RU2286172C2 - Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования - Google Patents
Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2286172C2 RU2286172C2 RU2003101695/15A RU2003101695A RU2286172C2 RU 2286172 C2 RU2286172 C2 RU 2286172C2 RU 2003101695/15 A RU2003101695/15 A RU 2003101695/15A RU 2003101695 A RU2003101695 A RU 2003101695A RU 2286172 C2 RU2286172 C2 RU 2286172C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ribavirin
- hcv
- antigen
- nucleic acid
- seq
- Prior art date
Links
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 title claims abstract description 215
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 title claims abstract description 204
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 title claims abstract description 204
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 190
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 107
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 39
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108700012707 hepatitis C virus NS3 Proteins 0.000 claims abstract 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 224
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 207
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 205
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 205
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 155
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 140
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 140
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 87
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 74
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 74
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 72
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 72
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 66
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 60
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 54
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 41
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 27
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 27
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 27
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 25
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 16
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 16
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 15
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 12
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 11
- -1 but not limited to Chemical compound 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003491 array Methods 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 7
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 7
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 6
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 4
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 102100022299 All trans-polyprenyl-diphosphate synthase PDSS1 Human genes 0.000 description 3
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 101710111275 Non-structural 3 Proteins 0.000 description 3
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 108010056325 HAV peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Chemical class 0.000 description 2
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 2
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Chemical class 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 125000004035 thiopropyl group Chemical group [H]SC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- FHLXUWOHGKLDNF-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OC(Cl)=O FHLXUWOHGKLDNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101150094949 APRT gene Proteins 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 101150045895 Apela gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101001110283 Canis lupus familiaris Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000032759 Hemolytic-Uremic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700008783 Hepatitis C virus E1 Proteins 0.000 description 1
- 101001110313 Homo sapiens Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M Methantheline bromide Chemical compound [Br-].C1=CC=C2C(C(=O)OCC[N+](C)(CC)CC)C3=CC=CC=C3OC2=C1 PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 101000783356 Naja sputatrix Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 description 1
- 101150038760 Ns3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100022129 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940051881 anilide analgesics and antipyretics Drugs 0.000 description 1
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001558 benzoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 150000003938 benzyl alcohols Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002340 cardiotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000677 cardiotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019961 diglycerides of fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHFKGANKURXVMY-LCWPZEQJSA-N hcv e2 protein Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)CC1=CC=CC=C1 SHFKGANKURXVMY-LCWPZEQJSA-N 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 235000019960 monoglycerides of fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037368 penetrate the skin Effects 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical class OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- RCIMBBZXSXFZBV-UHFFFAOYSA-N piromidic acid Chemical compound N1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CN=C1N1CCCC1 RCIMBBZXSXFZBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 150000003673 urethanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150069452 z gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
- C07K16/109—Hepatitis C virus; Hepatitis G virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается нового полипептида вируса гепатита С NS3/4A и его использования в вакцине. Сущность изобретения включает новый полипептид вируса гепатита С NS3/4A, имеющий последовательность SEQ. ID. NO.: 17, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид с последовательностью SEQ. ID. NO.: 16, рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий этот полинуклеотид, генетически сконструированную клетку-хозяина, содержащую этот рекомбинантный вектор, антитело, которое взаимодействует с полипептидом NS3/4A, и иммуногенные составы, содержащие полипептид NS3/4A и рибавирин, а также полинуклеотид SEQ. ID. NO.: 16 и рибовирин. Преимущество изобретения заключается в повышении иммуногенности нового полипептида NS3/4A, 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 15 табл., 5 ил.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к составам и способам усиления эффекта, оказываемого вакцинами на животных, таких как сельскохозяйственные, спортивные, домашние, и на людей. В частности, предпочтительные варианты выполнения связаны с использованием рибавирина в качестве вспомогательного фармацевтического вещества и составов, содержащих рибавирин и антиген.
Существующий уровень техники
Использование вакцин для предотвращения заболеваний у людей, домашнего скота, спортивных и домашних животных является общепринятой практикой. Однако зачастую антиген, используемый в вакцине, не является достаточно иммуногенным для повышения титра антител до уровней, достаточных для обеспечения защиты от последующего заражения или для поддержания потенциала для закрепления этих уровней на длительные периоды времени. Далее, многие вакцины являются недостаточными для того, чтобы вызвать опосредованный клетками иммунитет, который является первичной иммунной защитой от бактериальной и вирусной инфекции. Значительная часть исследований в настоящее время сфокусирована на разработке более мощных вакцин и способов усиления иммуногенности содержащих антиген препаратов (См., например, патенты США №№6056961, 6060068, 6063380 и Li et al., Science 288:2219-2222 (2000)).
Среди таких "слабых" вакцин печально известны вакцины гепатита В. Например, рекомбинантные вакцины против вируса гепатита В, такие как Genhevacb (Pasteur Merieux Serums tn Vaccines, 58, Avenue Leclerc 69007 Lyon, France), Engerixb (Smith, Kline and Symbol French) и Recombivaxhb (Merck, Sharp, and Dhome) эффективны только после по меньшей мере трех инъекций на 0, 30 и 60 или 180 дни с обязательной бустерной дозой через год (Chedid et al., патент США №6063380). Далее, многие субъекты, получавшие эти вакцины, реагировали слабо, если вообще реагировали. Поскольку многие регионы мира являются эндемичными для инфекции HBV, слабый иммуногенный характер существующих HBV-вакцин стал крайне серьезной проблемой.
Для получения более сильной гуморальной и/или клеточной реакции общепринятым является введение вакцины в веществе, которое усиливает иммунную реакцию пациента на антиген, присутствующий в вакцине. Наиболее часто используемыми вспомогательными фармацевтическими веществами (адъювантами) для вакцинных протоколов являются масляные препараты и квасцы (Chedid et al., патент США №6063380). Необходим более широкий спектр безопасных и эффективных адъювантов.
Нуклеозидные аналоги широко использовались при антивирусных терапиях из-за своей способности снижать вирусную репликацию (Hosoya et al., J. Inf. Dis., 168:641-646 (1993)). Рибавирин (1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) является синтетическим гуанозиновым аналогом, который использовался для ингибирования репликации RNA и DNA вирусов (Huffman et al., Antimicrob. Agents. Chemother., 3:235 (1973); Sidwell et al., Science, 177:705 (1972)). Показано, что рибавирин является конкурентоспособным ингибитором инозитол монофосфата (IMP) дегидрогеназы (IMPDH), которая преобразует IMP в IMX (который затем преобразуется в гуаниловую кислоту GMP). (De Clercq, Anti viral Agents: characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact. Academic press, Inc., New York, N.Y., pp.1-55 (1993)). Внутриклеточные емкости гуанозин 5'-трифосфата (GTP) истощаются в результате долговременной обработки рибавирином.
В дополнение к антивирусной активности исследователи наблюдали, что некоторые гуанозиновые аналоги оказывают влияние на иммунную систему (Патенты США №№6063772 и 4950647). Показано, что рибавирин ингибирует функциональные гуморальные иммунные реакции (Peavy et al., J. Immunol., 126:861-864 (1981); Powers et al., Antimicrob. Agents. Chemother., 22:108-114 (1982)) и опосредованную IgE модуляцию секреции тучных клеток (Marquardt et al., J. Pharmacol. Exp.Therapeutics, 240:145-149 (1987)). Некоторые исследователи докладывали, что ежедневная пероральная терапия рибавирином оказывает модулирующий эффект на людей и мышей (Hultgren et al., J. Gen. Virol., 79:2381-2391 (1998) и Cramp et al., Gastron. Enterol., 118:346-355 (2000)). Тем не менее, современное понимание воздействий рибавирина на иммунную систему находится в зародышевом состоянии.
Сущность изобретения
Обнаружено, что рибавирин может использоваться в качестве адъюванта для усиления или облегчения иммунного отклика на антиген. Варианты выполнения изобретения, описанные здесь, содержат "сильные" вакцинные препараты, содержащие антиген и рибавирин. В общем случае эти препараты содержат количество рибавирина, достаточное для усиления или облегчения иммунной реакции на антиген. Прочие аспекты изобретения содержат способы усиления или облегчения иммунной реакции животного, в том числе человека, на антиген. В соответствии с одним из аспектов, к примеру, животное, нуждающееся в мощной иммунной реакции на антиген, идентифицируется, а затем обеспечивается некоторым количеством рибавирина вместе с антигеном. В некоторых способах рибавирин и антиген вводятся совместно (то есть в виде одного состава), а в других рибавирин и антиген вводятся по отдельности. Несколько вариантов выполнения также касаются производства и использования составов, содержащих рибавирин и антиген.
Хотя реализованные составы содержат рибавирин и практически любой антиген или эпитоп, предпочтительные варианты выполнения содержат рибавирин и вирусный антиген или антигенную детерминанту (эпитоп) гепатита. Антиген или эпитоп могут быть основаны на пептиде или нуклеиновой кислоте (например, RNA, кодирующей пептидный антиген или конструкт, который экспрессирует пептидный антиген при введении в субъекта). Вариантами выполнения являются составы, содержащие рибавирин и пептид, содержащий антиген или эпитоп из вируса гепатита A(HAV), или нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый пептид. Вариантами выполнения являются составы, содержащие рибавирин и пептид, содержащий антиген или эпитоп из вируса гепатита B(HBV), или нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый пептид. К пригодным антигенам HBV относятся, например, поверхностный антиген гепатита B(HBsAg), ядерный антиген гепатита (HBcAg), е-антиген гепатита (HBeAg) и нуклеиновые кислоты, кодирующие эти молекулы. Далее, вариантами выполнения являются составы, содержащие рибавирин и пептид, содержащий антиген или эпитоп из вируса гепатита C(HCV), или нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый пептид. К подходящим антигенам HCV относятся, не в порядке исключения, один или несколько доменов последовательности HCV (например, NS3 и/или NS4/A) и нуклеиновые кислоты, кодирующие эти молекулы.
Была также обнаружена новая последовательность HCV. Новый фрагмент NS3/4A генома HCV был клонирован, и его последовательность была определена у пациента, инфицированного HCV (SEQ.ID.NO.:16). Было обнаружено, что эта последовательность только на 93% гомологична наиболее близкородственной последовательности HCV. Этот новый пептид (SEQ.ID.NO.:17) и ее фрагменты длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот, нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы, векторы, содержащие упомянутые нуклеиновые кислоты, и клетки, содержащие упомянутые векторы, нуклеиновые кислоты или пептиды, также являются вариантами выполнения настоящего изобретения. Частное предпочтительное выполнение является вакцинным составом, содержащим рибавирин и пептид HCV из SEQ.ID.NO.:17 или его фрагмент длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:25) или нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутые пептид или фрагменты.
В дополнение к этому было обнаружено, что усеченные мутанты или мутанты пептида NS3/4A, у которых отсутствует сайт протеолитического расщепления, являются сильно иммуногенными. Эти новые пептиды (SEQ.ID.NO.:29-32 и 43-49) и их фрагменты длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:26, 27 и 33-42), нуклеиновые кислоты, кодирующие эти молекулы, векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, и клетки, содержащие упомянутые векторы, нуклеиновые кислоты или пептиды, также является вариантами выполнения изобретения. Частное предпочтительное выполнение является вакцинным составом, содержащим рибавирин и пептид HCV из SEQ.ID.NO.:29-32 и 43-49 или его фрагмент длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:26, 27 и 33-42) или нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутые пептиды или фрагменты.
Более того, составы, содержащие смесь вышеупомянутых антигенов, являются вариантами выполнения изобретения. Например, некоторые составы содержат антиген HBV, антиген HAV и рибавирин, или антиген HBV, антиген HCV и рибавирин, или антиген HAV, антиген HCV и рибавирин, или антиген HBV, антиген HAV, антиген HCV и рибавирин. Прочие варианты выполнения содержат рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую смесь описанных выше антигенов. Некоторые варианты выполнения также содержат прочие адъюванты, связыватели, эмульгаторы, носители и наполнители, известные из уровня техники, в том числе, не в порядке ограничения, квасцы, масло и прочие соединения, усиливающие иммунную реакцию.
Также аспектами изобретения являются способы изготовления и использования описанных здесь составов. Некоторые способы осуществляются путем смешивания рибавирина с пептидным или нуклеиново-кислотным антигеном (например, антигеном HAV, HBV, HCV) для получения единого состава (например, вакцинного состава). Предпочтительные способы содержат смешивание рибавирина с антигеном HCV, который содержит эпитоп, присутствующий на одном или нескольких доменах HCV (например, NS3 и/или NS4A).
Предпочтительные способы использования описанных здесь составов содержат введение нуждающемуся животному достаточного количества рибавирина и гепатитного вирусного антигена (например, антигена HBV, антигена HAV, антигена HCV, нуклеиновой кислоты, кодирующей один из этих антигенов, или любой их комбинации). В соответствии с одним из подходов, например, идентифицируется животное, нуждающееся в мощной иммунной реакции на гепатитный вирусный антиген (например, животное с риском заразиться или уже заразившееся гепатитной инфекцией), и этому животному вводится количество рибавирина и гепатитного вирусного антигена (либо в виде единого состава, либо по отдельности), эффективное для усиления или облегчения иммунной реакции на гепатитный вирусный антиген. Предпочтительно, идентифицируется животное, нуждающееся в мощной иммунной реакции на HCV, и этому животному вводится состав, содержащий рибавирин и пептид, содержащий антиген или эпитоп, присутствующий в SEQ.ID.NO.:1, 6, 7 или 17, или нуклеиновая кислота, кодирующая упомянутый пептид. Частные предпочтительные варианты выполнения содержат идентификацию животного, нуждающегося в мощной иммунной реакции на HCV и введение упомянутому животному состава, содержащего рибавирин и антиген HCV (например, NS3/4A (SEQ.ID.NO.:17), мутант NS3/4A SEQ.ID.NO.:29-32 и 43-49 или его фрагмент длиной по меньшей мере 3,4-10, 10-20, 20-30 или 30-50 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:25-27 и 33-42) или нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько из этих молекул), которых достаточно, чтобы усилить или упростить иммунную реакцию на упомянутый антиген.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 является диаграммой, показывающей гуморальную реакцию на 10 и 100 мкг неструктурного 3 белка (NS3) рекомбинантного вируса гепатита C(HCV), определенную по средним конечным титрам, при совместном введении одной дозы 1 мг рибавирина.
Фиг.2 является диаграммой, показывающей гуморальную реакцию на 20 мкг неструктурного 3 белка (NS3) рекомбинантного вируса гепатита C(HCV), определенную по средним конечным титрам, при совместном введении одной дозы 0,1, 1,0 или 10 мг рибавирина.
Фиг.3 является диаграммой, показывающей воздействия единственной дозы 1 мг рибавирина на NS3-специфические пролиферативные реакции лимфатического узла, как определено по анамнестическим реакциям in vitro.
Фиг.4 является диаграммой, показывающей антительный титр против NS3 у мышей Н-2d в виде функции времени после первой иммунизации. Ромбами отмечен антительный титр мышей, иммунизированных с помощью NS3/4A-pVAX, а квадратами отмечен антительный титр мышей, иммунизированных NS3-pVAX.
Фиг.5А является диаграммой, показывающей процент специфического CTL-опосредованного лизиса клеток-мишеней SP2/0 в виде функции отношения эффектора к мишени. Фосфатный буферный солевой раствор (PBS) использовался в качестве контрольного иммуногена.
Фиг.5Б является диаграммой, показывающей процент специфического CTL-опосредованного лизиса клеток-мишеней SP2/0 в виде функции отношения эффектора к мишени. Плазмид NS3/4A-pVAX использовался в качестве иммуногена.
Подробное описание изобретения
Обнаружено, что составы, содержащие рибавирин и антиген (например, молекулу, содержащую эпитоп такого патогена как вирус, бактерия, плесень, дрожжи или паразит), усиливают и/или облегчают иммунную реакцию животного на антиген. То есть было обнаружено, что рибавирин является эффективным "адъювантом", что, в целях настоящего раскрытия, означает вещество, имеющее способность усиливать или облегчать иммунную реакцию на отдельный антиген. Адъювантная активность рибавирина проявлялась в значительном увеличении иммунно-опосредованной защиты от антигена, увеличении титра антитела к антигену и увеличении пролиферативных реакций Т-клеток.
Здесь описаны некоторые составы (например, вакцины), содержащие рибавирин и антиген или эпитоп. Вакцинные формулы, содержащие рибавирин, например, могут варьироваться в соответствии с количеством рибавирина, формой рибавирина и типом антигена. Антиген может являться пептидом или нуклеиновой кислотой (например, RNA, кодирующей пептидный антиген, или конструктом, экспрессирующим пептидный антиген при вводе субъекту). Предпочтительные составы содержат рибавирин и гепатитный вирусный антиген (например, антиген HAV, антиген HBV, антиген HCV, нуклеиновую кислоту, кодирующую эти молекулы, или любые их комбинации). В частности, по меньшей мере один антиген HCV или эпитоп, присутствующий в SEQ.ID.NO.:1, или нуклеиновая кислота, кодирующая такой антиген HCV, желательны для смешивания с рибавирином для приготовления упомянутых составов. Таким образом, некоторые варианты выполнения содержат, не в порядке ограничения, составы, содержащие рибавирин и пептид, составляющий SEQ.ID.NO.:1 или ее фрагмент, содержащий по меньшей мере 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 или 3 последовательные аминокислоты SEQ.ID.NO.:1. Дополнительные варианты выполнения относятся к составам, содержащим рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ.ID.NO.:13 или ее фрагмент, содержащий по меньшей мере 9, 12, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 200, 500 последовательных нуклеотидов SEQ.ID.NO.:13.
Остальные варианты выполнения содержат состав (например, вакцину), которая содержит рибавирин и специфический фрагмент SEQ.ID.NO.:1, причем упомянутый фрагмент соответствует отдельному домену HCV. Некоторые выполнения, например, содержат фрагмент HCV, соответствующий аминокислотам 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 или 1972-3011 SEQ.ID.NO.:1. Также вариантами выполнения изобретения являются составы, содержащие рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько из этих фрагментов.
Дополнительно, была обнаружена новая последовательность HCV. Новые нуклеиновая кислота и белок, соответствующие домену NS3/4A HCV, были клонированы из материала пациента, инфицированного HCV (SEQ.ID.NO.:16). Поиск по базе Genebank показал, что клонированная последовательность имеет наибольшую гомологию с последовательностями HCV, но только на 93% гомологична ближайшему HCV-родственнику (каталожный номер AJ278830). Этот новый пептид (SEQ.ID.NO.:17) и его фрагменты длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот, нуклеиновые кислоты, кодирующие эти молекулы, векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, и клетки, содержащие упомянутые векторы, нуклеиновые кислоты или пептиды, также являются вариантами выполнения изобретения. Дополнительно некоторые из описанных здесь вакцинных вариантов выполнения содержат рибавирин и этот новый пептид NS3/4A или его фрагмент длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:25), или нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько этих молекул.
Были также созданы мутанты нового пептида NS3/4A. Было обнаружено, что усеченные мутанты (например, SEQ.ID.NO.:29) и мутанты, у которых отсутствует сайт протеолитического расщепления, являются сильно иммуногенными. Эти новые пептиды SEQ.ID.NO.:29-32 и 43-49 и их фрагменты длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:26, 27 и 33-42), нуклеиновые кислоты, кодирующие эти молекулы, векторы, содержащие упомянутые нуклеиновые кислоты, и клетки, содержащие упомянутые векторы, нуклеиновые кислоты или пептиды, также являются вариантами выполнения. Более того, некоторые из описанных здесь составов содержат рибавирин и по меньшей мере один из мутантных пептидов HCV, описанных выше, или его фрагмент длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот. Прочие вакцинные варианты выполнения содержат рибавирин и нуклеиновую кислоту (например, DNA), кодирующую один или несколько пептидов, описанных выше.
Способы изготовления и использования составов также являются вариантами выполнения. Например, описанные выше составы могут приготавливаться путем подачи рибавирина, подачи антигена (например, пептида, содержащего антиген HCV или нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый пептид) и смешивания упомянутого рибавирина и упомянутого антигена так, чтобы получить состав, который может использоваться для усиления или облегчения иммунной реакции субъекта на упомянутый антиген. Предпочтительные способы включают в себя смешивание предпочтительного антигена или эпитопа (например, пептида, содержащего SEQ.ID.NO.:1, 6, 7 или 17, или его специфических фрагментов, таких как аминокислоты 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 1972-3011 в SEQ.ID. NO.:1, и нуклеиновых кислот, кодирующих эти молекулы) с рибавирном.
Прочие антигены или эпитопы также могут смешиваться с рибавирином, в том числе, не в порядке ограничения, фрагменты SEQ.ID.NO.:1, содержащие по меньшей мере 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 или 3 последовательные аминокислоты, и нуклеиновые кислоты, кодирующие эти фрагменты. В частности, к предпочтительным способам относятся изготовление вакцинных составов, содержащих новообнаруженный NS3/4A-фрагмент или NS3/4А-мутант (например, усеченный мутант или мутант с отсутствующим сайтом протеолитического расщепления) или его фрагмент длиной по меньшей мере четыре аминокислоты или нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько из этих молекул.
Способы усиления или облегчения иммунной реакции животных, в том числе и человека, на антиген являются вариантами выполнения изобретения. Такие способы могут быть реализованы, например, посредством идентификации животного, нуждающегося в мощной иммунной реакции на антиген/эпитоп, и введении упомянутому животному состава, содержащего антиген/эпитоп и количество рибавирина, эффективное для усиления или облегчения иммунной реакции на антиген/эпитоп. В некоторых вариантах выполнения рибавирин и антиген вводятся по отдельности, а не в составе единой смеси. В этом случае рибавирин предпочтительно вводится спустя короткое время после введении антигена. Предпочтительные способы содержат введение нуждающемуся животному рибавирина и антигена гепатита (например, антигена HAV, антигена HBV, антигена HCV, нуклеиновой кислоты, кодирующей эти молекулы, или любых их комбинаций). Некоторые из этих способов содержат антигены HCV, такие как пептид, содержащий SEQ. ID.NO.:1, или его фрагмент, содержащий по меньшей мере 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 или 3 последовательные аминокислоты SEQ.ID.NO.:1.
Дополнительные способы содержат составы, содержащие рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ.ID.NO.:13, или нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько из обсуждавшихся выше фрагментов.
Некоторые предпочтительные способы, например, относятся к использованию состава (например, вакцины), который содержит рибавирин и пептид, содержащий SEQ.ID.NO.:1, или его специфический фрагмент, соответствующий домену HCV, в том числе, не в порядке ограничения, пептид, содержащий аминокислоты 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 1972-3011 SEQ.ID.NO.:1. В частности, предпочтительные варианты выполнения относятся к использованию вакцинного состава, содержащего NS3/4А-фрагмент SEQ.ID.NO.:17 или мутант NS3/4A (например, SEQ.ID.NO.:29-32 и 43-49), у которого отсутствует сайт протеолитического расщепления, или его фрагмент длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:26, 27 и 33-42). Составы, содержащие рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую эти фрагменты, также могут использоваться в описанных здесь способах.
Остальные варианты выполнения относятся к способам лечения и предотвращения инфекции HCV. В соответствии с одним из подходов рибавирин и антиген или эпитоп HCV используются для приготовления медикамента для лечения и/или предотвращения инфекции HCV. В соответствии с другим подходом идентифицируется индивид, нуждающийся в медикаменте, предотвращающем и/или лечащем инфекцию HCV, и упомянутому индивиду вводится медикамент, содержащий рибавирин и антиген или эпитоп HCV, предпочтительно эпитоп, присутствующий в SEQ.ID.NO.:1, более предпочтительно - фрагмент SEQ.ID.NO.:1, содержащий по меньшей мере 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 или 3 последовательные аминокислоты или, наиболее предпочтительно - такой фрагмент SEQ.ID.NO.:1, как аминокислоты 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 или 1972-3011, или нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ.ID.NO.:1, или ее вышеупомянутые фрагменты. В частности, предпочтительные способы относятся к использованию вакцинного состава, содержащего рибавирин и NS3/4A-фрагмент SEQ.ID.NO.:17 или мутантный NS3/4A, у которого отсутствует сайт протеолитического расщепления (например, SEQ.ID.NO.:29-32 и 43-49), или его фрагмент длиной по меньшей мере 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:26, 27 и 33-42), или нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько из этих молекул. В нижеследующем разделе более подробно обсуждается использование рибавирина в качестве адъюванта.
Рибавирин
Состав, описанный здесь, может быть произведен с помощью общепринятых способов галеновой фармакологии для получения медицинских агентов для введения животным, например млекопитающим, в том числе и человеку. Рибавирин может быть получен у коммерческих поставщиков (например, Sigma и ICN). Рибавирин и/или антиген может быть представлен вакциной с модифицированием и без него. Например, рибавирин и/или антиген может быть модифицирован, или от него могут быть взяты производные, для получения более стабильной молекулы и/или более мощного адъюванта. В соответствии с одним из подходов стабильность рибавирина и/или антигена может быть увеличена путем связывания молекул с такой поддерживающей структурой, как гидрофильный полимер (например, полиэтиленгликоль).
Множество производных рибавирина могут быть получены с помощью методов, обычных при нормальном создании лекарств и в комбинаторной химии. Например, компания Molecular Simulations Inc. (MSI), как и многие другие поставщики, поставляют программное обеспечение, которое позволяет специалисту построить комбинаторную библиотеку органических молекул. Например, программа С2.Analog Builder может быть интегрирована с набором программного обеспечения Cerius2 molecular diversity компании MSI для разработки библиотеки рибавириновых производных, которые могут использоваться в описанных здесь вариантах выполнения (См., например, http://msi.com/life/products/cerius2/index.html).
В соответствии с одним из подходов химическая структура рибавирина записывается на машиночитаемый носитель, и одна или несколько моделирующих прикладных программ осуществляют к ней доступ. Программа C2.Analog Builder совместно с программой C2Diversity позволяют пользователю вырабатывать очень большую виртуальную библиотеку на основании, например, разнообразия R-групп для каждой позиции заместителя. Соединения, имеющие такую же структуру, что и смоделированные производные рибавирина, созданные в виртуальной библиотеке, затем получаются с помощью общепринятой химии, либо могут быть получены из коммерческого источника.
Вновь произведенные производные рибавирина затем исследуются в тестах, которые определяют степень адъювантной активности молекулы и/или степень ее способности модулировать иммунную реакцию. Некоторые тесты могут использовать такое программное обеспечение виртуального исследования медикаментов, как C2.Ludi. C2.Ludi является программой, позволяющей пользователю исследовать базы данных по молекулам (например, производным рибавирина) на предмет их способности взаимодействовать с активным сайтом интересующего белка (например, RAC2 или другого связывающего GTP белка). На основании предсказанных взаимодействий, обнаруженных с помощью программного обеспечения виртуального исследования медикаментов, производные рибавирина могут быть распределены в приоритетном порядке для дальнейшего исследования в общепринятых тестах, определяющих адъювантную активность и/или степень модулирования молекулой иммунной реакции. Пример 1 описывает некоторые тесты, которые использовались для оценки адъювантной активности рибавирина.
ПРИМЕР 1
Нижеследующие тесты могут использоваться с любым производным рибавирина или комбинациями производных рибавирина для определения степени адъювантной активности конкретного состава. В первом множестве экспериментов группы из трех-пяти мышей Balb/c (BK Universal, Uppsala, Sweden) иммунизировались внутрибрюшинно или подкожно (например, у основания хвоста) с помощью 10 мкг или 100 мкг рекомбинантного неструктурного-3 белка (rNS3) вируса гепатита С в недели 0 и 4. rNS3 был растворен в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) или в PBS, содержащем 1 мг рибавирина (полученного у ICN, Costa Mesa, CA). Мышам вводили суммарный объем 100 мкл за одну инъекцию.
Через две, четыре и шесть недель после первой внутрибрюшинной иммунизации у всех мышей брали кровь из заднеглазничной области. Образцы сыворотки собирались и анализировались на наличие антител к rNS3. Для определения антительного титра производился ферментный иммунотест (EIA). (См., например, Hultgren et al., J Gen Virol. 79:2381-91 (1998) и Hultgren et al., din. Diagn. Lab. Immunol. 4:630-632 (1997)). Уровни антител записывались в виде наивысшего разбавления сыворотки, дающего при 405 нм оптическую плотность, более чем в два раза превышающую тот же показатель у неиммунизированной мыши.
Мыши, получившие 10 мкг или 100 мкг rNS3, смешанного с 1 мг рибавирина в PBS, показали значительно более высокие уровни антител к NS3. Антительный титр, который был обнаружен путем EIA через две недели после иммунизации, показан на фиг.1. Вакцинные формулы, содержащие 1 мг рибавирина и либо 10 мкг, либо 100 мкг rNS3, вызывали значительно более высокий антительный титр, чем вакцинные формулы, составленные только из rNS3.
Во втором множестве экспериментов группы из восьми мышей Balb/c в недели 0 и 4 иммунизировались внутрибрюшинно 10 или 50 мкг rNS3 в 100 мкл фосфатного буферного солевого раствора, содержащего 0 мг, 1 мг, 3 мг или 10 мг рибавирина (Sigma). На четвертой, шестой и восьмой неделях у мышей бралась кровь, а сыворотка отделялась и замораживалась. После завершения исследования сыворотки исследовались на предмет уровней антител к рекомбинантному NS3, как описано выше. Средние уровни антител к rNS3 сравнивались для разных групп с помощью t-теста Стьюдента (параметрический анализ) или теста Манна-Уитни (непараметрический анализ) и программного пакета StatView 4.5 (Abacus Concepts, Berkley, CA). Адъювантные эффекты рибавирина при добавлении трех дозировок к 10 мкг rNS3 показаны в Таблице 1. Адъювантные эффекты рибавирина при добавлении трех дозировок к 50 мкг rNS3 показаны в Таблице 2. Параметрическое сравнение средних антительных титров rNS3 у мышей, получавших 10 мкг или 50 мкг rNS3 и различные дозы рибавирина, показаны в Таблицах 3 и 4 соответственно. Непараметрическое сравнение средних антительных титров rNS3 у мышей, получавших 10 мкг или 50 мкг rNS3 и различные дозы рибавирина, показаны в Таблицах 3 и 4 соответственно. Приведенные значения представляют конечные титры для рекомбинантного rNS3.
Таблица 1 | |||||
Количество рибавирина (мг/доза) | Количество иммуногена (мкг/доза) | Идентификатор мыши | Антительный титр к rNS3 в указанную неделю | ||
Неделя 4 | Неделя 6 | Неделя 8 | |||
Нет | 10 | 5:1 | 300 | 1500 | 1500 |
Нет | 10 | 5:2 | <60 | 7500 | 1500 |
Нет | 10 | 5:3 | <60 | 1500 | 300 |
Нет | 10 | 5:4 | 60 | 1500 | 1500 |
Нет | 10 | 5:5 | <60 | 1500 | НТ |
Нет | 10 | 5:6 | 60 | 1500 | 1500 |
Нет | 10 | 5:7 | <60 | 7500 | 7500 |
Нет | 10 | 5:8 | 300 | 37500 | 7500 |
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл.) | 180±139 | 7500±12421 | 3042±3076 | ||
1 | 10 | 6:1 | 300 | 37500 | 37500 |
1 | 10 | 6:2 | <60 | 1500 | 1500 |
1 | 10 | 6:3 | 300 | 37500 | 187500 |
1 | 10 | 6:4 | 300 | 37500 | 7500 |
1 | 10 | 6:5 | 60 | НТ | НТ |
1 | 10 | 6:6 | <60 | 37500 | 7500 |
1 | 10 | 6:7 | <60 | 37500 | 7500 |
1 | 10 | 6:8 | 300 | 7500 | 7500 |
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл) | 252±107 | 28071±16195 | 36642±67565 | ||
3 | 10 | 7:1 | 60 | 37500 | 7500 |
3 | 10 | 7:2 | 60 | 37500 | 37500 |
3 | 10 | 7:3 | 300 | 7500 | 7500 |
3 | 10 | 7:4 | 300 | 37500 | 7500 |
3 | 10 | 7:5 | 300 | 37500 | 37500 |
3 | 10 | 7:6 | 300 | 37500 | 37500 |
3 | 10 | 7:7 | 60 | 7500 | 7500 |
3 | 10 | 7:8 | 60 | 37500 | 37500 |
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл) | 180±128 | 30000±13887 | 22500±34637 | ||
10 | 10 | 8:1 | 300 | 37500 | 37500 |
10 | 10 | 8:2 | 300 | 37500 | 37500 |
10 | 10 | 8:3 | <60 | 300 | 300 |
10 | 10 | 8:4 | 60 | 7500 | 7500 |
10 | 10 | 8:5 | <60 | 300 | 300 |
10 | 10 | 8:6 | <60 | 37500 | 37500 |
10 | 10 | 8:7 | <60 | 7500 | 7500 |
10 | 10 | 8:8 | <60 | НТ | НТ |
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл) | 220±139 | 18300±18199 | 18300±18199 |
Таблица 2
Количество рибавирина (мг/доза) | Количество иммуногена (мкг/доза) | Идентификатор мыши | Антительный титр к rNS3 в указанную неделю | |||
Неделя 4 | Неделя 6 | Неделя 8 | ||||
Нет | 50 | 1:1 | 60 | 7500 | 7500 | |
Нет | 50 | 1:2 | 60 | 7500 | 7500 | |
Нет | 50 | 1:3 | 60 | 7500 | 7500 | |
Нет | 50 | 1:4 | <60 | 1500 | 300 | |
Нет | 50 | 1:5 | 300 | 37500 | 387500 | |
Нет | 50 | 1:6 | 60 | 7500 | 7500 | |
Нет | 50 | 1:7 | 60 | 37500 | 7500 | |
Нет | 50 | 1:8 | ||||
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл) | 100±98 | 15214±15380 | 10757±12094 | |||
1 | 50 | 2:1 | 60 | 7500 | 7500 | |
1 | 50 | 2:2 | 300 | 37500 | 7500 | |
1 | 50 | 2:3 | 60 | 187500 | 7500 | |
1 | 50 | 2:4 | 60 | 37500 | 187500 | |
1 | 50 | 2:5 | 60 | 37500 | 7500 | |
1 | 50 | 2:6 | 60 | 37500 | 37500 | |
1 | 50 | 2:7 | 300 | 37500 | 7500 | |
1 | 50 | 2:8 | 300 | 37500 | 37500 | |
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл) | 150±124 | 52500±55549 | 37500±62105 | |||
3 | 50 | 3:1 | 60 | 37500 | 7500 | |
3 | 50 | 3:2 | 300 | 37500 | 37500 | |
3 | 50 | 3:3 | 300 | 37500 | 7500 | |
3 | 50 | 3:4 | 60 | 37500 | 7500 | |
3 | 50 | 3:5 | 300 | 37500 | 7500 | |
3 | 50 | 3:6 | 60 | 37500 | 7500 | |
3 | 50 | 3:7 | - | 7500 | 37500 | |
3 | 50 | 3:8 | 1500 | 7500 | 37500 | |
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл) | 387±513 | 30000±13887 | 187500±15526 | |||
10 | 50 | 4:1 | 300 | 7500 | 7500 | |
10 | 50 | 4:2 | 300 | 37500 | 37500 | |
10 | 50 | 4:3 | 60 | 7500 | 7500 | |
10 | 50 | 4:4 | 60 | 7500 | 7500 | |
10 | 50 | 4:5 | 60 | 1500 | 1500 | |
10 | 50 | 4:6 | 60 | 7500 | 37500 | |
10 | 50 | 4:7 | - | 7500 | 7500 | |
10 | 50 | 4:8 | 60 | 37500 | 7500 | |
Средний титр для группы (среднее ± ср. квадр. откл) | 140±124 | 10929±11928 | 15214±15380 |
Таблица 6 | ||||||
Группа | Неделя | Среднее ± ср. квадр. откл | Группа | Среднее ± ср. квадр. откл | анализ | Значение р |
50 мкг NS3/без рибавирина | 4 | 100±98 | 50 мкг NS3/1 мг рибавирина | 150±124 | тест Манна-Уитни | 0,1128 |
6 | 15214±15380 | 52500±55549 | тест Манна-Уитни | 0,0210 | ||
8 | 10757±12094 | 37500±62105 | тест Манна-Уитни | 0,1883 | ||
50 мкг NS3/без рибавирина | 4 | 100±98 | 50 мкг NS3/3 мг рибавирина | 387±513 | тест Манна-Уитни | 0,1400 |
6 | 15214±15380 | 30000±13887 | тест Манна-Уитни | 0,0679 | ||
8 | 10757±12094 | 18750±15526 | тест Манна-Уитни | 0,2091 | ||
50 мкг NS3/без рибавирина | 4 | 100±98 | 50 мкг NS3/10 мг рибавирина | 140±124 | тест Манна-Уитни | 0,4292 |
6 | 15214±15380 | 10929±11928 | тест Манна-Уитни | 0,9473 | ||
8 | 10757±12094 | 15214±15380 | тест Манна-Уитни | 0,6279 | ||
Уровни значимости: NS = не значимо; *=р0,05; **=р<0,01; ***=р<0,001 |
Вышеприведенные данные демонстрируют, что рибавирин облегчает или усиливает иммунную реакцию на антиген HCV или эпитопы HCV. Мощная иммунная реакция на rNS3 проявлялась после иммунизации с помощью вакцинного состава, содержащего всего 1 мг рибавирина и 10 мкг антигена к rNS3. Вышеприведенные данные также доказывают, что количество рибавирина, достаточное для облегчения иммунной реакции на антиген, составляет от 1 до 3 мг на инъекцию для мыши Balb/c весом 25-30 г.Следует, однако, учитывать, что такие количества являются только ориентирами, и их не следует интерпретировать в качестве какого-либо ограничения объема изобретения. Тем не менее, эти данные показывают, что вакцинные составы, содержащие дозы приблизительно от 1 до 3 мг рибавирина, вызывают иммунную реакцию, которая более чем в 12 раз сильнее, чем иммунная реакция, вызываемая в отсутствии рибавирина (Таблицы 3 и 4). Таким образом, рибавирин оказывает значительный адъювантный эффект на гуморальную иммунную реакцию животного и благодаря этому усиливает или облегчает иммунную реакцию на антиген. Нижеприводимый пример описывает эксперименты, которые выполнялись для того, чтобы лучше понять, какое количество рибавирина требуется для усиления или облегчения иммунной реакции на антиген.
ПРИМЕР 2
Для определения дозы рибавирина, которая достаточна для обеспечения адъювантного эффекта, выполнялись следующие эксперименты. В первом множестве экспериментов группы мышей (по три в группе) иммунизировались с помощью только 20 мкг rNS3 или смеси 20 мкг rNS3 и 0,1 мг, 1 мг или 10 мг рибавирина. Уровни антител к антигену определялись посредством EIA. Отмечались средние конечные титры в недели 1 и 3, они показаны на фиг.2. Было обнаружено, что адъювантный эффект рибавирина имел различную кинетику в зависимости от вводимой дозы рибавирина. Например, было обнаружено, что даже низкие дозы (<1 мг) рибавирина увеличивают уровни антител на первой неделе, но не на третьей неделе, в то время как более высокие дозы (1-10 мг) увеличивают уровни антител на третьей неделе. Так же выполнялось второе множество экспериментов. В этих экспериментах группы мышей инъецировались с помощью вакцинных составов, содержащих различные количества рибавирина и rNS3, и отслеживалась реакция IgG у этих животных. Вакцинные составы содержали приблизительно 100 мкл фосфатного буферного солевого раствора и 20 мкг rNS3 с или без 0,1 мг, 1,0 мг или 10 мг рибавирина (Sigma). Кровь у мышей бралась на шестой неделе, а уровни rNS3-специфического IgG определялись посредством EIA, как описано ранее. Как показано в Таблице 7, адъювантные эффекты, оказываемые на поддерживаемые уровни антител, были наиболее очевидны при дозе в диапазоне от 1 до 10 мг на инъекцию для мыши весом 25-30 г.
Таблица 7 | |||||
Иммуноген | Количество (мг) рибавирина, смешанного с иммуногеном | Идентификатор мыши | Конечный титр IgG rNS3 в указанную неделю | ||
Неделя 1 | Неделя 2 | Неделя З | |||
20 мкг rNS3 | Нет | 1 | 60 | 360 | 360 |
20 мкг rNS3 | Нет | 2 | 360 | 360 | 2160 |
20 мкг rNS3 | Нет | 3 | 360 | 2160 | 2160 |
Среднее | 260±173 | 960±1039 | 1560±1039 | ||
20 мкг rNS3 | 0,1 | 4 | 2160 | 12960 | 2160 |
20 мкг rNS3 | 0,1 | 5 | 60 | 60 | 60 |
20 мкг rNS3 | 0,1 | 6 | <60 | 2160 | 2160 |
1110±1484 | 5060±6921 | 1460±1212 | |||
20 мкг rNS3 | 1,0 | 7 | <60 | 60 | 12960 |
20 мкг rNS3 | 1,0 | 8 | <60 | 2160 | 2160 |
20 мкг rNS3 | 1,0 | 9 | 360 | 2160 | 2160 |
Среднее | 360 | 1460±1212 | 5760±6235 | ||
20 мкг rNS3 | 10,0 | 10 | 360 | 12960 | 77760 |
20 мкг rNS3 | 10,0 | 11 | <60 | 2160 | 12960 |
20 мкг rNS3 | 10,0 | 12 | 360 | 2160 | 2160 |
Среднее | 360 | 5760±6235 | 30960±40888 |
В третьем множестве экспериментов исследовался адъювантный эффект рибавирина после первичных и усиливающих инъекций. В этих экспериментах мышам производились две внутрибрюшинные инъекции вакцинных составов, содержащих 10 мкг rNS3 с рибавирином или без него, и отслеживалась реакция подкласса IgG на антиген, как и ранее. В соответствии с этим мыши иммунизировались с помощью 100 мкл фосфатного буферного солевого раствора, содержащего только 10 мкг rNS3, с или без 0,1 мг, 1,0 мг или 10 мг рибавирина (Sigma) в недели 0 и 4. Кровь у мышей бралась на шестой неделе, а rNS3-специфические подклассы IgG определялись посредством EIA, как описано ранее. Как показано в Таблице 8, добавление рибавирина к иммуногену до инъекции не изменяет реакцию подкласса IgG в NS3-специфической иммунной реакции. Таким образом, адъювантный эффект вакцинного состава, содержащего рибавирин и антиген, не может объясняться сдвигом баланса Th1/Th2. Представляется, что некоторый другой механизм может отвечать за адъювантное воздействие рибавирина.
Таблица 8 | ||||||
Иммуноген | Количество (мг) рибавирина, смешанного с иммуногеном | Идентификатор мыши | Конечный титр, показывающий IgG-подкласс NS3 | |||
IgGI | IgG2a | IgG2b | IgG3 | |||
10 мкг rNS3 | Нет | 1 | 360 | 60 | <60 | 60 |
10 мкг rNS3 | Нет | 2 | 360 | <60 | <60 | 60 |
10 мкг rNS3 | Нет | 3 | 2160 | 60 | <60 | 360 |
Среднее | 960±1039 | 60 | - | 160±173 | ||
10 мкг rNS3 | 0,1 | 4 | 360 | <60 | <60 | 60 |
10 мкг rNS3 | 0,1 | 5 | 60 | <60 | <60 | <60 |
10 мкг rNS3 | 0,1 | 6 | 2160 | 60 | 60 | 360 |
860±1136 | 60 | 60 | 210±212 | |||
10 мкг rNS3 | 1,0 | 7 | 2160 | <60 | <60 | 60 |
10 мкг rNS3 | 1,0 | 8 | 360 | <60 | <60 | |
10 мкг rNS3 | 1,0 | 9 | 2160 | <60 | <60 | 60 |
Среднее | 1560±1039 | - | - | 60 |
Данные, представленные в этом примере, дополнительно подтверждают, что рибавирин может вводиться в качестве адъюванта, и устанавливают, что доза рибавирина может модулировать кинетику адъювантного эффекта. Нижеприводимый пример описывает еще один тест, который проводился для оценивания способности рибавирина усиливать или облегчать иммунную реакцию на антиген.
ПРИМЕР 3
Данный тест может использоваться с любым производным рибавирина или комбинациями рибавириновых производных для определения степени, в которой конкретный вакцинный состав модулирует клеточную иммунную реакцию. Для определения реакций клетки CD4+ Т на рибавирин-содержащую вакцину группы мышей иммунизировались подкожно с помощью либо 100 мкг rNS3 в ФБР, либо 100 мкг rNS3 и 1 мг рибавирина в PBS. Мыши умерщвлялись через 10 дней после иммунизации, а их лимфатические узлы собирались и из них извлекалась жидкость. Затем производились тесты на воспроизведение in vitro (См., например, Hultgren et al., J. Gen. Virol. 79:2381-91 (1998) и Hultgren et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630-632 (1997)). Количество пролиферации клеток CD4+ Т определялось при 96 h культуры путем внедрения [3Н] тимидина.
Как показано на фиг.3, мыши, которые были иммунизированы с помощью 100 мкг rNS3, смешанного с 1 мг рибавирина, имели гораздо большую пролиферативную реакцию Т-клеток, чем мыши, которые были иммунизированы с помощью 100 мкг rNS3 в PBS. Эти данные обеспечивают дополнительные доказательства, что рибавирин усиливает или облегчает клеточную иммунную реакцию (например, путем способствования эффективного инициирования Т-клеток). В следующем разделе обсуждаются некоторые из антигенов и эпитопов, которые могут использоваться в описанных здесь вариантах выполнения.
Антигены и эпитопы
Фактически любой антиген, который может использоваться для вырабатывания иммунной реакции у животного, может комбинироваться с рибавирином для приготовления описанных здесь составов. Таким образом, к антигенам, которые могут внедряться в такие составы (например, вакцины), относятся бактериальные антигены или эпитопы, грибковые антигены или эпитопы, растительные антигены или эпитопы, плесневые антигены или эпитопы, вирусные антигены или эпитопы, антигены или эпитопы раковых клеток, антигены или эпитопы токсинов, химические антигены или эпитопы и самоантигены или эпитопы. Хотя многие из этих молекул вызывают значительную иммунную реакцию без адъюванта, рибавирин может вводиться совместно с "сильными" или "слабыми" антигенами или эпитопами для усиления или облегчения иммунной реакции на упомянутый антиген или эпитоп. Дополнительно, использование рибавирина в качестве адъюванта может позволить использовать меньшие количества антигенов при сохранении иммуногенности.
В дополнение к пептидным антигенам в описанных здесь вакцинных составах могут использоваться антигены на основе нуклеиновых кислот. Известны различные вакцины на основе нуклеиновых кислот, и предполагается, что эти составы и подходы к иммунотерапии могут быть дополнены посредством изменения составов с помощью рибавирина (см., например, патенты США №. 5589466 и 6235888). В соответствии с одним из подходов, например, ген, кодирующий интересующий полипептидый антиген, клонируется в вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид при введении в субъект. Экспрессионный конструкт вводится в субъект в смеси с рибавирином или совместно с рибавирином (например, рибавирин вводится вскоре после экспрессионного конструкта в том же месте). Альтернативно, RNA, кодирующая интересующий полипептидный антиген, вводится субъекту в смеси с рибавирином или в сочетании с рибавирином.
Если антигеном должна являться DNA (например, при приготовлении DNA-вакцинного состава), к подходящим промоторам относятся промоторы вируса Симиана 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочных желез мыши (MMTV), вируса иммунодефицита человека (HIV), такой как промотор HIV Long Terminal Repeat (LTR), вируса Молони, ALV, цитомегаловируса (CMV), такой как непосредственный ранний промотор CMV, вируса Эпстайна-Барра (EBV), вируса саркомы Рауса (RSV), а также могут использоваться промоторы из генов человека, такие как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин и человеческий металлотионеин. Примерами сигналов полиадениляции, полезных в некоторых вариантах выполнения, особенно при получении генетической вакцины для людей, являются, не в порядке ограничения, сигналы полиадениляции SV40 и сигналы полиадениляции LTR. В частности, используется сигнал полиадениляции SV40, который находится в плазмиде рСЕР4 (Invitrogen, San Diego Calif.), обозначаемый как сигнал полиадениляции SV40.
В дополнение к регуляторным элементам, требуемым для экспрессии гена, прочие элементы могут также вводится в генный конструкт. К таким дополнительным элементам относятся усиливающие агенты. Усиливающий агент может выбираться из группы, содержащей, не в порядке ограничения, человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин и такие вирусные усиливающие агенты, как усиливающие агенты из CMV, RSV и EBV. Генные конструкторы можно получить от млекопитающего источника репликации для поддержания конструкта вне хромосом и получения множества копий конструкта в клетке. Плазмиды рСЕР4 и pREP4 компании Invitrogen (San Diego, CA) содержат источник репликации вируса Эпстайна-Барра и ядерный кодирующий участок антигена EBNA-1, который дает эписоматическую репликацию с большим числом копий без интеграции. Могут использоваться все формы DNA, реплицирующие и нереплицирующие, которые не интегрируются в геном и которые могут экспрессироваться. Приведенный ниже пример описывает использование состава, содержащего антиген на основе нуклеиновой кислоты и рибавирин.
ПРИМЕР 4
Нижеследующее описывает иммунизацию животного с помощью вакцины, содержащей антиген на основе нуклеиновой кислоты и рибавирин. Самкам и самцам мышей Balb/c в возрасте от пяти до шести недель делали анестезию путем внутрибрюшинной инъекции 0,3 мл 2,5% авертина. На передней части бедра делался надрез длиной 1,5 см, и становилась напрямую видна четырехглавая мышца бедра. Одной группе мышей инъецировали приблизительно 20 мкг экспрессионного конструкта, содержащего ген gp-120, приводимый в действие промотором цитомегаловируса (CMV), а второй группе мышей инъецировали приблизительно 5 мкг транскрибированной in vitro RNA (например, SP6, Т7 или Т3 (Ambion)), кодирующей gp-120. Эти две группы являлись контрольными. Третьей группе мышей инъецировали приблизительно 20 мкг экспрессионного вектора, содержащего ген gp-120 и CMV-промотор, смешанный с 1 мг рибавирина, а четвертой группе мышей инъецировали приблизительно 5 мкг транскрибированной in vitro RNA, смешанной с 1 мг рибавирина. Вакцины инъецировались в виде 0,1 мл раствора (PBS) в шприце объемом 1 куб. см через иглу 27 размера в течение одной минуты, приблизительно в 0,5 см от места дистального вложения мышцы в колено и на глубину примерно 0,2 см. На место инъекции накладывался шов для последующей локализации, а затем кожа скреплялась клипсами их нержавеющей стали.
Образцы крови брались перед инъекцией (день 0) и вплоть до 40 с лишним дней после инъекции. Сыворотка из каждого образца последовательно разбавлялась и исследовалась по стандартной технологии ELISA для определения антитела с помощью рекомбинантного белка gp-120 в дрожжах в качестве антигена. Во всех образцах обнаруживаются и IgG, и IgM-антитела, специфические для gp-120, однако в группах три и четыре, содержавших рибавирин, проявляется большая иммунная реакция на gp-120, при измерении по количеству и/или титру антител, обнаруженных в сыворотках.
Предпочтительные варианты выполнения изобретения содержат рибавирин и вирусный антиген или эпитоп, присутствующий на вирусе, предпочтительно вирусе гепатита. Составы, например, содержат рибавирин и антиген HAV, антиген HBV, антиген HCV или любая комбинация этих антигенов или эпитопов на одном или нескольких из этих вирусов. Гепатитные антигены могут быть пептидами или нуклеиновыми кислотами. Составы, которые могут использоваться для вакцинации от инфекции HAV, содержат, например, рибавирин и пептид HAV длиной по меньшей мере 3-10 последовательных аминокислот, 10-50 последовательных аминокислот, 50-100 последовательных аминокислот, 100-200 последовательных аминокислот, 200-400 последовательных аминокислот, 400-800 последовательных аминокислот, 800-1200 последовательных аминокислот, 1200-1600 последовательных аминокислот, 1600-2000 последовательных аминокислот и 2000-2227 последовательных аминокислот из SEQ.ID.NO.:12.
В дополнение к этому, составы, содержащие рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько пептидов HAV, описанных выше, могут использоваться для лечения или предотвращения инфекции HAV. К предпочтительным антигенам на основе нуклеиновых кислот относятся нуклеотидные последовательности по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов последовательности HAV (например, SEQ.ID.NO.:15). To есть антиген на основе нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере 9-25 последовательных нуклеотидов, 25-50 последовательных нуклеотидов, 50-100 последовательных нуклеотидов, 100-200 последовательных нуклеотидов, 200-500 последовательных нуклеотидов, 500-1000 последовательных нуклеотидов, 1000-2000 последовательных нуклеотидов, 2000-4000 последовательных нуклеотидов, 4000-8000 последовательных нуклеотидов и 8000-9416 последовательных нуклеотидов из SEQ.ID.NO.:15 или RNA, которая соответствует этим последовательностям.
Подобным же образом, предпочтительные варианты выполнения HBV-вакцины содержат рибавирин и пептид HBV по меньшей мере из 3 последовательных аминокислот HBsAg (SEQ.ID.NO.:10) или HBcAg и HBeAg (SEQ.ID.NO.:11). To есть некоторые выполнения содержат рибавирин и пептид HBV длиной по меньшей мере 3-10 последовательных аминокислот, 10-50 последовательных аминокислот, 500-100 последовательных аминокислот, 100-150 последовательных аминокислот, 150-200 последовательных аминокислот и 200-226 последовательных аминокислот из SEQ.ID.NO.:10 или SEQ.ID.NO.:11.
Дополнительно, составы, содержащие рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько пептидов HBV, описанных выше, могут использоваться для лечения или предотвращения инфекции HBV. К предпочтительным антигенам на основе нуклеиновых кислот относятся нуклеотидные последовательности по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов последовательности HBV (например, SEQ.ID.NO.:14). To есть антиген на основе нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере 9-25 последовательных нуклеотидов, 25-50 последовательных нуклеотидов, 50-100 последовательных нуклеотидов, 100-200 последовательных нуклеотидов, 200-500 последовательных нуклеотидов, 500-1000 последовательных нуклеотидов, 1000-2000 последовательных нуклеотидов, 2000-4000 последовательных нуклеотидов, 4000-8000 последовательных нуклеотидов и 8000-9416 последовательных нуклеотидов из SEQ.ID.NO.:14 или RNA, которая соответствует этим последовательностям. Нижеприведенный пример описывает использование рибавирина в сочетании с коммерческим препаратом HBV-вакцины.
ПРИМЕР 5
Адъювантное воздействие рибавирина исследовалось при смешивании с двумя дозами коммерчески доступной вакцины, содержащей HBsAg и квасцы (Engerix, SKB). Приблизительно 0,2 мкг или 2 мкг вакцины Engerix смешивались либо с PBS, либо с 1 мг рибавирина в PBS, и смеси инъецировались внутрибрюшинно группам мышей (по три в группе). Усиливающая инъекция делалась на четвертой неделе, и у всех мышей бралась кровь на шестой неделе. Образцы сыворотки разбавлялись от 1:60 до 1:37500, и эти разбавления тестировались посредством EIA, как описано выше, за исключением того, что в качестве твердого антигена использовался очищенный человеческий HBsAg. Как показано в Таблице 9, вакцинные составы, содержащие рибавирин, усиливали реакцию на 2 мкг существующей вакцины несмотря на то, что вакцина уже содержала квасцы. То есть путем добавления рибавирина к вакцинной дозе ниже оптимальной (т.е. такой, которая сама по себе не вызывает появления обнаруживаемых антител) антитела становились обнаруживаемыми, обеспечивая доказательство того, что добавление рибавирина позволяет использовать меньшие количества антигена в вакцинной формуле без ухудшения иммунной реакции.
Таблица 9 | ||||||||||||
Неделя | Конечный антительный титр для HBsAg в EIA | |||||||||||
0,02 мкг Engerix | 0,2 мкг Engerix | |||||||||||
Без рибавирина | 1 мг рибавирина | Без рибавирина | 1 мг рибавирина | |||||||||
#1 | #2 | #3 | #1 | #2 | #3 | #1 | #2 | #3 | #1 | #2 | #3 | |
6 | <60 | <60 | <60 | <60 | <60 | <60 | <60 | <60 | <60 | 300 | 60 | <60 |
Некоторые HCV-вакцинные составы содержат рибавирин и пептид HCV по меньшей мере из 3 последовательных аминокислот SEQ.ID.NO.:1, или нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый пептид HCV. То есть вакцинный состав может содержать рибавирин и один или несколько пептидов HCV длиной по меньшей мере 3-10 последовательных аминокислот, 10-50 последовательных аминокислот, 50-100 последовательных аминокислот, 100-200 последовательных аминокислот, 200-400 последовательных аминокислот, 400-800 последовательных аминокислот, 800-1200 последовательных аминокислот, 1200-1600 последовательных аминокислот, 1600-2000 последовательных аминокислот, 2000-2500 последовательных аминокислот и 2500-3011 последовательных аминокислот из SEQ.ID.NO.:1 или нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько из этих фрагментов.
Предпочтительные HCV-составы содержат рибавирин и пептид по меньшей мере из 3 последовательных аминокислот ядерного белка HCV (SEQ.ID.NO.:2), белка E1 HCV (SEQ.ID.NO.:3), белка Е2 HCV (SEQ.ID.NO.:4), NS2 HCV (SEQ.ID.NO.:5), NS3 HCV (SEQ.ID.NO.:6), NS4A HCV (SEQ.ID.NO.:7), NS4B HCV (SEQ.ID.NO.:8) или NS5A/B HCV (SEQ.ID.NO.:9), либо пептиды, содержащие комбинации этих доменов. Таким образом, предпочтительные HCV-вакцины содержат рибавирин и пептид длиной по меньшей мере 3-10 последовательных аминокислот, 10-50 последовательных аминокислот, 50-100 последовательных аминокислот, 100-200 последовательных аминокислот, 200-400 последовательных аминокислот, 400-800 последовательных аминокислот и 800-1040 последовательных аминокислот любой одной или нескольких из SEQ.ID.NO.:2-9. Эти домены соответствуют аминокислотным остаткам 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 или 1972-3011 из SEQ.ID.NO.:1. Таким образом, предпочтительные варианты выполнения также содержат один или несколько из 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971 или 1972-3011 из SEQ.ID.NO.:1 или их фрагменты.
Вакцинные составы, содержащие рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько пептидов, описанных выше, также являются вариантами выполнения. К предпочтительным антигенам на основе нуклеиновых кислот относятся нуклеотидные последовательности по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов HCV (SEQ.ID.NO.:13). To есть антиген на основе нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере 9-25 последовательных нуклеотидов, 25-50 последовательных нуклеотидов, 50-100 последовательных нуклеотидов, 100-200 последовательных нуклеотидов, 200-500 последовательных нуклеотидов, 500-1000 последовательных нуклеотидов, 1000-2000 последовательных нуклеотидов, 2000-4000 последовательных нуклеотидов, 4000-8000 последовательных нуклеотидов и 8000-9416 последовательных нуклеотидов из любой из SEQ.ID.NO.:13 или RNA, которая соответствует этим последовательностям. В следующем разделе обсуждаются некоторые составы, содержащие рибавирин и антиген.
Составы, содержащие рибавирин и антиген
Составы (например, вакцины), которые содержат рибавирин и антиген или эпитоп патогена (например, вирус, бактерию, плесень, дрожжи и паразит), могут содержать прочие ингредиенты, в том числе, не в порядке ограничения, адъюванты, связывающие агенты, наполнители, такие как стабилизаторы (для способствования долговременному хранению), эмульгаторы, загустители, соли, консерванты, растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и абсорбционные замедляющие агенты и тому подобное. Эти составы пригодны для лечения животных в качестве либо превентивной меры для того, чтобы избежать заболевания или состояния, либо терапевтически для лечения животных, уже подверженных заболеванию или состоянию.
В вакцине могут присутствовать многие другие ингредиенты. Например, рибавирин и антиген могут использоваться в смеси с общепринятыми наполнителями (например, фармацевтически приемлемыми органическими или неорганическими носителями, пригодными для парентерального, энтерального (например, перорального) или местного применения, которые не реагируют вредным образом с рибавирином и/или антигеном). К подходящим фармацевтически приемлемым носителям относятся, не в порядке ограничения, вода, солевые растворы, спирты, гуммиарабик, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, такие углеводороды как лактоза, амилоза или крахмал, стеарат магния, тальк, кремниевая кислота, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, пентаэритритоловые сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюза, поливинил пирролидон и т.д. Гораздо больше подходящих носителей описано в Remmington's Pharmaceytical Sciences, 15th Edition, Easton:Mack Publishing Company, pp.1405-1412 и 1461-1487 (1975) и в The National Formulary XIV, 14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association (1975).
Описанные здесь генные конструкты могут быть включены в состав с помощью или вводиться в сочетании с агентами, которые увеличивают поглощение и/или экспрессию генного конструкта клетками по отношению к поглощению и/или экспрессии генного конструкта клетками, которые наблюдаются, когда идентичная генетическая вакцина вводится в отсутствие таких агентов. Такие агенты и протоколы их введения в сочетании с генными конструктами описаны а патентной заявке США №08/008342 от 26 января 1993, патентной заявке США №08/029336 от 11 марта 1993, патентной заявке США №08/125012 от 21 сентября 1993, патентной заявке РСТ № PCT/US94/00899 от 26 января 1994 и патентной заявке США №08/221579 от 1 апреля 1994. Примерами таких агентов являются: CaPO4, декстран DEAE, анионные липиды; внеклеточные матрично-активные ферменты; сапонины; лектины; эстрогенные соединения и стероидные гормоны; гидроксилированные низшие алкилы; диметилсульфоксид (DMSO); мочевина; и анилиды, амидины, уретаны сложных эфиров бензоевой кислоты и такие их гидрохлоридные соли, как члены семейства местных анестетиков. Вдобавок, генные конструкты внедряются в липиды/поликатионные комплексы или вводятся в сочетании с липидами/поликатионными комплексами.
Вакцины могут быть стерилизованы и, по желанию, смешаны со вспомогательными агентами, например лубрикантами, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими агентами, эмульгаторами, солями для воздействия на осмотическое давление, буферами, окрашивающими, вкусовыми и/или ароматическими веществами и тому подобным, которые не реагируют вредным образом с рибавирином или антигеном.
Эффективная доза и способ введении конкретной вакцинной формулировки могут варьироваться в зависимости от конкретного пациента и типа и стадии заболевания, а также от других факторов, известных специалистам. Терапевтическая эффективность и токсичность вакцин может определяться с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, с помощью ЕД50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Данные, полученные в тестах, проводимых на клеточной культуре и при исследованиях на животных, могут использоваться для формулирования диапазона дозировок для использования людьми. Дозировка вакцины предпочтительно лежит в диапазоне циркуляционных концентраций, включающем ЕД50 без токсичности. Дозировка варьируется в рамках этого диапазона в зависимости от типа рибавиринового производного и антигена, используемой формы дозировки, чувствительности пациента и маршрута введения.
Поскольку рибавирин представлен на рынке уже несколько лет, многие формы дозировки и маршруты введения известны. Все известные формы дозировки и маршруты введения могут обеспечиваться в контексте описанных здесь вариантов выполнения. Предпочтительно, количество рибавирина, эффективное для усиления иммунной реакции на антиген у животного, может рассматриваться в качестве количества, которое достаточно для достижения уровня антигена в сыворотке крови животного, приблизительно равного 0,25-12,5 мкг/мл, предпочтительно приблизительно 2,5 мкг/мл. В некоторых вариантах выполнения количество рибавирина определяется в соответствии с весом тела животного, которому вводится вакцина. Соответственно, количество рибавирина в вакцинной формуле может составлять приблизительно 0,1-6,0 мг/кг веса тела. То есть в некоторых вариантах выполнения количество рибавирина соответствует приблизительно 0,1-1,0 мг/кг, 1,1-2,0 мг/кг, 2,1-3,0 мг/кг, 3,1-4,0 мг/кг, 4,1-5,0 мг/кг, 5,1 и 6,0 мг/кг веса тела животного. Более традиционно вакцины содержат приблизительно 0,25 мг-2000 мг рибавирина. То есть некоторые выполнения содержат приблизительно 250 мкг, 500 мкг, 1 мг, 25 мг, 50 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 1 г, 1,1 г, 1,2 г, 1,3 г, 1,4 г, 1,5 г, 1,6 г, 1,7 г, 1,8 г, 1,9 г и 2 г рибавирина.
Общепринятые вакцинные препараты могут быть модифицированы путем добавления некоторого количества рибавирина, которого достаточно для усиления иммунной реакции на антиген. Таким образом, существующие традиционные вакцинные формулы могут модифицироваться посредством простого добавления к препарату рибавирина или посредством введения общепринятой вакцины в сочетании с рибавирином (например, вскоре после или незадолго перед введением антигена). Как отметит специалист, количество антигенов в вакцине может варьироваться в зависимости от типа антигена и его иммуногенности. Количество антигенов в вакцинах может соответственно варьироваться. Тем не менее, в качестве общих ориентировочных значений, вакцины могут содержать приблизительно 0,25 мг-5 мг, 5-10 мг, 10-100 мг, 100-500 мг и вплоть до 2000 мг антигена (например, гепатитного вирусного антигена).
В некоторых описанных здесь подходах точное количество рибавирина и/или антигена выбирается конкретным врачом для лечащегося пациента. Дополнительно, количества рибавирина могут добавляться совместно с или отдельно от такого же или эквивалентного количества антигена, и эти количества могут регулироваться в ходе конкретного протокола вакцинации, чтобы обеспечить достаточные уровни с пациент-специфической и антиген-специфической точки зрения. В этом случае к принимаемым во внимание пациент-специфическим и антиген-специфическим факторам относятся, не в порядке ограничения, тяжесть заболевания пациента, возраст и вес пациента, характер питания, время и частота введении, комбинация (комбинации) медикаментов, реакционные чувствительности и толерантность/реакция на терапию. Следующий раздел описывает обнаружение нового гена ВГС и создание мутантных последовательностей ВГС, которые могут использоваться в описанных здесь вариантах выполнения.
Новые NS3/4A и мутантная NS3/4A последовательности
Новая нуклеиновая кислота и белок, соответствующий домену NS3/4A ВГС, были клонированы из пациента, инфицированного ВГС (ИД. ПОСЛ. №16 и 17). В результате поиска по Genebank обнаружилось, что клонированная последовательность имеет наибольшую гомологию с последовательностями ВГС, но только на 93% гомологична своему ближайшему ВГС-родственнику (каталожный номер AJ 278830). Был также создан усеченный мутант нового пептида NS3/4A и мутантов NS3/4A, у которого отсутствует сайт протеолитического расщепления. Было обнаружено, что эти новые пептиды и нуклеиновые кислоты, кодирующие данные пептиды, являются мощными иммуногенами, которые могут быть смешаны с рибавирином для приготовления состава, обеспечивающего адресату мощную иммунную реакцию на ВГС. Клонирование нового домена NS3/4A и создание различных М83/4А-мутантов описано в следующем примере.
ПРИМЕР 6
Последовательность NS3/4A была усилена из сыворотки инфицированного ВГС пациента (генотип ВГС 1а) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Вся РНК была экстрагирована из сыворотки, синтез кДНК и ТТТТР выполнялись в соответствии со стандартными протоколами (Chen M. et al., J. Med. Virol. 43:223-226 (1995)). Синтез кДНК инициировался с помощью античувствительного праймера "NS4KR" (5'-CCG TCT AGA ТСА GCA СТС ТТС CAT TTC АТС-3' (ИД. ПОСЛ. №18)). Из этой кДНК был усилен фрагмент ДНК ВГС из 2079 пар оснований, соответствующий аминокислотам от 1007 до 1711, который охватывает гены NS3 и NS4A. Высокоточная полимераза (Expand High Fidelity PCR, Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany) использовалась с праймером "NS3KF" (5'-CCT GAA TTC ATG GCG CCT АТС ACG GCC TCT-3' (ИД. ПОСЛ. №19)) и праймером NS4KR. Праймер NS3KF содержал сайт расщепления рестриктирующего фермента EcoRI и инициирующий кодон, а праймер NS4KR содержал сайт расщепления рестриктирующего фермента Xbal и терминирующий кодон.
Затем усиленный фрагмент был определен как ИД. ПОСЛ. №16. Сравнительный анализ последовательностей показал, что генный фрагмент был усилен из вирусного штамма генотипа 1а. Компьютерный поиск BLAST по базе данных Genebank с помощью сайта NCBI показал, что ближайший гомолог ВГС был идентичен на 93% по нуклеотидной последовательности.
Затем усиленный фрагмент ДНК был поглощен с помощью EcoRI и Xbal и был вставлен в плазмид пкДНК3,1/Гис (Invitrogen), поглощенный теми же ферментами. Затем плазмид NS3/4А-пкДНК3,1 был поглощен EcoRI и Xbal, и вставка была очищена с помощью набора QiaQuick (Qiagen, Hamburg, Germany) и сращена с поглощенным EcoRI/Xbal вектором pVAX (Invitrogen), чтобы выработать плазмид NS3/4A-pVAX.
Усеченный мутант rNS3 был получен путем удаления последовательности NS4A из ДНК NS3/4A. Соответственно, генная последовательность NS3 в NS3/4A-pVAX была усилена посредством ПЦР с помощью праймеров NS3KF и 3'NotI (5'-CCA CGC GGC CGC GAC GAC СТА CAG-3' (ИД. ПОСЛ. №20)), содержащих сайты рестрикции EcoRI и Not I, соответственно. Фрагмент NS3 (1850 пар оснований) затем сращивался с поглощенным EcoRI и Not I плазмидом pVAX для вырабатывания вектора NS3-pVAX. Плазмиды выращивались в клетках BL21 Е. coli. Последовательности плазмидов определялись и проверялись путем рестриктирующего расщепления, и результаты совпали с ожидаемыми на основе исходной последовательности.
Для изменения сайта протеолитического расщепления между NS3 и NS4A плазмид NS3/4A-pVAX мутагенизировался с помощью набора для мутагенеза QUICK-CHANGE™ (Stratagene), следуя рекомендациям производителя.
Для получения мутации "ТРТ" плазмид был усилен с помощью праймеров 5'-CTGGCGGTCGTCACGCCTACCTGGGTGCTCGTT-3' (SEQ.ID.NO.:21) и 5'-ACCGAGCACCCAGGTAGGCGTGACGACCTCCAG-3' (SEQ.ID.NO.:22), что дало NS3/4A-TPT-pVAX. Для получения мутации "RGT" плазмид был усилен с помощью праймеров 5'-CTGGAGGTCGTCCGCGGTACCTGGGTGCTCGTT-3' (SEQ.ID.NO.:23) и 5'-ACCGAGCACCCAGGTACC-GCGGACGACCTCCAG-3' (SEQ.ID.NO.:24), что дало NS3/4A-RGT-pVAX.
Последовательности всех мутагенизированных конструктов определялись для проверки того, что все мутации были проведены корректно. Плазмиды выращивались в компетентных BL21 Е.coli. Плазмидная DNA, используемая для инъекций in vivo, была очищена с помощью колонн Qiagen для очистки DNA, в соответствии с инструкциями производителей (Qiagen GmbH, Hilden, FRG). Концентрация получившейся плазмидной DNA определялась спектрофотометрически (Dynaquant, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), и очищенная DNA была растворена в стерильном фосфатном буферном солевом растворе (PBS) при концентрациях 1 мг/мл. Аминокислотные последовательности некультивированных и мутировавших соединений показаны в Таблице 10. Следующий раздел описывает несколько нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды HCV.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды HCV
Варианты выполнения с нуклеиновыми кислотами содержат нуклеотиды, кодирующие пептиды HCV, описанные здесь (например, SEQ.ID.NO.:17, 29, 31, 32 и 43-49), или их фрагменты длиной по меньшей мере 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот (например, SEQ.ID.NO.:25-27 и 33-42). Некоторые варианты выполнения, к примеру, содержат геномные DNA, RNA и cDNA, кодирующие эти пептиды HCV. Варианты выполнения с нуклеотидами HCV содержат не только последовательности DNA, показанные в листинге последовательностей (например, SEQ.ID.NO.:16), но также и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, показанные в листинге последовательностей (например, SEQ.ID.NO.:17), и любые нуклеотидные последовательности, которые гибридизируются с последовательностями DNA, показанными в листинге последовательностей, при строгих условиях (например, гибридизация со связанной с фильтром DNA в 0,5 моль NaHPO4, 7,0% додецилсульфата натрия (SDS), 1 ммоль EDTA при 50°С и промывание в 0,2 Х SSC/0,2% SDS при 50°С), и любые нуклеотидные последовательности, которые гибридизируются с последовательностями DNA, кодирующими аминокислотную последовательность, приведенную в листинге последовательностей (SEQ.ID.NO.:17) при менее строгих условиях (например, гибридизация в 0,5 моль NaHPO4, 7,0% додецилсульфата натрия (SDS), 1 ммоль EDTA при 37°С и промывание в 0,2 Х SSC/0,2% SDS при 37°С).
Варианты выполнения с нуклеиновыми кислотами содержат также фрагменты, модификации, производные и варианты вышеописанных последовательностей. Желательные варианты выполнения, например, содержат нуклеиновые кислоты, имеющие по меньшей мере 12 последовательных оснований одной из новых последовательностей HCV или последовательности, комплементарной к ней, а предпочтительные фрагменты содержат по меньшей мере 12 последовательных оснований нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу NS3/4A из SEQ.ID.NO.:17 или последовательности, комплементарной к ней.
С этой точки зрения, варианты выполнения изобретения с нуклеиновыми кислотами могут содержать от 12 до приблизительно 2079 последовательных нуклеотидов. Некоторые фрагменты DNA по изобретению, например, содержат нуклеиновые кислоты, содержащие по меньшей мере 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 1000-1500, 1500-2079 последовательных нуклеотидов из SEQ.ID.NO.:16 или комплементарной к ней. Варианты выполнения с нуклеиновыми кислотами могут также изменяться посредством таких мутаций как замены, добавления или делеции. Из-за деградирования нуклеотидных кодирующих последовательностей, например, прочие последовательности DNA, которые кодируют практически ту же аминокислотную последовательность HCV, что и показанная как SEQ.ID.NO.:17, могут использоваться в некоторых вариантах выполнения. К ним относятся, не в порядке ограничения, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей весь NS3/4A или его части (SEQ.ID.NO.:16), или нуклеиновые кислоты, являющиеся комплементарными ко всей этой последовательности или ее части, которые были изменены посредством замены различных кодонов, которые кодируют функционально эквивалентный аминокислотный остаток в последовательности, таким образом, давая скрытое изменение, или функционально неэквивалентный аминокислотный остаток в последовательности, давая тем самым обнаруживаемое изменение.
Посредством использования вышеописанных последовательностей нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидного синтеза могут быть сконструированы и изготовлены зонды, которые дополняют эти молекулы. Желательные зонды содержат последовательность нуклеиновых кислот из (SEQ.ID.NO.:16), которая уникальна для данного изолята HCV. Эти зонды могут использоваться для исследования cDNA пациентов, чтобы изолировать естественные источники HCV, некоторыми из которых могут быть сами новые последовательности HCV. Исследование может выполняться путем фильтерной гибридизации или, например, посредством PCR. При фильтерной гибридизации маркированный зонд предпочтительно содержит по меньшей мере 15-30 пар оснований последовательности нуклеиновых кислот из (SEQ.ID.NO.:16), которая уникальна для данного пептида NS3/4A. Промывочные условия гибридизации обычно от средней до высокой строгости. Гибридизация может выполняться в 0,5 моль NaHPO4, 7,0% додецилсульфата натрия (SDS), 1 ммоль EDTA при 42°С в течение ночи, а промывание может выполняться в 0,2Х SSC/0,2% SDS при 42°С. Рекомендации в отношении таких условий см., например, в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Press, N.Y.; и Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Inter-science, N.Y.
Нуклеиновые кислоты HCV могут также быть изолированы у пациентов, инфицированных HCV, с помощью описанных здесь нуклеиновых кислот. (См. также Пример 6). Соответственно, RNA, полученная у пациента, инфицированного HCV, обратно транскрибируется, а результирующая cDNA амплифицируется с помощью РСК или другого метода амплифицирования. Праймеры предпочтительно получаются из последовательности NS3/4A (SEQ.ID.NO.:16).
Обзор технологии PCR см. в Molecular Cloning to Genetic Engineering, White, B.A. Ed. in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press Totowa (1997), и в публикации, озаглавленной "PCR methods and Applications" (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Для амплифицирования MRNAs в объем изобретения входит обратная транскрипция mRNA в cDNA с последующим PCR (RT-PCR); либо использование одного фермента для обоих шагов, как описано в патенте США №5322770. Еще один метод содержит использование обратно-транскриптазной цепной реакции лигазы с асимметрическим зазором (RT-AGLCR), как описано в Marshall R.L. et al. (PCR Methods and Applications 4:80-84, 1994).
Коротко говоря, RNA изолирована по стандартным процедурам. Реакция обратной транскрипции выполняется над RNA с помощью олигонуклеотидного праймера, специфического по большей части для 5'-конца усиленного фрагмента, в качестве праймера синтеза первой спирали. Получающийся гибрид RNA/DNA затем получает "хвост" из гуанинов с помощью стандартной терминальной трансферазной реакции. Затем гибрид поглощается RNAse Н, и синтез второй спирали инициализируется с помощью поли-С праймера. Таким образом, легко изолируются последовательности cDNA выше амплифицированного фрагмента. Обзор стратегий клонирования, которые могут использоваться, см., например, в Sambrook et al., 1989, выше.
В каждой из процедур амплифицирования праймеры на каждой из сторон амплифицированной последовательности добавляются к подходящим образом подготовленному образцу нуклеиновой кислоты вместе с dNTRs и термостабильной полимеразой, такой, как полимераза Taq, полимераза Pfu или полимераза Vent. Нуклеиновая кислота в образце денатурируется, а праймеры специфически гибридизируются с дополнительными последовательностями нуклеиновых кислот в образце. Гибридизированные праймеры затем удлиняются. После этого инициализируется еще один цикл денатурирования, гибридизации и вытягивания. Циклы повторяются много раз для получения амплифицированного фрагмента, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты между праймерными сайтами. PCR была дополнительно описана в нескольких патентах, в том числе в патентах США №4683195, 4683202 и 4965188.
Праймеры выбираются так, чтобы быть практически комплементарными к части последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ.ID.NO.:16), которая является уникальной для данной молекулы NS3/4A, тем самым позволяя амплифицировать последовательность между праймерами. Предпочтительно, праймеры имеет длину по меньшей мере 16-20, 20-25 или 25-30 нуклеотидов. Формирование стабильных гибридов зависит от температуры плавления (Тпл) DNA. Тпл зависит от длины праймера, ионной силы раствора и состава G+C. Чем выше состав G+С праймера, тем выше температура плавления, поскольку пары G:C удерживаются тремя Н-связями, в то время как пары А:Т удерживаются только двумя такими связями. Состав G+C усиливающих праймеров, описываемых здесь, предпочтительно находится в диапазоне между 10 и 75%, более предпочтительно между 35 и 60%, и наиболее предпочтительно между 40 и 55%. Подходящая длина праймеров при конкретных экспериментальных условиях может быть определена эмпирически специалистом.
Расстояние между праймерами связано с длиной амплифицируемого сегмента. В контексте описываемых здесь вариантов выполнения амплифицируемые сегменты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептиды HCV, могут иметь размер в диапазоне от по меньшей мере 25 пар оснований до полной длины генома HCV. Типичны фрагменты длиной 25-1000 пар оснований, предпочтительны фрагменты длиной 50-1000 пар оснований, а фрагменты длиной 100-600 пар оснований являются в высшей степени предпочтительными. Следует отметить, что амплифицирующие праймеры могут иметь любую последовательность, позволяющую специфическое амплифицирование участка NS3/4A, и могут, например, содержать модификации, такие как сайты рестрикции, для облегчения клонирования.
Продукт PCR может быть субклонирован, и его последовательность может быть определена для того, чтобы убедиться, что амплифицированная последовательность представляет последовательности пептида HCV. Затем PCR-фрагмент может использоваться для изолирования клона cDNA полной длины с помощью различных способов. Например, амплифицированный фрагмент может быть маркирован и использован для проверки библиотеки cDNa, такой как бактериофаговая библиотека cDNA. Альтернативно, маркированный фрагмент может использоваться для изолирования геномных клонов путем проверки геномной библиотеки. Дополнительно, экспрессионная библиотека может быть сконструирована с помощью cDNA, синтезированной, например, из RNA, изолированной из инфицированного пациента. Таким способом могут изолироваться генные продукты HCV с помощью стандартных методов отслеживания антител в сочетании с антителами к генному продукту HCV. (О методах отслеживания см., например, в Harlow, E. and Lane, eds., 1988, Antobodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.)
Варианты выполнения содержат также (а) векторы DNA, содержащие любые вышеупомянутые последовательности нуклеиновых кислот и/или их дополнения (то есть противоположности); (б) векторы экспрессии DNA, содержащие любые из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот, оперативно связанные с регуляторным элементом, который направляет экспрессию нуклеиновой кислоты; и (в) генетически сконструированные клетки хозяина, содержащие любые из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот, оперативно связанные с регуляторным элементом, который направляет экспрессию кодирующих последовательностей в клетке хозяина. Эти рекомбинантные конструкты способны к автономной репликации в клетке хозяина. Альтернативно, рекомбинантные конструкты могут интегрироваться в хромосомную DNA клетки хозяина. Такие рекомбинантные полинуклеотиды обычно, с помощью человеческих манипуляций, содержат геномный полинуклеотид или cDNA-полинуклеотид HCV полусинтетической или синтетической природы. Поэтому обеспечиваются рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие эти последовательности и их дополнения, которые не встречаются в природе.
Несмотря на то что могут использоваться нуклеиновые кислоты, кодирующие пептид HCV, или нуклеиновые кислоты, имеющие последовательности, дополняющие ген HCV, встречающиеся в природе, они часто модифицируются, например, посредством делеции, замещения или вставки, и могут сопровождаться последовательностью, не встречающейся у людей. К используемым здесь регуляторным элементам относятся, не в порядке ограничения, возбуждаемые и невозбуждаемые промоторы, усилители, операторы и прочие элементы, известные специалистам, которые инициируют экспрессию и управляют ей. К таким регуляторным элементам относятся, не в порядке ограничения, непосредственный ранний ген цитомегаловируса hCMV, ранние или поздние промоторы аденовируса SV40, система lac, система trp, система ТАС, система TRC, главные операторный и промоторный участки фага А, управляющие участки покровного белка fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы, промоторы кислотной фосфатазы и промоторы факторов скрещивания дрожжей.
Вдобавок могут быть сконструированы рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид HCV, и дополнительные к ним последовательности, чтобы модифицировать их обработку или экспрессию. Например, и не в порядке ограничения, описанные здесь нуклеиновые кислоты HCV могут комбинироваться с последовательностью промотора и/или сайтом связывания рибосом, либо сигнальная последовательность может вставляться выше последовательностей, кодирующих пептид HCV, чтобы позволить секрецию пептида и, тем самым, упростить сбор или биодоступность. Дополнительно заданная нуклеиновая кислота HCV может быть мутирована in vitro или in vivo для создания и/или разрушения трансляционной, инициализирующей и/или терминирующей последовательностей или для создания вариаций в кодирующих участках и/или формирования новых сайтов рестрикции или разрушения существующих, либо для облегчения дальнейшей модификации in vitro. (См. Пример 6). Может использоваться любая известная из уровня техники технология мутагенеза, в том числе, не в порядке ограничения, сайтонаправленный мутагенез in vitro (Hutchinson et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)).
Дополнительно, нуклеиновые кислоты, кодирующие другие белки или домены других белков, могут быть присоединены к нуклеиновым кислотам, кодирующим пептид HCV, для создания фузионного белка. Нуклеотиды, кодирующие фузионные белки, могут содержать, не в порядке ограничения, последовательность NS3/4A полной длины (SEQ.ID.NO.:16), усеченную последовательность NS3/4A или пептидный фрагмент последовательности NS3/4A, сращенный с неродственным белком или пептидом, таким, например, как полигистидин, гемагглютинин, фермент, флюоресцентный белок или люминесцентный белок, как описывается ниже.
Неожиданно было обнаружено, что векторы NS3-pVAX и NS3/4A-pVAX были способны вызывать мощную иммунную реакцию при инъецировании иммунокомпетентному животному. Приводимый ниже пример описывает эти эксперименты более подробно.
ПРИМЕР 7
Чтобы определить, вызывалась ли гуморальная иммунная реакция векторами NS3-pVAX и NS3/4A-pVAX, экспрессионные конструкты, описанные в Примере 6, очищались с помощью системы очистки DNA Qiagen в соответствии с инструкциями производителя, и очищенные векторы DNA использовались для иммунизации групп по четыре-десять мышей Balb/c. Плазмиды инъецировались напрямую в регенерирующиеся передние большеберцовые мышцы (ПБ), как описано ранее (Davis et al., Human Gene Therapy 4(6):733 (1993)). Говоря коротко, мыши инъецировались внутримышечно с помощью 50 мкл/ПБ 0,01-мМ кардиотоксина (Latoxan, Rosans, France) в 0,9% стерильном NaCl. Через пять дней в каждую ПБ-мышцу инъецировали 50 мкл PBS, содержащего либо rNS3, либо DNA.
Инбридинговые породы мышей C57/BL6 (H-2b) Balb/C (H-2d) и СВА (H-2k) были получены в питомниках Moellegard, Дания, Charles River Uppsala, Швеция, или В&К Sollentuna, Швеция. Все мыши были самками и использовались в возрасте 4-8 недель. Для отслеживания гуморальных реакций все мыши получали усиливающую инъекцию 50 мкл/ПБ плазмида DNA каждую четвертую неделю. Дополнительно некоторым мышам давали рекомбинантный белок NS3 (rNS3), который был очищен, как описано здесь. Мыши, получавшие rNS3, иммунизировались не более двух раз. У всех мышей брали кровь два раза в месяц.
Использовались ферментные иммуносорбентные тесты (ElAs) для обнаружения наличия мышиных антител к NS3. Эти тесты выполнялись практически, как описано в (Chen et al., Hepatology 28(1):219 (1998)). Коротко говоря, rNS3 пассивно адсорбировался в течение ночи при 4°С в 96-ячеечные пластины микротитра (Nunc, Copenhagen, Denmark) при концентрации 1 мкг/мл в 50 ммоль буфера из карбоната натрия (рН 9,6). Затем пластины блокировались посредством инкубации с разбавляющим буфером, содержащим PBS, 2% альбумина козлиной сыворотки и 1% альбумина бычьей сыворотки, в течение 1 часа при 37°С. Последовательные разбавления мышиных сывороток начиная с 1:60 затем инкубировались на пластинах в течение 1 часа. Связанные антитела мышиной сыворотки обнаруживались с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой козлиного анти-мышиного IgG (Sigma Cell Products, Saint Louis, МО) с последующим добавлением субстратного pNPP (1 таблетка/5 мл 1M-диэтаноламинового буфера с 0,5 ммоль MgCl2). Реакция останавливалась путем добавления 1 моль NaOH, и абсорбция считывалась при 405 нм.
Через четыре недели четыре из пяти мышей, иммунизированных с помощью NS3/4A-pVAX, выработали антитела к NS3, в то время как одна из пяти, иммунизированных с помощью NS3-pVAX, выработала антитела (фиг.4). Через шесть недель четыре из пяти мышей, иммунизированных с помощью NS3/4A-pVAX, выработали высокие уровни (>104) антител к NS3 (средние уровни 10800±4830), а у одной был титр, равный 2160. Несмотря на то что все мыши, иммунизированные с помощью NS3-pVAX, выработали антитела к NS3, ни одна из них не выработала таких высоких уровней, как уровни, полученные с помощью конструкта NS3/4A-pVAX (средние уровни 1800±805). Уровни антител, вызванные фузионным конструктом NS3/4A, были значительно выше, чем уровни, вызванные NS3-pVAX, через шесть недель (средние значения 7,6 против 3,4, р<0,05, тест суммарного значения Манна-Уитни, и р<0,01, t-тест Стьюдента). Таким образом, иммунизация с помощью либо NS3-pVAX, либо NS3/4A-pVAX приводит к вырабатыванию антител к NS3, но фузионный ген NS3/4A был более мощным иммуногеном. Приводимый ниже пример описывает эксперименты, которые были выполнены для определения того, может ли конструкт NS3/4A-TPT-pVAX вызвать мощную иммунную реакцию.
ПРИМЕР 8
Чтобы проверить, можно ли полностью отнести усиленную иммуногенность NS3/4A на счет присутствия NS4A, или же фузионный белок NS3/4A дополнительно должен быть расщеплен на месте связки NS3/4A, были проведены новые эксперименты. В первом эксперименте иммуногенность векторов NS3-pVAX, NS3/4A-pVAX и NS3/4A-TPT-pVAX сравнивалась у мышей Balb/c. Мыши иммунизировались на неделе 0, как описано выше, и, через две недели, у всех мышей бралась кровь и определялось наличие антител к NS3 в разбавлении сыворотки 1:60 (Таблица 11). У мышей снова брали кровь на неделе 4. Несмотря на то что вектор NS3/4A-TPT-pVAX был сравним с вектором NS3-pVAX (4/10 против 0/10; NS, точный тест Фишера), вектор NS3/4A-pVAX продолжал оставаться самым мощным иммуногеном. Таким образом, все конструкты HCV, которые были введены мышам, были способны вызывать иммунную реакцию на NS3, однако последовательность NS4A и функциональный сайт протеолитического расщепления между последовательностями NS3 и NS4A обеспечивали более мощную иммунную реакцию.
Таблица 11 | |||
Недели после первой иммунизации | Количество проявивших антительную реакцию на соответствующий иммуноген после одной иммунизации с помощью 100 мкг внутримышечно | ||
NS3-pVAX | NS3/4A-pVAX | NS3/4A-TPT-pVAX | |
2 | 0/10 | 17/20 | 4/10 |
4 | 0/10 | 20/20 | 10/10 |
(<60) | (2415±3715) | (390±639) | |
55%>103 | 50%>102 | ||
10%>104 | 10%>103 |
В ходе хронической фазы инфекции HCV реплицируется в гепатоцитах и распространяется в печени. Главным фактором в борьбе с хроническими и постоянными вирусными инфекциями является опосредованная клетками система иммунной защиты. Лимфоциты CD4+ и CD8+ проникают в печень во время хронической фазы инфекции HCV, но они не способны вычистить вирус или предотвратить разрушение печени. Вдобавок, постоянная инфекция HCV связана с установлением гепатоцеллюлярной карциномы (НСС). Приводимые ниже примеры описывают эксперименты, которые проводились для определения способности конструктов NS3 и NS3/4A вызывать опосредованную Т-клетками иммунную реакцию на NS3.
ПРИМЕР 9
Для того, чтобы изучить, способны ли описанные выше конструкты вызывать опосредованную клетками реакцию на NS3, был выполнен тест опухолевого роста in vivo. Для этого была получена опухолевая клеточная линия SP2/0, стабильно трансфецируемая с помощью гена NS/4A. Плазмид pcDNA3.1, содержащий ген NS3/4A, был линеаризован путем поглощения BglII. Всего 5 мкг линеаризованной плазмидной DNA смешивались с 60 мкг трансфекционного реагента (Superfect, Qiagen, Germany), и смесь добавлялась к 50% сливному слою клеток SP2/0 на 35-мм блюдце. Трансфецированные клетки SP2/0 (NS3/4A-SP2/0) выращивались 14 дней в присутствии 800 мкг/мл генитисина, и изолировались отдельные клоны. Стабильный NS3/4A-экспрессирующий клон SP2/0 был идентифицирован с помощью PCR и RTPCR. Клонированная клеточная линия поддерживалась в DMEM, содержащем 10% сыворотки бычьего плода, L-глутамин и пенициллин-стрептомицин.
Кинетика роста клеточных линий SP2/0 и NS3/4A-SP2/0 in vivo оценивалась на мышах Balb/c. Мышам инъецировали подкожно 2×106 опухолевых клеток в правый бок. Каждый день размер опухоли определялся через кожу. Кинетика роста двух клеточных линий была сравнимой. Например, средние размеры опухоли не отличались у двух клеточных линий в один и тот же момент времени (см. Таблицу 12). Приводимый ниже пример описывает эксперименты, которые были проведены, чтобы определить, выработали ли мыши, иммунизированные с помощью конструктов NS3/4A, реакцию Т-клеток на NS3.
Таблица 12 | ||||||||||
Идентификатор мыши | Опухолевая клеточная линия | Максимальный размер опухоли in vivo в указанный момент времени | ||||||||
5 | 6 | 7 | 8 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
1 | SP2/0 | 1,6 | 2,5 | 4,5 | 6,0 | 10,0 | 10,5 | 11,0 | 12,0 | 12,0 |
2 | SP2/0 | 1,0 | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 7,5 | 7,5 | 8,0 | 11,5 | 11,5 |
3 | SP2/0 | 2,0 | 5,0 | 7,5 | 8,0 | 11,0 | 11,5 | 12,0 | 12,0 | 13,0 |
4 | SP2/0 | 4,0 | 7,0 | 8,0 | 10,0 | 13,0 | 15,0 | 16,5 | 16,5 | 17,0 |
5 | SP2/0 | 1,0 | 1,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 6,0 | 6,0 | 7,0 |
Среднее в группе | 1,92 | 3,3 | 5,0 | 6,2 | 9,3 | 10,1 | 10,7 | 11,6 | 12,1 | |
6 | NS3/4A-SP2/0 | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 3,5 | 4,0 | 5,5 | 6,0 | 7,0 | 8,0 |
7 | NS3/4A-SP2/0 | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 5,0 | 7,0 | 9,0 | 9,5 | 9,5 | 11,0 |
8 | NS3/4A-SP2/0 | 1,0 | 2,0 | 3,5 | 3,5 | 9,5 | 11,0 | 12,0 | 14,0 | 14,0 |
9 | NS3/4A-SP2/0 | 1,0 | 1,0 | 2,0 | 6,0 | 11,5 | 13,0 | 14,5 | 16,0 | 18,0 |
10 | NS3/4A-SP2/0 | 3,5 | 6,0 | 7,0 | 10,5 | 15,0 | 15,0 | 15,0 | 15,5 | 20,0 |
Среднее в группе | 1,7 | 2,7 | 3,7 | 5,7 | 9,4 | 10,7 | 11,4 | 12,4 | 14,2 | |
Значение р при сравнении среднегрупповых значений по t-тесту Стьюдента | 0,7736 | 0,6918 | 0,4027 | 0,7903 | 0,9670 | 0,7986 | 0,7927 | 0,7508 | 0,4623 |
ПРИМЕР 10
Чтобы исследовать, вызвана ли Т-клеточная реакция иммунизацией с помощью NS3/4A, была исследована способность защитной иммунной системы иммунизированной мыши атаковать МS3-экспрессирующую опухолевую клеточную линию. Протокол тестирования ингибирования in vivo роста опухоли миеломной клеточной линии SP2/0 у мышей Balb/c был подробно описан ранее (Encke et al., J. Immunol. 161:4917 (1998)). Ингибирование опухолевого роста в этой модели зависит от инициализации цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTLs). Коротко говоря, группы из десяти мышей иммунизировались внутримышечно пять раз с интервалом в один месяц с помощью либо 100 мкг NS3-pVAX, либо 100 мкг NS3/4A-pVAX. Через две недели после последней иммунизации в правый бок каждой мыши инъецировали 2×106 клеток SP2/0 или NS3/4A-SP2/0. Через две недели после этого мышей умерщвляли и измеряли максимальные размеры опухолей. Не было различия между средними размерами опухолей SP2/0 и NS3/4A-SP2/0 у мышей, иммунизированных с помощью NS3-pVAX. (См. Таблицу 13).
Таблица 13 | |||||
Идентификатор мыши | Иммуноген | Доза (мкг) | Опухолевая клеточная линия | Рост опухоли | Максимальный размер опухоли (мм) |
1 | NS3-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 5 |
2 | NS3-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 15 |
3 | NS3-pVAX | 100 | SP2/0 | нет | - |
4 | NS3-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 6 |
5 | NS3-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 13 |
Общее в группе | 4/5 | 9,75±4,992 | |||
6 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | да | 9 |
7 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | да | 8 |
8 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | да | 7 |
9 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | нет | - |
10 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | нет | - |
3/5 | 8,00±1,00 | ||||
Примечание: Статистический анализ (StatView): t-тест Стьюдента в отношении максимального размера опухоли. Значения р<0,05 рассматриваются как значимые. |
В следующем множестве экспериментов оценивалось ингибирование роста опухолей SP2/0 или NS3/4A-SP2/0 у иммунизированных с помощью NS3/4A-pVAX мышей Balb/c. У мышей, иммунизированных с помощью плазмида NS3/4A-pVAX, рост опухолевых клеток NS3/4A-SP2/0 был значительно ингибирован по сравнению с ростом нетрансфецированных клеток SP2/0. (См. Таблицу 14). Таким образом, иммунизация с помощью NS3/4A-pVAX возбуждает CTLs, которые ингибируют рост клеток, экспрессирующих NS3/4A in vivo. Приведенный ниже пример описывает эксперименты, которые были проведены для анализа эффективности различных NS3-содержащих составов при возбуждении опосредованной клетками реакции на NS3.
Таблица 14 | |||||
Идентификатор мыши | Иммуноген | Доза (мкг) | Опухолевая клеточная линия | Рост опухоли | Максимальный размер опухоли (мм) |
11 | NS34A-pVAX | 100 | SP2/0 | нет | - |
12 | NS3/4A-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 24 |
13 | NS3/4A-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 9 |
14 | NS3/4A-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 11 |
15 | NS3/4A-pVAX | 100 | SP2/0 | да | 25 |
4/5 | 17,25±8,421 | ||||
16 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | нет | - |
17 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | да | 9 |
18 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | да | 7 |
19 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | да | 5 |
20 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | да | 4 |
4/5 | 6,25±2,217 | ||||
Примечание: Статистический анализ (StatView): t-тест Стьюдента в отношении максимального размера опухоли. Значения р<0,05 рассматриваются как значимые. |
Непарный t-тест на максимальный диаметр
Группирующая переменная: Столбец 1
Гипотетическая разница = 0
Исключение строки: NS3DNA-Опухоль-001213
NS3/4-sp2, NS3/4-spNS3 | Средняя разница | DF | Значение t | Значение р |
11,000 | 6 | 2,526 | 0,044 |
Групповая информация для максимального диаметра
Группирующая переменная: Столбец 1
Исключение строки: NS3DNA-Опухоль-001213
Количество | Среднее | Вариация | Ср. кв. откл | Станд. ошибка | |
NS3/4-sp2 | 4 | 17,250 | 70,917 | 8,421 | 4,211 |
NS3/4-spNS3 | 4 | 6,250 | 4,917 | 2,217 | 1,109 |
ПРИМЕР 11
Чтобы проанализировать, влияет ли введение различных NS3-содержащих составов на вырабатывание опосредованной клетками иммунной реакции, мыши иммунизировались с помощью PBS, rNS3, нерелевантной DNA или конструкта NS3/4A, и определялись размеры опухолей, как описано выше. Только конструкт NS3/4A был способен вызвать Т-клеточную реакцию, достаточную для того, чтобы вызвать статистически значимое уменьшение размера опухоли. (См. Таблицу 15). Приведенный ниже пример описывает эксперименты, которые были выполнены, чтобы определить, может ли уменьшение размера опухоли объясняться вырабатыванием NS3-специфических Т-лимфоцитов.
Таблица 15 | ||||||||||||
Идентификатор мыши | Иммуноген | Доза (мкг) | Опухолевая клеточная линия | Анти-NS3 | Рост опухоли | Максимальный размер опухоли (мм) | ||||||
1 | NS3-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 12,0 | ||||||
2 | NS3-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 20,0 | ||||||
3 | NS3-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | 60 | + | 18,0 | ||||||
4 | NS3-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 13,0 | ||||||
5 | NS3-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 17,0 | ||||||
Среднее в группе | 60 | 5/5 | 16,0±3,391 | |||||||||
6 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | 2160 | + | 10,0 | ||||||
7 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | - | - | ||||||
8 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | - | - | ||||||
9 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | 360 | - | - | ||||||
10 | NS3-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 12,5 | ||||||
Среднее в группе | 1260 | 2/5 | 11,25±1,768 | |||||||||
11 | NS3/4A-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 10,0 | ||||||
12 | NS3/4A-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | - | - | ||||||
13 | NS3/4A-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | - | - | ||||||
14 | NS3/4A-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 13,0 | ||||||
15 | NS3/4A-pVAX | 10 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 13,5 | ||||||
Среднее в группе | <60 | 3/5 | 12,167±1,893 | |||||||||
16 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | 60 | + | 10,0 | ||||||
17 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | 360 | - | - | ||||||
18 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | 2160 | + | 8,0 | ||||||
19 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | 2160 | + | 12,0 | ||||||
20 | NS3/4A-pVAX | 100 | NS3/4A-SP2/0 | 2160 | + | 7,0 | ||||||
Среднее в группе | 1380 | 4/5 | 9,25±2,217 | |||||||||
36 | p17-pcDNA3 | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 20,0 | ||||||
37 | p17-pcDNA3 | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 7,0 | ||||||
38 | p17-pcDNA3 | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 11,0 | ||||||
39 | p17-pcDNA3 | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 15,0 | ||||||
40 | p17-pcDNA3 | 100 | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 18,0 | ||||||
Среднее в группе | <60 | 5/5 | 14,20±5,263 | |||||||||
41 | rNS3/CFA | 20 | NS3/4A-SP2/0 | >466560 | + | 13,0 | ||||||
42 | rNS3/CFA | 20 | NS3/4A-SP2/0 | >466560 | - | - | ||||||
43 | rNS3/CFA | 20 | NS3/4A-SP2/0 | >466560 | + | 3,5 | ||||||
44 | rNS3/CFA | 20 | NS3/4A-SP2/0 | >466560 | + | 22,0 | ||||||
45 | rNS3/CFA | 20 | NS3/4A-SP2/0 | >466560 | + | 17,0 | ||||||
Среднее в группе | 466560 | 4/5 | 17,333±4,509 | |||||||||
46 | PBS | - | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 10,0 | ||||||
47 | PBS | - | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 16,5 | ||||||
48 | PBS | - | NS3/4A-SP2/0 | 60 | + | 15,0 | ||||||
49 | PBS | - | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 21,0 | ||||||
50 | PBS | - | NS3/4A-SP2/0 | <60 | + | 15,0 | ||||||
51 | PBS | - | NS3/4A-SP2/0 | <60 | - | - | ||||||
Среднее в группе | 60 | 5/6 | 15,50±3,937 | |||||||||
Примечание: Статистический анализ (StatView): t-тест Стьюдента в отношении максимального размера опухоли. Значения р<0,05 рассматриваются как значимые. |
ПРИМЕР 12
Чтоб определить, вырабатывались ли NS3-специфические Т-клетки за счет иммунизации с помощью NS3/4A, использовался тест in vitro опосредованного Т-клетками лизиса опухолевых клеток. Этот тест был подробно описан ранее (Townsend et al., J. Virol. 71:3365 (1997)). Коротко говоря, группы по пять мышей Balb/c иммунизировались три раза внутримышечно с помощью 100 мкг NS3/4A-pVAX. Через две недели после последней инъекции мыши умерщвлялись, и собирались спленоциты. Были установлены рестимуляционные культуры с 3×106 спленоцитов и 3×106 клеток NS3/4A-SP2/0. Через пять дней был выполнен стандартный тест испускания Cr51 с помощью клеток NS3/4A-SP2/0 или SP2/0 в качестве мишеней. Специфический лизис был процентно рассчитан как соотношение лизиса клеток NS3/4A-SP2/0 и лизиса клеток SP2/0. Только мыши, иммунизированные с помощью NS3/4A-pVAX, проявили специфический лизис более 10% у четырех из пяти тестируемых мышей при соотношении 20:1 между эффектором и мишенью (см. фиг.5А и Б). Соответственно, мыши, иммунизированные с помощью NS3/4A, проявили уменьшение пролиферации раковых клеток, и/или NS3/4A вызывал лизис раковых клеток. Следующий раздел описывает несколько воплощенных полипептидов HCV более подробно.
Пептиды HCV
Нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды HCV, описанные в предыдущем разделе, могут быть преобразованы с помощью общепринятых в молекулярной биологии методов так, чтобы создать рекомбинантные конструкты, которые экспрессируют пептиды HCV. К воплощенным пептидам HCV и их производным относятся, не в порядке ограничения, пептиды и производные, содержащие в качестве первичной аминокислотной последовательности всю аминокислотную последовательность, практически как показано в листинге последовательностей (SEQ.ID.NO.:17, 29-32 и 43-49), и их фрагменты длиной по меньшей мере четыре аминокислоты (например, SEQ.ID.NO.:25-27 и 33-42), в том числе измененные последовательности, в которых функционально эквивалентные аминокислотные остатки замещают остатки в последовательности, что приводит к скрытым изменениям. Предпочтительные фрагменты последовательности из SEQ.ID.NO.:17, 29-32 и 43-49 содержат по меньшей мере четыре аминокислоты и содержат аминокислотную последовательность, уникальную для обнаруженного пептида NS3/4A (SEQ.ID.NO.:17), в том числе измененные последовательности, в которых функционально эквивалентные аминокислотные остатки замещают остатки в последовательности, что приводит к скрытым изменениям. Например, пептиды HCV могут быть длинной по меньшей мере 12-15, 15-20, 20-25, 25-50, 500-100, 100-150, 150-250, 250-500 или 500-704 аминокислоты. Прочие фрагменты (например, SEQ.ID.NO.:25-27 и 33-42) также являются аспектами изобретения.
Варианты выполнения изобретения содержат также пептиды HCV, которые практически идентичны описанным выше. То есть пептиды HCV, содержащие один или несколько аминокислотных остатков в SEQ.ID.NO.:17, и их фрагменты, замещенные другой аминокислотой подобной же полярности, действующей как функциональный эквивалент, что приводит к скрытому изменению. Заместители аминокислоты в последовательности могут выбираться из других членов класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают в себя аспартовую кислоту и глутаминовую кислоту. Ароматические аминокислоты включают в себя фенилаланин, триптофан и тирозин.
Пептиды HCV, описанные здесь, могут быть приготовлены посредством способов химического синтеза (таких как твердофазный пептидный синтез) с помощью известных из уровня техники методов, таких как описанные в Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:51:32 (1985), Stewart and Young (Solid Phase Peptide Sunthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984), и Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Principles, W.H.Freeman & Co., N.Y. Такие полипептиды могут синтезироваться с помощью метионина или без него на аминотерминале. Химически синтезированные пептиды HCV могут окисляться с помощью способов, описанных в названных источниках, формируя дисульфидные мосты.
Несмотря на то что описанные здесь пептиды HCV могут быть синтезированы химически, может быть более эффективным получать эти полипептиды путем технологии рекомбинантной DNA. Такие способы могут использоваться для конструирования экспрессионных векторов, содержащих, например, нуклеотидные последовательности HCV, описанные выше, и подходящих транскрипционных и трансляционных управляющих сигналов. К данным способам, например, относятся технологии in vitro рекомбинантной DNA, синтетические технологии и генетическая рекомбинация in vivo. Альтернативно, RNA, способная кодировать нуклеотидные последовательности HCV, может быть химически синтезирована с помощью, например, синтезаторов. См., к примеру, методы, описанные в Oligonucleotide Synthesis. 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford. Соответственно, некоторые выполнения относятся к клеточным линиям, которые были разработаны для экспрессирования выполненных пептидов HCV. Например, некоторые клетки выполнены для экспрессирования пептидов HCV из SEQ.ID.NO.:17, 29-32 и 43-49 или фрагментов этих молекул.
Множество систем векторов экспрессии в хозяине могут использоваться для экспрессирования воплощенных пептидов HCV. К подходящим экспрессионным системам относятся, не в порядке ограничения, такие микроорганизмы как бактерии (например, Е. coli или В. subtilis), преобразованные с помощью экспрессионных векторов рекомбинантной бактериофаговой DNA, плазмидной DNA или козмидной DNA, содержащих нуклеотидные последовательности HCV; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichid), преобразованные с помощью рекомбинантных дрожжевых экспрессионных векторов, содержащих нуклеотидные последовательности HCV; клеточные системы насекомых, инфицированные с помощью рекомбинантных вирусных экспрессионных векторов (например, бакуловирус), содержащих последовательности HCV; клеточные системы растений, инфицированные с помощью рекомбинантных вирусных экспрессионных векторов (например, мозаичный вирус цветной капусты, CaMV; мозаичный вирус табака, TMV) или преобразованные с помощью рекомбинантных плазмидных экспрессионных векторов (например, плазмид Т1), содержащих последовательности HCV; или клеточные системы млекопитающих (например, COS, СНО, ВНК, 293, 3Т3), несущие рекомбинантные экспрессионные конструкты, содержащие промоторы, выведенные из генома клеток млекопитающего (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих (например, аденовирусный поздний промотор; промотор 7.5К вируса коровьей оспы).
В бактериальных системах количество экспрессионных векторов может преимущественно выбираться в зависимости от предполагаемого использования экспрессируемого генного продукта HCV. Например, когда должно производиться большое количество такого белка, например, для приготовления фармацевтических составов пептида HCV или для поднятия уровня антител к пептиду HCV, могут быть желательны векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней фузионных белковых продуктов, которые уже очищены. К таким векторам относятся, не в порядке ограничения, экспрессионный вектор pUR278 E.coli (Ruther et al., EMBOJ., 2:1791 (1983)), в котором кодирующая последовательность HCV может быть индивидуально лигирована в вектор в кадре с кодирующим участком lacZ так, чтобы получался фузионный белок; векторы pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acid Res., 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509 (1989)) и тому подобное. Векторы pGEX также могут использоваться для экспрессирования чуждых полипептидов в виде фузионных белков с помощью S-трансферазы (GST). В общем случае такие фузионные белки растворимы и могут быть очищены из лизированных клеток с помощью адсорбции на глутатион-агарозных шариках с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы PGEX разработаны так, что содержат тромбин или сайты расщепления протеазы фактора Ха, чтобы клонированный целевой генный продукт мог быть высвобожден из доли GST.
В системе насекомого используется вирус ядерного полигедроза Autographa californica (AcNPV) в качестве вектора для экспрессирования чуждых генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность HCV может быть клонирована индивидуально в необязательные участки (например, ген полигедрина) вируса и размещается под управлением промотора AcNPV (например, полигедринового промотора). Успешное вставление кодирующей последовательности гена HCV даст в результате дезактивацию гена полигедрина и получение непокрытого рекомбинантного вируса (то есть вируса, у которого отсутствует белковая оболочка, кодируемая геном полигедрина). Эти рекомбинантные вирусы затем используются для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda, в которых экспрессируется вставленный ген (См., например, Smith et al., J. Virol. 46:584 (1983); и Smith, патент США №4215051).
В клетках хозяина-млекопитающего могут использоваться многие экспрессионные системы на основе вирусов. В тех случаях, когда в качестве экспрессионного вектора используется аденовирус, интересующая нуклеотидная последовательность HCV может быть лигирована с аденовирусным транскрипционным/трансляционным управляющим комплексом, например поздним промотором и трехчастной лидирующей последовательностью. Затем этот химерический ген может быть вставлен в геном аденовируса путем рекомбинации in vitro или in vivo. Вставление в необязательный участок вирусного генома (например, участок Е1 или Е3) приведет к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать генный продукт HCV в инфицированных хозяевах. (См., например, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3655-3659 (1984)). Специфические инициализирующие сигналы также могут быть необходимы для эффективной трансляции вставленных нуклеотидных последовательностей HCV. Эти сигналы содержат инициализирующий кодон ATG и смежные последовательности.
Однако в случаях, когда вставляется только часть кодирующей последовательности HCV, могут предусматриваться экзогенные трансляционные управляющие сигналы, содержащие, разумеется, инициализирующий кодон ATG. Более того, инициализирующий кодон может быть в фазе с кадром считывания желательной кодирующей последовательности для обеспечения трансляции всей вставки. Эти экзогенные трансляционные управляющие сигналы и инициализационные кодоны могут иметь разную природу, как естественную, так и синтетическую. Эффективность экспрессии может быть усилена путем вставления подходящих улучшающих транскрипцию элементов, прерывателей транскрипции и т.д. (См. Bittner et al., Methods in Enzymol., 153:516-544 (1987)).
Вдобавок к этому, может выбираться штамм клеток хозяина, который модулирует экспрессию вставляемых последовательностей или модифицирует и обрабатывает генный продукт специфическим желательным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов важны для функции белка. Различные клетки хозяина имеют отличительные и специфические механизмы для послетрансляционной обработки и модифицирования белков и генных продуктов. Могут выбираться подходящие клеточные линии или системы хозяина для обеспечения правильной модификации и обработки экспрессированного чуждого белка. С этой точки зрения могут использоваться эукариотические клетки хозяина, обладающие клеточными механизмами для правильной обработки первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. К таким клеткам хозяина-млекопитающего относятся, не в порядке ограничения, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3Т3 и WI38.
Для долговременного высокопродуктивного производства рекомбинантных белков предпочтительна стабильная экспрессия. Например, могут быть разработаны клеточные линии, которые стабильно экспрессируют пептиды HCV, описанные выше. Вместо использования экспрессионных векторов, содержащих вирусный источник репликации, клетки хозяина могут быть преобразованы с помощью DNA, управляемой подходящими элементами управления экспрессией (например, последовательностями промотора, амплификатора, прерывателями транскрипции, сайтами полиадениляции и т.д.), и выбираемого маркера. После введения чуждой DNA сконструированным клеткам позволяют расти 1-2 дня в обогащенной среде, а затем их переводят в селективную среду. Выбираемый маркер в рекомбинантном плазмиде оказывает сопротивление выбору и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмид в свои хромосомы и расти, формируя очаги, которые, в свою очередь, клонируются и вставляются в клеточные линии. Этот способ преимущественно используется для конструирования клеточных линий, которые экспрессируют генный продукт HCV.
Может использоваться множество систем выбора, в том числе, не в порядке ограничения, гены тимидин-киназы вируса простого герпеса (Wigler, et al., Cell 11:223 (1977), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962), и аденин фосфорибозилтрансферазы (Lowy, et al., Cell 22:817 (1980) могут использоваться в клетках tk-, ngpr- или aprt-, соответственно. Также может использоваться антиметаболитная сопротивляемость в качестве основы выбора для следующих генов: dhfr, который оказывает сопротивление метотрексату (Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, который оказывает сопротивление микофеноловой кислоте (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, который оказывает сопротивление аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin, et al., Gene 30:147 (1984)).
Альтернативно, любой фузионный белок может быть легко очищен посредством использования антитела, специфического для экспрессируемого фузионного белка. Например, система, описанная у Janknecht et al., позволяет очищать неденатурированные фузионные белки, экспрессированные в человеческих клеточных линиях (Janknecht, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976 (1991)). В этой системе интересующий ген субклонируется в рекомбинационный плазмид вируса коровьей оспы так, чтобы открытый кадр считывания гена трансляционно сращивался с амино-терминальным участком, состоящим из шести гистидиновых остатков. Экстракты из клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом коровьей оспы, загружаются в Ni2+ нитрилоуксусные кислотно-агарозные колонны, и гистидиново-помеченные белки выборочно элюируются с помощью имидазолсодержащих буферов. Приводимый ниже пример описывает способ, который был использован для экспрессирования пептидов HCV, закодированных с помощью воплощенных нуклеиновых кислот.
ПРИМЕР 13
Для характеризации фузионного белка NS3/4A и его усеченных и мутантных версий векторные конструкты, описанные в Примере 6, были транскрибированы и транслированы in vitro, и полученные полипептиды были визуализированы посредством натриевого додецилсульфат-полиакриламидного гелевого электрофореза (SDS-PAGE). Транскрипция и трансляция in vitro выполнялись с помощью связанной ретикулоцитной лизатной системы Т7 (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкциями производителя. Все реакции трансляции in vitro экспрессионных конструктов выполнялись при 30°С с помощью маркированного 35S метионина (Amersham International, Pic, Buckinghamshire, UK). Маркированные белки были сепарированы на 12% гелях SDS-PAGE и визуализированы посредством экспонирования на рентгеновскую пленку (Hyper Film-MP, Amersham) в течение 6-18 часов.
Анализ in vitro показал, что все белки были экспрессированы в больших количествах из соответствующих экспрессионных конструктов. Конструкт rNS3 (вектор NS3-pVAX) дал один пептид на приблизительно 61 кДа, в то время как конструкт ТРТ (NS3/4A-TPT-pVAX) и конструкт RGT (NS3/4A-RGT-pVAX) дали один полипептид на приблизительно 67 кДа, что идентично молекулярному весу нерасщепленного пептида NS3/4A, полученного из конструкта NS3/4A-pVAX. Расщепленный продукт, полученный из экспрессированного пептида NS3/4A, имел вес приблизительно 61 кДа, что идентично по размеру rNS3, полученному из вектора NS3-pVAX. Эти результаты демонстрируют, что экспрессионные конструкты были функциональны, конструкт NS3/4A был ферментно активным, rNS3 давал пептид предсказанного размера, а мутации ТРТ и RGT полностью отменяли расщепление связки NS3-NS4A.
Последовательности, конструкты, векторы, клоны и прочие материалы, содержащие выполненные нуклеиновые кислоты и пептиды HCV, могут находится в обогащенной или изолированной форме. Используемый здесь термин "обогащенный" означает, что концентрация материала по меньшей мере в 2, 5, 10, 100 или 1000 раз больше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01% по весу, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,1% по весу. Обогащенные препараты от приблизительно 0,5%, 1%, 5%, 10% и 20% по весу также предусматриваются. Термин "изолированный" указывает, что материал удален из своей исходной среды (например, естественной среды, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид, присутствующий в живом животном, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих с ним в естественной системе материалов, является изолированным. Также предпочтительно, чтобы последовательности были в очищенном виде. Термин "очищенный" не требует абсолютной чистоты; скорее это относительное определение.
Изолированные белки общепринято очищались до электрофоретической гомогенности, например, с помощью окрашивания Кумасси. Явно подразумевается очистка исходного материала или природного материала по меньшей мере на один порядок, предпочтительно на два или три порядка, и более предпочтительно - на четыре или пять порядков.
Описанные здесь генные продукты HCV также могут экспрессироваться в растениях, насекомых и животных, чтобы создать трансгенный организм. К желательным трансгенным растительным системам, содержащим пептид HCV, относятся Arabadopsis, кукуруза и Chlamydomonas. К желательным системам насекомых, содержащим пептид HCV, относятся, не в порядке ограничения, D. melanogaster и С.elegans. Животные любого вида, в том числе, не а порядке ограничения, земноводные, рептилии, птицы, мыши, хомяки, крысы, кролики, морские свинки, свиньи, микросвиньи, козы, собаки, кошки и нечелевекообразные обезьяны, например бабуины, мартышки и шимпанзе, могут использоваться для вырабатывания трансгенных животных, содержащих воплощенную молекулу HCV. Эти трансгенные организмы желательно проявляют перенос зародышевой линии описанных здесь пептидов HCV.
Любой известной из уровня техники метод предпочтительно используется для введения трансгена HCV в животных для получения линий трансгенных животных или для удаления или замены существующих генов HCV. К таким методам относятся, не в порядке ограничения, проядерная микроинъекция (Норре, Р.С. and Wagner, Т.Е., 1989, патент США №4873191); опосредованный ретровирусом генный перенос в микробные линии (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152 (1985); генный таргетинг в эмбриональных стволовых клетках (Thompson et al., Cell. 56:313-321 (1989); электропорация эмбриона (Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983); и генный перенос через сперму (Lavitrano et al., Cell 57:717-723 (1989); см. также Gordon, Transgenic animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229 (1989). Следующий раздел описывает производство антител, которые взаимодействуют с описанными здесь пептидами HCV.
Антитела к HCV
После синтеза или экспрессии и изоляции или очистки пептидов HCV изолированный или очищенный пептид может использоваться для вырабатывания антител. В зависимости от контекста термин "антитела" может охватывать поликлональные, моноклональные, химерические, одноцепочечные антитела, фрагменты Fab и фрагменты, выработанные экспрессионной библиотекой Fab. Антитела, опознающие пептиды HCV, имеют много вариантов использования, в том числе, не в порядке ограничения, биотехнологические применения, терапевтические/профилактические применения и диагностические применения.
Для получения антител различные хозяева, в том числе, козы, кролики, крысы, мыши и люди и т.д., могут иммунизироваться путем инъекции пептида HCV. В зависимости от вида хозяина могут использоваться различные адъюванты для увеличения иммунологической реакции. К таким адъювантам относятся, не в порядке ограничения, рибавирин, адъювант Фройнда, такие минеральные гели как гидроксид алюминия, и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиоли, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, <keyhole limpet> гемоцианин и динитрофенол. Потенциально полезными адъювантами являются также BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum.
Пептиды, используемые для возбуждения специфических антител, могут иметь аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из четырех аминокислот, а предпочтительно - по меньшей мере из 10-15 аминокислот. В соответствии с одним из подходов, короткие отрезки аминокислотных кодирующих фрагментов NS3/4A сращиваются с фрагментами другого белка, такого как <keyhole limpet> гемоцианин, так, чтобы вырабатывалось антитело к химерической молекуле. Дополнительно, состав, содержащий рибавирин и NS3/4A (SEQ.ID.NO.:17), ее фрагмент длиной по меньшей мере 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 аминокислот, или нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько из этих молекул, вводится животному. Хотя антитела, способные специфически распознавать HCV, могут быть выработаны путем инъекции в мышей синтетических 3-мерных, 10-мерных и 15-мерных пептидов, которые соответствуют пептиду HCV, более разнообразное множество антител может быть выработано с помощью рекомбинантных пептидов HCV, приготовленных, как описано выше.
Для вырабатывания антител к пептиду HCV практически чистый пептид изолируется из трансфецированной или преобразованной клетки. Концентрация пептида в конечном препарате регулируется, например, путем концентрирования на фильтерном устройстве Amicon, до уровня нескольких микрограммов/мл. Моноклональное или поликлональное антитело к интересующему пептиду затем может быть получено следующим образом.
Моноклональные антитела к пептиду HCV могут быть получены с помощью любого метода, обеспечивающего получение молекул антитела непрерывными клеточными линиями в культуре. К ним относятся, не в порядке ограничения, гибридомный метод, впервые описанный в Koehler и Milstein (Nature 256:495-497 (1975), гибридомный метод человеческих В-клеток (Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030 (1983), и EBV-гибридомный метод Cote et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss Inc, New York N.Y., pp.77-96 (1985). Вдобавок, могут быть использованы методы, разработанные для получения "химерических антител", сплайсинг генов мышиного антитела в гены человеческого антитела для получения молекулы с подходящей антигенной специфичностью и биологической активностью. (Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al. Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al. Nature 314:452-454 (1985). Альтернативно, методы, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США №4946778), могут быть адаптированы для получения HCV-специфических одноцепочечных антител. Антитела также могут быть получены путем возбуждения производства in vivo в популяции лимфоцитов или путем скрининга рекомбинантных иммуноглобулиновых библиотек или панелей сильно специфических связывающих реагентов, как раскрыто a Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837 (1989), и Winter G. and Milstein C., Nature 349:293-299 (1991).
Могут также вырабатываться фрагменты антитела, содержащие специфические сайты связывания для пептида HCV. Например, к таким фрагментам относятся, не в порядке ограничения, фрагменты F(ab')2, которые могут быть получены путем поглощения пепсином молекулы антитела, и фрагменты Fab, которые могут быть выработаны путем восстановления дисульфидных мостов фрагментов F(ab')2. Альтернативно, могут конструироваться экспрессионные библиотеки Fab, чтобы обеспечить быструю и простую идентификацию моноклональных фрагментов Fab с желательной специфичностью. (Huse W.D. et al., Science 256:1275-1281 (1989)).
В соответствии с одним из подходов, моноклональные антитела к пептиду HCV получаются следующим образом. Коротко говоря, мышь многократно в течение нескольких недель инокулируется с помощью нескольких микрограммов избранного белка или пептидов, производных от него. Затем мышь умерщвляется, а производящие антитела клетки селезенки изолируются. Клетки селезенки сращиваются в присутствии полиэтиленгликоля с мышиными миеломными клетками, и избыточные несращенные клетки разрушаются за счет роста системы на селективной среде, содержащей аминоптерин (среда HAT). Успешно сращенные клетки разбавляются, и аликвотные количества разбавления размещаются в ячейках пластины микротитра, где рост культуры продолжается. Производящие антитела клоны идентифицируются путем обнаружения антител во всплывшей жидкости ячеек с помощью таких иммунотестовых процедур как ELISA, как первоначально описано в Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980), и производных от него способов. Избранные положительные клоны могут расширяться, а их моноклональный антительный продукт собирается для использования. Подробно процедуры получения моноклональных антител описаны в Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2.
Поликлональные антитела, содержащие антисыворотку к гетерогенным эпитопам одного белка, могут быть приготовлены посредством иммунизации подходящих животных с помощью экспрессированного белка или производных от него пептидов, описанных выше, которые могут быть немодифицированными или модифицированными, для увеличения иммуногенности. Эффективное получение поликлонального антитела зависит от многих факторов, относящихся как к антигену, так и к виду хозяина. Например, малые молекулы обычно являются менее иммуногенными, чем прочие, и могут потребовать использования носителей или адъюванта. Животные-хозяева также различаются по реакции на место инокуляции и дозу, при этом и неадекватные, и избыточные дозы антигена приводят к антисывороткам с низким титром. Малые дозы (уровень ng) антигена, введенные в нескольких внутрикожных местах, представляются наиболее надежными. Эффективный протокол иммунизации для кроликов можно найти в Vaitukaitis, J. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971).
Усиливающие инъекции вводятся с равными промежутками, и антисыворотка собирается, когда ее антительный титр, определенный по половине количества, например, путем двойной иммунодиффузии в агаре, начинает падать по отношению к известным концентрациям антигена. См., например, Ouchterlony, О. et al., Chap.19 в Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed.) Blackwell (1973). Концентрация антител на пластине обычно находится в диапазоне от 0,1 до 0,2 мг/мл сыворотки (приблизительно 12 мкмоль). Сродство антисывороток для антигена определяется путем построения конкурирующих кривых связывания, как, например, описано в Fisher, D., Chap.42 в Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedamn, eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980). Антительные препараты, приготовленные в соответствии с любым из этих протоколов, полезны в количественных иммунных тестах, которые определяют концентрации антиген-содержащих веществ в биологических образцах; они используются также полуколичественно или качественно (например, в диагностических вариантах выполнения, которые идентифицируют наличие HCV в биологических образцах). Следующий раздел описывает некоторые из диагностических вариантов выполнения более подробно.
Диагностические выполнения
В общем случае выполненные диагностики классифицируются по тому, используется ли тест, основанный на нуклеиновой кислоте или на белке. Некоторые диагностические тесты определяют присутствие или отсутствие воплощенной последовательности нуклеиновой кислоты HCV в образце, полученном у пациента, в то время как другие тесты пытаются идентифицировать присутствие воплощенного пептида HCV в биологическом образце, полученном у пациента. Дополнительно выполняется производство наборов, содержащих описанные здесь реагенты и способы, обеспечивающих быстрое обнаружение и идентификацию HCV. Эти диагностические наборы могут содержать, к примеру, зонд воплощенной нуклеиновой кислоты или антитело, которое специфически обнаруживает HCV. Обнаруживающий компонент этих наборов обычно будет поставляться в комбинации с одним или несколькими из следующих реагентов. Часто будет поставляться основа, способная абсорбировать или иным способом связывать DNA, RNA или белок. К доступным основам относятся мембраны из нитроцеллюлозы, нейлона или производных нейлона, которые отличаются тем, что несут массив положительно заряженных заместителей. С этими наборами может поставляться один или несколько рестриктирующих ферментов, управляющих реагентов, буферов, усиливающих ферментов и не-человеческих полинуклеотидов, таких как DNA телячьего тимуса или DNA спермы лосося.
К полезным диагностикам, основанным на нуклеиновых кислотах, относятся, не в порядке ограничения, прямое определение последовательности DNA, саузерн-блоттинг, точечный блоттинг, амплификация нуклеиновой кислоты и комбинации этих подходов. Начальной точкой этих анализов является изолированная или очищенная нуклеиновая кислота из биологического образца, полученного у пациента, подозреваемого в заражении HCV, или у пациента с риском заражения HCV. Нуклеиновая кислота экстрагируется из образца и может быть амплифицирована путем RT-PCR и/или амплификации DNA с помощью праймеров, соответствующих участкам, находящимся по бокам воплощенных последовательностей нуклеиновой кислоты HCV (например, NS3/4A (SEQ.ID.NO.:16)).
В некоторых вариантах выполнения зонды нуклеиновых кислот, которые специфически гибридизируются с последовательностями HCV, прилагаются к основе в упорядоченном массиве, причем зонды нуклеиновых кислот прилагаются к отдельным участкам основы, которые не перекрываются друг с другом. Предпочтительно, такой упорядоченный массив конструируется для того, чтобы быть "адресуемым", когда отдельные расположения зонда записываются, и к ним можно осуществить доступ в ходе процедуры анализа. Эти зонды соединены с основой в различных известных местах. Знание точного расположения каждого нуклеиново-кислотного зонда делает такие "адресуемые" массивы полезными, в частности в тестах на связывание. Нуклеиновые кислоты из препарата нескольких биологических образцов маркируются с использованием общепринятых подходов (например, радиоактивности или флюоресценции), и маркированные образцы применяются к массиву при условиях, позволяющих гибридизацию.
Если нуклеиновая кислота в образцах гибридизируется с зондом в массиве, то будет зафиксирован сигнал в том месте на основе, которое соответствует положению гибрида. Поскольку известен каждый маркированный образец и известен участок на основе, на который был нанесен маркированный образец, быстро выполняется идентификация наличия полиморфного варианта. Эти подходы легко автоматизируются с помощью технологии, известной специалистам в области высокопроизводительной диагностики или обнаруживающего анализа.
Дополнительно может использоваться подход, противоположный представленному выше. Нуклеиновые кислоты, присутствующие в биологических образцах, могут размещаться на основе так, чтобы создавать адресуемый массив. Предпочтительно образцы размещаются на основе в известных местах, которые не перекрываются. Наличие нуклеиновых кислот HCV в каждом образце определяется путем нанесения маркированных нуклеиново-кислотных зондов, комплементарных для нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды HCV, в тех местах массива, которые соответствуют положениям, в которых были расположены биологические образцы. Поскольку биологические образцы и их положения на массиве известны, можно быстро идентифицировать пациента, инфицированного HCV. Эти подходы также легко автоматизируются с помощью технологии, известной специалистам в области высокопроизводительного диагностического анализа.
Можно использовать любую технологию адресуемого массива, известную из уровня техники. Одно частное выполнение полинуклеотидных массивов известно как Genechips™ и в целом описано в патенте США №5143854, публикациях РСТ WO 90/15070 и 92/10092. Эти массивы в целом получаются с помощью механических способов синтеза или светонаправленных способов синтеза, которые включают в себя комбинацию фотолитографических способов и твердофазный олигонуклеотидный синтез (Fodor et al., Science, 251:767-777, (1991)). Иммобилизация массивов олигонуклеотидов на твердых основах стало возможным посредством разработки технологии, известной в целом как "Синтез иммобилизированных полимеров в очень больших масштабах" (VLSPIS™), в которой обычно зонды иммобилизируются в массиве с высокой плотностью на твердой поверхности тонкой пластинки. Примеры технологии VLSPIStm приведены в патентах США №5143854 и 5412087 и в публикациях РСТ WO 90/15070, WO 92/10092 и WO 95/11995, которые описывают способы формирования олигонуклеотидных массивов посредством таких методов как методы светонаправленного синтеза. В стратегиях разработки, направленных на обеспечение массивов нуклеотидов, иммобилизированных на твердых основах, были разработаны дополнительные стратегии представления для упорядочивания и отображения олигонуклеотидных массивов на тонких пластинках в попытке максимизировать образцы гибридизации и диагностическую информацию. Примеры таких стратегий представления раскрыты в публикациях РСТ WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 и WO 97/31256.
Большое множество маркеров и методов конъюгирования известно специалистам и может использоваться в различных нуклеиново-кислотных анализах. Существует несколько способов получения маркированных нуклеиновых кислот для гибридизации или PCR, в том числе, не в порядке ограничения, олигомаркирование, трансляция метки, концевое маркирование или PCR-амплифицирования с помощью маркированного нуклеотида. Альтернативно нуклеиновая кислота, кодирующая пептид HCV, может быть клонирована в вектор для получения зонда mRNA. Такие векторы известны из уровня техники, коммерчески доступны и могут использоваться для синтеза зондов RNA in vitro путем добавления подходящей RNA-полимеразы, такой как Т7, Т3 или SP6, и маркированных олигонуклеотидов. Некоторые компании, такие как Pharmacia Biotech (Piscataway, N.J.), Promega (Madison, Wis) и U.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio), поставляют коммерческие наборы и протоколы для этих процедур. К подходящим репортерным молекулам или маркерам относятся радионуклиды, ферменты, флюоресцентные, хемифлюоресцентные или хромогенные агенты, а также подложки, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и тому подобное.
Наличие пептида HCV в белковом образце, полученном у пациента, также может быть обнаружено с помощью общепринятых тестов и описанных здесь вариантов выполнения. Например, антитела, являющиеся иммунореактивными с раскрытыми пептидами HCV, могут быть использованы для скрининга биологических образцов на наличие инфекции HCV. В предпочтительных вариантах выполнения антитела, реактивные по отношению к воплощенным пептидам HCV, используются для иммуноосаждения раскрытых пептидов HCV из биологических образцов, либо используются для реагирования с белками, полученными из биологического образца при вестерн-блоттинге или иммуноблоттинге. К предпочтительным диагностическим вариантам выполнения относятся также твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунные анализы (RIA), иммунорадиометрические анализы (IRMA) и иммуноферментные анализы (IEMA), в том числе сэндвич-анализы с помощью моноклональных и/или поликлоналых антител, специфических для раскрытых пептидов HCV. Примеры сэндвич-анализов описаны у David et al., в патентах США №№4376110 и 4486530. Прочие выполнения используют аспекты технологии иммунной полоски, раскрытой в патентах США №№5290678, 5604105, 5710008, 5744358 и 5747274.
В еще одной основанной на белке диагностике описанные здесь антитела соединяются с основой в виде упорядоченного массива, в котором множество антител прикрепляется к отдельным участкам основы, которые не перекрываются друг с другом. Как и в основанных на нуклеиновой кислоте массивах, основанные на белке массивы являются упорядоченными массивами, разработанными так, чтобы быть они были "адресуемыми" так, чтобы отдельные расположения записывались и к ним можно было осуществлять доступ в ходе процедуры анализа. Эти зонды соединяются с основой в различных известных местах. Знание точного расположения каждого зонда делает эти "адресуемые" массивы полезными, в частности, в тестах на связывание. Например, адресуемый массив может содержать основу, имеющую несколько участков, с которыми соединены множество антительных зондов, которые специфически распознают пептиды HCV, присутствующие в биологическом образце, и дифференцируют изотип идентифицированного HCV.
В соответствии с одним из подходов, белки получаются из биологических образцов и затем маркируются с помощью общепринятых подходов (например, радиоактивно, колориметрически или флюоресцентно). Маркированные образцы затем наносятся на массив при условиях, обеспечивающих связывание. Если белок в образце связывается с антительным зондом в массиве, то будет зафиксирован сигнал в том месте основы, которое соответствует положению комплекса антитело-белок. Поскольку известен каждый маркированный образец, и известен участок основы, на который был нанесен маркированный образец, можно быстро определять наличие, концентрацию и/или уровень экспрессии. То есть с помощью маркированных стандартов известной концентрации пептида HCV исследователь может точно определить концентрацию белка конкретного пептида в тестируемом образце, а также может изучить уровень экспрессии пептида HCV. Общепринятые в денситометрии способы также могут использоваться для более точного определения концентрации или уровня экспрессии пептида HCV. Эти подходы легко автоматизируются с помощью технологии, известной специалистам в области высокопроизводительного диагностического анализа.
В еще одном варианте выполнения может использоваться подход, обратный представленному выше. Белки, присутствующие в биологических образцах, могут быть размещены на основе, чтобы создать адресуемый массив. Предпочтительно белковые образцы располагаются на основе в известных местах, которые не перекрываются. Наличие пептида HCV в каждом образце затем определяется путем нанесения маркированных антительных зондов, которые распознают эпитопы, специфические для пептида HCV. Поскольку биологический образец и его положение в массиве известны, идентификация наличия, концентрации и/или уровня экспрессии пептида HCV может быть проведена быстро.
Таким образом, с помощью маркированных стандартов известной концентрации пептида HCV исследователь может точно определить концентрацию пептида в образце, а из этой информации может изучить уровень экспрессии пептида. Общепринятые в денситометрии способы также могут использоваться для более точного определения концентрации или уровня экспрессии пептида HCV. Эти подходы легко автоматизируются с помощью технологии, известной специалистам в области высокопроизводительного диагностического анализа. Как подробно описано выше, может использоваться любая технология адресуемого массива, известная из уровня техники. Следующий раздел описывает некоторые составы, которые могут содержать один или несколько воплощенных нуклеиновых кислот HCV или пептидов HCV.
Составы, содержащие воплощенные нуклеиновые кислоты или пептиды HCV
Некоторые варианты выполнения содержат по меньшей мере одну из нуклеиновых кислот или один из пептидов HCV, соединенный с основой. Предпочтительно эти основы производятся так, чтобы создавать многомерный агент. Эти многомерные агенты обеспечивают пептид HCV или нуклеиновую кислоту HCV в таком виде или таким способом, чтобы достигалось достаточное сродство с молекулой. Многомерный агент, содержащий нуклеиновую кислоту или пептид HCV, может быть получен путем соединения желательной молекулы с макромолекулярной основой. "Основой" может называться носитель, белок, смола, клеточная мембрана или любая макромолекулярная структура, используемая для соединения или иммобилизации таких молекул. К твердым основам относятся, не в порядке ограничения, стенки ячеек реакционного лотка, тестовые трубки, полистиреновые шарики, магнитные шарики, полоски нитроцеллюлозы, мембраны, такие микрочастицы как латексные частицы, животные клетки, Duracyte®, искусственные клетки и прочее. Нуклеиновая кислота или пептид HCV может также соединяться с неорганическими носителями, такими как кремниево-оксидный материал (например, силикагель, цеолит, диатомовая земля или аминированное стекло), с помощью, например, ковалентной связи через гидрокси-, карбокси- или аминогруппу и реактивную группу на носителе.
В некоторых многомерных агентах макромолекулярная основа имеет гидрофобную поверхность, которая взаимодействует с частью нуклеиновой кислоты или пептида HCV за счет гидрофобного нековалентного взаимодействия. В некоторых случаях гидрофобная поверхность основы является таким полимером, как пластик или любой другой полимер, у которого гидрофобные группы связаны, такой как полистирен, полиэтилен или поливинил. Дополнительно нуклеиновая кислота или пептид HCV может быть ковалентно связан с носителями, в том числе белками и олиго/полисахаридами (например, целлюлозой, крахмалом, гликогеном, хитозаном или аминированной сефарозой). В этих последних многомерных агентах такая реактивная группа на молекуле как гидрокси- или аминогруппа, используется для соединения с реактивной группой на носителе, чтобы создавать ковалентную связь. Дополнительные многомерные агенты содержат основу, которая содержит прочие реактивные группы, которые химически активируются так, чтобы прикреплять нуклеиновую кислоту или пептид HCV. Например, используются цианогенбромидактивируемые матрицы, эпоксиактивируемые матрицы, тио- и тиопропиловые гели, нитрофенил хлорформатные и N-гидроксисукцинимидхлорформатные связи или оксиранакриловые основы (Sigma).
Носители для использования в организме (то есть для профилактических или терапевтических применений) желательно являются физиологическими, нетоксичными и, предпочтительно, неиммунореакционными. К подходящим носителям для использования в организме относятся поли-L-лизин, поли-D,L-аланин, липосомы и Chromosorb® (Johns-Manville Products, Denver, Co.). Конъюгированный с лигандом Chromosorb® (Synsorb-Pk) был протестирован на людях на предмет предотвращения гемолитическо-уремического синдрома, и сообщалось, что он не вызывает обратных реакций (Armstrong et al. J. Infectious Diseases 171:1042-1045 (1995)). В некоторых вариантах выполнения вводился "пустой" носитель (то есть носитель без прикрепленных нуклеиновой кислоты или пептида HCV), который имеет способность прикреплять нуклеиновую кислоту или пептид HCV в организме. В соответствии с этим подходом предусматривается терапия "пропрепаратного типа", при которой пустой носитель вводится отдельно от нуклеиновой кислоты или пептида HCV и, когда оба компонента находятся в организме, носитель и нуклеиновая кислота или пептид HCV собираются в многомерный комплекс.
Также подразумевается вставка линкеров, таких как линкеры (например, "λ-линкеры", разработанные так, чтобы они напоминали гибкие участки λ-фага) подходящей длины, между нуклеиновой кислотой или пептидом HCV и основой, чтобы получить большую гибкость пептида HCV, гибрида или партнера по связыванию и, тем самым, преодолеть все пространственные препятствия, которые может вызывать основа. Определение подходящей длины линкера, которая обеспечивает оптимальную клеточную реакцию или ее отсутствие, может выполняться путем скрининга нуклеиновой кислоты или пептида HCV с различными линкерами в тестах, подробно описанных в настоящем раскрытии.
Также предусматривается композитная основа, содержащая более одного типа нуклеиновой кислоты или пептида HCV. "Композитной основой" может быть носитель, смола или любая макромолекулярная структура, используемая для прикрепления или иммобилизации двух или более различных нуклеиновых кислот или пептидов HCV. Как описано выше, подразумевается также вставка линкеров, таких как λ-линкеры, подходящей длины между нуклеиновой кислотой или пептидом HCV и основой, чтобы получить большую гибкость пептида HCV, гибрида или партнера по связыванию и, тем самым, преодолеть все пространственные препятствия, которые могут возникнуть. Определение подходящей длины линкера, которая обеспечивает оптимальную клеточную реакцию или ее отсутствие, может выполняться путем скрининга нуклеиновой кислоты или пептида HCV с различными линкерами в тестах, подробно описанных в настоящем раскрытии. В других вариантах выполнения обсуждавшиеся выше многомерные и композитные основы могут содержать прикрепленные многомеризованные нуклеиновые кислоты или пептиды ВГС, чтобы создавать "многомеризованно-многомерную основу" и "многомеризованно-композитную основу" соответственно. Многомеризованный лиганд может, к примеру, быть получен путем соединения двух или более нуклеиновых кислот или пептидов HCV в тандем с помощью общепринятых в молекулярной биологии методов. Многомеризованная форма нуклеиновой кислоты или пептида HCV может иметь преимущества во многих приложениях за счет способности получать, например, более высокое сродство. Внедрение линкеров или спейсеров, таких как гибкие λ-линкеры, между отдельными доменами, составляющими многомеризованный агент, также может иметь преимущества в некоторых вариантах выполнения. Вставление λ-линкеров подходящей длины между доменами связывания белка, например, может обусловить большую гибкость и ограничить пространственные препятствия, представляемые основой. Определение подходящей длины линкера может производиться путем скрининга нуклеиновых кислот или пептидов HCV в тестах, подробно описанных в данном раскрытии.
Варианты выполнения изобретения также включают в себя генетические вакцины, как описано выше. Эти составы предпочтительно содержат рибавирин и нуклеиновую кислоту, кодирующую NS3/4A (SEQ.ID.NO.:17), NS3 (SEQ.ID.NO.:29) или мутант (например, SEQ.ID.NO.:30-32 и 43-49) или его фрагмент (например, SEQ.ID.NO.:25-27 и 33-42). Следующий пример описывает приготовление генетической вакцины, пригодной для использования на людях.
ПРИМЕР 14
Экспрессионный плазмид HCV разрабатывается для экспрессирования пептида NS3/4A. Кодирующая NS3/4A последовательность NS3/4A-pVAX удаляется путем поглощения с помощью EcoRI и XbaI, и изолированный фрагмент вставляется в плазмид А так, чтобы он находился под транскрипционным управлением промотора CMV и усиливающего элемента RSV (См. патент США №6235888, выданный Pachuk et al.). Плазмидная основа А имеет длину 3969 пар оснований; она содержит PBR-источник репликации для репликации в Е. coli и ген сопротивления канамицину. Такие вставки, как NS3/4A, клонируются в полилинкерный участок, который помещает вставку между промотором и сигналом полиадениляции и связывается с ними. Транскрипция клонированных вставок находится под управлением промотора CMV и усиливающего элемента RSV. Сигнал полиадениляции обеспечивается наличием сигнала SV40 поли А, расположенного всего 3' от сайта клонирования. Содержащий NS3/4A вакцинный состав затем получается смешиванием 500 мкг конструкта NS3/4A с 1 мг рибавирина.
Упомянутый вакцинный состав может использоваться для повышения антител у млекопитающего (например, мышей или кроликов) или может быть инъецирован внутримышечно человеку, хронически инфицированному вирусом HCV. Реципиент предпочтительно получает также три усиливающих иммунизации из этой смеси с интервалами в 4 недели. За счет третьего усиления титр антитела, специфического для HCV, будет значительно увеличен. Дополнительно в это время упомянутый субъект будет испытывать усиленную антительную и опосредованную Т-клетками иммунную реакцию на NS3, что подтверждается увеличенной долей NS3-специфических антител по данным EIA и уменьшением вирусной нагрузки по данным RT-PCR.
К вариантам выполнения относятся также фузионные белки NS3/4A или нуклеиновые кислоты, кодирующие эти молекулы. Например, получение и очищение рекомбинантного белка может облегчаться добавлением вспомогательных аминокислот для формирования "метки". К таким "меткам" относятся, не в порядке ограничения, His-6, Flag, Мус и GST. Метки могут добавляться к С-терминалу, N-терминалу или внутри аминокислотной последовательности NS3/4A. К дополнительным вариантам относятся фузионные белки NS3/4A с усечениями амино- или карбокситерминала или внутренними делециями, или с дополнительными полипептидными последовательностями, добавленными к концам амино- или карбокситерминала или добавленными внутри. К прочим вариантам выполнения относятся фузионные белки NS3/4A или их усеченные или мутантные версии, в которых остатки сайта протеолитического расщепления NS3/4A замещены. К таким замещениям относятся, не в порядке ограничения, последовательности, в которых сайт Pl' является Ser, Gly или Pro, либо позиция Pl является Arg, или в которых последовательность Р8-Р4' является Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-Ser-Thr-Trp-Val (SEQ.ID.NO.:28).
Прочие варианты выполнения связаны с иммуногеном, содержащим фузионный белок NS3/4A или его усеченную или модифицированную версию, способные вызывать усиленную иммунную реакцию на NS3. Иммуноген может обеспечиваться в практически очищенном виде, что означает, что иммуноген был освобожден от прочих белков, липидов, углеводов или иных соединений, с которыми он связан в природе. К вариантам выполнения относятся также вакцинные составы, содержащие фузионный белок NS3/4A (SEQ.ID.NO.:17), или его усеченную или мутантную версию (например, SEQ.ID.NO.:NO.:29-32 и 43-49), или его фрагмент (например, SEQ.ID.NO.:NO.:25-27 и 33-42), и адъювант, такой как рибавирин. Следующий пример описывает один из подходов к приготовлению вакцинного состава, содержащего фузионный белок NS3/4A и адъювант.
ПРИМЕР 15
Для вырабатывания помеченного конструкта NS3/4A кодирующая NS3/4A последовательность NS3/4A-pVAX удаляется путем поглощения с помощью EcoRI и XbaI, и изолированный фрагмент вставляется в вектор Xpress (Invitrogen). Вектор Xpress позволяет получить рекомбинантный фузионный белок, имеющий короткий N-терминальный начальный пептид, который имеет высокое сродство для двухвалентных катионов. С помощью никель-хелирующей смолы (Invitrogen) рекомбинантный белок может быть очищен за один шаг, а после этого начальный пептид может быть удален путем расщепления энтерокиназой. Предпочтительным вектором является pBlueBacHis2 Xpress. Вектор pBlueBacHis2 Xpress является экспрессионным вектором Baculovirus, содержащим несколько сайтов клонирования, ген сопротивления ампициллину и ген lac z. Соответственно, поглощенный фрагмент усиления клонируется в вектор pBlueBacHis2 Xpress, и инфицируются клетки SF9. Экспрессионный белок затем изолируется или очищается в соответствии с инструкциями производителя. Содержащий NS3/4A вакцинный состав затем получается путем смешивания 100 мкг rNS3/4A с 1 мг рибавирина.
Упомянутый вакцинный состав может использоваться для повышения уровня антител у млекопитающих (например, мышей или кроликов) или может внутримышечно инъецироваться человеку для повышения уровня антител, предпочтительно, человеку, хронически инфицированному вирусом HCV. Реципиент предпочтительно получает три усиления иммунизации с помощью смеси с интервалами в 4 недели. Третье усиление значительно повышает титр антител, специфических для HCV. Дополнительно в это время упомянутый субъект будет испытывать усиленную антительную и опосредованную Т-клетками иммунную реакцию на NS3, что видно по увеличенной доле NS3-специфических антител по данным EIA и уменьшению вирусной нагрузки по данным RT-PCR. Следующий раздел дает более подробные объяснения относительно использования описанных здесь составов.
Способы использования составов, содержащих рибавирин и антиген
К маршрутам введения описанных здесь вакцин относятся, не в порядке ограничения, чрескожный, парентеральный, желудочно-кишечный, чрезбронхиальный и чрезальвеолярный. Чрескожное введение может выполняться путем нанесения крема, полоскания, геля или прочих соединений, способных позволить рибавирину и антигену проникать через кожу. К парентеральным маршрутам введения относятся, не в порядке ограничения, электрическая или прямая инъекция, такие как прямая инъекция в центральную венозную линию, внутривенная, внутримышечная, внутрибрюшинная, внутрикожная или подкожная инъекция. К желудочно-кишечным маршрутам введения относятся, не в порядке ограничения, введение проглатыванием и ректальный маршрут. К чрезбронхиальным и чрезальвеолярным маршрутам введения относятся, не в порядке ограничения, ингаляция либо через рот, либо через нос.
К составам, содержащим рибавирин и антиген, пригодным для чрескожного введения, относятся, не в порядке ограничения, фармацевтически приемлемые суспензии, масла, кремы и мази, наносимые непосредственно на кожу или внедряемые в защитный носитель, такой как чрескожное устройство ("чрескожный лоскут"). Примеры подходящих кремов, мазей и т.п.можно найти, например, в Physician's Desk Reference. Примеры подходящих чрескожных устройств описываются, к примеру, в патенте США №4818540, выданном 4 апреля 1989 на имя Chinen et al.
К составам, содержащим рибавирин и антиген, пригодным для парентерального введения, относятся, не в порядке ограничения, фармацевтически приемлемые стерильные изотонические растворы. К таким растворам относятся, не в порядке ограничения, солевой раствор, фосфатно-буферный солевой раствор и масляные препараты для инъекции в центральную венозную линию, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно или подкожно.
К составам, содержащим рибавирин и антиген, пригодным для чрезбронхиального и чрезальвеолярного введения, относятся, не в порядке ограничения, различные типы аэрозолей для ингаляции. Устройства, пригодные для чрезбронхиального и чрезальвеолярного введения этих аэрозолей, также являются вариантами выполнения. К таким устройствам относятся, не в порядке ограничения, атомизаторы и вапоризаторы. Многие виды доступных в настоящее время атомизаторов и вапоризаторов могут быть легко адаптированы для доставки вакцин, содержащих рибавирин и антиген.
К составам, содержащим рибавирин и антиген, пригодным для желудочно-кишечного введения, относятся, не в порядке ограничения, фармацевтически приемлемые порошки, таблетки или жидкости для проглатывания, а также суппозитории для ректального введения.
Описанные здесь генные конструкты, в частности, могут вводиться с помощью, не в порядке ограничения, традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств или "генных пушек микропроективной бомбардировки". Альтернативно, генетическая вакцина может вводиться при помощи различных средств в клетки, изъятые из индивида. К таким средствам относятся, не в порядке ограничения, трансфекция ex vivo, электропорация, микроинъекция и микропроективная бомбардировка. После того как генный конструкт принят клетками, они имплантируются в индивида. Подразумевается, что неиммуногенные в других случаях клетки, содержащие внедренные в них генные конструкты, могут быть имплантированы индивиду даже в том случае, если клетки были изначально взяты у другого индивида.
В соответствии с некоторыми вариантами выполнения, генный конструкт вводится индивиду с помощью безыгольного инъекционного устройства. В соответствии с некоторыми вариантами выполнения, генный конструкт одновременно вводится индивиду внутрикожно, подкожно и внутримышечно с помощью безыгольного инъекционного устройства. Безыгольные инъекционные устройства хорошо известны и широко распространены. Специалист может, следуя приводимому здесь описанию, использовать безыгольные инъекционные устройства для доставки генетического материала в клетки индивида. Безыгольные инъекционные устройства хорошо подходят для доставки генетического материала во все ткани. Они, в частности, полезны для доставки генетического материала в клетки кожи и мышц. В некоторых вариантах выполнения безыгольное инъекционное устройство может использоваться для продвижения жидкости, содержащей молекулы ДНК, к поверхности кожи индивида. Жидкость продвигается с достаточной скоростью для того, чтобы после соприкосновения с кожей жидкость проникала через поверхность кожи, распространяясь по коже и мышечной ткани под ней. Таким образом, генетический материал одновременно вводится внутрикожно, подкожно и внутримышечно. В некоторых вариантах выполнения безыгольное инъекционное устройство может использоваться для доставки генетического материала в ткань других органов для введения молекулы нуклеиновой кислоты в клетки этого органа.
Вакцины, содержащие рибавирин и антиген, могут использоваться для лечения и предотвращения широкого спектра заболеваний и могут усиливать иммунную реакцию животного на антиген. Как отметят специалисты, общепринятые вакцины вводились субъектам, нуждающимся в лечении или предотвращении бактериальных заболеваний, вирусных заболеваний, грибковых заболеваний и рака. Поскольку описанные здесь вакцины содержат общепринятые вакцины, которые были модифицированы посредством добавления рибавирина, описанные здесь способы содержат лечение или предотвращение заболевания с помощью вакцины, содержащей антиген и рибавирин.
Предпочтительные варианты выполнения относятся к способам лечения или предотвращения гепатитной инфекции. В этих вариантах выполнения нуждающемуся животному дают гепатитный антиген (например, пептидный антиген или антиген на основе нуклеиновой кислоты) и некоторое количество рибавирина, достаточное для проявления адъювантной активности в упомянутом животном. Соответственно, животное может быть идентифицировано как нуждающееся, с помощью доступного на сегодняшний день диагностического тестирования или клинической оценки. Диапазон гепатитно-вирусных антигенов, которые могут использоваться в этих вариантах выполнения, разнообразен. К предпочтительным гепатитно-вирусным антигенам относятся антиген HBV, антиген HAV, антиген HCV, нуклеиновые кислоты, кодирующие эти антигены, или любая их комбинация. К в высшей степени предпочтительным вариантам выполнения относятся антиген HBV, выбранный из группы, состоящей из поверхностного антигена гепатита B(HBsAg), ядерного антигена гепатита (HBcAg) и Е-антигена гепатита (HBeAg), в частности описанные выше антигены на основе пептида и нуклеиновой кислоты. Рибавирин и антиген могут обеспечиваться по отдельности или в сочетании, и нуждающемуся животному могут также вводиться прочие адъюванты (например, масло, квасцы или прочие агенты, усиливающие иммунную реакцию). Таким образом, к предпочтительным вариантам выполнения относятся способы лечения или предотвращения гепатита у животного (например, HBV) путем идентификации инфицированного животного или животного с риском инфицирования и введения упомянутому животному гепатитного антигена (например, HBsAg, HBcAg и HBeAg) и некоторого количества рибавирина, которого достаточно для проявления адъювантной активности.
К прочим вариантам выполнения относятся способы усиления иммунной реакции на антиген путем обеспечения нуждающегося животного таким количеством рибавирина, которое является эффективным для усиления упомянутой иммунной реакции. В этих вариантах выполнения животное, нуждающееся в усиленной иммунной реакции на антиген, идентифицируется с помощью доступных на сегодня диагностического тестирования или клинической оценки. Часто эти индивиды страдают от заболевания (например, бактериального, грибкового, плесневого, вирусного заболевания или рака) или имеют риск заражения заболеванием. Однако животное, нуждающееся в усиленной иммунной реакции, может быть отравившимся животным (например, укушенным ядовитым насекомым или животным) или подвергнувшимся действию токсина или другого токсичного соединения. Будучи идентифицированным, животное получает подходящий антиген и количество рибавирина, которое является эффективным для усиления иммунной реакции у животного.
Как описано выше, к гепатитным вирусным антигенам, которые могут использоваться в данных вариантах выполнения, относятся, не в порядке ограничения, антиген HBV, антиген HAV, антиген HCV, нуклеиновая кислота, кодирующая эти молекулы, или любая их комбинация. К в высшей степени предпочтительным вариантам выполнения относятся антиген HBV, выбранный из группы, состоящей из поверхностного антигена гепатита B(HBsAg), ядерного антигена гепатита (HBcAg) и Е-антигена гепатита (HBeAg), в частности, описанные выше антигены на основе пептида и нуклеиновой кислоты. Рибавирин и антиген могут обеспечиваться по отдельности или в сочетании, и нуждающемуся животному могут также вводиться прочие адъюванты (например, масло, квасцы или прочие агенты, усиливающие иммунную реакцию). Таким образом, к предпочтительным вариантам выполнения относятся способы усиления иммунной реакции на гепатитный антиген (например, HBV) путем идентификации нуждающегося животного и введения животному гепатитного антигена (например, HBsAg, HBcAg и HBeAg) и некоторого количества рибавирина, которое эффективно для усиления иммунной реакции у животного.
В соответствии с одним из подходов, например, неинфицированному животному вводят вышеупомянутые вакцинные составы в количестве, достаточном для возбуждения клеточной и гуморальной иммунной реакции на NS3, чтобы защитить упомянутого индивида от инфицирования HCV. В еще одном варианте выполнения инфицированный HCV индивид идентифицируется и обеспечивается вакцинным составом, содержащим рибавирин и NS3 в количестве, достаточном для усиления клеточной и гуморальной иммунной реакции на NS3, чтобы уменьшить или устранить инфекцию HCV. Такой индивид может иметь хроническую или острую фазу инфекции. В еще одном выполнении инфицированный HCV индивид, страдающий НСС, обеспечивается составом, содержащим рибавирин и фузионный ген NS3/4A в количестве, достаточном, чтобы вызвать клеточную и гуморальную иммунную реакцию на NS3-экспрессирующие опухолевые клетки.
Хотя изобретение описано со ссылками на варианты выполнения и примеры, следует понимать, что могут быть сделаны различные модификации без отхода от сущности изобретения. Соответственно, изобретение ограничено только нижеследующей формулой изобретения.
Claims (17)
1. Изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид вируса гепатита С, причем упомянутый полинуклеотид содержит
а) нуклеиновую кислоту, состоящую из последовательности SEQ. ID. NO.: 16;
б) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, состоящий из последовательности SEQ. ID. NO.: 17;
в) фрагмент нуклеиновой кислоты SEQ. ID. NO.: 16, которая кодирует NS3,или
г) нуклеиновую кислоту, состоящую из последовательности SEQ. ID. NO.: 16, содержащую мутацию в домене NS3 и кодирующую полипентид NS3/4A.
2. Изолированный полипептид, кодированный нуклеиновой кислотой по п.1.
3. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1.
4. Генетически сконструированная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1 или рекомбинантный вектор по п.3.
5. Антитело, которое непосредственно взаимодействует с изолированным полипептидом по п.2.
6. Антитело по п.5, в котором упомянутое антитело является моноклональным антителом.
7. Иммуногенный состав с использованием в качестве антигена изолированного полинуклеотида по п.1 или изолированного полипептида по п,2, содержащий рибаверин и антиген гепатита В или гепатита С.
8. Иммуногенный состав по п.7, в котором упомянутый антиген гепатита С является нуклеиновой кислотой.
9. Иммуногенный состав по п.8, в котором упомянутый антиген гепатита С содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует NS3.
10. Иммуногенный состав по п.7, в котором упомянутый антиген гепатита С содержит NS3.
11. Иммуногенный состав, содержащий рибавирин и изолированный полипептид NS3/4A вируса гепатита С.
12. Иммуногенный состав, содержащий рибавирин и полинуклеотид, кодирующий полипептид NS3/4A.
13. Иммуногенный состав по п.11, в котором упомянутый полипептид NS3/4A содержит последовательность SEQ. ID. NO.: 17.
14. Иммуногенный состав по п.12, в котором упомянутый полинуклеотид, кодирующий упомянутый полипептид NS3/4A, содержит последовательность SEQ. ID. NO.: 16.
Приоритет по пунктам:
17.08.2000 - пп.1-6;
29.08.2000 - пп.7-12;
03.11.2000 - пп.13-14.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US22576700P | 2000-08-17 | 2000-08-17 | |
US60/225,767 | 2000-08-17 | ||
US22917500P | 2000-08-29 | 2000-08-29 | |
US60/229,175 | 2000-08-29 | ||
US09/705,547 | 2000-11-03 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003101695A RU2003101695A (ru) | 2004-07-10 |
RU2286172C2 true RU2286172C2 (ru) | 2006-10-27 |
Family
ID=37438778
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003101695/15A RU2286172C2 (ru) | 2000-08-17 | 2001-08-15 | Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6858590B2 (ru) |
RU (1) | RU2286172C2 (ru) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6680059B2 (en) * | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
US7022830B2 (en) * | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
RU2286172C2 (ru) * | 2000-08-17 | 2006-10-27 | Трипеп Аб | Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования |
DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
US20050176065A1 (en) * | 2003-10-22 | 2005-08-11 | Invitrogen Corporation | Target sequences for synthetic molecules |
US20060068917A1 (en) | 2004-09-21 | 2006-03-30 | Snoddy Jon H | System, method and handheld controller for multi-player gaming |
US20080214273A1 (en) * | 2004-09-21 | 2008-09-04 | Snoddy Jon H | System, method and handheld controller for multi-player gaming |
WO2007031867A2 (en) * | 2005-05-25 | 2007-03-22 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-stru tural ns3/4a fusion gene |
US8071561B2 (en) * | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
US20090214593A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-08-27 | Tripep Ab | Immunogen platform |
WO2009152147A2 (en) * | 2008-06-09 | 2009-12-17 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Compositions and methods for dengue virus (dv) treatment and vaccination |
CA2770075C (en) * | 2009-08-07 | 2021-08-24 | Perrine Martin | Composition for treating hbv infection |
TW201321016A (zh) * | 2011-09-29 | 2013-06-01 | Transgene Sa | 免疫療法組成物及用於治療c型肝炎病毒感染之療程(二) |
WO2013045658A1 (en) * | 2011-09-29 | 2013-04-04 | Transgene Sa | Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection |
WO2023114510A2 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Denali Therapeutics Inc. | Polypeptide engineering, libraries, and engineered cd98 heavy chain and transferrin receptor binding polypeptides |
Family Cites Families (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4215051A (en) * | 1979-08-29 | 1980-07-29 | Standard Oil Company (Indiana) | Formation, purification and recovery of phthalic anhydride |
US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4873191A (en) * | 1981-06-12 | 1989-10-10 | Ohio University | Genetic transformation of zygotes |
US4818540A (en) * | 1985-02-25 | 1989-04-04 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Transdermal fertility control system and process |
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US5643565A (en) | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
US5322770A (en) * | 1989-12-22 | 1994-06-21 | Hoffman-Laroche Inc. | Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5714596A (en) | 1987-11-18 | 1998-02-03 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus |
US5698390A (en) | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
US5712088A (en) | 1987-11-18 | 1998-01-27 | Chiron Corporation | Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same |
US5350671A (en) | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
EP0318216B2 (en) | 1987-11-18 | 2001-08-29 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics |
US6171782B1 (en) | 1987-11-18 | 2001-01-09 | Chiron Corporation | Antibody compositions to HCV and uses thereof |
US5683864A (en) | 1987-11-18 | 1997-11-04 | Chiron Corporation | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies |
US5968775A (en) | 1987-11-18 | 1999-10-19 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus infected cell systems |
US5679342A (en) | 1987-11-18 | 1997-10-21 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus infected cell systems |
US4950647A (en) | 1988-10-04 | 1990-08-21 | Nucleic Acid Research Institute | T cell immunopotentiator |
HUT54896A (en) | 1989-03-17 | 1991-04-29 | Chiron Corp | Process for producing aquous diagnosticum and vaccine of nanbv |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US6027729A (en) | 1989-04-20 | 2000-02-22 | Chiron Corporation | NANBV Diagnostics and vaccines |
GEP20002164B (en) | 1989-05-18 | 2000-07-10 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Oligomers, method for detecting of hcv sequence, kit for its detecting, method for production of the blood free from hcv |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
ATE161041T1 (de) | 1989-08-25 | 1997-12-15 | Chiron Corp | Verfahren zur hcv-züchtung in zell-linien aus b- oder t-lymphozyten |
US5372928A (en) | 1989-09-15 | 1994-12-13 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus isolates |
US5712087A (en) | 1990-04-04 | 1998-01-27 | Chiron Corporation | Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens |
US6194140B1 (en) | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
DE69133402T2 (de) | 1990-04-04 | 2004-11-11 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Protease von hepatitis-c-virus |
JP2733138B2 (ja) | 1990-04-04 | 1998-03-30 | カイロン コーポレイション | 抗hcv抗体の免疫アッセイに使用するc型肝炎ウイルス(hcv)抗原の組合せ |
US5747339A (en) * | 1990-06-25 | 1998-05-05 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka | Non-A, non-B hepatitis virus genomic CDNA and antigen polypeptide |
WO1992002642A1 (en) | 1990-08-10 | 1992-02-20 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus |
US5604105B1 (en) * | 1990-10-12 | 1999-08-24 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosingand distinguishing chest pain in early onset thereof |
CA2027434C (en) * | 1990-10-12 | 1999-01-05 | George Jackowski | Diagnostic kit for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof |
US5710008B1 (en) * | 1990-10-12 | 1999-09-07 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof |
JPH06504431A (ja) | 1990-11-08 | 1994-05-26 | カイロン コーポレイション | C型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 |
US6274148B1 (en) | 1990-11-08 | 2001-08-14 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus asialoglycoproteins |
EP1046421B8 (en) | 1990-12-06 | 2006-01-11 | Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) | Methods and reagents for very large scale immobilized polymer synthesis |
SK284205B6 (sk) | 1991-05-08 | 2004-10-05 | Chiron Corporation | Prirodzene sa nevyskytujúca nukleová kyselina, spôsob tvorby hybridizačného produktu a spôsob detekcie genotypov HCV |
US6190864B1 (en) | 1991-05-08 | 2001-02-20 | Chiron Corporation | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
FR2677372B1 (fr) * | 1991-06-06 | 1994-11-10 | Pasteur Institut | Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques. |
DE69232871T2 (de) | 1991-06-24 | 2003-05-08 | Chiron Corp | Polypeptide des hepatitis c-virus (hiv) |
DE69232859T2 (de) * | 1991-09-13 | 2003-04-10 | Chiron Corp | Zusammensetzung aus mehreren immunreaktiven hepatitis-c-virus-polypeptiden |
US5412087A (en) * | 1992-04-24 | 1995-05-02 | Affymax Technologies N.V. | Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces |
HU211019B (en) * | 1991-12-02 | 1995-09-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing new 1,2,3,6-tetrahydropyridine and piperidine derivatives substituted with n-(hydroxylalkyl) group and compositions comprising such compounds |
US5795714A (en) | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
DE4239311C2 (de) | 1992-11-23 | 1996-04-18 | Guehring Joerg Dr | Bohrer, insbesondere Spitzbohrwerkzeug mit austauschbarem Schneideinsatz |
AU675702B2 (en) | 1993-01-26 | 1997-02-13 | Leslie R. Coney | Compositions and methods for delivery of genetic material |
US5593972A (en) | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
EP1004670B1 (en) | 1993-04-27 | 2012-04-11 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
US7255997B1 (en) | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
EP0730663B1 (en) | 1993-10-26 | 2003-09-24 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
DK0992580T3 (da) | 1993-11-04 | 2005-07-11 | Innogenetics Nv | Epitoper på human T-celler, som er immundominante for hepatitis C-virus |
US5739118A (en) | 1994-04-01 | 1998-04-14 | Apollon, Inc. | Compositions and methods for delivery of genetic material |
WO1996009805A2 (en) | 1994-09-23 | 1996-04-04 | Zonagen, Inc. | Chitosan induced immunopotentiation |
US6235888B1 (en) | 1994-10-05 | 2001-05-22 | The General Hospital Corporation | Hepatitis C virus vaccine |
PT804584E (pt) | 1994-10-21 | 2002-11-29 | Innogenetics Nv | Sequencias de virus da hepatite c genotipo 7 e sua utilizacao como agentes profilacticos terapeuticos e de diagnostico |
FR2730935A1 (fr) | 1994-12-21 | 1996-08-30 | Vacsyn Sa | Vaccin presentant une immunogenicite accrue |
US5932556A (en) | 1995-09-17 | 1999-08-03 | Tam; Robert C | Methods and compositions for regulation of CD28 expression |
WO1996028162A1 (en) | 1995-03-14 | 1996-09-19 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | New drug combination for the treatment of viral diseases |
UA56132C2 (ru) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины |
US6150337A (en) | 1996-01-23 | 2000-11-21 | Icn Pharmaceuticals, Inc. | Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by Ribavirin in activated T-lymphocytes |
DE69712316T2 (de) | 1996-01-23 | 2003-01-02 | Icn Pharmaceuticals | Modulation der th1/th2 cytokinexpression durch ribavirin in aktivierten t-lymphozyten |
US5767097A (en) * | 1996-01-23 | 1998-06-16 | Icn Pharmaceuticals, Inc. | Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by ribavirin in activated T-lymphocytes |
AU2189397A (en) | 1996-02-08 | 1997-08-28 | Affymetrix, Inc. | Chip-based speciation and phenotypic characterization of microorganisms |
CA2244891C (en) | 1996-02-09 | 2008-12-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
JP2002500502A (ja) | 1996-06-11 | 2002-01-08 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 合成c型肝炎遺伝子 |
EP1860192A1 (en) | 1996-09-17 | 2007-11-28 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Compositions and methods for treating intracellular diseases |
ATE238328T1 (de) | 1996-10-16 | 2003-05-15 | Ribapharm Inc | Monozyklische l-nukleoside, analoga und ihre anwendungen |
KR100412480B1 (ko) | 1996-10-16 | 2003-12-31 | 아이씨엔 파마슈티컬스, 인코포레이티드 | 푸린 l-누클레오시드, 이의 유사체 및 이들의 용도 |
IL119833A (en) | 1996-12-15 | 2001-01-11 | Lavie David | Hypericum perforatum extracts for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of hepatitis |
IL130497A0 (en) | 1997-01-17 | 2000-06-01 | Icn Pharmaceuticals | Controlled release preparations to selectively modulate Th1 and Th2 responses |
IL131131A0 (en) | 1997-02-07 | 2001-01-28 | Merck & Co Inc | Synthetic hiv gag genes |
WO1998037180A2 (en) | 1997-02-22 | 1998-08-27 | Abbott Laboratories | Hcv fusion protease and polynucleotide encoding same |
US6153421A (en) * | 1997-07-18 | 2000-11-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Cloned genomes of infectious hepatitis C viruses and uses thereof |
US6541011B2 (en) | 1998-02-11 | 2003-04-01 | Maxygen, Inc. | Antigen library immunization |
GB9820525D0 (en) | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
US20020187945A1 (en) | 1999-01-29 | 2002-12-12 | Robert Tam | Modulation of immune response by ribavirin |
CA2357735A1 (en) | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Icn Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immune response by ribavirin |
RU2286172C2 (ru) | 2000-08-17 | 2006-10-27 | Трипеп Аб | Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования |
US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
WO2002014362A2 (en) | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
CN1582337B (zh) | 2001-10-11 | 2011-12-14 | 默沙东公司 | 丙型肝炎病毒疫苗 |
-
2001
- 2001-08-15 RU RU2003101695/15A patent/RU2286172C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-15 US US09/929,955 patent/US6858590B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-04-02 US US10/817,591 patent/US7241440B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-10-13 US US11/249,893 patent/US7439347B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-04-26 US US11/411,494 patent/US7226912B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-26 US US11/411,493 patent/US7244715B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7241440B2 (en) | 2007-07-10 |
US6858590B2 (en) | 2005-02-22 |
US20020136740A1 (en) | 2002-09-26 |
US20070026425A1 (en) | 2007-02-01 |
US20060062801A1 (en) | 2006-03-23 |
US20040229832A1 (en) | 2004-11-18 |
US20060183699A1 (en) | 2006-08-17 |
US7439347B2 (en) | 2008-10-21 |
US7244715B2 (en) | 2007-07-17 |
US7226912B2 (en) | 2007-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7244715B2 (en) | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof | |
AU2006203358B2 (en) | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof | |
US7223743B2 (en) | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene | |
AU2001292151A1 (en) | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof | |
ES2371936T3 (es) | Ácido nucleico que codifica ns3/4a de hcv. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070816 |