incrementada de los tres antígenos clonados cuando los dos casetes de expresión se insertaron en la misma orientación (datos no mostrados). De este modo, el vector de MVA que contiene ambos casetes de expresión en la misma orientación, denominado MVA NS34-NS5B, se seleccionó para estudios posteriores. La expresión de los antígenos de NS3, NS4 y NS5B in vitro se caracterizó mediante citometría de flujo y análisis de inmunofluorescencia tras la infección con NS34-NS5B de MVA de las células Huh-7. Los análisis de citometría y de flujo mostraron expresión clara de los tres antígenos (figura 8). Aunque el porcentaje de células que expresan tras la infección parece idéntico para los tres antígenos codificados, la medida de la intensidad media de
fluorescencia (MFI) sugirió una expresión más débil de la NS5B, probablemente debido a una menor fortaleza del promotor p7.5 en comparación con el promotor ph5r. Fue de esperar la colocalización de los antígenos expresados en el citoplasma de células infectadas basándose en propiedades conocidas de los antígenos (Penin et al., 2004, Hepatology 39, 5-19), y de hecho se confirmó en los análisis de inmunofluorescencia.
3.2. Un programa de vacunación acelerado con NS34-NS5B de MVA induce células T CD8+ específicas que presentan dos funciones efectoras comparables con las obtenidas siguiendo un programa clásico más prolongado.
El montaje de respuestas inmunitarias tras la vacunación a base de MVA se ha analizado típicamente después de 23 inyecciones de vacunas candidatas administradas 2-4 semanas separadas entre sí (Gilbert et al., 2002, Vaccine 20, 1039-45; Vazquez-Blomquist et al., 2004, Biotechnol. Applied Biochem. 39, 313-8). Aún, puede merecer la pena montar rápidamente de hecho respuestas inmunitarias específicas para intentar minimizar el impacto de la antiinmunidad desarrollada por vectores, así como tener un impacto más rápido sobre la carga viral y/o la evolución de la enfermedad en casos de vacunación terapéutica. Basándose en datos recientes, muy alentadores, obtenidos en la clínica con una vacuna de MVA a base de VHP (virus del papiloma humano), administrada según un programa acelerado (Transgene Abstract, EUROGIN 2006), se decidió comparar en primer lugar dos programas diferentes de vacunación uno al lado del otro. Los ratones transgénicos HLA-A2 recibieron, subcutáneamente, 3 inyecciones a un intervalo de 3 semanas (programa 1) o 3 inyecciones a un intervalo de 1 semana, seguido de una cuarta inyección 3 semanas más tarde (programa 2), de 107 pfu de NS34-NS5B de MVA o N33 de MVA (virus de tipo salvaje usado como control negativo). Se investigaron las respuestas de células T CD8+ inducidas mediante ensayos in vitro de CTL y ELISPOT de IFNγ a dos puntos de tiempo para cada programa, ya sea 2 semanas después de la segunda y tercera inyección para el programa 1 (semana 6 y 9) o 2 semanas después de la tercera y cuarta inyección para el programa 2 (semana 5 y 8) (figura 9). Como se muestra en la figura 9A, ambos programas de inyección dieron como resultado la inducción de células productoras de IFNγ específicas para dos epítopos restringidos a HLA-A2 (GLL y KLT) localizados en la proteína NS3 y que se sabe que son reconocidos durante la infección natural (Martin et al., 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405; Ward et al., 2002, Clin. Exp. Immunol. 128, 195-203). Se observó un número similar de manchas con ambos programas: se observó un número elevado para el epítopo GLL (hasta 1000 manchas), de cuerdo con las observaciones que describen a GLL como epítopo dominante en ratones HLA-A2 (Martin et al., 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405), mientras que las respuestas fueron más débiles frente al epítopo KLT (hasta 200 manchas). Aunque la frecuencia de las células positivas específicas de GLL disminuyó con el tiempo y se encontró que era menor dos semanas tras la inyección final para ambos programas (semana 9 para el programa 1 y 8 para el programa 2, figura 9B), el número observado global de manchas siguió siendo comparable para ambos programas. La respuesta específica de KLT se perdió en ese momento (datos no representados). Se detectó elevada actividad citotóxica frente al péptido GLL usando ambos programas en el primer punto del tiempo estudiado (semana 6 para el programa 1, y semana 5 para el programa 2) (figura 10A), mientras que se observaron menores porcentajes de lisis específica tras la última revacunación (semana 9 y 8) (Fig. 10B). Se detectó una actividad citotóxica débil pero específica dirigida hacia el epítopo ALY de NS5B subdominante para los 2 ratones después de 3 inyecciones (Fig. 10A), y un ratón después de 4 inyecciones siguiendo el programa 2 (Fig. 10B). En conjunto, estos resultados sugieren que 2 inyecciones a intervalos de 3 semanas indujeron actividades citotóxicas específicas de NS3 similares y frecuencias de células T productoras de IFNγ que las obtenidas por 3 inyecciones a un intervalo de 1 semana. Una inyección de revacunación adicional, independiente del programa (la tercera inyección para el programa 1 o la cuarta para el programa 2), no potenció estas respuestas. Entonces se llevaron a cabo experimentos adicionales basados en el programa 2 de vacunación, denominado como programa de inmunización “acelerado”.
3.3. La vacunación acelerada con la NS34-NS5B de MVA induce un porcentaje significativo de células T CD8+ productoras de IFNγ y que presentan actividad lítica in vivo potente
Para caracterizar adicionalmente la inmunogenicidad del programa de vacunación generado, se investigó, en ratones transgénicos HLA-A2, la capacidad de células T CD8+ inducidas para producir IFNγ mediante tinción citocínica de IFNγ intracelular (ICS), así como su potencial citotóxico in vivo. El análisis de ICS, llevado a cabo dos semanas después de la tercera inyección (Figura 11A), indicó que los 4 animales inmunizados presentaron un porcentaje elevado de células T CD8+ específicas de GLL productoras de IFNγ (que oscila desde 1,13 a 2,3%, porcentaje de la mediana de 1,7%). Se examinó la capacidad exterminadora in vivo de células T CD8+ efectoras específicas transfiriendo esplenocitos diana marcados con CFSE pulsados con péptido GLL en ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA o con N33 de MVA, 2 semanas después de la tercera inyección. Después de la transferencia, las dianas pulsadas con GLL se eliminaron eficientemente en los ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA (figura 11B: lisis de 15%, 45%, 65% y 78% para cada ratón, respectivamente), en un ensayo de 20 horas, mientras que la actividad de CTL fue indetectable en ratones de control (no mostrado). En conjunto, estos resultados confirman que las células T CD8+ inducidas en los ratones inmunizados con la NS34-NS5B de MVA, en una base semanal, habían adquirido una capacidad significativa para producir IFNγ y presentar una actividad citolítica in vivo.
3.4. La vacunación acelerada con NS34-NS5B de MVA es capaz de inducir respuestas que seleccionan como dianas a epítopos restringidos a HLA-B7
Se dio a conocer recientemente que las respuestas inmunitarias restringidas a HLA-B pueden presentar un papel importante en el resultado de la infección por VHC (Neumann-Haefelin et al., 2006, Hepatology 43, 563-72), similar a lo que se ha descrito para VIH o VEB (Frahm et al., 2005, J. Virol. 79, 10218-25; Kiepiela et al., 2004, Nature 432, 769-75; Bihl et al., 2006, J. Immunol. 176, 4094-101). Para apuntar a la capacidad de la NS34-NS5B de MVA para cebar, in vivo, respuestas inmunitarias celulares restringidas mediante una molécula de HLA-B, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-B7 siguiendo el programa acelerado, y se investigó la respuesta de células T CD8+ usando el ensayo de ELISPOT de IFNγ. Como se muestra en la figura 12, la vacuna fue capaz de cebar células T productoras de IFNγ significativas específicas de dos epítopos restringidos a HLA-B7 que son los únicos epítopos de HLA-B7 de NS3 descritos hasta ahora en la infección por VHC, a saber, WPA10 y LSP10 (Martin et al., 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405). En 4 (WPA10) a 5 (LSP10) de 5 animales inmunizados, se detectaron células T productoras de IFNγ con una frecuencia elevada para WPA10 (valor de la mediana: 305 manchas/106 esplenocitos), y con una frecuencia más débil para LSP10 (valor de la mediana: 160 manchas/106 esplenocitos). Estos resultados demuestran la capacidad de la NS34-NS5B de MVA para inducir, además de las respuestas restringidas a HLA-A2, respuestas restringidas a HLA-B7 específicas de epítopos reconocidos en infección natural por VHC.
3.5. Respuestas de células T CD4+ específicas de los tres inmunógenos expresados por la NS34-NS5B de MVA son inducidas siguiendo la inmunización acelerada
Debido al papel crítico de las respuestas mediadas por células T CD4+ a la hora de determinar el resultado de la infección por VHC, es de importancia obvia que las vacunas candidatas de VHC posean la capacidad de generar tales respuestas. Se evaluó la capacidad de la NS34-NS5B de MVA para inducir, siguiendo un programa “acelerado” de administración, respuestas de células T CD4+ específicas en ratones Balb/c, puesto que tales respuestas fueron difíciles de detectar en ratones HLA-A2 o -B7, presentando ambos unos antecedentes genéticos de C57B16 (datos no mostrados). Las respuestas de células T CD4+ se evaluaron 2 semanas después de la tercera inmunización, mediante análisis de ELISPOT de IFNγ y análisis de ICS llevados a cabo sobre esplenocitos totales, la fracción positiva de células T CD4+, así como la fracción de efluente obtenida tras la selección positiva. Como se muestra en la figura 13, las células productoras de IFNγ específicas de cada proteína NS3, NS4 y NS5B se detectaron usando las fracciones purificadas de células T CD4+ obtenidas de ratones inmunizados, mientras que no se pudieron observar señales en animales de control. También se detectó una respuesta débil de ELISPOT de IFNγ específica de NS4 usando la fracción de esplenocito total. El análisis de ICS condujo a resultados similares (datos no mostrados). En conjunto, estos datos revelan que una administración semanal de la NS34-NS5B de MVA es capaz de inducir células T CD4+ específicas de los tres antígenos expresados.
3.6. Las respuestas específicas de células T CD8+ inducidas siguiendo una vacunación acelerada con NS34-NS5B de MVA son de larga duración y se pueden revacunar
Una característica clave común a las vacunas potentes es su potencial para inducir respuestas de memoria de larga duración. Para evaluar la longevidad de las respuestas de células T CD8+ a NS34-NS5B de MVA inducidas siguiendo una vacunación acelerada, se llevó a cabo un experimento en dos etapas. La primera etapa evaluó la longevidad de las respuestas llevando a cabo ensayos de CTL y ELISPOT de IFNγ a 1 mes (semana 5), 2 meses (semana 10) y 6 meses (semana 27) después de la inyección primaria. En una segunda etapa, se exploró la capacidad de una cuarta inyección de NS34-NS5B de MVA para recordar respuestas de memoria, usando los mismos ensayos, 2 semanas después de una inyección de recuerdo llevada a cabo 6 meses después de la vacunación primaria (semana 29). Las respuestas de CTL inducidas en la semana 5, 10, 27 y 29 se representan en la figura 14. Se detectaron respuestas de CTL potentes, específicas del péptido GLL, en todos los ratones, en cada punto de tiempo estudiado, incluso a relaciones bajas de células efectoras/células diana (valores de la mediana a una relación E/T de 11:1: 68% de lisis en la semana 5, 73% a la semana 10, 47% en la semana 27). Las respuestas detectadas 2 semanas después de la cuarta inyección de NS34-NS5B de MVA permanecieron similares a las medidas antes de esta inyección (valor de la mediana a una relación E/T de 11/1: 51% de lisis). No se pudo observar respuesta anamnésica obvia. Las respuestas de ELISPOT de IFNγ inducidas en la semana 5, 10, 27 y 29 se representan en la Figura 15. La vacuna fue capaz de inducir frecuencias elevadas de células T productoras de IFNγ específicas del péptido GLL en todos los ratones inyectados, en cada punto de tiempo estudiado (Figura 15A). El número de células específicas siguió siendo estadísticamente (p>0,05) entre la semana 5 y 10, y se observó una disminución en la semana 27 (p<0,05), aunque estas respuestas permanecieron claramente detectables en ese momento (valores de la mediana: 655 manchas/106 esplenocitos en la semana 5, 529 en la semana 10, y 230 en la semana 27). Una cuarta inyección, llevada a cabo 6 meses después de la inyección primaria, condujo a una intensificación poderosa de la frecuencia de células productoras de IFNγ (valor de la mediana: 1049 manchas/106 esplenocitos en la semana 29). Además, se detectaron células T productoras de IFNγ específicas de otros 2 péptidos restringidos a HLA-A2 de NS3 (CVN y KLT) en la semana 27 en 2 de 4 ratones (Figuras 15B y 15C). Aunque débiles, estas respuestas se mantuvieron en un nivel bastante comparable después de la cuarta inyección (valores de la mediana para CVN: 112 manchas/106 esplenocitos en la semana 27 y 145 en la semana 29; valores de la mediana para KLT: 63 manchas/106 esplenocitos en la semana 27, y 156 en la semana 29). Estos resultados revelan que una vacunación débil con la NS34-NS5B de MVA indujo células T productoras de IFNγ y CTL de larga
duración, detectables hasta 6 meses. Además, una cuarta inmunización llevada a cabo en el sexto mes condujo a un recuerdo significativo de células T productoras de IFNγ.
El programa de tiempo óptimo para llevar a cabo la inyección de recuerdo se evaluó adicionalmente en ratones transgénicos HLA-A2-1. Los animales recibieron 3 inyecciones subcutáneas (sc) en la base de la cola con 107 pfu de NS34-NS5B de MVA o MVATGN33 (grupo de control) a 1 intervalo de una semana (semana 0, 1 y 2), y una cuarta inyección (inyección de recuerdo) ya sea 4 meses o 6 meses después de la tercera inyección. Las respuestas de células T CD4+ y CD8 se evaluaron en cuatro animales inyectados con NS34-NS5B de MVA (y dos animales inyectados con MVATGN33) a diversos puntos de tiempo tras las primeras inyecciones: mes 1, mes 4 y mes 6, así como dos semanas después de la cuarta inyección. Las respuestas de células T CD4+ se analizaron mediante ensayo de ICS llevado a cabo sobre esplenocitos cultivados en presencia de NS3 o una proteína irrelevante como se describe en 2.7. Una respuesta se consideró como positiva si el porcentaje de células T CD4+ positivas a IFNg fue mayor que 3 la desviación estándar del porcentaje obtenido con medio solamente y por encima de 0,05%. La respuesta de CD8 se monitorizó mediante ensayos de ELISPOT de IFNg y de CTL como se describe previamente.
Los resultados demuestran que una cuarta inyección en el mes 4 o en el mes 6 fue capaz de intensificar las respuestas de células T tanto de CD4+ como CD8+. Sin embargo, las respuestas de células T IFNγ CD8+ fueron óptimas cuando se llevó a cabo el recuerdo en el mes 4 frente al mes 6, mientras que las respuestas de células T IFNγ CD4+ fueron equivalentes cuando el recuerdo es en el mes 4 o en el mes 6.
3.7. La vacunación acelerada con la NS34-NS5B de MVA induce una respuesta protectora in vivo en un ensayo de exposición sucedánea
Debido a que los hepatocitos representan el sitio de replicación principal para VHC, una de las metas de una vacuna contra VHC es inducir células T capaces de migrar al hígado y destruir células que expresan el antígeno. Se usó un modelo de exposición sucedánea que imita en cierto grado la infección por VHC, para investigar la capacidad de la vacuna de NS34-NS5B de MVA para generar tal respuesta deseable. Se usó el agente de exposición, una Listeria monocytogenes recombinante que expresa la proteína NS3 de una cepa del genotipo 1a de VHC (denominada TC-LNS3, (Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80), puesto que estas bacterias son capaces de infectar y replicarse en hepatocitos (Jiang et al., 1997, 158, 287-93). Numerosos estudios han demostrado que es necesaria una fuerte respuesta de células T CD8+ específicas del antígeno para la protección frente a infección por L. monocytogenes (Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80; Baldridge et al., 1990, Infection and Immunity 58, 654-58). Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 según el programa de inmunización acelerado con NS34-NS5B de MVA o con N33 de MVA. Como ratones inmunizados de control positivo, se incluyó un grupo de ratones, inmunizados intravenosamente 1 o 2 veces a un intervalo de 2 semanas con una dosis de inmunización baja (0,05 a 0,1 LD50) de TC-LNS3 (capaz de proteger a los ratones frente a una infección posterior con una dosis de exposición elevada de TCLNS3 (Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80). Los ratones vacunados con MVA se expusieron intravenosamente con una dosis de exposición elevada de TC-LNS3 (1LD50) 2 semanas después de la tercera inyección de MVA. Para el grupo de control positivo, la exposición se llevó a cabo una semana después de la segunda inyección de la dosis baja de TC-LNS3, según se da a conocer (Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80). Dos días después de la exposición, se determinó el número de bacterias viables en el bazo e hígado de cada ratón. Los experimento se llevaron a cabo en dos razas de ratones, ratones HLA-A2 y ratones Balb/c. Los resultados presentados en la Figure 16A muestran que los ratones inmunizados con NS34-NS5B de MVA mostraron cargas bacterianas significativamente en el bazo (valor de la mediana: 3,83 Log CFU/mg, p=0,02) tras la exposición que lo que lo hicieron los ratones con N33 de MVA (5,17 Log CFU/mg). Estos datos son representativos de 4 experimentos independientes. En el experimento mostrado, los recuentos bacterianos también se redujeron significativamente en el hígado de ratones inyectados con NS34-NS5B de MVA (4,53 Log CFU/ml, p=0,02) en comparación con aquellos de los animales inmunizados con N33 de MVA (5,62 Log CFU/mg), aunque la reducción en este órgano fue menor y no siempre estadísticamente significativa, es decir, dependiente del experimento (datos no mostrados). Los ratones Balb/c inmunizados con NS34-NS5B de MVA demostraron una reducción significativa de las cargas bacterianas en el bazo, en comparación con ratones inmunizados con N33 de MVA (valor de la mediana: 2,28 frente a 2,89 Log CFU/mg, p=0,006). En este ejemplo representativo, como se observa típicamente en la raza de ratones, también se observaron recuentos bacterianos reducidos en el hígado; sin embargo, las diferencias no fueron estadísticamente significativas (p>0,05). Estos datos originales demuestran que una administración semanal de la NS34-NS5B de MVA puede cebar respuestas inmunitarias capaces de conferir protección inmunitaria frente a la exposición subsiguiente con L. monocytogenes recombinante que expresa la proteína de NS3 de VHC en dos especies de ratón diferentes. Puesto que se ha demostrado que el mecanismo de protección en este modelo implica a las células T CD8+ efectoras (Baldridge et al., 1990, Infection and Immunity 58, 654-58), estos datos conducen a concluir que la vacuna de MVA es capaz de inducir tales células, en particular células que presentan la capacidad de migrar y ejercer su función en los hígados de los animales. Las bacterias expuestas usadas contenían una NS3 del genotipo 1a, mientras que la vacuna de MVA está expresando una proteína de genotipo 1b, demostrando de este modo que se pueden generar respuestas protectoras cruzadas por la vacuna.
4. Discusión
En el presente estudio, se diseñó una vacuna de VHC candidata basándose en la cepa de la vacuna de MVA que expresa tres antígenos de VHC, NS3, NS4 y NS5B a partir de una cepa vírica de genotipo 1b (NS34-NS5B de MVA). Inyectados según un programa de inmunización “acelerado” basado en 3 inyecciones separadas una semana en diversos modelos de ratón transgénico HLA o comercial, se muestra que esta vacuna candidata induce células T CD8+ simultáneamente específicas, capaces de producir IFNγ y glisar células, así como células CD4+ específicas. Se muestra que las respuestas de células T CD8+ inducidas son respuestas de larga duración, detectables hasta 6 meses después de la vacunación primaria y revacunables con una cuarta inmunización. Finalmente, se demostraron efectos protectores cruzados de las respuestas inducidas por NS34-NS5B de MVA en dos especies de ratón que usan un ensayo de exposición sucedánea basado en una Listeria monocytogenes de NS3 de VHC recombinante.
La estrategia para el diseño y desarrollo de una vacuna de VHC se basó en la observación fundamental de que la inmunidad amplia, eficaz y sostenida a base de células T está asociada con un resultado favorable de infección ya sea espontáneamente o inducido por terapia (Bowen y Walker, 2005, Nature 436, 946-52). Tres elementos clave guiaron nuestro enfoque: la elección de inmunógenos de vacuna que contienen múltiples epítopos restringidos a células T CD4+ y CD8, la selección de una plataforma de vector segura y eficiente, y el de un programa de vacunación capaz de montar rápidamente una inmunidad de células T eficiente.
Los tres inmunógenos codificados por la presente vacuna se seleccionaron con diferentes criterios. NS3 apareció como un antígeno obligatorio, ya que su contribución a la magnitud total de las respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas de VHC encontradas en infección resuelta parece ser esencial (Diepolder et al., 1997, J. Virol. 71, 6011-9; Smyk-Pearson et al., 2006, J. Infect. Dis. 194, 454-63). por lo menos un estudio de vacunas ha dado a conocer el papel crítico desempeñado por respuestas Th1 específicas de NS3 en el control de viremia por VHC mediado por vacunas en el modelo de chimpancé (Rollier et al., 2004, J. Virol. 78, 187-96). En contraste con la gran mayoría de estudios de vacunas a base de NS3, que han incluido NS3 como un inmunógeno por sí solo (Arribillaga, 2002, Vaccine 21, 202-10; Wedemeyer et al., 2001, Gastroenterology 121, 1158-66; Jiao et al., 2003, Hepatology 37, 452-60; Wuest et al., 2004, Vaccine 22, 2717-21), en este informe se ha diseñado con éxito un MVA recombinante estable individual (estabilidad observada hasta 6 pasadas), que expresa NS3 en asociación con otras dos proteínas no estructurales, NS4 y NS5B. NS3 también se coexpresó con NS4, ya que se ha documentado que la parte central de NS4A es obligatoria para el plegamiento apropiado de NS3 (Penin et al., 2004, Hepatology 39, 5-19). Esto fue una característica importante de mantener, puesto que se mostró previamente que tal coexpresión influyó positivamente en la inmunogenicidad de NS3 (Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76, 12735-46). En la presente configuración, NS5B se expresó como un antígeno de tipo salvaje y en ausencia de NS5A. Esta elección se basó en nuestras observaciones previas que indican que NS5B pero no NS5A contenían epítopos de células T restringidas a HLA-A2 muy inmunógenos (Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76, 12735-46).
Se seleccionó MVA con respecto a otros vectores usados clínicamente por diversas razones. No es posible la integración del genoma vírico en el ADN hospedante, ya que el ciclo de vida del virus de la vacuna tiene lugar completamente en el citoplasma de las células (Moss, 2001, pp 2849-83 en Fields Virology 4th ed. Lippincott-Raven Press). MVA se ha atenuado mediante más de 570 pasadas en fibroblastos de embriones de pollo, dando como resultado la pérdida de alrededor de 15% de su genoma (Meyer et al., 1991 J. Gen. Virol. 72, 1031-38). Consecuentemente, MVA es incapaz de producir viriones maduros en la mayoría de las células de mamíferos, debido a un bloqueo en la etapa de la formación viriónica (Sutter y Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-S1) que da como resultado un riesgo reducido de diseminación (Carroll y Moss, 1997, Virol. 244, 365-96) y una inmunogenicidad incrementada debido a la pérdida de varios genes de defensa antiinmunitarios (Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51). Se han dado a conocer datos controvertidos referidos a la influencia de la inmunidad del virus anti-vacuna preexistente en la eficacia de la vacuna a base de MVA (Wedemeyer et al., 2001, Gastroenterology 121, 1158-66; Ramirez et al., 2000, J. Virol. 74, 923-33; Belyakov et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4512-7). Sin embargo, si ciertamente la inmunidad preexistente tiene un efecto perjudicial sobre la eficacia de la vacuna de MVA, éste parece mínimo en comparación con lo observado en el caso de vectores adenovíricos. La inmunidad anti-adenovirus preexistente al vector Ad5 clínica y ampliamente usado es de hecho bien conocida por afectar considerablemente a la eficacia de vacunas a base de Ad5 (Casimoro et al., 2003, J. Virol. 77, 6305-13).
Se evaluó en la presente memoria un programa “acelerado” de vacunación original basado en diferentes argumentos. En primer lugar, se han obtenido datos clínicos recientes muy alentadores con una vacuna de MVA a base de VHP terapéutica administrada en una base semanal (3 veces). Este ensayo de fase II da a conocer el aclaramiento de ARN vírico de VHP en mujeres con displasias de grado 2/3 hasta 12 meses tras la vacunación con un MVA que expresa las proteínas víricas E6 y E7 (Transgene Abstract, EUROGIN 2006). Estos nuevos datos sugieren que puede ser importante, a partir del desarrollo de una vacuna terapéutica, disponer rápidamente una respuesta eficaz en lugar de disponerla a lo largo del tiempo. Tras la inyección semanal de la NS34-NS5B de MVA de VHC, se muestra en modelos de ratón el montaje sin ambigüedad de respuestas de células T CD8+ potentes, que presentan dos funciones efectoras que se cree que desempeñan un papel en el control de la replicación del VHC (capacidad para producir IFNy y para lisar células diana). Además, fue particularmente interesante observar que estas respuestas, por lo menos la capacidad para producir IFNy se pudieron revacunar 6 meses después de la
última inyección semanal, confirmando que se puede desarrollar un estado de memoria inmunológica de larga duración mediante un programa que incluye 3 inmunizaciones de MVA próximas. Esta característica es un elemento clave tanto para el desarrollo de una vacuna preventiva como una vacuna terapéutica. Sugiere que la inmunidad anti-MVA montada después de la vacunación “acelerada” disminuyó con el tiempo o no se montó todavía hasta un grado suficiente para afectar a la inmunidad de la vacuna. La capacidad de nuestra vacuna para inducir respuestas CD8+ de larga duración junto con respuestas de células T CD4+ específicas, y el hecho de que las respuestas inducidas globales fueron capaces de controlar la expresión esplénica o hepática de un antígeno de VHC, son extremadamente alentadores. De hecho, un estudio reciente llevado a cabo en un modelo de chimpancé, ha mostrado que una vacuna a base de células T Ad5 que expresa antígenos NS3-NS4-NS5A-NS5B, fue capaz de provocar inmunidad no estéril aunque protectora en 4 de 5 animales expuestos (Folgori et al., 2006 Nature Medicine 12, 190-7). La protección en este estudio se correlacionó con el montaje de respuestas de células T, en particular con la presencia intrahepática de células T CD8+ específicas de los antígenos NS3 y NS5. De forma interesante, el esquema de inmunización en ese estudio fue atípico en el sentido de que primero se llevaron a cabo 3 vacunaciones con adenovirus, seguido de 3 inyecciones de una vacuna de ADN, esta última vacuna se añadió aparentemente para mejorar el montaje de respuestas de células T CD4+ específicas que son notoriamente débiles tras la vacunación de Ad5. Similar a nuestras observaciones, esta vacuna de Ad5 también mostró inducir respuestas protectoras cruzadas de genotipo 1. Tanto Both Folgori et al. (Folgori et al., 2006 Nature Medicine 12, 190-7), como nuestra vacuna candidata, contienen secuencias de subtipo 1b, y obviamente son capaces de inducir respuestas que reaccionan de forma cruzada con determinantes del subtipo 1a puesto que las cepas de exposición usadas en nuestro estudio y en el de Folgori implican secuencias del subtipo 1a. Esta característica es también muy alentadora aunque se deben llevar a cabo claramente evaluaciones adicionales para medir de forma más precisa el grado de la reactividad cruzada inducida.
En conclusión, se ha diseñado y producido una vacuna candidata de VHC basándose en el vector de la vacuna de MVA clínicamente aprobado que presenta un perfil de seguridad elevado y ampliamente reconocido. Esta vacuna, que puede propiciar respuestas inmunitarias mediadas por células T potentes, de larga duración y de protección cruzada, está actualmente entrando en el ensayo clínico de fase I. Los estudios preclínicos demuestran que tres inyecciones subcutáneas de NS34-NS5B de MVA (que codifica las proteínas NS3NS4 y NS5B del virus de la hepatitis C) en un intervalo de una semana (semanas 1, 2 y 3) representan un protocolo optimizado para inducir células T productoras de IFNγ específicas de VHC y linfocitos T citotóxicos.
Una inyección de recuerdo de NS34-NS5B de MVA tres semanas después de la primera serie no intensificó las respuestas de células T CD8+ específicas de NS3.
Sin embargo, una inyección de recuerdo llevada a cabo varios meses después de la primera serie (ya sea en el mes 4 o el mes 6) fue capaz de potenciar las respuestas de células T tanto CD4+ como CD8+. En particular, las respuestas de células T IFNγ CD8+ fueron óptimas cuando el recuerdo se llevó a cabo en el mes 4 frente al mes 6, mientras que las respuestas de células T IFNγ CD4+ fueron equivalentes en ambos casos.
Puesto que las respuestas de células T CD8+ parecen ser requeridas preferentemente para la resolución de la infección por VHC, un protocolo optimizado comprende 3 inyecciones subcutáneas de NS34-NS5B de MVA en la semana 1, 2 y 3, seguido de una cuarta inyección subcutánea aproximadamente 4 meses después de la tercera inyección.
Listado de secuencias
<110> BIOMERIEUX INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE
<120> Composición que comprende la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias correspondientes y su utilización terapéutica
<130> ADENOVIR
<160> 27
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 2844
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica NS3NS4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2844)
<223>
<400> 1
<210> 2
<211> 947 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica NS3NS4 10
<400> 2
<210> 3
<211> 1779
5
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica NS5b
10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1779)
<223>
15
<400> 3
<210> 4
<211> 592 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica NS5b 10
<400> 4
<210> 5
<211> 1344
5
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica NS5a
10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1344)
<223>
15
<400> 5
<210> 6
<211> 448 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica NS5a 10
<400> 6
<210> 7
<211> 2241
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica CE1E2
10 <220>
<221> CDS
<222> (1)..(2241)
<223>
15 <400> 7
<210> 8
<211> 746 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica CE1E2 10
<400> 8
<210> 9
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> cebador oIV166
5
<400> 9 gggggggcta tggcgcctat cacggccta 29
<210> 10 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> cebador oIV171 <400> 10
ggggggacgc gtttagcatg gcgtggagca gt
32
<210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> cebador oIV232
<400> 11
ggggggagat ctccagcagg cagaagtatg
30
35
<210> 12 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> cebador oIV233
<400> 12
gggggggtcg accgaaaatg gatatacaag ctc
33
45
<210> 13 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> cebador oIV212
<400> 13
55
ggggggtcta gaatgtcaat gtcctacaca tggac <210> 14 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial 35
<220> <223> cebador oIV218
65
<400> 14 ggggggtcta gattaccggt tggggagcag gt 32
5
<210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> cebador oIV225
10
<400> 15
ggggggctgc agatggcgcc tatcacggcc ta
32
15
<210> 16 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> cebador oIV226
<400> 16
25 30
ggggggtcta gattagcatg gcgtggagca gt <210> 17 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador oIV227 32
35
<400> 17 gggggggtcg acatgtcaat gtcctacaca tggac
35
40
<210> 18 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
45
<220> <223> cebador oIV228 <400> 18
gggggggcat gcttaccggt tggggagcag gt
32
50
<210> 19 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
55
<220> <223> cebador oIV229
<400> 19
60
ggggggtcta gaccggtagt tcgcatatac ata 33
65
<210> 20 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> cebador oIV172
5
<400> 20 ggggggggta ccatgtccgg ctcgtggcta agg 33
10
<210> 21 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> cebador oIV173 <400> 21
ggggggtcta gattagcagc agacgatgtc gtc
33
20
<210> 22 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> cebador oIV62
<400> 22
30
gggggggcta gcatgagcac aaatcctaaa cct 33
35
<210> 23 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> cebador oIV68
40
<400> 23
ggggggtcta gatcaggcct cagcctgggc tat
33
45
<210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial
50
<220> <223> epítopo GLL
<400> 24
55
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
60
<220>
<223> epítopo ALY
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> epítopo KLQ
<400> 26
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> epítopo DLM
<400> 27

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:
    -
    una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;
    -
    un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C; y
    -
    un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C, así como los medios necesarios para su expresión,
    para su utilización en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de la infección persistente por VHC o cáncer hepático en pacientes infectados con VHC, o para disminuir o ralentizar la inflamación hepática, la esteatosis
    o la fibrosis asociada a la infección por VHC, en el que el tratamiento comprende por lo menos tres administraciones secuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.
  2. 2. Composición farmacéutica o kit que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:
    -
    una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;
    -
    un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C; y
    -
    un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión;
    para la administración secuencial de dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo para su utilización en el tratamiento de la infección persistente por VHC o del cáncer hepático en pacientes infectados por VHC, o para su utilización para disminuir o ralentizar la inflamación hepática, la esteatosis o la fibrosis asociada con la infección por VHC, en particular en la forma de por lo menos 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, siendo dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo de manera que está acondicionada preferentemente para 3 administraciones, más preferentemente en 3 viales diferentes, separándose preferentemente dichas administraciones entre sí por un período de tiempo que varía desde 3 a 10 días.
  3. 3.
    Principio activo para su utilización según la reivindicación 1 o composición farmacéutica o kit para su utilización según la reivindicación 2, en el que dichas NS3 y/o NS4 y/o NS5b se originan del mismo genotipo de VHC, o en el que dichas secuencias nucleotídicas que codifican la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b se originan a partir del mismo genotipo de VHC, preferentemente el genotipo 1b.
  4. 4.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit farmacéutico para su utilización según la reivindicación 3, en el que dicha poliproteína NS3/NS4 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 2.
  5. 5.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit farmacéutico para su utilización según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho polipéptido NS5b comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 4.
  6. 6.
    Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5 o composición farmacéutica
    o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho vector de expresión es un poxvirus, preferentemente un MVA.
  7. 7.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según la reivindicación 6, en el que dicho vector de expresión comprende un genoma de MVA que se modifica para insertar el casete de expresión ph5r-NS3-NS4 y para insertar el casete de expresión p7.5-NS5b, preferentemente en la misma orientación y en la supresión III.
  8. 8.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que dicho principio activo comprende de 106 a 108 pfu de vector poxvírico o de MVA.
  9. 9.
    Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 8 o composición farmacéutica
    o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dichas por lo menos tres administraciones secuenciales se llevan a cabo en un intervalo de aproximadamente una semana.
  10. 10. Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9 o composición farmacéutica
    o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que dicha utilización o patrón de administración comprende además por lo menos una administración de recuerdo llevada a cabo por lo menos 4 semanas después de la última de las series de administraciones secuenciales.
  11. 11.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según la reivindicación 10, en el que dichas administraciones secuenciales y de recuerdo y dicha administración de recuerdo usan el mismo principio activo, que es preferentemente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.
  12. 12.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que dicha administración de recuerdo se lleva a cabo a aproximadamente 4 meses o 6 meses después de la última de las series de administraciones secuenciales.
  13. 13.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicha utilización o patrón de administración comprende tres administraciones a un intervalo de aproximadamente una semana, y una administración de recuerdo ya sea aproximadamente 4 meses o 6 meses después de la última de las series de administraciones secuenciales.
  14. 14.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicha utilización o patrón de administración comprende tres administraciones a un intervalo de aproximadamente una semana y dos administraciones de recuerdo a aproximadamente 4 meses y aproximadamente 6 meses después de la última de las series de las administraciones secuenciales.
  15. 15.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dichas administraciones secuenciales y de recuerdo se llevan a cabo mediante la misma vía de administración, preferentemente seleccionadas de entre el grupo constituido por las vías intramuscular, subcutánea, transdérmica, oral, sublingual y tópica.
  16. 16.
    Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dichas administraciones secuenciales y de recuerdo se llevan a cabo mediante diferentes vías de administración, preferentemente seleccionadas de entre el grupo constituido por las vías intramuscular, subcutánea, transdérmica, oral, sublingual y tópica.
  17. 17.
    Composición farmacéutica para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, caracterizada porque comprende asimismo un vehículo farmacéuticamente apropiado.
  18. 18.
    Kit farmacéutico para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, caracterizado porque comprende por lo menos 4 viales diferentes que comprenden una cantidad eficaz de un principio activo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que 3 viales son para 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, y el 4º vial es para una administración de recuerdo llevada a cabo por lo menos 4 semanas después de la última de las 3 administraciones secuenciales.
  19. 19.
    Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 16 o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18, en el que dicha utilización o patrón de administración se lleva a cabo conjuntamente con tratamiento del organismo hospedante con IFN-α2 pegilado y/o ribavirina.
  20. 20.
    Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 17 y 19, en el que dicha utilización o patrón de administración es para estimular una respuesta inmunitaria celular específica para VHC, y en el que dicha respuesta inmunitaria estimulada es una respuesta de célula T CD8+, una respuesta de célula T CD4+,
    o respuestas de células T tanto CD8+ como CD4+ T, preferentemente dirigidas a un epítopo localizado en una proteína NS3 y/o NS4 y/o NS5B.
  21. 21.
    Principio activo para su utilización según la reivindicación 20, en el que dicho epítopo es a) restringido a HLA-B7 y está localizado en el polipéptido NS3 del virus de la hepatitis infeccioso, o b) restringido a HLA-A2 y está localizado en la proteína NS3 y/o NS5b del virus de la hepatitis infeccioso.
  22. 22.
    Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 16 y 19 a 21 o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que dicho virus de la hepatitis C infeccioso es del genotipo 1a o 1b.
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