TW201318637A - 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（一） - Google Patents

免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（一） Download PDF

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Abstract

本發明係有關於免疫療法領域，及更詳細地係有關於一種包含非結構性(NS)HCV抗原或其表現載體的組成物，該組成物待與抗病毒療法(如干擾素與雷巴威林(ribavirin)標準照護(SOC)療法)併用於治療C型肝炎病毒(HCV)感染。本發明亦有關於一治療療程，其步驟包括對於一個體投予該種免疫療法組成物以及一試劑套組，試劑套組該包含多個容器及用於進行該治療療程之說明書。

Description

免疫療法組成物及用於治療C型肝炎病毒感染之療程(一) 發明領域
本發明係有關於免疫療法領域，及更詳細地係有關於一種包含非結構性(NS)HCV抗原或其表現載體之組成物，該組成物待與抗病毒療法(如干擾素與雷巴威林標準照護(SOC)療法)併用於治療C型肝炎病毒(HCV)感染。本發明亦有關於一治療療程，其步驟包括對於一個體投予該種免疫療法組成物以及一試劑套組，試劑套組該包含多個容器及用於進行該治療療程之說明書。
發明背景
HCV屬於黃熱病毒科(Flaviviridae)及係一種被膜病毒，其具有由約9,600個核苷酸組成之一個正單股型核糖核酸(RNA)基因體及其組織係所有HCV基因型與分離株所常見者(利平科特-雷文(Lippencott-Raven)出版社於1996年出版及由Fields編輯之“病毒學(Virology)”第三版第945-51頁或後續版本)。該基因體RNA係依據基因型而轉譯成為由3010至3030個胺基酸所組成的單一多蛋白，其經病毒與細胞蛋白酶的蛋白分解性剪切作用而產生功能性多肽，分別為三種結構蛋白(核心蛋白及套膜醣蛋白E1與E2)；一種小型嵌入型膜蛋白p7，其似乎作用為一種離子通道；及六種非結構性(NS)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B，其等媒介病毒生命週期的細胞內過程。更 詳細地，NS3(長度為631個胺基酸及在HCV-1多蛋白前體中的位置係自1027至1657)包含二種截然不同的結構域，分別為具有活性絲胺酸蛋白酶活性及涉及病毒多蛋白成熟作用之一個N端域，及包含解旋酶活性及在病毒基因體複製作用中扮演一角色之一個C端域。NS4(長度為315個胺基酸及在HCV-1多蛋白前體中位於自1658至1972之位置)係由NS4A與NS4B多肽中的NS3相關型蛋白酶剪切。其等均為疏水性，及發現其等與膜相關聯。NS4A多肽(位於自1658至1711之位置)係NS3蛋白酶的輔因子，NS4B(位於自1712至1972之位置)的功能尚屬未知。NS5(1039個胺基酸及在HCV-1多蛋白前體中位於自1973至3011之位置)係由NS5A與NS5B多肽中的NS3相關型蛋白酶剪切，已發現NS5A與NS5B多肽二者係位於與ER膜相關聯的複製複合體內。NS5B(位於自2421至3011之位置)係作用為一種RNA依賴性RNA聚合酶，據推測其容許合成一種負股型RNA中間產物與正股型子代複製本。NS5A(位於自1973至2420之位置)係一種磷蛋白及可能涉及RNA依賴性RNA聚合酶的調節作用。此外，其可能涉及HCV抗病毒抗性。
世界衛生組織估計在2011年全球約有二億人受到HCV慢性感染，及每年的新感染人數為三至四百萬人。HCV感染伴隨著高比例的慢性，及估計75%的血清陽性個體具有循環病毒(病毒血症)及慢性肝臟疾病。20%的慢性感染病患可能發生嚴重併發症，每年的肝癌風險為1至4%，這使得C型肝炎成為美國與歐洲肝臟移殖的首要原因。
目前在大部分國家中對於慢性感染HCV的病患之抗病毒療法(SOC代表“標準照護”)，係合併使用聚乙二醇化干擾素α(PEG-IFN-α)與雷巴威林(Neyts於2006年期刊“Antiviral Res.”第71期第363-371頁乙文)。然而，該療法昂貴又漫長(依感染性HCV基因型而定需要24個星期或48個星期)，在10%的病例中伴隨著顯著的副作用而導致治療提前結束，及對於顯著數目的病患(如該等患有失償性肝硬化、自體免疫疾病、有憂鬱症病史及懷孕者)而言是不足的。此外，對於SOC有反應且達到持續性病毒反應(SVR；在SOC結束後6個月未檢測出HCV RNA)者，在經第1基因型感染的病患中僅有40至50%，而在經第2與3基因型感染的病患中僅有70至80%。在SOC治療期間，病毒消滅作用的動力學是雙階段的，其中在最初一個星期或最初幾個星期存在病毒負荷量快速減少之一階段，其反映血液中的病毒之清除作用；接著是漸進式階段，其反映受感染肝臟細胞之清除作用。在SOC最初一個星期的病毒減量係病患反應之預測因子。通常將無反應型與不反應型病患之治療終止，無反應型與不反應型病患係在第12星期之前分別無法達到病毒減量至少1 log10及病毒減量小於2 log10者。
最近用於提高SOC療效之研究工作，係專注在標定病毒所編碼的蛋白之其他化合物上。有數種NS3/4A、NS5A及NS5B抑制劑目前正處於第H臨床研發階段，而最先進者甚至處於第III階段。抗NS3/4A特拉匹韋(telaprevir)/因昔弗(Incivo)或因昔韋克(Incivek)(頂點(Vertex)公司)及伯賽 匹韋(boceprevir)/韋克瑞斯(Victrelis)(默克(Merck)公司)最近均獲得美國食品藥物管理局(FDA)與歐盟執行委員會核准與聚乙二醇化干擾素α及雷巴威林合併用於治療第1基因型慢性C型肝炎病毒，及現今在美國與歐洲已可取得。當與聚乙二醇化干擾素α及雷巴威林併用時，雖然持續性病毒反應(SVR)增加(如在受第1基因型感染的病患中增加達25至30%)，該等化合物亦具有顯著的副作用，及可能促進所標定的HCV蛋白之突變作用，從而促進抗藥性HCV變異體之產生。
有人可能期望免疫治療方法與抗病毒療法相輔相成，其目標係在慢性HCV感染中提供特異性的保護性免疫力。已出現以重組蛋白、合成肽、熱致死性表現型酵母、DNA及病毒載體為基礎之數種候選方案(Torresi等人於2011年期刊“J.Hepatol”第54期第1273-1285頁乙文)。就這方面而言，WO2008/113606述及仰賴編碼HCV NS3、NS4及NS5B抗原(稱為TG4040)之減毒型非複製性牛痘病毒安卡拉(Ankara)株(MVA)之一種治療方法，該方法適用於三次重複投藥作用及各投藥作用之間相隔3至10天。尤其，包括各間隔一個星期的三次注射作用之一期程，係用於引發具HCV特異性的產生IFN-g型T細胞之一最佳化操作程序。在4或6個月後的第四次注射作用可增強T細胞反應。在動物模式中，由疫苗所引發的該強力與特異性T細胞式反應，係持續達6個月之久(Fournillier等人於2007年期刊“Vaccine”第25期第7339-7353頁乙文)。此外，在以表現HCV NS3蛋白 的單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)為基礎之HCV代理挑戰分析中，TG4040可賦予部分保護作用。
目前，TG4040在法國已完成第I階段試驗。該研究的劑量遞增部分係涉及經慢性感染第1基因型HCV之未曾接受治療的15名病患。該等病患領受三個每星期一次的TG4040皮下注射作用(依據WO2008/113606所述的加速操作程序)及劑量係自106個溶菌斑形成單位遞增至108個溶菌斑形成單位，及經最高劑量治療的病患亦在第6個月領受第四次的TG4040注射作用。15名病患中的8名之病毒負荷量減少0.5至1.2 log10國際單位/毫升，最大的病毒減量係發生在展現最顯著的HCV特異性T細胞反應之2名病患上；而在病毒負荷量並無變化或變化極微的該等病患中未檢測出對於NS3與NS4B病毒抗原的免疫反應(Honnet等人於2009年11月3日第60屆AASLD年會的口頭報告；Habersetzer等人於2011年期刊“Gastroentelology”第141期第890-899頁乙文)。
最近所研究的另一種方法係涉及編碼HCV抗原之一種酵母式免疫療法組成物，其適用於與干擾素與雷巴威林併用之每星期一次與每月一次的重複性投藥作用(WO2010/033841)。揭露各種的治療設置，而HCV NS3與表現核心型酵母之投予係在SOC開始之前、同時或在SOC治療之後。
由於HCV感染的慢性與持續性之性質、其高發生率、HCV的持續傳播及相關疾病的顯著發病率，可能有人預期HCV在多年以後仍持續成為全球嚴重的健康威脅。 因此，企需研發更有效、毒性更低及更短期且併用免疫治療方法與抗病毒療法之方法，來改善HCV感染或HCV相關疾病或疾患及尤其是慢性HCV感染之治療。
本發明中所提出的目標問題係提供併用免疫療法與抗病毒療法之一種最佳化治療療程。在投予免疫療法組成物之前起始抗病毒療法。該免疫療法組成物之投予係依據一系列快速與相隔更遠的投藥作用。預期該最佳化治療療程可在治療個體中藉由初打作用引發或刺激免疫反應之前，容許減少抗病毒載量。
藉由提供如申請專利範圍中所界定之實施例，而解決該技術問題。
本發明之其他與進一步方面、特性及優點，在與本發明的目前較佳實施例相關的下列說明中顯而易見。該等實施例係就揭露內容之目的而提供。
發明概要
本發明的一實施例係有關於用於治療HCV感染及特別是慢性HCV感染之一種免疫療法組成物。該免疫療法組成物係與一抗病毒療法併用，該抗病毒療法係在該免疫療法組成物投藥至需要的一個體之前即起始；該免疫療法組成物所依據的投藥模式係包括彼此相隔3至10天不等的2至5次投藥作用，接著進行彼此相隔6至20個星期不等的1至8次投藥作用。
就該實施例的一方面而言，在投予該免疫療法組 成物之至少1個星期前，提供該抗病毒療法。
就上述實施例的另一方面而言，該免疫療法組成物包含一治療有效量之一有效成分，該有效成分係選自由下列所組成之群組：(a)C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4與C型肝炎病毒的多肽NS5B；(b)一表現載體，其包含編碼C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4之一核苷酸序列及編碼肝炎病毒的多肽NS5B之一核苷酸序列；或(c)包含編碼C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4之一核苷酸序列之一表現載體及包含編碼肝炎病毒的多肽NS5B之一核苷酸序列之一表現載體。
在又一方面而言，該免疫療法組成物包含一病毒載體，其係一種痘病毒載體，及較佳係選自由西方(Western)保留株、哥本哈根(Copenhagen)株、惠氏(Wyeth)株及經改質的安卡拉(Ankara)(MVA)株所組成之群組之牛痘病毒載體。
本發明的另一實施例係有關於一治療療程，其步驟包括投予與抗病毒療法併用的該免疫療法組成物。
本發明的又一方面包括供用於治療HCV感染及較佳慢性HCV感染之一試劑套組，其中該套組包含多個容器及對於一個體投予該免疫療法組成物或進行該治療療程之說明書。
在本發明的又一方面係有關於一種方法，其依據本文中所述的用途與治療療程，將慢性感染HCV的個體族群中達到完全早期病毒反應(cEVR)的個體比例增加至少5%，其係相較於慢性感染HCV及僅用抗病毒療法治療的個 體族群中之cEVR而言。
就又一方面而言，本發明亦容許在安全性方面發揮作用，如藉由提供一種方法而在依據本發明治療之慢性感染HCV的個體族群中縮短抗病毒療法之期間及/或減少至少一種抗病毒化合物的劑量或療程，其係相較於僅用抗病毒療法治療之慢性感染HCV的個體族群而言，從而導致在依據本發明治療的HCV病患族群中之抗病毒劑相關不良事件的比例降低(如降低至少5%)。
發明之詳細說明
本發明係有關於一種免疫療法組成物，其包含一治療有效量的一有效成分，該有效成分係選自由下列所組成之群組：- 一種C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4與一種C型肝炎病毒的多肽NS5B；- 一種表現載體，其包含編碼C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4之一核苷酸序列及編碼肝炎病毒的多肽NS5B之一核苷酸序列；- 包含編碼C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4之一核苷酸序列之一種表現載體以及包含編碼肝炎病毒的多肽NS5B之一核苷酸序列之一表現載體；作為意欲治療HCV感染之一藥劑之用途，其中該藥劑的投藥模式係包括彼此相隔3至10天不等之該免疫療法組成物的2至5次投藥作用，接著進行彼此相隔6至20個星期不等之 該免疫療法組成物的1至8次投藥作用，及其中該投藥模式係在該個體的抗病毒療法起始之後進行。
定義
如在整個申請案中所用之“一(a)”與“一(an)”等詞，係在其等表示所指稱化合物或步驟的“至少一者”、”至少第一者”、”一或多種”或“多個”之涵義上使用，除非上下文中另有所指。
凡用於本文中之“及/或”一詞，係包括“及”、”或”以及“由該詞所連接的元素之全部或其他任何組合”之含義。
如本文中所用之“約”或“約略”一詞，係指位於一給定數值或範圍之10%內，較佳8%內，及更佳5%內。
“胺基酸”、“殘基”及“胺基酸殘基”等詞係同義詞，及涵蓋天然胺基酸以及胺基酸類似物(如非天然、合成及經改質的胺基酸，及包括D或L光學異構物)。
“多肽”、“肽”及“蛋白”等詞係指胺基酸殘基的聚合物，其至少包括經由肽鍵鍵結的9個或更多個胺基酸。該聚合物可為直鏈型、分支型或環狀，及可包含天然存在的胺基酸及/或胺基酸類似物，及其間可中斷而存在非胺基酸。就通用的表示方式而言，若該胺基酸聚合物所具有的胺基酸殘基超過50個，則較佳稱作多肽或蛋白；若其長度為50個胺基酸以下，則稱作“肽”。
如本文中所用之“多蛋白”一詞，係指在單一多肽鏈中的二或多種多肽/肽彼此融合。較佳，融合作用係 藉由遺傳方式進行，亦即藉由在同一個讀框內融合編碼該等多肽/肽中各者之核苷酸序列。“在同一個讀框內融合”係指所融合的編碼序列之表現作用產生單一蛋白，而在所融合的多肽/肽中之各者之間不具有任何轉譯終止子。該融合作用可為直接型(亦即其間並無任何附加的胺基酸殘基)或經由一連接子(如由重複的胺基酸殘基所組成之長度為3至30個胺基酸之肽，該等胺基酸殘基諸如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸及/或脯胺酸)。
在本發明的上下文中，“核酸”、“核酸分子”、“聚核苷酸”及“核苷酸序列”等詞係以可互換方式使用，及用於界定由聚去氧核糖核苷酸(DNA)(如cDNA、基因體DNA、質體、載體、病毒基因體、分離的DNA、探針、引子及其任一混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)(如mRNA、反義RNA)或混合的聚核糖-聚去氧核糖核苷酸所組成之任何長度的聚合物。其等涵蓋單股或雙股、直鏈或環狀、天然或合成的聚核苷酸。此外，聚核苷酸可包含非天然存在的核苷酸，及其間可中斷而存在非核苷酸組分。
當用於界定產物、組成物與方法時，如本文中所用之“包含”(及包含(comprising)的任何形式諸如“包含(comprise)”與“包含(comprises)”)、“具有”(及具有(having)的任何形式諸如“具有(have)”及“具有(has)”)、“包括”(及包括(including)的任何形式諸如“包括(includes)”及“包括(include)”)或“含有”(及含有(containing)的任何形式諸如“含有(contains)”及“含有(contain)”)等詞，係開放式及不排除 其他未列舉的元素或方法步驟。因此，多肽係“包含”一胺基酸序列，當該胺基酸序列可能是多肽的最終胺基酸序列的一部分時。該多肽可能具有高達數百個附加的胺基酸殘基。“實質上由...所組成”係指將具任何實質意義的其他組分或步驟排除在外。因此，實質上由所列舉的組分所組成之一組成物將不排除微量污染物與藥學上可接受的載劑。當胺基酸序列終究只存在一些附加的胺基酸殘基時，則多肽係“實質上由該胺基酸序列所組成”。“由...所組成”係指所排除者不只是其他組分的微量元素或步驟。例如，當多肽不含有所列舉之胺基酸序列以外的任何胺基酸時，則多肽係“由該胺基酸序列所組成”。
如本文中所用之“免疫療法組成物”一詞係指一調配物，其包含本文中所述的至少一種治療劑(如編碼NS3/NS4多蛋白與NS5B多肽之表現載體)及選擇性地一或多種藥學上可接受的載劑(如載體、稀釋劑、佐劑等)，當依據本文中所述的投藥模式投藥至一個體時，可引發或刺激一免疫反應。所引發或所刺激的免疫反應可為先天性或特異性、荷爾蒙性或細胞性，及可藉不同測量方法評估，該等測量方法包括但不限於抗體生產作用及/或細胞介素(如IFN-g)生產作用及/或細胞毒性T細胞、B淋巴球、T淋巴球、抗原呈現細胞、輔助T細胞、樹突細胞、NK細胞等的活化作用。
如本文中所用之“HCV”係指“C型肝炎病毒”，其係引發C型肝炎之黃熱病毒科(Flaviviridae)的成員(亦稱為 非A型、非B型肝炎)。
“NS多肽”一詞係指源自目前所辨識出之任何HCV基因型、亞型或分離株之一種非結構性(NS)多肽。該詞係涵蓋由HCV病毒衍生之cDNA或RNA片段的一開放讀碼框所編碼之一種天然NS多肽以及涵蓋一種NS衍生物及其任何片段(如免疫原肽)。
為說明之用，“NS5B多肽”係指由任何HCV基因型、亞型或分離株所編碼之一種天然NS5B多肽(如HCV-1多蛋白前體中之約第2421個胺基酸至約第3011個胺基酸)以及其任何衍生物或片段。“NS3/NS4多蛋白”係指由任何HCV基因型、亞型或分離株所編碼或源自任何HCV基因型、亞型或分離株(HCV-1多蛋白前體中之約第1027個胺基酸至約第1972個胺基酸)之NS3多肽與NS4多肽(如涵蓋NS4A與NS4B二者)之間之一融合體以及其任何衍生物或片段。為了清楚起見，在本文中所提及之與HCV多肽相關的胺基酸延伸範圍，係針對其等在HCV-1多蛋白前體中的位置而給定(如Choo等人於1991年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第88期第2451-2455頁乙文所述或如基因庫(GenBank)登錄號M62321中所述)。然而，除非上下文清楚地指出，否則當在本文中參照HCV-1多蛋白前體而提及一種NS多肽或其一肽時，其係指HCV-1之NS多肽或其肽；其他任何HCV基因型、亞型或分離株之NS多肽或其肽；或一種經改質的NS多肽或其肽。
當本文中所用之“天然”一詞係針對一種NS多肽 或多蛋白或針對一種NS編碼的核苷酸序列使用時，係指可從一天然來源發現、分離、獲得之一胺基酸序列或一核苷酸序列，其係有別於人為在實驗室所人工改質或突變產生者(亦即突變體或衍生物)。該等天然來源包括從感染或曾暴露於HCV的一個體所收集之生物試樣(如血液、血漿、血清、精液、唾液、組織切片、活組織檢驗檢體等)；所培養的細胞；組織培養；以及重組材料。重組材料包括但不限於HCV分離株(如可自寄存機構取得者)、HCV基因體、基因體RNA或cDNA庫、含有HCV基因體或其片段之載體。
如本文中所用之“衍生物”或“突變體”一詞，係指展現相對於天然對應體的一或多種改質作用之一多肽/核苷酸序列。為說明之用，“NS衍生物”係指經人工突變或在實驗室藉由人為改變後之NS多肽。可設想任何改質作用，包括一或多個核苷酸/胺基酸殘基的取代作用、插入作用及/或刪除作用；非天然的排列(如與非HCV多肽/肽之融合作用)以及該等可能性的任何組合。當設想數種突變作用時，其等可涉及相鄰殘基及/或非相鄰殘基。突變作用可藉由嫻熟技藝者所知的一些方式產生，諸如定點誘突變作用(如使用法國雷祖里(Les Ullis)之安瑪西亞(Amersham)公司的SculptorTM試管內誘突變系統)、PCR誘突變作用、DNA重排技術及藉由化學合成技術(如產生一合成核酸分子)。
如本文中所用之“一致性”一詞係指在二種多肽 或核苷酸序列之間之胺基酸相對於胺基酸或核苷酸相對於核苷酸之確切對應。二種序列之間的一致性百分比係該等序列所共享的相同位置之數目，同時將為求最佳比對所需納入的缺口數目及各缺口的長度納入考量。在技藝中可取得各種電腦程式與數學演算法，來測定胺基酸序列之間的一致性百分比，諸如例如可在NCBI取得之基本局部比對搜尋工具(Blast)程式或“蛋白序列與結構圖集(Atlas of Protein Sequence and Structure)”中之ALIGN(Dayhoffed於1981年附刊第3期第482-489頁)。亦可在專門資料庫中，取得用於測定核苷酸序列之間的同源性之程式(如基因資料庫(Genbank)、威斯康辛序列分析套組(Wisconsin Sequence Analysis Package)、BESTFIT、FASTA及GAP程式)。為說明之用，為說明之用，如本文中所用之“至少80%的序列一致性”係指80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
如本文中所用之“表現載體”一詞，係指較佳為一核酸分子或一病毒顆粒之一載體，及其含有容許所感興趣的HCV核苷酸序列在一宿主細胞或一個體內輸送、增殖及/或表現所需之元素。該詞涵蓋染色體外載體(如多套組質體)及嵌入性載體(如經設計嵌入宿主細胞的基因體中及當宿主細胞複製時產生附加套數的核酸分子)。就本發明之目的而言，該等載體可來自天然存在的基因來源，可為合成或人工型，或為天然與人工基因元素之一些組合。
如本文中所用之“分離”一詞，係指將一蛋白、多肽、肽、聚核苷酸、載體等從其天然環境移開(亦即與其天然相關聯或天然存在的至少一組分分離)。例如，當一核苷酸序列與在天然中通常與其為伍的一序列分離(如從一基因體中解離)時，即將該核苷酸序列分離；但其可與異源序列為伍。
如本文中所用之“宿主細胞”一詞應從廣義上理解，其在有關組織、器官或所分離的細胞之組成方面並無任何限制。該等細胞可為一獨特類型的細胞或為不同類型細胞之群組，諸如所培養的細胞株、初代細胞及增生細胞。在本發明的上下文中，“宿主細胞”一詞包括原核生物細胞；低等真核生物細胞諸如酵母菌；及其他真核生物細胞諸如昆蟲細胞、植物及哺乳類動物(如人類或非人類)細胞；以及可產生NS多肽載體及本發明的免疫療法組成物中所用的表現載體之細胞。該詞亦包括可成為或業已成為本文所述載體的接受體之細胞以及該等細胞的子代。
“個體”或“病患”一詞係以可互換方式使用及一般係指一脊椎動物，特別是哺乳類動物物種之一員，及特別是需要本發明的任何產物與方法或本發明的任何產物與方法可能對其有益之家畜、農場動物、競賽用動物及包括人類在內的靈長類動物，諸如經診斷已感染HCV或具有感染風險之個體，該個體因而容易罹患HCV感染所造成或與HCV感染相關聯之一疾病或病況或具有罹患風險者。在一較佳實施例中，該宿主生物體係慢性感染HCV病毒或任擇 地合併感染HCV病毒與另一種病毒(如人類免疫不全症病毒(HIV))之一人類病患。
如本文中所用之“治療”一詞(及治療(treating)一詞的任何形式諸如“治療作用(treatment)”、“治療(treat)”)，係指預防(如對於具有HCV感染風險的一個體之預防作用)及/或治療(如用於在經診斷確定感染HCV的一個體中治癒或控制病毒複製作用或疾病進程)。治療作用需要依外用或內服方式對於一個體投予一治療劑，諸如本文中所述的免疫療法組成物，及該組成物最終與抗病毒療法併用，特別是目前用於治療慢性HCV感染及包括聚乙二醇化IFNα及/或雷巴威林及/或蛋白酶抑制劑及/或聚合酶抑制劑等者。
如本文中所用之“投藥”一詞(及投藥一詞的任何形式諸如“投予”)，係指將一治療劑諸如本文所述之免疫療法組成物輸送至一個體中。
如本文中所用之“投藥模式”一詞，係指依據本文中所述的方式，在一個體中進行一系列的投藥作用。
HCV序列
適用於本發明之一些HCV序列，係包括該領域的研究者即可取得的該等序列，其等包括但不限於基因資料庫(Genbank)與PubMed中所述的HCV序列。詳盡的種系發生分析將HCV分離株分類成6種主要基因型(1至6)，及在各基因型中又分成數種亞型(a、b、c等...)(Simmons等人於2005年期刊“Hepatology”第42期第962-973頁乙文)。在本文中所述的實施例中可使用源自任何基因型與亞型的HCV 序列。
例示性的第1a基因型HCV包括但不限於HCV-1(Choo等人於1991年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第88期第2451-2455頁乙文)、-J1(Okamoto等人於1992年期刊“Nucleic Acids Res.”第20期第6410-6410頁乙文)、-H(Inchauspé等人於1991年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第88期第10292-10296頁乙文)及WO2004/048402中所述之分離株。例示性的第1b基因型HCV包括但不限於HCV-JA(Kato等人於1990年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第87期第9524-9528頁乙文)與BK(Takamizawa等人於1991年期刊“J.Virol”第65期第1105-1113頁乙文)。例示性的第1c基因型HCV包括但不限於HCV-G9(Okamoto等人於1994年期刊“J.Gen.Virol.”第45期第629-635頁乙文)。例示性的第2基因型HCV包括但不限於HCV-J6(第2a基因型；Okamoto等人於1991年期刊“J.Gen.Virol.”第72期第2697-2704頁乙文)、HCV-J8(第2b基因型；Okamoto等人於1992年期刊“Virology”第188期第331-341頁乙文)及HCV-BEBE1(第2c基因型；Nako等人於1996年期刊“J.Gen.Virol.”第141期第701-704頁乙文)。例示性的第3基因型HCV包括但不限於HCV-NZL1(第3a基因型；Sakamoto等人於1994年期刊“J.Gen.Virol.”第75期第1761-1768頁乙文)與HCV-Tr(第3b基因型；Chayama等人於1994年期刊“J.Gen.Virol.”第75期第3623-3628頁乙文)。例示性的第4基因型HCV序列包括但不限於HCV-ED43第4a基因型；Chamberlain等人於1997年期 刊“J.Gen.Virol.”第78期第1341-1347頁乙文)。例示性的第5基因型HCV序列為HCV-EUH1480(第5a基因型；Chamberlain等人於1997年期刊“Biochem.Biophys.Res.Commun.”第236期第44-49頁乙文)。來自第6基因型的例示性HCV序列包括但不限於HCV-EUHK2(第6a基因型；Adams等人於1997年期刊“Biochem.Biophys.Res.Commun.”第234期第393-396頁乙文)。
本發明係意欲不侷限於該等例示性HCV病毒。誠然，如本發明使用之HCV NS序列中的任一或所有者之核苷酸與胺基酸序列，可能因不同的HCV分離株、亞型及基因型而有所差異，而這天然的基因差異以及如下文所述的非天然改質作用係涵蓋於本發明的範圍內。
NS多肽
本發明中所用之免疫療法組成物係至少包含非結構性(NS)NS3、NS4及NS5BHCV多肽，及尤其以融合構型的NS3與NS4HCV多肽(亦即NS3/NS4多蛋白)或用於表現該NS3、NS4(如NS3/NS4多蛋白)之表現載體及NS5B多肽為首選。本發明較佳排除HCV核心多肽或編碼HCV核心多肽的表現載體之使用。
在本發明的上下文中，用於本發明的組成物所包含或所編碼之HCV NS3、NS4及NS5B多肽中的各者，可個別源自目前所辨識出之任何HCV基因型、亞型或分離株，諸如本文中所述者或其任何片段(如致免疫片段)。
本發明亦涵蓋經改質之NS衍生物，該改質作用 係直接或間接涉及一天然NS多肽所展現的酵素活性之一或多種胺基酸殘基(相鄰或非相鄰)的改質作用，其目的係破壞該酵素活性。例如，在一酵素催化位址內的改質作用可容許降低或去除相關的酵素活性。可藉由例行方法辨識出攸關該等功能性質之胺基酸殘基，及在使用嫻熟技藝者所知方法之適當分析中，可輕易測定經改質的酵素活性之降低或去除。就這方面而言，已辨識出涉及NS3媒介型蛋白酶與解旋酶活性之催化性殘基，及技藝中已述及蛋白酶缺陷型NS3衍生物(如Bartcnshlager等人於1993年期刊“J.Virol.”第67期第3835-3844頁乙文及Tomei等人於1993年期刊“J.Virol.”第67期第4017-4026頁乙文)以及解旋酶缺陷型NS3衍生物(如Kim等人於1997年期刊“J.Virol.”第71期第9400頁乙文及Lin與Kim於1999年期刊“J.Virol.”第73期第8798-8807頁乙文)。亦可取得聚合酶缺陷型NS5B衍生物(如Lohmann等人於1997年期刊“J.Virol.”第71期第8416-8428頁乙文)。
其他適宜的NS衍生物可展現一種經改質的細胞呈現方式(如藉由添加適當的訊息肽與跨膜肽之細胞膜錨定作用)及/或相對於天然NS對應體之經改質的後轉譯處理。
所產生的NS衍生物理想地保有致免疫性質，尤其在與天然NS對應體相同或任擇地較高範圍內，保有刺激一種細胞媒介型免疫反應之能力。因此最好避免在富含B、CTL及/或TH抗原決定位部分之改質作用，以免可能損 及致免疫性質。
在一實施例中，如本發明所使用的組成物所包含或所編碼之NS3、NS4及NS5B多肽中的至少二者，可源自不同的HCV基因型、亞型或分離株。該構型可因而提供對抗較廣範圍的HCV基因型之保護作用；或藉由使用一區域或一特定病患族群所特有的HCV基因型，而使得該組成物或治療療程適用於該特定的地理區域。就這方面而言，第1a、1b、2及3基因型係最常見於北美、歐洲及亞洲；第4基因型係在北非與中非較為普遍；第5基因型迄今大多在南非發現；而第6基因型分離株主要在越南與香港發現。例如，使用來自第1基因型HCV的一種NS3/NS4多蛋白與來自第3基因型的一種NS5B多肽或者反過來，可容許設計適用於治療亞洲、北美及歐洲的個體之一組成物。
在另一實施例中，如本發明所使用的組成物所包含或所編碼之NS3、NS4(如NS3/NS4多蛋白)及NS5B多肽，係源自相同的HCV基因型、亞型或分離株。適宜地，其等皆源自第1基因型HCV，較佳源自第1b基因型，及尤其以HCV-JA分離株來源為首選。
特別有利的是一種NS3/NS4多蛋白，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：1中所示的胺基酸序列之一致性係至少80%，有利地具有至少85%的一致性，較佳具有至少90%的一致性，更佳具有至少95%的一致性，及甚至更佳98%的一致性。又更佳是一種NS3/NS4多蛋白，其包含序列辨識編號：1中所示的胺基酸序列。
NS5B多肽任擇地或組合地包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：2中所示的胺基酸序列之一致性係至少80%，有利地具有至少85%的一致性，較佳具有至少90%的一致性，更佳具有至少95%的一致性，及甚至更佳具有98%的一致性。又更佳是一種NS5B多肽，其包含序列辨識編號：2中所示的胺基酸序列。
可採用本文中所述的表現載體(或感染性病毒顆粒)，藉由重組方式產生NS多肽(如NS3/NS4多蛋白與NS5B多肽)。該方法通常包括(a)將一表現載體導入適宜的宿主細胞中，而產生經轉染或受感染的宿主細胞；(b)在適合宿主細胞生長的條件下，在試管中培養該經轉染或受感染的宿主細胞；(c)回收細胞培養物；及(d)選擇性地從所回收的細胞及/或培養上清液中純化NS多肽與多蛋白。
適用於NS多肽的重組生產作用之表現載體包括但不限於供在原核生物宿主細胞諸如細菌(如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或李斯特菌屬(Listeria))中表現之噬菌體、質體或黏接質體載體；供在酵母(如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))中表現之載體；供在昆蟲細胞系統(如Sf9細胞)中表現之桿狀病毒載體；供在植物細胞系統(如Ti質體、花椰菜嵌紋病毒CaMV、菸草嵌紋病毒TMV)中表現之病毒與質體載體；以及供在高等真核生物細胞或生物體中表現之病毒與質體載體。通常可商購取得該等載體(如自英杰(Invitrogen)公司、史崔塔基 因(Stratagene)公司、阿默舍姆生物科技(Amersham Biosciences)公司、普洛麥格(Promega)公司等)；或可自諸如美國菌種保存中心(ATCC及位於美國馬里蘭州羅克維爾(Rockville))的寄存機構取得；或有眾多出版文獻述及其等的序列、組成及生產方法，使得專業人員可加以應用。可藉由多種方式，將一表現載體導入宿主細胞中，該等方式包括但不限於顯微注射作用、磷酸鈣所媒介的轉染作用、DEAE-聚葡萄糖所媒介的轉染作用、脂質體感染作用/脂質體融合作用、基因槍、轉導作用、電穿孔作用、病毒感染作用等。可在習用的發酵用生物反應器、燒瓶及培養皿中培養宿主細胞。可在適合一特定宿主細胞的溫度、pH值及氧含量進行培養。在此不試圖詳述已知用於多肽的重組生產作用之各種表現系統、宿主細胞及方法。
NS核苷酸序列
可使用技藝中可取得的序列資料及本文中所提供的序列資訊，從任一來源產生編碼NS3、NS4及NS5B的核苷酸序列。一較佳實施例係有關於使用編碼NS3/NS4多蛋白之一核苷酸序列及編碼NS5B多肽之一核苷酸序列。可藉由習用的分子生物學或PCR技術，從含有HCV的細胞、cDNA與基因體庫、病毒基因體或已知包括該等核苷酸序列之習知技藝中的任何載體，獨立地分離出該等核苷酸序列。任擇地，其等亦可藉由自動化製程中的化學合成作用產生(如從重疊的合成寡核苷酸或合成基因組裝而成)。可藉由嫻熟技藝者所知的一些方式，諸如化學合成 作用、定點誘突變作用、PCR誘突變作用、DNA重排技術等，產生改質作用。
核酸改質作用也可設想用於提高一特定的宿主細胞或個體中的表現水平。當可用於編碼一特定胺基酸之密碼子不只一個時，確實觀察到密碼子的使用模式係高度非隨機，及不同宿主之間之密碼子使用係明顯不同。因本發明所涵蓋的核苷酸序列係大部分來自病毒來源(HCV)，其等的密碼子使用模式可能不適合在諸如細菌、低等或高等真核生物細胞的宿主細胞中有效表現。通常，可用在所感興趣的宿主細胞/個體中編碼同一胺基酸之較常使用的一或多種密碼子，來置換對應於在所感興趣的宿主細胞/個體中不常使用的一密碼子之一或多種“天然”(如HCV)密碼子，而進行密碼子最佳化作用。沒有必要置換所有對應於不常使用的密碼子之天然密碼子，因為即使在部分置換之情況下，亦可增加表現作用。此外，可偏離而不嚴格遵循最佳化密碼子使用，使得以在所產生的核酸分子中引入限制酶切位址。
此外，可經由核苷酸序列的附加改質作用，而增進宿主細胞或個物體中的表現作用，該等改質作用之目的在於阻止罕見、非最佳的密碼子之群聚作用及/或對於預期負向影響表現水平的負向序列元素(如富含AT或富含GC的序列延伸；不穩定的正向或反向重複序列；RNA二級結構；及/或內部隱藏式調控元素諸如內部TATA盒、chi位址、核糖體進入位址及/或剪接供體/受體位址)中之至少一部分進 行抑制或改質。
在一較佳實施例中，編碼NS3/NS4多蛋白之核苷酸序列所包含的一核苷酸序列與序列辨識編號：3中所示的核苷酸序列之一致性係至少80%，適宜地具有至少85%的一致性，有利地具有至少90%的一致性，較佳具有至少95%的一致性，更佳具有98%的一致性，甚至更佳具有100%的一致性。任擇地或組合地，編碼NS5B多肽之核苷酸序列所包含的一核苷酸序列與序列辨識編號：4中所示的核苷酸序列之一致性係至少80%，適宜地具有至少85%的一致性，有利地具有至少90%的一致性，較佳具有至少95%的一致性，更佳具有98%的一致性，甚至更佳具有100%的一致性。
表現載體
本發明的較佳方面係有關於一種免疫療法組成物，其包含至少編碼本文中所述的NS3、NS4及NS5B多肽(如NS3/NS4多蛋白與NS5B多肽)之一或二種表現載體。
在本發明的上下文中，應廣義地將“載體”一詞理解為包括質體與病毒載體。
如本文中所用之“質體載體”係指用於各種表現系統中之一種可複製的DNA構建體，“轉運”載體係作用在原核生物及/或真核生物細胞中，而“轉移”載體係在一病毒載體中作用於聚核苷酸之轉移。通常質體載體含有篩選標記基因，而容許在一對應的篩選用藥物存在下，將帶有該質體載體的宿主細胞篩選出或棄選。技藝中已知多種正向與負向篩選標記基因。舉例而言，可使用一種抗生素抗性 基因作為一正向篩選標記基因，而容許在對應的抗生素存在下篩選出一宿主細胞；及可使用一種自殺基因作為一負向篩選標記基因，而容許在添加對應的前驅藥之際，讓表現該自殺基因的宿主細胞被殺滅。
適宜質體載體的代表性實例包括但不限於pBR類型質體(如pBR322)、pUC(吉柏柯(Gibco)公司)、pBluescript(史崔塔基因(Stratagene)公司)、pREP4、pCEP4(英杰(Invitrogen)公司)、pCI(普洛麥格(Promega)公司)、pVAX(英杰(Invitrogen)公司)及pgWiz(基因療法系統(Genetherapy System)有限公司)。
本發明亦涵蓋與脂質或聚合物複合而形成顆粒結構之載體(如質體DNA)，諸如脂質體、脂複合體或奈米粒子。
如本文中所用之“病毒載體”一詞，係指包括病毒基因體的至少一元素之核酸載體，及可將其包裝在一病毒顆粒中或包裝成一病毒顆粒。“病毒”、“病毒粒子”、“病毒顆粒”及“病毒載體顆粒”等詞係以可互換方式使用，及係指當該核酸載體依據容許產生感染性病毒顆粒的適宜條件而轉導至一適當的宿主細胞或細胞株時所形成之病毒顆粒。在本發明的上下文中，應廣義地將“病毒載體”一詞理解為包括核酸載體(如DNA病毒載體)以及其所產生的病毒顆粒。“感染性”一詞係指一病毒載體感染及進入一宿主細胞或個體中之能力。病毒載體可為複製作用勝任型，或可在基因方面失效而成為複製作用缺陷型或複製作用受損 型。如本文中所用之“複製作用勝任型”一詞係涵蓋經工程化而在特定宿主細胞(如受感染的細胞)中具有更佳或選擇性的複製作用之選擇性複製型與有條件複製型病毒載體。
適用於本發明中之病毒載體可由多種不同的病毒(如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、α病毒、濾泡性口炎病毒等)產生。如上文所述，“病毒載體”一詞涵蓋載體DNA、基因體DNA以及其所產生的病毒顆粒。
在一實施例中，本發明所用的組成物中所包含之表現載體係一種痘病毒載體。其可自任何痘病毒科成員獲得，諸如正痘病毒、副痘病毒、禽痘(如金絲雀痘ALVAC與禽痘)、羊痘病毒、兔痘病毒、豬痘病毒、軟體動物痘病毒及亞塔痘病毒。該痘病毒較佳為一種正痘病毒及尤其以牛痘病毒為首選，特別是選自由下列所組成之群組之牛痘病毒(VV)：VV西方(Western)保留株、哥本哈根(Copenhagen)株(Goebel等人於1990年期刊“Virol.”第179期第247-266頁乙文；Johnson等人於1993年期刊“Virol.”第196期第381-401頁乙文)、惠氏(Wyeth)株及尤其經改質的安卡拉(Ankara)(MVA)株(Antoine等人於1998年期刊“Virol.”第244期第365-396頁乙文)品系，其中以後者為較佳者，尤其是MVA 575(ECCAC V00120707)與MVA BN(ECCAC V00083008)。在文獻與專門資料庫中述及眾多痘病毒科成員的基因體序列(如基因庫登錄號NC_006998、M35027、U94848及NC_005309NC_001132係分別對應於 西方(Western)保留株、哥本哈根(Copenhagen)株、MVA及金絲雀痘序列)，而用於建構重組型痘病毒的通用條件係技藝中所眾所周知。
可將編碼NS3/NS4多蛋白與NS5B多肽之核苷酸序列插入同一載體或獨立的載體及插入痘病毒基因體的任一位置，較佳插入一個非必要基因座中。當插入同一表現載體時，其等可位於彼此的同義或反義定向。在VV哥本哈根(Copenhagen)牛痘載體中，特別適合插入胸腺嘧啶激酶基因；而在MVA載體中，特別適合插入缺失I至VI，及較佳插入缺失II或III。
適用於本發明之另一種病毒載體係腺病毒載體。其可自多種人類或動物腺病毒(如犬、羊、類人猿等)衍生。可使用任何血清型。理想地，腺病毒載體係複製作用缺陷型及源自人類Ad，尤其是源自具罕見血清型之人類Ad，或源自黑猩猩Ad。人類腺病毒的代表性實例包括亞屬C之Ad2 Ad5與Ad6；亞屬B之Ad11、Ad34與Ad35；及亞屬D之Ad19、Ad24、Ad48及Ad49。黑猩猩Ad的代表性實例包括但不限於AdCh3(Peruzzi等人於2009年期刊“Vaccine”第27期第1293-1300頁乙文)、AdCh63(Dudareva等人於2009年期刊“Vaccine”第27期第3501-3504頁乙文)及技藝中所述之任一者(例如參見WO03/000283；WO03/046124；WO2005/071093；WO2009/073103；WO2009/073104；WO2009/105084；WO2009/136977及WO2010/086189)。可如技藝中所述獲得複製作用缺陷型腺病毒載 體，如藉由刪除病毒複製作用所不可或缺之腺病毒基因體的至少一區或其部分，其中尤以刪除E1區(如參照基因庫登錄號M 73260及Chroboczek等人於1992年期刊“Virol.”第186期第280-285頁乙文所揭露之第5型人類腺病毒序列之自位置459左右延伸至3510)為首選。本發明亦涵蓋在腺病毒基因體內具有附加的刪除作用/改質作用之載體，特別是在非必要的E3區或其他必要的E2、E4區之刪除作用/改質作用，如WO94/28152及Lusky等人於1998年期刊“J.Virol”第72期第2022-2032頁乙文所述)。
適用於本發明的景況中之其他病毒載體，係可從副黏液病毒科獲得的麻疹病毒屬，其中尤以麻疹病毒為首選。在技藝中可取得各種減毒株(Brandler等人於2008年期刊“CIMID”第31期第271-291頁乙文；Singh等人於1999年期刊“J.Virol.”第73(6)期第4823-4828頁乙文)，諸如但不限於埃德蒙斯頓(Edmonston)A與B株(Griffin等人於2001年期刊“Field’s in Virology”第1401-1441頁乙文)、施瓦茨(Schwartz)株(Schwarz A於1962年期刊“Am J Dis Child”第103期第216頁乙文)、S-191或C-47株(Zhang等人於2009年期刊“J Med Virol”第81(8)期第1477-1483頁乙文)。其中特別適合插入P與M基因之間。
如本發明，本發明所用的組成物中所包含之核苷酸序列，係適合在一種宿主細胞或個體中表現所編碼的NS多肽(如NS3/NS4多蛋白與NS5B多肽)之一形式，其係指該等核苷酸序列中之各者係置於適當的調控序列之控制 下。如本文中所用之“調控元素”一詞，係指容許、有助於或調節一核苷酸序列在一指定宿主細胞或個體中的表現作用之任一元素，該表現作用包括該核酸或其衍生物(亦即mRNA)的增殖作用、複製作用、轉錄作用、剪接作用、轉譯作用、安定化作用及/或輸送作用。
嫻熟技藝者將理解調控序列及尤其是啟動子之選擇可取決於載體本身、宿主細胞、所欲的表現水平等因子。在本發明的上下文中，其可在多種宿主細胞類型或針對特定宿主細胞(如具肝臟特異性的調控序列)中持續引導核酸分子的表現作用，或回應特定事件或外源性因子(如溫度、營養素添加劑、荷爾蒙等)或依據病毒週期階段(如晚期或早期)而進行調節。亦可使用在生產步驟期間回應特定事件或外源性因子而受到抑制之啟動子，以避開所表現多肽的潛在毒性。
適合在哺乳類動物細胞中持續表現之啟動子係包括但不限於細胞巨大病毒(CMV)迅早期啟動子(Boshart等人於1985年期刊“Cell”第41期第521-530頁乙文)、RSV啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、磷甘油激酶(PGK)啟動子(Adra等人於1987年期刊“Gene”第60期第65-74頁乙文)、單純疱疹病毒(HSV)-1的胸腺嘧啶激酶(TK)啟動子及T7聚合酶啟動子。牛痘病毒啟動子係特別適用於痘病毒載體中的表現作用。其代表性實例包括但不限於牛痘7.5K、H5R、11K7.5(Erbs等人於2008年期刊“Cancer Gene Ther.”第15期第18-28頁乙文)、TK、p28、p11及K1L啟動子，以及合成 啟動子諸如Chakrabarti等人(於1997年期刊“Biotechniques”第23期第1094-1097頁乙文)、Hammond等人(於1997年期刊“J.Virological Methods”第66期第135-138頁乙文)及Kumar與Boyle(於1990年期刊“Virology”第179期第151-158頁乙文)中所述，以及早期/晚期嵌合啟動子。適用於麻疹所媒介的表現作用之啟動子，係包括但不限於引導麻疹轉錄單位的表現作用之任何啟動子(Brandler與Tangy於2008年期刊“CIMID”第31期第271-291頁乙文)。具肝臟特異性的啟動子係包括但不限於下列各者之啟動子：HMG-CoA還原酶(Luskey於1987年期刊“Mol.Cell.Biol”第7期第1881-1893頁乙文)；第1型固醇調控元素(SRE-1；Smith等人於1990年期刊“J.Biol.Chem.”第265期第2306頁乙文)；白蛋白(Pinkert等人於1987年期刊“Genes Dev.”第1期第268-276頁乙文)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)(Eisenberger等人於1992年期刊“Mol.Cell Biol.”第12期第1396-1403頁乙文)；α-1抗胰蛋白酶(Ciliberto等人於1985年期刊“Cell”第41期第531-540頁乙文)；人類轉鐵蛋白(Mendelzon等人於1990年期刊“Nucleia Acids Res.”第18期第5717-5721頁乙文)；及FIX基因(第5,814,716號美國專利)。
嫻熟技藝者將理解，控制NS(NS3/NS4與NS5B)核苷酸序列的表現作用之調控元素可進一步包含供宿主細胞或個體中之轉錄作用的適當起始、調節及/或終止作用(如多腺嘌呤轉錄作用終止序列)、mRNA輸送作用(如細胞核定位訊號序列)、操作處理(如剪接訊號)與安定性(如內 含子與非編碼的5’與3’序列)、轉譯作用(如起始子甲硫胺酸、三連體引導序列、IRES核糖體結合位址、夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列等)及純化步驟(如一標籤)所用之附加元素。
在一較佳實施例中，本發明所用的組成物包含一MVA表現載體，及在其基因體的缺失III中較佳以相同定向插入下列各者：(a)編碼NS3/NS4多蛋白之一核苷酸序列，其係置於牛痘pH5R啟動子之控制下；及(b)編碼NS5B多肽之一核苷酸序列，其係置於牛痘p7.5K啟動子之控制下。較佳，編碼NS3/NS4多蛋白之核苷酸序列係包含序列辨識編號：3中所示的核苷酸序列，及編碼NS5B多肽之核苷酸序列係包含序列辨識編號：4中所示的核苷酸序列。
若需要，本發明中所用的組成物可進一步包含一或多種轉殖基因，如待與編碼NS(NS3/NS4與NS5B)的核苷酸序列在一種宿主細胞或個體中表現之所感興趣的一基因，其目的在於改善對於HCV感染或由HCV感染所造成或與其相關聯的任何疾病或病況之治療性或保護性活性。適宜的轉殖基因包括但不限於免疫調節劑，諸如細胞介素及源自可能合併感染的生物體(如HIV、結核分枝桿菌等)之其他任何抗原。若使用一轉殖基因，其可由編碼NS3/NS4多蛋白及/或NS5B多肽的表現載體表現，或由組合使用的一獨立載體表現，該獨立載體可與表現NS3/NS4或NS5B的載體相同或不同。
依據另一較佳實施例，本發明所用的組成物中 所包含的表現載體，係感染性病毒顆粒之形式。通常藉由一方法產生該等病毒顆粒，及其步驟包括：(a)將本發明的病毒表現載體導入一適宜的宿主細胞中；(b)在適宜條件下培養該宿主細胞，從而容許產生該感染性病毒顆粒；(c)從該細胞的培養物中回收所產生的病毒顆粒；及(d)選擇性地純化所回收的該病毒顆粒。
可使用眾多的宿主細胞來產生本發明中所用的表現載體。可在習用的生物反應器、搖擺式生物反應器、微載體、滾瓶、燒瓶或培養皿中，以附著細胞的形式或以存在或不存在載體的懸服形式培養宿主細胞。使用批式、饋料批式、連續式系統、中空纖維等，在適合一特定細胞的溫度、pH值及氧含量進行培養。
例如，可在禽類細胞諸如從受精雞蛋獲得的雞胚胎所製備之雞胚胎纖維母細胞(CEF)及鴨細胞株中，產生痘病毒載體(如參見WO03/076601、WO2007/077256、WO2009/004016、WO2010/130756及US2011-008872)。禽類細胞通常在可供細胞生長的適當培養系統中，在30℃至37℃之間之溫度培養。所培養的細胞然後經痘病毒表現載體感染，及在促成病毒擴增(病毒基因體的轉錄作用、產生病毒蛋白及組裝成為感染性病毒顆粒)的條件下，培養1至14天不等。尤其，感染步驟期間所用的培養基與溫度條件，可與細胞生長及/或病毒擴增步驟期間所用的培養基與溫度相同或不同。
可在提供反式缺陷型功能的細胞株中，產生複 製作用缺陷型腺病毒載體。例如，用於互補該刪除E1型腺病毒載體之適宜細胞株，係包括293細胞(Graham等人於1997年期刊“J.Gen.Virol.”第36期第59-72頁乙文)以及HER-96與PER-C6細胞(如Fallaux等人於1998年期刊“Human Gene Ther.”第9期第1909-1917頁乙文；WO97/00326)或該等細胞株的任何衍生物。
在技藝中可取得數種培養基，諸如杜貝可(Dulbecco)改良型伊格氏(Eagle)培養基(英杰(Invitrogen)公司的DMEM)或伊格氏基礎培養基(英杰公司的BME)，其等可選擇性地增補血清(如胎牛血清(FCS))及/或胺基酸(如L-麩醯胺)。亦可在不含有動物產品的培養基中培養細胞。已述及許多不含有動物產品的培養基，及其中一部分可商構取得，諸如例如293 SFM II；293-F細胞、SFM改良型；293-H細胞、SFM改良型；293fectinTM轉染試劑；CD 293 AGTTM；CD 293培養基；FreeStyleTM 293表現系統；FreeStyleTM 293培養基；FreeStyleTM 293-F細胞、SFM改良型；VP-SFM；VP-SFM AGTTM；供PER.C6®細胞使用之腺病毒表現培養基(AEM)生長培養基；CD 293 AGTTM；CD 293培養基；SFM改良型；EPISERF®培養基；OptiProTM SFM(所有皆可自英杰公司取得)。
可從培養上清液及/或從宿主細胞回收所產生的載體。可將細胞裂解，而容許生產細胞將病毒顆粒釋出。可藉由技藝中眾所周知的各種技術破壞細胞膜，該等技術包括但不限於冷凍/解凍、低滲透壓溶胞作用、清潔劑媒介 型溶胞作用、超音波處理及微射流作用等。
若需要，所回收的載體可進行純化。可實施各種步驟，不論這些步驟的順序為何，諸如澄清步驟容許在適當的條件下去除細胞碎片(如藉由深層過濾作用)，濃縮步驟容許濃縮粗製品中的載體(如藉由微過濾作用或超過濾作用)；核酸酶處理步驟容許降解細胞的DNA(如藉由使用苯佐酶(benzonase))；及/或一或多種層析步驟(如離子交換、凝膠過濾作用、親和性、羥磷灰石等及尤其以離子交換為首選)。為說明之用，可如WO2007/147528與WO2010/130753中所述，進行痘病毒顆粒的純化作用；其中可如WO96/27677、WO98/00524、WO98/22588、WO98/26048、WO00/40702、EP1016700及WO00/50573所述，純化腺病毒載體。所採用的條件與技術係取決於諸如淨電荷、分子量、疏水性、親水性等因子，及其等係嫻熟技藝者所顯而易見。此外，純化程度將依預定用途而定。
通常，用於本發明之免疫療法組成物所包含或所編碼的治療劑係以一“治療有效量”投藥，其係指足以產生一治療效益之量。治療有效量可因各種參數而異，尤其是治療劑類型(多肽、質體或病毒載體)；投藥模式；疾病狀態；個體的年齡與體重；症狀的性質與範圍；並行的治療類型(如干擾素及/或雷巴威林及/或抗蛋白酶療法)；及/或治療的頻率與劑量。並由執業醫生根據相關情況，例行地進行進一步精細計算，來決定適當的治療劑量。
就一般準則而言，一種包含病毒載體的組成物之 適宜的治療有效量係自約105至約1013vp(病毒顆粒)、iu(感染單位)或pfu(溶菌斑形成單位)不等，依所用的載體與定量技術而定。例如，用於投予牛痘病毒式組成物之個別劑量係包含約5x105至約109個溶菌斑形成單位的痘病毒或MVA，有利地約5x106溶菌斑形成單位至約108個溶菌斑形成單位，理想地約5x106個溶菌斑形成單位至約5x107個溶菌斑形成單位；及其量較佳約為107個溶菌斑形成單位。腺病毒載體組成物的較佳劑量係含有約105至約1012vp，及尤其以約5x108、約109、約5x109、約1010、約5x1010vp或約1011vp之劑量為首選。可用於評估一劑量中的vp、iu及pfu數量之技術，係技藝中所習用者。可藉由使用允許性細胞(如BHK-21或CEF)的例行性效價分析技術及適宜的著色作用(如使用中性紅；Talavera於1992年期刊“Methods Mol.Biol.”第8期第235-248頁乙文)或免疫染色法(如使用抗MVA抗體；Caroll等人於1997年期刊“Virology”第238期第198-211頁乙文)，測定一試樣中所存在的牛痘病毒載體。通常藉由測量A260吸光度或HPLC而測定腺病毒顆粒(vp)之數值，藉由定量DBP免疫螢光法測定iu效價，及在允許性細胞的感染作用後藉由計數溶菌斑數目而測定溶菌斑形成單位。依據FDA準則，vp/iu比例較佳低於50。
以載體質體為基礎之一組成物的投予劑量可介於1微克與25毫克之間，有利地介於10微克與20毫克之間，裡想地介於100微克與2毫克之間，及尤其以介於200微克與1毫克之間之劑量為首選。可用於評估一試樣中的 質體載體量之技術，係技藝中所習用者(如藉由光譜測定法)。一蛋白組成物所投予的劑量可介於10奈克與20毫克之間，尤以每公斤體重約0.1微克至約2毫克的免疫原性多肽之劑量為首選。
本發明中所用之免疫療法組成物係適合多種投藥模式，包括非經腸與黏膜途徑。較佳為非經腸投藥作用及特別是皮內、上皮內、鼻內、皮下接種、皮下或肌內途徑，及尤以皮下途徑為首選。
此外，免疫療法組成物的各次投藥作用之投藥途徑、治療劑及治療有效量可互不相同。為說明之用，可用一種MVA載體式免疫療法組成物進行彼此相隔3至10天之2至5次投藥作用，及可用一種腺病毒或質體載體式免疫療法組成物進行彼此相隔6至20個星期之1至8次投藥作用。亦可設想由不同投藥途徑組合而成的投藥模式，如組合皮下與肌內投藥作用。
然而，較佳仍藉由相同的投藥途徑進行免疫療法組成物的所有投藥作用，投藥途徑較佳選自由皮內、肌內及皮下所組成之群組，及以後者為較佳。皮下投藥作用特別適用於包含病毒表現載體諸如MVA之組成物，而肌內投藥作用特別適用於包含質體表現載體之組成物。
可使用習用的針或適用於投藥途徑的裝置，及選擇性地使用可促進或增進活性劑(多肽或表現載體)輸送作用之一或多種化合物或裝置，進行投藥作用。適宜的化合物包括但不限於多價陽離子聚合物(如幾丁聚醣、聚甲 基丙烯酸鹽、PEI等)及陽離子型脂質(如DC-Chol/DOPE、可自普洛麥格(Promega®)公司取得之轉染坦(transfectam)脂質感染素(lipofectin))；及適宜的裝置包括但不限於該等容許電穿孔作用及壓力介導型輸送作用者。經由電穿孔的投藥作用係特別適用於質體載體式組成物之肌內輸送作用。
免疫療法組成物
在另一個較佳實施例中，本發明所用之免疫療法組成物除了治療有效量的活性劑之外，還進一步包含一種藥學上可接受的載劑。
“藥學上可接受的載劑”一詞係意欲包括可與哺乳類動物及尤其人類的投藥作用相容之任何與所有載劑、溶劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑、分散介質、塗料、抗細菌劑與抗真菌劑及延遲吸收劑之類。
本發明中所用的組成物理想地係經適當地緩衝，以使得適合在生理或弱鹼性pH值(如約pH 7至約pH 9)供人類或動物使用。適宜的緩衝液包括但不限於磷酸鹽緩衝液(如PBS)、碳酸氫鹽緩衝液及/或Tris緩衝液。
本發明中所用的組成物可進一步包含適用於人類或動物之一稀釋劑。其較佳為等張、低張或弱高張及具有相對低的離子強度。代表性實例包括但不限於無菌水、生理食鹽水(如氯化鈉)、林格氏(Ringer)液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、漢克氏(Hank)液及其他含水的生理平衡鹽溶液(例如參見利平科特、威廉斯及威爾金斯(Lippincott, Williams & Wilkins)公司出版及由A.Gennaro所編輯之“雷明頓：藥劑學之科學與應用(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)”乙書最新版本))。
藥學上可接受的載劑亦可在製造及在冷凍(如-70℃、-20℃)、冷藏(如4℃)或環境溫度長期儲存(亦即至少6個月及同時較佳至少二年)之條件下保存其安定性，不論該組成物的形式為何(如冷凍、液態或固態)。可藉由涉及真空乾燥與冷凍乾燥的一種方法，獲得固態(如乾燥粉末型或冷凍乾燥型)組成物。為說明之用，無菌磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)與生理食鹽水係適用於保存質體載體，而包含氯化鈉與糖之經緩衝的調配物係適用於保存病毒載體，如用於腺病毒載體之具有1M蔗糖、150 mM氯化鈉、1 mM氯化鎂及54毫克/公升的妥文(Tween)80之10 mM Tris pH 8.5，及用於MVA載體之具有蔗糖5%(重量/體積)、10 mM麩胺酸鈉及50 mM氯化鈉之Tris 10 mM pH 8。
可使用藥學上可接受的附加賦形劑來提供所欲的藥學或藥效動力學性質，例如包括該調配物的滲透性、黏度、透明度、顏色、無菌性、安定性、溶解速率；延遲釋出或吸收進入個體內之作用；促進輸送通過血液障壁或滲透進入一特定器官(如肝臟)。
此外，本發明中所用之免疫療法組成物可包含一或多種佐劑。佐劑係指可擴增免疫原(如HCV NS多肽)的致免疫性質之一組分，不論該致免疫性質是特異性或非特異性、荷爾蒙性或細胞性。該佐劑理想地係適用於增強 免疫性，包括經由諸如TLR-7、TLR-8及TLR-9之類鐸受體(TLR)之一種T細胞所媒介的免疫性。適用佐劑的代表性實例包括但不限於明礬、礦物油乳劑諸如弗氏(Freund)完全與不完全佐劑(IFA)、脂多醣或其衍生物(美國紐約普列南(Plenum Press)出版公司於1986年出版之Ribi等人所著“細菌內毒素之免疫學與免疫藥理學(Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins)”乙書第407-419頁)、皂素諸如QS21(Sumino等人於1998年期刊“J.Virol.”第72期第4931頁乙文；WO 98/56415)、咪唑-喹啉化合物諸如咪喹莫特(Imiquimod)(Suader於2000年期刊“J.Am Acad Dermatol.”第43期第S6頁乙文)、S-27609(Smorlesi於2005年期刊“Gene Ther.”第12期第1324-1332頁乙文)及諸如WO2007/147529中所述的相關化合物、胞嘧啶磷酸鹽鳥核苷寡去氧核苷酸類諸如CpG(Chu等人於1997年期刊“J.Exp.Med.”第186期第1623-1631頁乙文；Tritel於2003年期刊“J.Immunol.”第171期第2538-2547頁乙文)及陽離子肽諸如IC-31(Kritsch等人於2005年期刊“J.Chromatogr Anal.Technol Biomed Life Sci”第822期第263-270頁乙文)。
與其他治療方式之合併使用
在一實施例中，該免疫療法組成物係與擬用於治療受HCV感染的一個體之其他治療方式併用。
“併用”一詞及其變體諸如“合併使用”係指在同一個體中投予二或多種實體之投藥作用，其中一實體係本文中所述的免疫療法組成物。所併用的二或多種實體可經 由不同途徑、劑量及依據不同排程投予不同的期間。
本發明中所用之免疫療法組成物較佳係與抗病毒療法併用，該抗病毒療法係包括提供一個體一或多種抗病毒化合物。“抗病毒化合物”可界定為可抑制HCV生命週期的至少一步驟之一化學化合物或一生物分子，其係直接(如藉由抑制一病毒酵素)或間接(如藉由模擬一病毒受質諸如核苷與核苷酸類似物或抑制病毒複製或進入所需的一細胞蛋白)，或可阻斷病毒感染作用(如阻斷抗體)，其目的係以暫時或持續之方式減少受感染個體的HCV病毒負荷量。
抗病毒化合物的代表性實例係選自由下列所組成之群組：干擾素、雷巴威林、NS3/4A蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS5B聚合酶抑制劑核苷類似物、核苷酸類似物、免疫調節劑諸如介白素與趨化激素及宿主細胞抑制劑諸如環親和素抑制劑或其任一功能性類似物(如威朗(Valeant)公司之TiribavirinTM)。與本文中所述的免疫療法組成物併用之較佳的抗病毒化合物，係干擾素及/或雷巴威林，及選擇性地為一種NS3/4A蛋白酶抑制劑。
通常依據所感染的HCV基因型、抗病毒療法的類型(二合或三合療法)及個體耐受度，而對於個體提供抗病毒療法達24至48個星期(如對於第1基因型提供達48個星期及對於第2與3基因型提供達24星期)。抗病毒療法較佳包括提供干擾素與雷巴威林達48個星期(生物療法)。當抗病毒療法進一步涉及NS3/4A蛋白酶抑制劑(三合療法)諸如默克(Merck)公司的伯賽匹韋(boceprevir)(韋克瑞斯(Victrelis))或 頂點(Vertex)公司的特拉匹韋(telaprevir)(因昔韋克(Incivek))時，抗病毒療法的期程可縮短為24個星期。任擇地，抗病毒療法可為不含有IFN者，而在不存在任何干擾素(如NS3/4A蛋白酶及/或聚合酶抑制劑)之情況下提供一或多種抗病毒化合物。抗病毒療法亦可在不存在任何干擾素或雷巴威林之情況下，包括提供一或多種核苷/核苷酸類似物。
雖然可在本發明的景況下提供任一干擾素，該干擾素有利地為一種干擾素-α(IFNα)，較佳為一種聚乙二醇化干擾素-α，及更佳為一種聚乙二醇化干擾素-α2a(如PEGASYSR)或一種聚乙二醇化干擾素-α2b(如PEGINTRONR)。亦可設想干擾素λ，及較佳為聚乙二醇化干擾素λ。投藥劑量、途徑及期程可因干擾素類型、製造廠商而異，及醫師可採用適合各個體的適當方式。聚乙二醇化干擾素α通常藉由肌內或皮下途徑提供，就聚乙二醇化干擾素-α2a而言，其劑量係每星期約180微克；而就聚乙二醇化干擾素-α2b而言，其劑量係每星期約每公斤1.5微克。
雷巴威林(如COPEGUSR)係一種合成性核苷類似物，其化學名稱為1-β-D-核呋喃基-1-H-1,2,4-三唑-3-甲醯胺。可商購取得口服錠劑形式的雷巴威林。依個體體重(75公斤以下的個體為5個200毫克錠劑及75公斤以上的個體為6個200毫克錠劑)或其他因子諸如耐受度而定，較佳以每日約1000至約1200毫克之劑量，以口服方式提供雷巴威林(如5或6個200毫克錠劑)。
病毒蛋白酶抑制劑包括但不限於NS/4A蛋白酶 抑制劑特拉匹韋(telaprevirTM)(頂點(Vertex)公司)、伯賽匹韋(boceprevirTM)(默克(Merck)公司)、TMC435(Tibotec)、BI201335(百靈佳殷格翰(BoehringerIngelheim)公司)、ABT-450(亞培(Abbott)公司)、BMS-650032(必治妥施貴寶(Bristol-Myers Squibb)公司)及RG7227(羅氏(Roche)公司的丹諾匹韋(danoprevir))。為說明之用，較佳分別以每日約2400與2250毫克的劑量，以口服方式提供伯賽匹韋(boceprevirTM)與特拉匹韋(telaprevirTM)。
NS5B聚合酶的抑制作用將HCV RNA合成作用中斷，並因此阻止產生新的病毒粒子所需之基因體HCV RNA合成作用。聚合酶抑制劑可基於其等的作用機制與化學結構而分成兩大類：核苷類似物係以競爭方式與聚合酶的活性位結合，而非核苷型類似物係非競爭型抑制劑及與NS5B上的多個分立位址結合。研發中的NS5B抑制劑包括但不限於RG7128(羅氏(Roche)公司的莫昔他濱(mericitabine))、GS-9190(吉利德(Gilead)公司)、PSI-7977與PSI-938(法莫賽特(Pharmasset)公司)及VX-222(頂點(Vertex)公司)。
涉及病毒複製作用與病毒組裝之病毒蛋白NS5A，亦為研發中的新抗病毒劑諸如BMS-790052(必治妥施貴寶(Bristol-Myers Squibb)公司)之標的。
除了病毒標的之外，涉及病毒複製作用的宿主細胞蛋白亦為藥物開發者之標的。尤其涉及眾多細胞作用諸如蛋白摺疊與移行之環親和素(肽基-脯胺醯基順反異構 酶)，亦為HCV複製作用所需。DEB-025(諾華(Novartis)公司的阿拉泊韋(alisporivir))與SCY-635(西尼克斯(Scynexis)公司)係目前臨床研發中的宿主環親和素抑制劑。
依據一較佳實施例，較佳在抗病毒療法期間，將本發明中所用之免疫療法組成物投藥至個體。較佳在投予本文中所述的免疫療法組成物之前，已開始提供抗病毒療法一段期間而足以減少治療個體中的病毒負荷量。醫師可在免疫療法組成物的投藥作用起始之前，判定提供抗病毒療法之適當期間。就通用的指導原則而言，在投予該免疫療法組成物之至少1個星期前，起始該抗病毒療法，有利地在至少2個星期前，理想地在至少3個星期前及較佳在至少4個星期前，及尤以在約4或5個星期前為首選。就通用的指導原則而言，在由PEG-IFNa與雷巴威林所組成的抗病毒療法進行4個星期後，預期約40%至50%的個體之病毒負荷量之減少係達到至少2 log10國際單位/毫升。
較佳依據一投藥模式，將本發明中所用的免疫療法組成物投藥至該個體，該投藥模式包括2至5次之彼此相隔約一個星期的投藥作用(在此稱為“每星期一次”的投藥作用)及接著進行1至8次之彼此相隔約三個月的投藥作用(在此稱為“每季”投藥作用)。如本文中所用之“約一個星期”或“每星期一次”係指6、7或8天，而“約三個月”或“每季”係指9至14個星期之期間(如9、10、11、12、13或14個星期)。在本發明的上下文中，二次投藥作用相隔之時間可能在所界定的範圍內變動。
一種特佳的投藥模式係包括三個每星期一次的投藥作用，接著進行一至六個每季一次的投藥作用；更佳為三個每星期一次的投藥作用，接著進行二至四個每季一次的投藥作用；及甚至更佳為三個每星期一次的投藥作用，接著進行三個每季一次的投藥作用。
一種更佳的投藥模式係包括六次的免疫治療組成物投藥作用，該等投藥作用較佳在干擾素與雷巴威林療法起始(抗病毒療法之起始係代表第0星期)後之第4、5、6、16、28及40星期。
可在抗病毒療法期間(如48個星期)甚至在抗病毒療法期程結束後，進行免疫治療性組成物的附加投藥作用，如以任何週期性進行，但尤其以每季的週期性為首選。
在本發明的上下文中，干擾素與免疫療法組成物可能在同一天提供給該個體(如每星期一次的PEG-IFNα2可能恰逢本文中所述組成物之每星期或每季的投藥作用)，或者干擾素注射作用與免疫療法組成物的投藥作用可相隔一天或數天(2、3、4、5或6天)。
所包含的MVA載體係編碼NS3/NS4多蛋白與NS5B多肽之免疫療法組成物，甚至更佳藉由皮下途徑及包含約5x106至約1x108個溶菌斑形成單位的劑量投藥至該名個體，該干擾素係藉由肌內或皮下途徑提供的一種聚乙二醇化IFNα2，而該抗病毒化合物係藉由口服提供的雷巴威林。該免疫療法組成物又更佳包含約107個溶菌斑形成單位的MVA載體，及在其基因體中納入編碼NS3/NS4融合蛋白 之一核苷酸序列，而該NS3/NS4融合蛋白所包含的胺基酸序列與序列辨識編號：1中所示的胺基酸序列之一致性係至少95%；及在該載體中納入編碼NS5B多肽之一核苷酸序列，而該NS5B多肽所包含的胺基酸序列與序列辨識編號：2中所示的胺基酸序列之一致性係至少95%；該干擾素係聚乙二醇化干擾素α 2a，其係以每星期約180微克的量及藉由皮下途徑每星期提供該個體一次；而該雷巴威林係藉由口服提供每日1000至1200毫克的量。
在另一實施例中，免疫療法組成物可與不含有IFN的抗病毒療法併用，亦即與任何IFN以外之如上文所述的一或多種抗病毒化合物併用，如與雷巴威林及/或病毒蛋白酶抑制劑及/或聚合酶抑制劑及/或核苷/核苷酸類似物併用。就這方面而言，免疫療法組成物引發先天性與適應性免疫力之能力可補充該等抗病毒化合物的作用機制，即若抗病毒逃逸突變株出現，免疫療法組成物的療效預計不會受到影響，因點突變作用不會干擾該免疫療法組成物所提供的整體免疫力。該方式可促成減少IFN相關副作用。
在另一實施例中，免疫療法組成物可與不含雷巴威林的抗病毒療法併用，亦即與雷巴威林或其任何類似物以外之如上文所述的一或多種抗病毒化合物併用，如與IFN及/或病毒蛋白酶抑制劑及/或聚合酶抑制劑及/或核苷/核苷酸類似物併用。
治療療程
本發明的另一方面係有關於一治療療程，其步驟 包括依據本文中所述的投藥模式，對於一個體投予本發明所用之免疫療法組成物。該治療療程之進行較佳係將本文所述的抗病毒療法合併提供給該個體，及特別是技藝中目前用於治療HCV感染及尤其慢性HCV感染(如PEG-IFNα及/或雷巴威林及最終一種NS3/4A抑制劑)之抗病毒療法。
在本發明的上下文中，使用免疫療法組成物或依據本文中所述的方式進行治療療程，以提供相較於未使用該免疫療法組成物(如相較於僅提供抗病毒療法)之對抗HCV感染之治療效益。
相較於未領受本文所述的免疫療法組成物或治療療程之預期症狀、疾病進程及存活期，藉由本文所述的免疫療法組成物或治療療程，可減少或緩解通常與HCV感染相關的一或多種症狀(如肝臟炎症、肝臟細胞溶解、肝臟纖維化、硬化及/或肝癌)、減輕疾病的程度、使疾病狀況穩定(亦即不惡化)、阻止疾病擴散、延遲或減緩疾病之進程或惡化、改善或減緩疾病狀況、降低SOC相關毒性及清除病毒(不論是暫時性或持續性)以及延長生存期之能力，而確認其治療效益。
更詳細地，本文所述之與抗病毒療法併用的免疫療法組成物或治療療程，可藉由例如增加在一特定時間點達到病毒減量或消滅之病患比例，或藉由縮短達到該目標所需的抗病毒療法期間，及/或藉由減少達到該目標之抗病毒療法的量及/或藉由減少抗病毒療法的頻率等，而有助於控制HCV感染。
就一般所示，可藉由針對醫師或其他技術嫻熟的醫護人員通常所考量之反映HCV感染的任何相關標記進行測量，而方便評估治療效益，例如藉由定量分析在不同時間點從一個體採集的生物試樣中之HCV核酸及/或病毒抗原。例如，可在所選定時間點，將依據本發明治療的個體群組中所測得的該等標記之水平，與在相同時間點與相同條件下未使用該免疫療法組成物或治療療程的個體中所測得的相同標記之水平比較，而評估治療效益。用於評估治療效益之特別適當的標記，係在不同時間點重複測量血中病毒負荷量，及將該等測量轉換為常規療效指標，如快速病毒反應、早期病毒反應、完全早期病毒反應、表示清除(亦即治癒)或與清除相關聯之治療反應的終點及/或持續性病毒反應。
通常使用定量RT-PCR分析或藉由技藝中所認可的其他任何方法，藉由定量分析從一個體所收集的一指定試樣(如血液或血清試樣)中的HCV核糖核酸(RNA)，而測定“病毒負荷量”。雖然測定HCV-RNA不可定量性之定量下限(LLOQ)可能因不同的分析而異，其理想地係小於29國際單位/毫升(IU/mL)，及較佳小於或等於15國際單位/毫升。一種特別適宜的RT-PCR分析法係羅氏(Roche)公司的泰克曼(TaqMan)R分析法(如所附實例中所述)，其所提供的LLOQ為15國際單位/毫升，及其測定HCV RNA的不可檢測性之檢測下限(LLOD)係小於10國際單位/毫升。
就一般準則而言，通常的做法係在基線(亦即在 如本發明的治療療程起始之前或在使用免疫療法組成物之前)及在治療療程或使用免疫療法組成物之期間，測量一個體的病毒負荷量。在所使用的免疫療法組成物及所進行的治療療程係與抗病毒療法併用之實施例中，可在不同時間點(如在提供抗病毒療法之前及在抗病毒療法進行2、4或5、12、24、36及48個星期之後及在抗病毒療法結束後之第12與24個星期)，估算病毒負荷量。例如，在二個時間點之間的HCV-RNA若減少至少0.5 log10國際單位/毫升，則可為治療效益之預測指標。
更詳細地，若在一特定時間點之後所定量分析的血清HCV RNA水平之降低達到顯著程度(如清除HCV RNA)之個體比例增加至少5%及較佳增加至少10%時，則確定治療效益。
相較於僅提供4個星期的抗病毒療法，所使用的免疫療法組成物或所進行的治療療程之目標，理想地係在12個星期的抗病毒療法之後，使得達到快速病毒反應(RVR)或甚至更佳維持長期的RVR之個體比例增加至少5%，及較佳增加至少10%。
相較於僅提供12個星期的抗病毒療法，所使用的免疫療法組成物或所進行的治療療程之目標，較佳係使得達到早期病毒反應(EVR)或甚至更佳達到完全早期病毒反應(cEVR)之個體比例增加至少5%，及較佳增加至少10%。
相較於僅提供24或48個星期的抗病毒療法，所 使用的免疫療法組成物或所進行的治療療程之目標，更佳係使得達到持續性病毒反應(SVR)之個體比例增加至少5%，及較佳增加至少10%。
“至少5%”係指5%或大於5及介於6與100之間的任何數值，而至少10%係指10%或大於10及介於11與100之間的任何數值，及尤其以至少至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%或至少35%為首選。
如本文中所用之“超病毒反應”或“UVR”一詞，係指在2個星期的抗病毒療法之後，無法檢測出HCV RNA。
如本文中所用之“快速病毒反應”或“RVR”一詞，係指在4個星期的抗病毒療法之後，無法檢測出HCV RNA。
如本文中所用之“長期的快速病毒反應”或“eRVR”一詞，係指在4與12個星期的抗病毒療法之後，無法檢測出HCV RNA。如本文中所用之“早期病毒反應”或“EVR”一詞，係指在12個星期的抗病毒療法之後的HCV RNA減少程度大於或等於2 log10國際單位/毫升。
“完全早期病毒反應”或“cEVR”一詞，在此係界定為在12個星期的抗病毒療法完成後之12個星期，無法檢 測出HCV RNA。
“治療反應的終點”或“ETR”在此係界定為在抗病毒療法完成後，無法檢測出HCV RNA。
如本文中所用之“持續性病毒反應”或“SVR”一詞，係指在抗病毒療法完成後之12或24個星期，仍維持無法檢測出HCV RNA。
較佳在不同時間點，使用LLOD小於10國際單位/毫升之RT-PCR分析，或使用技藝中所認可及靈敏度相當的其他任何方法，進行病毒負荷量的定量作用。
任擇地或組合地，亦可藉由測定一個體血液或血清中的肝臟酵素活性水平(如丙胺酸轉胺酶(ALT)及/或天門冬胺酸鹽轉胺酶(AST))及藉由評估肝臟中的纖維化水平(如藉由FibroscanR)，而評估治療效益。例如，該等酵素的正常化或彈性及/或纖維化分期的調降，可能表示較佳的肝臟狀態。
就一有利方面而言，相較於僅用抗病毒療法治療之慢性感染HCV的個體族群，所用的免疫療法組成物及所進行的治療療程之目標，係縮短抗病毒療法之期間及/或減少該等抗病毒化合物中的至少一者之劑量或療程，從而導致在依據本發明治療的HCV病患族群中之抗病毒劑相關不良事件的比例降低(如降低至少5%)。
在另一方面，所用的免疫療法組成物及所進行的治療療程之目標，係引發或刺激接受治療個體的免疫系統，而使其優於基線狀態或優於僅提供抗病毒療法(如 PEG-IFNα與雷巴威林)之預期狀態(就定量或定性而言)。
所引發或所刺激的免疫反應可為非特異性(先天性)及/或特異性(抗HCV及/或抗載體反應)、荷爾蒙性及/或細胞性，及尤其以引發或刺激由CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或CD8+與CD4+ T細胞二者所媒介的先天性或特異性T細胞反應為首選。特異性抗HCV免疫反應較佳係導向對抗存在於NS3、NS4及NS5B多肽中任一者的一或多種抗原決定位。在抗病毒療法期間之免疫療法組成物的多次重複性投藥作用，預期得以在治療個體中引發一有效的先天性及/或特異性免疫反應，而可能在抗病毒療法期間進行投藥之際，維持該免疫反應。
可藉由技藝中的多種標準分析法，評估上述免疫療法組成物或治療療程在接受治療的個體中引發或刺激一免疫反應之能力(關於免疫反應的起始與活化作用的評估技術之一般說明，例如參見美國國家衛生研究院(National Institute of Health)出版及由約翰威利父子(John Wiley & Sons)出版公司編輯之Coligan等人的1992年與1994年版本之“免疫學實驗操作手冊(Current Protocols in Immunology)”乙書))。可藉由測量由活化作用細胞及包括CD4+與CD8+ T細胞所衍生者所產生的細胞介素廓型(如藉由PBMC上的酶聯免疫斑點法(ELIspot)量化在各種終點所收集的血液試樣中之IL-10或產生IFNg型細胞))；藉由測定免疫作用細胞的活化狀態(如藉由傳統的[3H]胸腺嘧啶吸收法之T細胞增生作用分析)；藉由分析對於敏化個體中之抗原特異性T淋巴 球(如在細胞毒性分析中之具有肽特異性的溶胞作用)，而評估細胞免疫性。可藉由抗體結合作用及/或競爭分析法(如參見冷泉港(Cold Spring Harbor Press)出版公司於1989年出版及由Harlow所著之“抗體(Antibodies)”乙書)，測定荷爾蒙性反應。
在另一方面，本發明亦有關於將慢性感染HCV的個體族群中達到完全早期病毒反應(cEVR)的個體比例增加至少5%及較佳至少10%之一種方法，其係相較於慢性感染HCV及僅用抗病毒療法(如干擾素與雷巴威林)治療的個體族群中之cEVR而言，該方法包括對於個體族群投予免疫療法組成物或進行本文中所述的治療療程，從而引發或刺激一種T細胞所媒介的免疫反應，而對抗存在於HCV NS3、NS4及/或NS5B多肽中的一或多種抗原決定位。
在另一個較佳實施例中，如本發明所用的免疫療法組成物及所進行的治療療程係用於治療慢性感染的個體。
“慢性HCV感染”一詞，係指在一個體中持續超過6個月的HCV感染。雖然慢性HCV感染/慢性肝炎的天然歷程係因個體而異，慢性HCV感染通常導致肝臟相關疾病(肝臟炎症、肝臟纖維化及最終肝癌)。
個體所慢性感染的HCV之基因型或亞型，較佳係與本發明所用免疫療法組成物所包含或所編碼的NS多肽所源自之任何HCV相同，及尤其以第1基因型的感染性HCV(1a或1b)為首選。任擇地，個體所感染的HCV之基因 型，係不同於NS治療劑所源自之HCV(如第3基因型的感染性HCV)。在使用免疫療法組成物或進行該治療療程之前，該個體更佳未曾接受過用於HCV之習知的任何干擾素式治療。
在另一個較佳實施例中，待治療的個體係在基線未曾接受治療的一個體，及特別是在使用免疫療法組成物或進行本文中所述的治療療程之前未曾接受習知IFN療法之個體。
“未曾接受治療”係指待依據本文中所述的方式治療之該個體或病患先前未曾接受過核准用於治療HCV感染的任一抗病毒化合物之治療。因此，未曾接受IFN治療的一個體，係先前未曾接受過核准用於治療HCV感染的任一IFNα化合物之治療。
在基線，亦即在使用免疫療法組成物或進行本文中所述的治療療程之前，該名“未曾接受治療”的待治療個體較佳具有高病毒負荷量。
在本發明的上下文中，“在基線的高病毒負荷量”係指高於400,000國際單位/毫升及較佳高於600,000國際單位/毫升之HCV RNA水平。
任擇地，待治療的個體可為先前對於用於HCV的治療(如PEG-IFNα與雷巴威林)不反應者或部分反應者。
在另一個較佳實施例中，待治療的個體係非肝硬化者。(亦即如藉由例行性探查技術諸如肝纖維化掃描器或生物檢體法所測定之纖維化狀態低於4(如F0、F1、F2 或F3))。
在另一方面，本發明提供用於治療HCV感染及較佳慢性HCV感染之一種試劑套組，其中該套組包含多個容器及對於一個體投予免疫療法組成物或依據本文中所述的方式進行治療療程之說明書。
該套組較佳包括a)一種免疫治療性組成物，其包含如上文所界定之一牛痘MVA載體；b)抗病毒化合物諸如干擾素與雷巴威林；及c)用於投予(a)與(b)中各者之說明書。
已用例示方式說明本發明，應瞭解所用的術語係意欲著重詞彙的說明性質，而非用於限制。鑑於上述教導，顯然可能進行本發明的眾多改質作用與變化。因此，應當理解在所附申請專利範圍的範圍內，本發明可能依不同於本文中具體所述之方式實施。
上文所引述的所有專利案、發表文獻及資料庫項目的揭露內容係在此完整地逐一併入本案以為參考資料，如同各專利案、發表文獻及資料庫項目係逐一與個別地顯示併入本案以為參考資料。
實例 第1例：臨床前研究
該研究之目的係判定在TG4040初打疫苗接種(相隔一星期之三次皮下注射107個溶菌斑形成單位)後之加打的最佳時機，以增進所引發之具免疫原特異性的細胞免疫反應。藉由IFNg酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析、IFNg ICS、雙重IFNg/TNFα與IFNg/IL2 ICS分析，調查不同的加打時間點(稱作初打注射作用後1、2、3及4個月)。
材料與方法 病毒
TG4040係編碼HCV第1b基因型NS3、NS4及NS5B抗原之一種MVA載體(完整說明請參見如WO2004/111082或WO2008/113606)。MVATGN33.1係作為負對照組之一種空的MVA載體。該二MVA載體係在-80℃儲存於含有pH 8的Tris 10 mM與5%(重量/體積)的蔗糖、10 mM麩胺酸鈉及50 mM氯化鈉之緩衝液中。
動物模式
從巴斯德研究院(Pasteur Institute)獲得HLA-A2.1基因轉殖小鼠(Pascolo等人於1997年期刊“J.Exp.Med.”第185期第2043-2051頁乙文)，及在PBES(里昂)繁殖。該等小鼠的H-2Db與鼠類β2-微球蛋白基因已被剔除， 及表現一種基因轉殖型單鏈組織相容性第I類分子，其中人類β2m的C端係與一嵌合重鏈(HLA-A2.1 α1-α2，H-2Db α3跨膜域與細胞質內域)的N端共價連接。
免疫接種之操作程序
對於10組的HLA-A2基因轉殖小鼠(每組5隻動物及負對照組包括2隻動物)進行免疫接種：初打作用係相隔一個星期(第1、2及3個星期)在尾根部進行三次皮下(SC)注射107個溶菌斑形成單位的MVA載體(TG4040或MVATGN33.1)。小鼠然後在第6、10、14或18星期(稱作“第1、2、3或4個月加打組”)進行加打，或者不進行加打(稱作“第1、2、3或4個月對照組”)。第9組係對應於負對照組及具有2隻小鼠，其等領受各相隔一星期的三次皮下注射107個溶菌斑形成單位的MVATGN33.1加上在第18星期(“第4個月”)加打MVATGN33.1一次。增加具有2隻未曾接受治療的小鼠之第10組。加打動物係在加打15天後進行細胞免疫反應分析，而未加打動物亦在相同時間點進行分析。
酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析
收集來自各組小鼠的脾細胞，及將紅血球細胞溶解(西克瑪(Sigma)公司之R7757)。在經一種抗小鼠IFNγ單株抗體(必帝生物科學(BD Biosciences)公司)塗佈之多重篩選(Multiscreen)培養皿(密里博(Millipore)公司)中，細胞(每孔2x105個)係在αMEM培養基(吉柏柯(Gibco)公司)中及在10單位/毫升的重組型鼠類IL2(派普泰克(Peprotech)公司)之存 在下，以三重複進行培養40小時，在該αMEM培養基中增補10% FCS及盤尼西林(80單位/毫升)、鏈黴素(80微克/毫升)、2 mM L-麩醯胺(吉柏柯(Gibco)公司)、1X非必需胺基酸(吉柏柯(Gibco)公司)，僅具有重組型鼠類IL2者係作為負對照組(“僅存在培養基”之條件)，或者具有：
- 10微克的NS3肽(如來自歐洲基因科技(Eurogentec)公司之位於NS3內之位置1038至1047的GLL肽)，其係用於研究抗NS3反應；或E13K(來自NS3的一種15肽及顯示含有一個小鼠第II類限制性抗原決定位)；
- 用於研究抗NS5B反應之涵蓋NS5B的肽池(NS5BFP涵蓋第2421至3011個胺基酸)(模擬表位(Mimotope)公司之PepSet程式)(重疊11個胺基酸之125種13肽至17肽；各肽為1μM)；
- 用於研究抗MVA反應之MVATGN33.1；
- 作為正對照組之5微克/毫升的伴刀豆球蛋白A(西克瑪(Sigma)公司)。
- 作為負對照組之10微克/毫升的一種不相關肽(在HCV核心中之第132至140個胺基酸)。
使用3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)作為受質，藉由鏈黴抗生物素蛋白複合型辣根過氧化酶(南方生物科技(Southern Biotechnology)公司)，進行與生物素化抗鼠類IFNγ(必帝科學(BD science)公司)之培養，接著藉由酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析，進行產生IFNγ型細胞之定量。
使用酶聯免疫斑點(ELISPOT)微量平皿讀數器 (ImmunoSpot® S5微量分析儀(MicroAnalyzer))，進行產生IFNγ型細胞(斑點)之定量。若與106個細胞相關的斑點數目高於“僅存在培養基”條件下的平均值加上2倍標準偏差(實驗切點)及高於50個斑點/106個細胞(與讀數器相關的技術切點)，則將反應視為陽性。
IFNγ細胞內染色分析s(IFNγ ICS)
在來自各組的各動物之脾細胞上進行ICS。用溶胞緩衝液(西克瑪(Sigma)公司)進行紅血球細胞的溶胞作用之後，平底式96孔平皿中之每孔2x106個細胞係在完全型αMEM培養基(如酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析中所述)中培養，該培養作用係在10單位/毫升的鼠類重組型IL-2(派普泰克(Peprotech)公司之212-12)存在下進行，而僅存在鼠類重組型IL-2者係作為負對照組(“僅存在培養基”之條件)，或具有2微克/毫升的HCV核心蛋白作為不相關蛋白或具有2微克/毫升的HCV核心蛋白作為不相關蛋白或在內部產生在內部產生的NS3解旋酶(NS3h)或NS5B(分別為HCV多蛋白的第1192至1457個胺基酸及第2420至2989個胺基酸)。
在培養過夜之後，以0.67微升/毫升的最終濃度添加高爾基抑制劑(GolgiPlug)(必帝生物科學公司)達6小時。然後在V型底式96孔平皿中採集細胞，及用1%的FCS-PBS清洗。使用對抗CD3(倉鼠MAb抗CD3e-PE)、CD8(大鼠MAb抗CD8a-APC)及CD4(大鼠MAb抗CD4-PerCP)的單株抗體(皆來自必帝生物科學公司)，進行染色作用。在清洗之後，用細胞固定劑(Cytofix)/細胞破膜劑(Cytoperm)將細胞 固定及使細胞膜通透化，及用破膜/清洗緩衝液溶液(必帝生物科學公司)清洗。然後在室溫添加抗小鼠IFNγ-Alexa488抗體(必帝生物科學公司之)達15分鐘，及用破膜/清洗緩衝液清洗之後，將細胞再懸浮於1%的FCS-PBS中，及藉由使用FacsCalibur(必帝(Becton Dickinson)公司)之流動式細胞測量術，進行分析。將CD3e+、CD8α+細胞或CD3e+、CD4+細胞圈選，以測定IFNγ+ CD8+或IFNγ+ CD4+ T細胞族群之百分比。
就各小鼠而言，將僅存在培養基之條件下所得的百分比視為背景值，及從具有抗原之條件下所得的百分比中減去。若IFNγ+細胞的百分比係高於僅存在培養基之條件下所得數值的標準偏差之3倍(實驗切點)，則將反應視為陽性。此外，若IFNγ+細胞的百分比係高於CD4+T細胞的0.028%及高於CD8+T細胞的0.244%，則將反應視為陽性(就HLA-A2小鼠所界定的技術切點)。
雙重IFNγ/TNFα與IFNγ/IL2細胞內染色分析
收集個別動物的脾細胞，及進行紅血球細胞的溶胞作用(西克瑪(Sigma)公司)。平底式96孔平皿中之每孔2x106個細胞係在完全型αMEM培養基(如酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析所述)中培養，該培養作用係在1微升/毫升的高爾基抑制劑(GolgiPlug)(必帝生物科學(BD Biosciences)公司之含有布雷菲德菌素(Brefeldin)A的蛋白輸送抑制劑)存在下進行，而僅存在高爾基抑制劑者係作為負對照組(“僅存在培養基”條件)，或具有如酶聯免疫斑點(ELISPOT) 分析法所述(ELISPOT)的10 μM肽(皆來自歐洲基因科技(Eurogentec)公司)(如(不相關DLM肽、GLL或E13K)。
在培養過夜之後，採集V型底式96孔平皿中的細胞，及用1%的FCS-PBS清洗。在室溫，使用位於1% FCS-PBS中之對抗CD8(大鼠MAb抗CD8a-APC)及CD4(大鼠MAb抗CD4-PerCP)的單株抗體(二者均來自必帝生物科學公司)，進行染色15分鐘。在清洗之後，用細胞固定劑(Cytofix)/細胞破膜劑(Cytoperm)將細胞固定及使細胞膜通透化，及用破膜/清洗緩衝液溶液(必帝生物科學公司)清洗。在此階段，細胞在使用前可儲存於4℃。
藉由在室溫中添加對抗IFNγ的抗體(必帝生物科學公司之大鼠Mab抗小鼠IFNγ-PE)與TNFα(必帝生物科學公司之大鼠Mab抗小鼠TNF)或IFNg(如上述)及IL2(必帝生物科學公司之大鼠Mab抗小鼠IL2)達15分鐘，而進行細胞內染色。用破膜/清洗緩衝液清洗之後，將細胞再懸浮於1%的FCS-PBS中，及藉由使用FacsCalibur(必帝(Becton Dickinson)公司)之流動式細胞測量術進行分析。
將CD8+CD4-細胞與CD4+CD8-細胞圈選，及呈現在IFNγ/TNFα或IFNγ/IL2點圖上。就各小鼠而言，將僅存在培養基之條件下所得的百分比視為背景值，及從具有抗原之條件下所得的百分比中減去。若染色細胞的百分比係高於僅存在培養基之條件下所得數值的標準偏差之3倍(實驗切點)及高於CD4+的0.028%與CD8+的0.244%(就HLA-A2小鼠所界定的技術切點)，則將反應視為陽性。
統計分析
使用克魯斯卡爾-瓦利斯(Kruskal-Wallis)檢定，進行具HCV特異性的細胞免疫反應之分析，當差異顯著時，則接著進行曼-懷特尼(Mann-Whitney)檢定。當p值等於或低於0.05時，則視為顯著。在各檢定中進行所有組別之間的統計分析，但在研究報告的圖式中僅呈現統計上顯著之差異。
結果 在HLA-A2基因轉殖小鼠中所引發的IFNγ酶聯免疫斑點(ELISPOT)反應之分析 抗MVA反應
如預期地，在經TG4040或MVATGN33.1免疫接種的所有小鼠中，檢測出高頻率之對於MVA載體具有特異性的產生IFNγ型T細胞反應。
對於四個未加打組(“第1、2、3及4個月對照組”)之分析顯示，IFNγ酶聯免疫斑點(ELISPOT)反應在時間內顯著降低(每106個脾細胞的斑點自582個降至305個)。在加打組中，不論加打時間為何，第四次注射作用產生顯著的加打效應(在第1、2、3及4個月的提升率分別為2.7、3.1、7.6及6.2倍)，在第3個月觀察到最高的加打效應，雖然其等之差異並非統計上顯著。
抗GLL反應
在初打後之第4個月，對抗GLL抗原決定位之反應仍維持穩定，每106個脾細胞的斑點係自393至445個。 第四次注射作用提升IFNγ反應(在第1、2、3及4個月的提升率分別為1.6、2.1、4.8及2.8倍)，但對照組與加打組之間的差異僅當加打作用係在第3個月進行時，方具有顯著性。
抗E13K反應
直到TG4040初打後的第2個月，才檢測出具E13K特異性的微弱反應。在每個試驗時間點的第四次注射作用之後，觀察到顯著的加打效應，其隨時間遞增直至第4個月，在第1、2、3及4個月的提升率分別為3.3、6.1、12.8及13.3倍。
抗NS5B反應
最後，僅在用第四次TG4040注射作用進行加打的動物組別中，發現對於全長式NS5B肽池具有特異性的產生IFNγ型T細胞反應之陽性(除了一隻經MVATGN33.1免疫接種的小鼠產生異常的陽性結果之外)。提升該等反應之最有效的加打時間點係第3個月，其顯著增加13.6倍。
在HLA-A2基因轉殖小鼠中所引發的IFNγ ICS反應之分析
在加打注射作用二個星期後，藉由ICS分析對於NS3與NS5B蛋白具特異性的IFNγ+CD4+ T細胞反應。
如預期，在免疫接種MVATGN33.1之後或在未曾接受治療的小鼠中，未檢測出對於NS3或NS5B蛋白具特異性的IFNγ+CD4+ T細胞反應之陽性。在免疫接種TG4040之後，亦在核心不相關蛋白方面獲得陰性結果。
在初打作用之三個每星期一次的注射作用之 後，僅在第1個月(“第1個月對照組”)檢測出對於NS3具特異性的IFNγ+CD4+ T細胞反應，及其隨時間降低。第四次注射作用產生一加打效應。疫苗加打延遲越久越有效(IFNγ+CD4+ T細胞的百分比隨時間而自0.15增加至0.42)。
在第3個月進行加打之後，檢測出對於NS5B具特異性的IFNγ+CD4+ T細胞反應之唯一陽性。
在HLA-A2基因轉殖小鼠中所引發的IFNγ/TNFα與IFNγ/IL-2 ICS反應之分析 GLL刺激作用
如對於GLL刺激作用所預期者，僅發現CD8+T細胞反應，及所檢測出的主要反應為雙重陽性IFNγ/TNFαCD8+ T細胞族群及其等在分析期間基本上穩定。第四次注射作用可顯著提升該等反應的唯一時間點係在第3個月(提升率為3.1)。IFNγ-SP(單純陽性)反應雖然非常微弱，在一些動物中可藉由在第2與第4個月之間進行的第四次TG4040注射作用，而顯著提升該反應。
就IFNγ/IL2 ICS而言，所檢測的主要族群為IFNγ-SP CD8+。初打所引發的反應維持穩定直至第4個月。如IFNγ/TNFα ICS中觀察所得，僅在第3個月達到顯著的提升(提升率為4.3)，這也證實了酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析之數據。所引發之極微弱的雙重陽性IFNγ/IL2 CD8+反應在所有組別及所有試驗時間點皆維持一致。
E13K刺激作用
如對於E13K刺激作用所預期者，僅發現CD4+ T 細胞反應。就IFNγ/TNFα ICS數據而言，所揭露的主要族群係雙重產生IFNγ/TNFα型T細胞，雖然“加打”組的一些小鼠亦獲得IFNγ-SP或TNFα-SP CD4+ T細胞。可經由第四次TG4040注射作用，尤其在第2與第4個月之間(及在該期間在E13K-特異性CD4+ T細胞上達到0.42%的IFNγ/TNFαT細胞)，而顯著提升初打所引發的反應。
IFNγ/IL2 ICS顯示在雙重產生IFNγ/IL2型T細胞與單一產生IFNγ型T細胞之間之更平衡的反應。該等數據亦顯示，可藉由自第1個月至第4個月的加打作用，顯著提升具E13K特異性的CD4+ T細胞反應，而更有效加打作用係傾向於在第2個月之後。
總而言之，在HLA-A2模式中的該等臨床前研究突顯出，第四次TG4040注射作用可能有益於提升在三次皮下注射TG4040的初打作用後所引發之具HCV特異性的CD8+與CD4+ T細胞反應(如WO2008/113606中所述)，及提供加打TG4040的最有效時間係第一次初打注射作用後的第3個月(或第14星期)。
第2例：無標準照護(SOC)之TG4040第I階段研究
TG4040係述於WO2004/111082與WO2008/113606中，其等皆在此明確地及完整地併入本案以為參考資料。TG4040係一種經改質的牛痘病毒安卡拉(Ankara)(MVA)載體，其包含以相同定向植入MVA主鏈的缺失III之二個表現組合體，第一個組合體係在ph5r啟動子之下表現NS3與NS4蛋白之間的融合體，而第二個組合體係在p7.5啟動子之下 表現NS5B。NS3、NS4及NS5B多肽係源自第1b基因型HCV-JA品系(Kato等人於1990年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第87期第9524-9528頁乙文)。將TG4040儲存於-80℃之具有5%蔗糖、10 mM麩胺酸鈉及50 mM氯化鈉及緩衝為pH 8的10 mM Tris-HCl中。TG4040係用個別的透明玻璃小瓶提供。各小瓶僅供單次使用(亦即用於一病患之一次注射作用)。
該實例述及在非肝硬化、未曾接受治療之慢性感染C型肝炎病毒(HCV第1a或1b基因型)的病患中，用TG4040(TG4040.01)進行劑量遞增式第I階段研究之結果。對應於世代1、2與3，依皮下(SC)途徑投予分別為106、107及108個溶菌斑形成單位的三種TG4040劑量。在三個延伸世代(4、5與6)中進一步探討108個溶菌斑形成單位之劑量。該分析所包括的40名病患係領受三個每星期一次的皮下TG4040注射作用，及在首次注射作用之2、4或6個月後領受一次僅108個溶菌斑形成單位的加打注射作用。更詳細地，- 世代1(C1)：在第1天、第8天及第15天領受三次106個溶菌斑形成單位的注射作用之三名病患；- 世代2(C2)：在第1天、第8天及第15天領受三次107個溶菌斑形成單位的注射作用之三名病患；- 世代3(C3)：在第1天、第8天及第15天領受三次108個溶菌斑形成單位的注射作用及在第6個月領受一次加打注射作用之九名病患； - 世代4(C4)：在第1天、第8天及第15天領受三次108個溶菌斑形成單位的注射作用及在第6個月領受一次加打注射作用之七名病患。值得注意的是該等病患具有較晚期的肝臟疾病及具有高的丙胺酸轉胺酶ALT)水平(在納入研究的2個月前係介於正常[ULN]上限的2至5倍之間)及纖維化分期係高於或等於F2；- 世代5(C5)：在第1天、第8天及第15天領受三次108個溶菌斑形成單位的注射作用及在第2個月領受一次加打注射作用之九名病患；- 世代6(C6)：在第1天、第8天及第15天領受三次108個溶菌斑形成單位的注射作用及在第4個月領受一次加打注射作用之九名病患。
四十名病患的平均年齡為39.9歲。在研究中所納入的男性病患較多(57.5%)。第1a與1b基因型係平均分佈於各劑量組中。
在基線(在首次TG4040注射作用前)及不同時間點評估病毒學、生物學及免疫學標記。藉由定量RT-PCR評估病毒負荷量(HCV-RNA定量作用)(使用羅氏(Roche)公司的即時泰克曼(TaqMan)®分析)；藉由酶聯免疫斑點(ELISpot)IFN-g分析評估具MVA與HCV特異性的細胞免疫反應；及同時藉由ELISA(用於總抗體)及藉由以BHK-21細胞感染作用(用於中和抗體)為基礎的一種生物分析法，評估抗MVA荷爾蒙性反應。
結果
顯示TG4040是安全及耐受度良好。並無與TG4040相關的嚴重不良事件(SAE)。與藥物相關的注射部位硬結之發生率係在最高劑量組中較常見(108個溶菌斑形成單位)，其在34名病患中的18名(53%)發生29件事件；相較於低劑量與中劑量組(106個溶菌斑形成單位或107個溶菌斑形成單位)僅在6名病患中的2名(33%)發生2件事件。最常通報的不良藥物反應(ADR)之第二名係注射部位發炎，40名病患中的16名(40%)通報33件事件；接著是進行注射部位紅斑，40名病患中的13名(33%)通報20件事件。
病毒負荷量減少
世代1的基線平均病毒負荷量係5.02 log10國際單位/毫升，世代2為4.97 log10國際單位/毫升，及世代3為5.60 log10國際單位/毫升。當考量優於0.5 log10國際單位/毫升之病毒減量時，在三個每星期一次的低與中劑量注射作用觀察到較高的疫苗療效，因100%的病患(6/6)所顯現的病毒負荷量之減少係優於該切點至少一次。相反地，三個每星期一次的最高劑量注射作用導致僅在21%的病患(34名病患中的7名)中觀察到優於0.5 log10國際單位/毫升之減量。該等結果的原因可能在於當投予最高劑量時之較高的抗MVA中和抗體反應。值得注意的是13名病患中的過半數所顯現的病毒減量至少有一次是顯著的，在第37天觀察到NADIR，亦即在最後一次TG4040初打注射作用後的3個星期。在世代3至6中，以最高劑量進行的加打注射作用並未在病毒負荷量之減少方面顯示效應。
酶聯免疫斑點(ELISpot)分析之結果
當用來自TG4040所衍生的NS3與NS4b抗原之三個肽池、來自與TG4040不相關的NS5a的二個肽池及正對照組的CEF肽池刺激作用之後，在病患的末梢血液單核細胞(PBMC)上進行酶聯免疫斑點IFN-γ分析。在世代1至3中，該等結果顯示：
- 在基線，在15名病患中的3名檢測出對於TG4040所衍生及與TG4040不相關的抗原之反應。
- 在初步的TG4040注射作用後，在6名病患中觀察到對於TG4040所衍生的抗原之反應增加，但對於與TG4040不相關的NS5a抗原之反應則不然，其峰位於D22及高於切點。
各病患的詳細分析顯示在世代1與2觀察到顯著的反應，就該等病患中的一部分而言，病毒負荷量的減少與具TG4040特異性的免疫反應係同時發生的事件。值得注意地，病毒負荷量並未因TG4040而有變化之世代3的病患若有反應的話，亦僅展現非常微弱與偶發性的TG4040相關免疫反應。此外，TG4040在該等未曾接受治療的慢性感染病患中引發最顯著的免疫反應(IFN-γ作用)，及其發生係伴隨著最大的病毒減量。然而在這個水平不能斷定最高劑量不導致具HCV特異性的免疫反應，用於世代4、5與6之經進一步最佳化的方法，容許分別在71%(7名病患中的5名)、89%(9名病患中的8名)與56%(9名病患中的5名)的病患中測得顯著的反應。在加打注射作用後，在世代5(在第 2個月加打)中維持具HCV特異性的細胞反應之強度，及在世代6(在第4個月加打)的78%病患(9名病患中的7名)中進一步增加，而加打作用在世代4(第6個月加打)中並無效應。
總之，TG4040.01研究顯示良好的安全性廓型以及與致免疫性相關聯之有前途的抗病毒療效。基於療效以及注射部位的反應較少，而選擇107個溶菌斑形成單位之中劑量供進一步研究之用。
第3例：與標準照護(SOC)併用之TG4040第II階段研究
本實例述及在患有第1基因型慢性C型肝炎之未曾接受治療的病患中所進行之隨機、開放式第II階段研究。病患係按年齡(大於50歲相對於小於或等於50歲)及按基線病毒負荷量(大於400,000國際單位/毫升相對於小於或等於400,000國際單位/毫升)分層。該研究包括依據兩種不同的投藥動力學(以每星期與每季為基礎)之多次TG4040皮下注射作用，及合併使用由聚乙二醇化干擾素α-2a(Pegasys®)與雷巴威林(Copegus®)所組成之標準照護。該研究之目的係相對於單獨投予SOC，而比較TG4040與SOC併用之療效與安全性。該研究的示意圖說明係示於圖1。
所述研究背後的理念係藉由在投予TG4040之前提供抗病毒療法達4個星期，而減少病毒負荷量。然後在干擾素與雷巴威林療法期間，進行TG4040的多次重複性注射作用(三個每星期一次的注射作用與三個每季一次的注射作用)。該排程係以第1例所述之HLA-A2基因轉殖小鼠中的臨床前實驗為基礎，其支持用於初打引發抗HCV免 疫反應之三個每星期一次的注射作用，接著進行重複性加打作用及各次加打作用相隔12個星期。
材料與方法
在皮下注射107個溶菌斑形成單位的TG4040(如上文第2例中所述)。
雷巴威林(Copegus®)係具有抗病毒活性之一種核苷類似物。雷巴威林的化學名稱為1-ß-D-核呋喃基-1H-1,2,4-三唑-3-甲醯胺。可取得口服用的橢圓形、膜衣錠劑形式。各錠劑含有200毫克的RBV及下列非有效成分：預糊化澱粉、微晶型纖維素、羧甲基澱粉鈉、玉米澱粉及硬脂酸鎂。口服RBV的每日劑量係1000至1200毫克/天(按重量)。
聚乙二醇化干擾素α-2a(Pegasys®)係重組型α-2a干擾素與一種單分支型雙(單甲氧基)聚乙二醇(PEG)鏈之共價複合物。每星期皮下注射Peg-IFN α 2a的劑量係180微克，及係以預充式單次使用性注射器形式(180微克/0.5毫升)提供。
研究設計
納入94名未曾接受治療的慢性HCV第1基因型病患，及依據年齡與病毒負荷量分層。其等經過1：2的隨機分派，其中31名病患被納入對照組臂A(PegIFN/RBV)；63名病患納入臂B，及在PegIFN/RBV療法起始4個星期後，開始領受6次TG4040(107個溶菌斑形成單位)注射作用。
在對照組臂A中，病患領受現行SOC達48個星 期，SOC係由每星期皮下投予劑量為180微克的聚乙二醇化干擾素α-2a(Pegasys®)一次及口服投予1000至1200毫克/日的按重量劑量之雷巴威林(Copegus®)錠劑所組成。在SOC進行12個星期後，達到EVR(界定為病毒負荷量(VL)之減少大於或等於2 log10國際單位/毫升)之病患將繼續進行36個星期的SOC，而未經歷EVR的無效病患將停止SOC治療。
在臂B中，在SOC起始4個星期後，依據下列期程，對於病患投予劑量為107個溶菌斑形成單位的TG4040：共進行三個星期之三個每星期一次的皮下注射作用，接著進行三個每12個星期一次的皮下注射作用(第一次的每季注射作用係在首次每星期TG4040注射作用之12個星期後進行或在最末次的每星期TG4040注射作用之10個星期後進行)。注射作用係在左側與右側的大腿或手臂交替進行。在投予TG4040之前開始進行SOC，及提供達48個星期。總之，臂B的病患領受48個星期的SOC(SOC之起始係代表第0星期)，及在第4、5、6、16、28及40星期領受6次TG4040注射作用。在任何時間，提議對於無法耐受而中止SOC之病患繼續獨投予TG4040(三個每星期一次的皮下注射作用，接著每10至12個星期進行每季注射作用，亦即在第4、5、6、16、28、40及52星期進行注射)。應注意到為了遵循安全性修正，而在試驗期間停止TG4040注射作用；病患平均領受5次注射作用。
所有病患在治療結束後或在停用所有研究藥物 後，皆追蹤長達24個星期。
方法
追蹤項目包括隨時間及相對於基線之安全性、免疫參數評估及HCV-RNA監測。
藉由評估不良事件(AE)與嚴重不良事件(SAE)的總發生率，以及針對各臂與針對研究整體所進行的實驗室評估，而評定安全性。
藉由使用羅氏(Roche)公司泰克曼(TaqMan)®分析，在血清試樣上定量分析血清C型肝炎病毒(HCV)核糖核酸(RNA)，而進行病毒學評估。檢測極限為10國際單位/毫升血清。在不同的終點估算病毒負荷量，尤其評估在SOC進行4個星期後達到快速病毒反應(RVR)的病患百分比、在SOC進行12個星期後達到早期病毒學反應(EVR)的病患百分比、在SOC進行24個星期(可能採用中止規則之該星期)後、在SOC治療結束時(評估達到治療反應(ETR)的病患百分比)及在SOC治療結束後12與24個星期(評估達到持續性病毒反應(SVR12與SVR24)的病患百分比)。此外，將評估在SOC的第4星期與第12星期之間之第二階段病毒動態清除作用的斜率。
在不同時間點評估免疫反應的引發與持續時間之動力學。
在臂A中：在基線(在篩選時及第1天)及在第2、12與24星期進行免疫學評估作用，及更頻繁地進行病毒學評估作用(在基線及第1、2、3、4、8、12、16、20、24、 36及48星期)。
在臂B中：在基線(在篩選時及第1天)及在第2、8、12與48星期進行免疫學評估作用，及更頻繁地進行病毒學評估作用(在基線及第1、2、3、4、5、6、8、12、16、28、40及48星期)。
在試管中使用疫苗所衍生的抗原以及與疫苗不相關的HCV試劑(將使用重疊11個胺基酸之十五肽)進行PBMC的再刺激作用之後，藉由酶聯免疫斑點(ELISpot)IFN-γ探討具HCV特異性的細胞免疫參數。可分析其他免疫參數，以進一步獲得涉及TG4040作用機制的免疫途徑細節，如藉由分析抗MVA抗體與細胞免疫反應。分別藉由ELISA及藉由使用MVA-GFP抑制試管中的BHK21細胞株感染作用，而評估總抗MVA抗體(血漿IgG)及/或該等抗體的中和能力。在各時間點，為該目的抽取5毫升血液。藉由酶聯免疫斑點(ELISpot)IFN-γ或藉由ELISA/流式螢光(Luminex)技術，測量針對MVA之細胞媒介型反應。為進行免疫學評估作用，總共抽取45毫升血液，5毫升供用於荷爾蒙性免疫反應，及40毫升供用於細胞免疫反應。
統計分析
該研究係獨立測定可評估病患的cEVR率。基於下列假設，使用三結果一階段之設計，確定樣本數目：- 就cEVR反應率(r)而言的虛無假設H0係r小於40%；- 療效的對立假設HA係r大於60%；- 一偽陽性結果的機率係等於α=2.5%，偽陰性結果的 機率係等於β=10%；- 依據最後可評估的病患集合(在臂B中為61名)，若在28名或更少的病患中觀察到cEVR，則接受虛無假設；若在至少33名病患中觀察到cEVR，則駁回虛無假設；- 以文獻為基礎，而選擇40%作為閾值。
結果
所納入的病患係依據第1表分派。
初步數據(參見圖2)
在臂A與臂B之可評估的病患係分別為30名與61名。分別在SOC投藥作用達1個星期與2個星期後，臂A與 臂B中已減少超過1 log10國際單位/毫升之病患比例(第1星期與第2星期反應)係位於如預期的相同範圍內(TG4040注射作用在第4星期開始)，在臂A中為36%與67%及相對於臂B中的44%與59%。同樣地，在最初一個星期的SOC期間之病毒負荷量下降斜率方面，該二臂並無差異，在臂A與臂B中分別為0.9與1.0 log10國際單位/毫升。亦如預期，在SOC投藥作用達4個星期後，臂A與臂B中已達到HCV RNA不可檢測性(RVR反應)之病患比例係與所預期者相近(臂B中的10%相對於臂A中的7%)。
在TG4040注射作用起始後及在SOC投藥作用達12個星期後，在臂B中已達到cEVR的病患比例係高於臂A，在臂B中為46%(61名病患中的28名)而在臂A中為30%(30名病患中的9名)。
在SOC達24個星期後之現今可取得的最後病毒反應顯示，臂B中已達到不可檢測性的病患比例為65%(63名病患中的41名)，及該比例係與臂A的68%(31名病患中的21名)相近。在SOC結束(ETR)時，臂A與臂B中的百分比係分別為64%(31名病患中的20名)與57%(63名病患中的36名)。
並無任何跡象顯示該投藥模式造成肝臟酵素水平惡化。臂B中的二名病患曾通報二件安全性事件。該等事件的原因可能在於當在組合物中添加TG4040時，IFN效應惡化，因而支持與不含有IFN的抗病毒劑併用。
出乎預料地，在頭12個星期的SOC期間所進行 的TG4040投藥作用之後，臂B病患中展現血清HCV RNA不可檢測性(cEVR)(低於10國際單位/毫升)之比例係高於臂A病患，及在稍後的時間點達到大致相同的比例。
圖1係說明在患有第1基因型慢性C型肝炎之未曾接受治療的病患中所進行之一個隨機、開放式第II階段研究之示意圖呈現。臂A之個體係使用由聚乙二醇化干擾素α-2a(Pegasys®)與雷巴威林(Copegus®)所組成之SOC治療。臂B之病患領受與SOC併用之依據兩種不同的投藥動力學(以每星期與每季為基礎)之多次TG4040皮下注射作用。
圖2係說明在對照組臂A(SOC治療)與臂B(SOC+TG4040)病患中所測得的病毒反應率(具有不可檢測的HCV RNA之病患百分比)之示意圖呈現。
<110> 傳斯堅公司
<120> 免疫療法組成物及用於治療C型肝炎病毒感染之療程(一)
<130> 361599D31569
<150> EP11306249.1
<151> 2011年09月29日
<150> EP11306434.9
<151> 2011年11月04日
<150> EP11306442.2
<151> 2011年11月07日
<160> 4
<170> 專利申請軟體3.5版
<210> 1
<211> 947
<212> PRT
<213> C型肝炎病毒
<400> 1
<210> 2
<211> 592
<212> PRT
<213> C型肝炎病毒
<400> 2
<210> 3
<211> 2844
<212> DNA
<213> C型肝炎病毒
<400> 3
<210> 4
<211> 1779
<212> DNA
<213> C型肝炎病毒
<400> 4

Claims (39)

  1. 一種作為意欲治療HCV感染之一藥劑的免疫療法組成物，其包含一治療有效量之一選自由下列所組成之群組的有效成分：- 一種C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4與一種C型肝炎病毒多肽NS5B；- 一種表現載體，其包含編碼C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4之一核苷酸序列及編碼肝炎病毒的多肽NS5B之一核苷酸序列；- 包含編碼C型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4之一核苷酸序列之一種表現載體以及包含編碼肝炎病毒的多肽NS5B之一核苷酸序列之一表現載體；其中該藥劑的投藥模式係包括彼此相隔3至10天不等之該免疫療法組成物的2至5次投藥作用，接著進行彼此相隔6至20個星期不等之該免疫療法組成物的1至8次投藥作用，及其中該投藥模式係在該個體的抗病毒療法起始之後進行。
  2. 如申請專利範圍第1項之免疫療法組成物，其中該抗病毒療法之起始係在投予該免疫療法組成物之至少1個星期前，有利地至少2個星期前，理想地至少3個星期前及較佳至少4個星期前。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之免疫療法組成物，其中該投藥模式係包括彼此相隔約一個星期之該免疫療法組成物的2至5次投藥作用，接著進行彼此相隔約9至14個星 期不等之該免疫療法組成物的1至8次投藥作用。
  4. 如申請專利範圍第3項之免疫療法組成物，其中該投藥模式係包括三個每星期一次的投藥作用，接著進行一至六個每季一次的投藥作用；更佳包括三個每星期一次的投藥作用，接著進行二至四個每季一次的投藥作用；及甚至更佳包括三個每星期一次的投藥作用，接著進行三個每季一次的投藥作用。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之免疫療法組成物，其中提供該抗病毒療法達約48個星期之期間，及該免疫療法組成物係在提供抗病毒療法之期間同時投藥達24至48個星期，及較佳達約36個星期。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之免疫療法組成物，其中該NS3/NS4多蛋白與該NS5B多肽或編碼該NS3/NS4多蛋白與該NS5B多肽的該核苷酸序列係源自相同HCV基因型，較佳源自第1基因型，及更佳源自第1b基因型。
  7. 如申請專利範圍第6項之免疫療法組成物，其中該NS3/NS4多蛋白所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：1中所示的胺基酸序列之一致性係至少80%。
  8. 如申請專利範圍第6項之免疫療法組成物，其中該NS5B多肽所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：2中所示的胺基酸序列之一致性係至少80%。
  9. 如申請專利範圍第6或7項之免疫療法組成物，其中編碼NS3/NS4多蛋白之核苷酸序列所包含的一核苷酸序列 與序列辨識編號：3中所示的核苷酸序列之一致性係至少80%。
  10. 如申請專利範圍第6或8項之免疫療法組成物，其中編碼NS5B多肽之核苷酸序列所包含的一核苷酸序列與序列辨識編號：4中所示的核苷酸序列之一致性係至少80%。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之免疫療法組成物，其中該表現載體係一質體載體或一病毒載體。
  12. 如申請專利範圍第11項之免疫療法組成物，其中該病毒載體係一痘病毒載體，較佳為選自由西方(Western)保留株、哥本哈根(Copenhagen)株、惠氏(Wyeth)株及經改質的安卡拉(Ankara)(MVA)株所組成之群組之牛痘病毒載體。
  13. 如申請專利範圍第12項之免疫療法組成物，其中該免疫療法組成物包含一MVA表現載體，及在其基因體中及較佳在缺失III中以相同定向插入：(a)編碼NS3/NS4多蛋白之一核苷酸序列，其係置於牛痘pH5R啟動子之控制下；及(b)編碼NS5B多肽之一核苷酸序列，其係置於牛痘p7.5K啟動子之控制下。
  14. 如申請專利範圍第12或13項之免疫療法組成物，其中該免疫療法組成物係以個別劑量投藥，該等劑量包含約5x106個溶菌斑形成單位至約1x108個溶菌斑形成單位的痘病毒或MVA載體，理想地包含約5x106個溶菌斑形成單位至約5x107個溶菌斑形成單位；及較佳包含約107個溶菌斑形成單位。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之免疫療法組成物，其中該免疫療法組成物進一步包含一種藥學上可接受的載劑。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之免疫療法組成物，其係適用於非經腸投藥作用，及特別是皮內、皮下接種、皮下或肌內途徑。
  17. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之免疫療法組成物，其中該抗病毒療法包括提供一或多種抗病毒化合物，該等抗病毒化合物係選自由干擾素、雷巴威林(ribavirin)、NS3/4A蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS5B聚合酶抑制劑核苷類似物、核苷酸類似物、免疫調節劑及宿主細胞抑制劑或其任何功能性類似物所組成之群組。
  18. 如申請專利範圍第17項之免疫療法組成物，其中該一或多種抗病毒化合物係干擾素及/或雷巴威林及選擇性地一種NS3蛋白酶抑制劑。
  19. 如申請專利範圍第18項之免疫療法組成物，其中該干擾素係干擾素-α(IFNα)，較佳為聚乙二醇化干擾素-α及更佳為聚乙二醇化干擾素-α2a或聚乙二醇化干擾素-α2b或干擾素λ。
  20. 如申請專利範圍第19項之免疫療法組成物，其中該聚乙二醇化干擾素-α係藉由肌內或皮下途徑提供，聚乙二醇化干擾素-α2a的量係每星期約180微克，而聚乙二醇化干擾素-α2b的量係每星期每公斤約1.5微克。
  21. 如申請專利範圍第18項之免疫療法組成物，其中該雷巴威林係藉由口服方式提供，及其劑量係每日約1000至約1200毫克。
  22. 如申請專利範圍第18項之免疫療法組成物，其中該NS3/4A蛋白酶抑制劑係藉由口服方式提供，及其劑量係每日約2250至2400毫克。
  23. 如申請專利範圍第17至21項中任一項之免疫療法組成物，其中對於該個體同時提供該干擾素與該雷巴威林達24至48個星期之期間，及較佳達48個星期。
  24. 如申請專利範圍第23項之免疫療法組成物，其中該投藥模式係包括該免疫療法組成物的6次投藥作用，較佳在開始提供干擾素與雷巴威林後之第4、5、6、16、28及40星期。
  25. 如申請專利範圍第1至18項及第21至22項中任一項之免疫療法組成物，其中該抗病毒療法係不含有干擾素。
  26. 如申請專利範圍第25項之免疫療法組成物，其中該免疫療法組成物包含編碼NS3/NS4多蛋白與NS5B多肽之一MVA載體，及係以包含約5x106至約1x108個溶菌斑形成單位之劑量及藉由皮下途徑投藥至個體；該干擾素係藉由肌內或皮下途徑提供的一種聚乙二醇化IFNα2；而該抗病毒化合物係藉由口服方式提供的雷巴威林。
  27. 如申請專利範圍第26項之免疫療法組成物，其中該免疫療法組成物包含約107個溶菌斑形成單位的一MVA載體，及在其基因體中納入編碼NS3/NS4融合蛋白之一核 苷酸序列，而該NS3/NS4融合蛋白所包含的胺基酸序列與序列辨識編號：1中所示的胺基酸序列之一致性係至少95%；及納入編碼NS5B多肽之一核苷酸序列，而該NS5B多肽所包含的胺基酸序列與序列辨識編號：2中所示的胺基酸序列之一致性係至少95%；該干擾素係聚乙二醇化干擾素α2a，其係以每星期約180微克的量及藉由皮下途徑每星期提供該個體一次；而該雷巴威林係藉由口服方式提供每日1000至1200毫克的量。
  28. 一種治療療程，其步驟包括投予如申請專利範圍第1至27項中任一項之免疫療法組成物。
  29. 如申請專利範圍第1至27項中任一項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第28項之治療療程，其中相較於僅提供4或12個星期的該抗病毒療法，在12個星期的抗病毒療法之後達到快速病毒反應(RVR)或維持延長的RVR之個體比例係增加至少5%，及較佳增加至少10%。
  30. 如申請專利範圍第1至27項及第29項中任一項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第28或29項之治療療程，其中相較於僅提供12個星期的該抗病毒療法，達到早期病毒學反應(EVR)或完全早期病毒反應(cEVR)之個體比例係增加至少5%，及較佳增加至少10%。
  31. 如申請專利範圍第1至27項及第29至30項中任一項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第28至30項中任一項之治療療程，其中相較於僅提供24或48個星期的該抗病毒療法，達到持續性病毒反應(SVR)之個體比例係增 加至少5%，及較佳增加至少10%。
  32. 如申請專利範圍第1至27項及第29至31項中任一項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第28至31項中任一項之治療療程，用於引發或刺激個體中的免疫系統而優於基線狀態或優於僅提供該抗病毒療法的預期狀態之用途。
  33. 如申請專利範圍第1至27項及第29至32項中任一項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第28至32項中任一項之治療療程，用於治療一慢性感染個體之用途。
  34. 如申請專利範圍第33項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第33項之治療療程，其中該個體係慢性感染第1基因型HCV。
  35. 如申請專利範圍第33或34項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第33或34項之治療療程，其中該慢性感染個體係在起始該投藥模式之前未曾接受過核准用於治療HCV感染的任何習知干擾素α化合物治療之一個體。
  36. 如申請專利範圍第33至35項中任一項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第33至35項中任一項之治療療程，其中該慢性感染個體係在基線具有高病毒效價之一個體。
  37. 一種用於治療HCV感染及較佳慢性HCV感染之試劑套組，其中該套組包含多個容器及用於對一個體投予如申請專利範圍第1至27項及第29至36項中任一項之一種免疫療法組成物或依據如申請專利範圍第28至36項中 任一項之治療療程之說明書。
  38. 如申請專利範圍第37項之套組，其包含：a)如申請專利範圍第6至27項及第29至36項中任一項所界定之一種免疫療法組成物；b)一或多種抗病毒化合物諸如干擾素與雷巴威林；及c)用於投予(a)與(b)中各者之說明書。
  39. 一種方法，相較於慢性感染HCV及僅用干擾素與雷巴威林組合治療的個體族群之cEVR，該方法使得慢性感染C型肝炎病毒(HCV)的個體族群中達到完全早期病毒反應(cEVR)的個體比例增加至少5%及較佳增加至少10%，該方法包括對於個體族群投予如申請專利範圍第1至27項及第29至36項中任一項之免疫療法組成物或如申請專利範圍第28至36項中任一項之治療療程，從而引發或刺激對抗存在於HCV NS3、NS4及/或NS5B多肽中的一或多種抗原決定位之一種T細胞媒介型免疫反應。
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