JPH06504431A - C型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 - Google Patents
C型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
C型肝炎つィルスアシアロ糖タンパク質1皿立!
本発明は、組換えタンパク質の発現およびウィルス学の一般的分野に関する。さ
らに詳細には、本発明は、C型肝炎ウィルス(HCV)感染の診断、治療、およ
び予防に有用な糖タンパク質、ならびにこのような糖タンパク質の生産方法に関
する。
11茨血
非A型、非B型肝炎(NANBH)は、ウィルスによって誘発されると考えられ
ている伝染性疾患(あるいは疾患のファミリー)であり、A型肝炎ウィルス(H
Av) 、B型肝炎ウィルス(HBV)、デルタ肝炎ウィルス(■Dv)、サイ
トメガロウィルス(CMV)、あるいはエプスタインバーウィルス(EBV)に
起因する肝疾患などの、他の形態のウィルス関連肝疾患とは区別されている。
伝染病学的証拠によりNANBHこは3つの型があることが示されている。すな
わち、水に起因する伝染型;血液あるいは針に関連する型;および、散発的に発
生する集団獲得型。多くの原因因子は未知である。しかし最近、新種ウィルスで
あるC型肝炎つイ/l/X (HCV)が、血液に起因するNANBH(BB−
NANBH)の主要原因(もし唯一の原因でなければ)として同定された。
例えば、PCT WO391046699を参照のこと。C型肝炎は、アメリカ
合衆国、ヨーロッパおよび日本を含む多くの国あるいは地域で、輸血関連肝炎の
主要形態であるようだ。さらに、HCVに関連する肝細胞癌の誘発の証拠も存在
する。従って、HCV感染の効果的な予防法および治療法の必要性が存在する。
HCVキャリア、およびHCVに汚染された血液あるいは血液製剤をスクリーニ
ングおよび同定するための鋭敏で特異的な方法の要求が高まっている。輸血後肝
炎(PTH)が、輸血患者の約10%に発生し、この場合の90%まではHCV
に起因する。この疾患の主要な問題は、慢性肝障害の常習的な進行である(25
−55%)。
患者の世話、ならびに血液および血液製剤による、あるいは患者との密接な接触
によるHCVの伝染の予防には、HCVに関連する核酸、抗原および抗体の検出
のための信頼し得る診断ならびに予後手段が必要とされる。さらに、この疾患を
予防および/あるいは治療するための有効なワクチンおよび免疫治療的治療剤の
必要性が存在する。
HCVは、他の感染性ウィルスに比較して非常に低率で感染個体の血液中に存在
するようであり、このことはこのウィルスの検出を非常に困難にしている。この
ウィルスが低率で存在することが、おそらく、長い間NANB型肝炎の原因因子
が検出されなかった主な理由である。現在ではクローン化されてはいるが、いま
だに培養および増殖は困難である。従って、診断/治療/予防用の■Cvタンパ
ク質を生産する組換え法の必要性が強い。
このように、HCVワクチンが非常に必要である。しかし、細胞系におけるHC
Vの培養には、非常な困難がある。したがって、組織/細胞の継代培養により弱
毒化ウィルス株を産生ずることは不可能であった。
l囲立皿示
2種のHCVタンパク質、ElおよびElは、組換え系において発現されるとき
には、膜結合のアシアロ糖タンパク質であるようであることが発見された。糖タ
ンパク質は通常、哺乳類中ではマンノース末端形態ではなく、さらに他の炭水化
物で修飾されていて、マンノース末端化形態は、一般的には単に一過的なもので
あるので、このことは予想外のことである。ElおよびElの場合(われわれの
系において発現されるとき)には、アシアロ糖タンパク質は、最終形態であるよ
うだ。El(エンベロープタンパク質1)は、ncvゲノムの推定E1領域から
翻訳される分子量約35kDの糖タンパク質である。El (エンベロープタン
パク質2)は、HCVフラビウイルスモデルに基づく、HCVゲノムの推定NS
I (非構造タンパク質1)から翻訳される、分子量約72kDの糖タンパク質
である。ウィルス性糖タンパク質は、しばしば高免疫原性であるので、Elおよ
びElは、イムノアッセイおよび治療/予防ワクチンに使用されるのにまさに適
したものである。
ElおよびElがシアル化されていないことの発見は重要である。タンパク質の
特定の形態は、細胞が組換え発現用の適当な宿主として働き得るように指令する
。E、 coliなどの原核生物は、タンパク質をグリコジル化せず、そして一
般的には、抗原としての使用のために糖タンパク質を産生ずるのには適していな
い。その理由は、糖タンパク質はしばしば、タンパク質の完全な抗原性、可溶性
、ならびに安定性に対して重要であるからである。酵母ならびに真菌のなどの下
等真核生物は、タンパク質をグリコジル化するが、一般には、末端シアル酸を付
加して炭水化物複合体になし得ない。従って、酵母由来のタンパク質は、抗原と
しての、それらの天然(組換え体ではない)のタンパク質とは区別され得る。組
換えタンパク質のグリコジル化は野生ウィルスタンパク質のグリコジル化に非常
に類似しているので、哺乳動物細胞での発現は、産生物の抗原性が重要である応
用に好ましい。
HCVウィルスが、肝細胞上に見い出されるアシアロ糖タンパク質レセプター、
あるいは肝門皮細胞およびマクロファージ(特に、クツペル(Kupffer)
細胞)上に見い出されるマンノースレセプターを介する感染中に、宿主細胞への
入口を得ることができるという新たな証拠が示された。驚くべきことに、天然の
ElおよびE2塊は、末端シアル酸残基を有さず、コアグリコジル化のみなされ
ることが発見された。さらに少画分が末端N−アセチルグルコサミンを含む。従
って、本発明の目的は、全末端シアル酸残基あるいは実質的に全てのシアル酸残
基を欠く、HCVエンベロープ糖タンパク質を提供することである。
本発明の他の局面は、例えば、分泌または放出を促進する抗生物質を使用しての
酵母での発現、あるいは哺乳動物細胞における発現による、末端シアル酸付加を
阻害する条件下でアシアロE1あるいはElを産生ずる方法である。
本発明のもう一つの局面は、末端マンノース残基あるいは末端N−アセチルグル
コサミン残基に結合する、レクチンに対する親和性によるElあるいはElの精
製法である。
本発明のもう一つの局面は、免疫原性組成物であり、これは、薬学的に受容可能
な賦形剤と組み合わせた、HCV ElおよびElからなる群より選択される組
換えアシアロ糖タンパク質を含む。所望で有れば、必要に応じて、免疫学的アジ
ュバントが含まれ得る。
本発明のもう一つの局面は、イムノアッセイ試薬であり、これは適切な支持体と
組み合わせた、HCY ElおよびElからなる群より選択される組換えアシア
ロ糖タンパク質を含む。本発明の他のイムノアッセイ試薬は、適切な検出標識と
組み合わせた、HCV ElおよびElからなる群より選択される組換えアシア
ロ糖タンパク質を含む。
本発明のもう一つの局面は、Elおよび/あるいはElのダイマーおよび高次凝
集体(higher−order−aggregates)に関する。
本発明の1種はE2複合体である。本発明の他の種は、El:E2ヘテロダイマ
ーである。
本発明のもう一つの局面は、El:E2N集体および薬学的に受容可能なキャリ
アを含むI(CVワクチン組成物である。
本発明のもう一つの局面は、El:E2複合体の精製方法である。
本発明のもう一つの局面は、以下の(a)、(b)および(c)の工程を包含す
る、細胞培養物中でのHCVの増殖の方法である:(a)マツノースレセプター
およびアシアロ糖タンパク質レセプターからなる群より選択されるレセプターを
発現する細胞を供給する工程;(b)細胞をHCVで感染させる工程;および(
c)感染細胞を培養する工程。好ましくは、細胞は組換えレセプターを発現する
。
用語「アシアロ糖タンパク質」とは、実質的にシアル酸成分を含まないグリコジ
ル化タンパク質のことである。アシアロ糖タンパク質は、組換え、あるいは、細
胞培養または天然源からの精製により調製され得る。まさに、好ましいアシアロ
糖タンパク質は、1ick、好ましくは糖タンパク!ElおよびEl、最も好ま
しくは組換えElおよびEl (rElおよびrE2)由来である。シアル酸残
基の量が、実質的に糖タンパク質の、GNAのなどのマンノース結合タンパク質
への結合を阻害しない量であれば、この定義範囲内では、タンパク質は、シアル
酸を「含まない」。シアル化の程度は一般的には、全N結合炭水化物の約40%
未満がシアル酸であり、より好ましくは約30%未満であり、より好ましくは約
20%未満であり、より好ましくは約10%未満であり、より好ましくは約5%
未満であり、最も好ましくは約2%未満である。
本明細書に使用されている用語rEIJは、I(C’/ポリタンパク質の最初の
400アミノ酸以内に発現されるタンパク質あるいはポリペプチドのことであり
、ときにはEあるいはSタンパク質と呼ばれる。これは、その天然形態において
、膜に強く結合されていることが見いだされる、35kDの糖タンパク質である
。
はとんどの天然のHCV株では、Elタンパク質は、ウィルスポリタンパク質中
でC(コア)タンパク質の後にフードされる。E1タンパク質は、ポリタンパク
質全長の約192アミノ酸から約383アミノ酸に広がる。本明細書に使用され
ている用語「El」には、天然E1と免疫学的に交差反応性であるアナログおよ
び先端切断型変異体もまた含まれる。
本明細書に使用されている用語「El」は、■Cvポリタンパク質の最初の90
0アミノ酸以内に発現されるタンパク質あるいはポリペプチドのことであり、と
きにはNSISタンパク質ばれる。これは、その天然形態において、膜に強く結
合されていることが見いだされる、?2kDの糖タンパク質である。はとんどの
天然のHCV株では、E1タンパク質はE1タンパク質に続く。
E2タンパク質は、約384アミノ酸から約820アミノ酸に広がる。
本明細書に使用されている用語「El」には、天然E2と免疫学的に交差反応性
であるアナログおよび先端切断型変異体もまた含まれる。
本明細書に使用されている用語「凝集体」とは、1つより多いElあるいはE2
モノマーを含むElおよび/またはElの複合体のことである。El:E1ダイ
マー、El:E2ダイマーならびにEl:E2ヘテロダイマーは、すべてこの定
義内の「凝集体」である。
本発明の組成物はまた、より大きい凝集体を含み得、800kDを越える分子量
を有し得る。
本明細書に使用されている用語「粒子jとは、電子顕微鏡により見える、少なく
とも20 nmの直径を有する、El、El、あるいはEl/E2凝集体のこと
である。好ましい粒子は、電子顕微鏡によってみとめられる、だいたい円形形状
で約40nmの直径を有する。
本明細書中でタンパク質に適用されている用語「精製された」とは、所望のタン
パク質が、組成物中の総タンパク質成分の少なくとも35%を含む組成物のこ七
である。所望のタンパク質は、総タンパク質成分の好ましくは少なくとも40%
、さらに好ましくは少なくとも約50%、さらに好ましくは約60%、さらに好
ましくは約70%、さらに好ましくは約80%、さらに好ましくは約90%、お
よび最も好ましくは約95%を構成する。この組成物は、本明細書に使用されて
る純度の決定に影響しない、炭水化物、塩、脂質、溶媒などの他の化合物を含み
得る。[単離されたJ )ICVアシアロ糖タンパク質とは、純度が少なくとも
35%のHCVアシアロ糖タンパク質組成物を意味する。
本明細書に使用されている「マンノース結合タンパク71Jとは、レクチンある
いはマンノース末端グリコジル化されたタンパク質(例えば、アシアロ糖タンパ
ク質)に特異的に結合する他のタンパク質のことを意味し、これらの例には、マ
ンノース結合レクチン、マンノース末端グリコジルに特異的な抗体、マンノース
レセプタータンパク質(R,A、B、 Ezekowitzら、Lカ11鯨(1
990) 176:1785−94) 、777 ロ糖タンパク質しセプタータ
ンパク質(H,Kurataら、J Biol Chem (1990) 26
5:11295−98) 、血清77/−ス結合タンハク質(1,5chuff
eneckerら、Cto enet Ce1l Genet (1991)
56:99−102:L 5astryら、J Immunol (1991)
LLZ:692−97) 、血清アシアロ糖タンパク質結合タンパク質などが
含まれる。マンノース結合レクチンには、例えば、GNA、 コンカナバリンA
(ConA)ならびに同様の結合性を有する他のレクチンが含まれる。
用ii r GNAレクチン」とは、マンノース末端糖タンパク質に結合する市
販のレクチン、Ga1anthus n1va usアグルチニンのことである
。
本明細書に使用されている「組換え」糖タンパク質は、組換えポリヌクレオチド
から発現される糖タンパク質であり、糟タンパク質をコードする構造遺伝子は、
天然ではこの構造遺伝子に隣接していない調節配列の制御下に発現されるか、あ
るいはその構造遺伝子は改変されている。例えば、E1構造遺伝子が、酵母グリ
セルアルデヒド−3−ポスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDfl)プロモー
ターの機能性フラグメントの制御下に配置されたベクターを形成し得る。酵母で
の使用に好ましいプロモーターは、米国特許第4.880.734号に記載のハ
イブリッドADH2/GAPプロモーターであり、これは、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ2由来の上流の活性化配列と組み合わせてGAPDHプロモーターのフ
ラグメントを利用する。構造遺伝子の改変には、縮重コドンでの別のコドンの置
換(例えば、宿主に好ましいコドンの使用、制限酵素切断部位の削除あるいは形
成、ヘアピン形成の制御のためになど)、ならびに異なるアミノ酸をコードする
限定数のコドンの置換、挿入あるいは欠損(天然アミノ酸配列の、好ましくは約
10%未満、より好ましくは約5z未満が変えられるべきである)などが含まれ
る。同様に、「組換え」レセプターとは、組換えポリヌクレオチドから発現され
たレセプタータンパク質のことであり、レセプターをコードする構造遺伝子は、
天然では構造遺伝子に隣接しない調節遺伝子の制御下に発現されるか、あるいは
その構造遺伝子は改変されている。
用語「単離されたポリペプチド」とは、他のHCVウィルス成分、特にポリヌク
レオチドを実質的に含まないポリペプチドのことである。組成物中のポリペプチ
ドの重量が、そのポリペプチドと他の成分と合わせた重量の少なくとも70%、
より好ましくは約80%、さらに好ましくは約90%、そして最も好ましくは9
5%あるいはそれ以上である場合には、ポリペプチド組成物は、他の成分を「実
質的に含まない」。例えば、100μg/sLノEIJ、J、び3μg/1Lt
Db(D他(DHCV成分(例えば、DNA、脂質など)を含む組成物は、「他
のHCVウィルス成分」を実質的に含まず、従って、この定義の範囲内の単離ポ
リペプチドの組成物である。
用語「分泌リーダーjとは、タンパク質のN末端でコードされるときに、翻訳後
に宿主細胞培養培地中にそのタンパク質を分泌されるようにするポリペプチドの
ことである。分泌リーダーは、一般的に使用される宿主細胞に由来する。例えば
、酵母での使用に適した分泌リーダーには、5accI匡肛並L」revis(
aea因子リーダー(米国特許第4.870.008号を参照のこと)が含まれ
る。
用語「下等真核生物」とは、酵母、真菌などの宿主細胞のことである。下等真核
生物は、一般的に(必ずというわけではないが)単細胞である。好ましい下等真
核生物は酵母であり1特に5accharo+e cess 5ch1zosa
ccha am ces、■g」、■並n5Hansenulaなどの種である
。 Saccharom ces cerevfsfae、 S、 carls
ber ensisおよびに、Iactisは、最も一般的に使用される酵母宿
主ならびに便利な真菌宿主である。
用語「高等真核生物」とは、哺乳類、は生類、昆虫類などの高等動物由来の宿主
細胞のことである。現に好ましい高等真核宿主細胞は、チャイニーズハムスター
(例えば、 CHO)、サル(例えば、CO5細胞)、ヒトおよび昆虫(例えば
、加白tera fru i e da)由来である。宿主細胞は、懸濁あるい
はフラスコ培養、組織培養、器官培養などで供給され得る。
用語「カルシウムモジュレータ−」とは、小胞体内にカルシウムイオンを隠ぺい
あるいは結合し得るか、あるいはカルシウム調節タンパク質(例えば、カルシウ
ムチャンネルタンパク質、カルシウムポンプなど)に作用することによりER内
のカルシウムイオン濃度に影響する化合物のことである。適切ナカルシウムモジ
ュレーターには、例えば、サブシガルジン(thapsigargjn) 、E
GTA (エチレングリコールビス[β−アミノエチルエーテル]N、 N、
N’ 、 N’−テトラアセティ・ノクアッシド)が含まれる。現に好ましいモ
ジュレータ−は、サブシガルジンであるUlえば、0. Thastrupら、
Proc Nat Acad Sc(USA(199G) 87:2466−7
0を参照のこと)。
用語「免疫原性」とは、アジュバントの存在あるいは非存在下で、単独あるいは
キャリアと結合して、体液性および/または細胞性免疫応答をなす基質の能力の
ことである。「中和」とは、感染性物質の感染性を部分的に、あるいは完全に抑
制する免疫応答のことである。「ワクチン」とは、HCVに対する、一部あるい
は完全防御を誘起し得る、個体の治療に有用な免疫組成物のことである。
用語「生物学的液体」とは、血清、血漿、唾液、胃分泌物、粘液などの器官から
得られる流体のことである。一般的には、生物学的液体は、 ncv粒子の存在
に対してスクリーニングされる。ある種の生物学的流体は、血液凝固因子(例え
ば、因子Vlll:C) 、血清アルブミン、成長ホルモンなどの他の産生物源
として使用される。このような場合には、生物学的液体源がHCVのなどのウィ
ルスに汚染されていないことが重要である。
B、二股n久万蓬
HCVゲノムのE1領域は、欧州特許第388.232号にrEJ領域として、
そして一方E2はrNsIJとして記載されている。E1領域は、全長ウィルス
ポリタンパク雪中の約192−383アミノ酸を有スル。E2M域は、約384
−820アミノ酸を有する。これらのタンパク質の原型の全配列(HCV−1株
)は、タンパク質の一般的なりローニングおよび発現法と同様に、当該分野では
入手可能である(欧州特許第388.232号を参照のこと)。ElおよびE2
の両方は、HCVポリタンパク質の最初の850−90−0アミノ酸をコードす
るポリヌクレオチドから発現され得る。はとんどの真核宿主細胞中では翻訳後の
プロセッシングで、最初のポリタンパク質が、C,ElおよびElに切断される
。コーディング領域の5°末端を切断して、産生されるCタンパク質量を減少し
得る。
アシアロ糖タンパク質の発現は、多くの方法によりなされ得える。例えば、通常
はグリコジル化タンパク質にシアル酸残基を付加しない下等真核生物(酵母など
)中での発現が得れ得る。酵母発現系においては、タンパク質が翻訳後に培養培
地中に発現されるように、S、 cerevisiaeα因子リーダーなどの分
泌リーダーを使用することが好ましい。さらに、pmrlなどのグリコジル化欠
損変異体を使用することが好ましい。
なぜなら、これらの変異体は、コアグリコジル化のみ行い、かなり高効率に異種
タンパク質を分泌するからである( H,K。
Rudo Lphら、江且(1989) S8:133−45)。あるいは、P
fchfa」」±yrisなどの他の種の酵母を使用し得る。これは、哺乳類お
よびS、 cerevfsjaeに見られるコアグリフシル化様式に類似すると
考えられている様式で、8−9マンノース残基を有する糖タンパク質を発現する
。
あるいは、哺乳類細胞中の発現を調整して末端グリコジル化(シアル酸付加)を
ブロックし得る。組換え構築物は、タンパク質が小胞体へ方同づけられることを
確実にするために、好ましくは分泌シグナルを含む。ゴルジ体への移送は、El
およびE2自身でブロックされるようである。哺乳類細胞でのElあるいはEl
の高レベルの発現は、小胞体あるいは山ゴルジ体での全ての細胞タンパク質の分
泌を妨げるようである。さらに、グリコジル化欠損変異体を使用し得る。例えば
、P、 5ta) n1ey、 Ann Rev Genet (1984)
La:525−52を参照のこと。グリコジル化あるいは移送変異体が、シアル
化を伴ってElあるいはElを発現する場合には、ノイラミニダーゼによる処理
によって末端シアル酸残基を除去し得る。
収量は、小胞体内からのタンパク質の放出を得るためのカルシウムモジル−ター
の使用により増加されるべきである。
適切なモジュレータ−には、サブシガルジン、 EGTA、ならびにA2381
7(例えば、0、Thastrupら、P oc Nat cad Sc’ U
S(1990) B7:2466−70を参照のこと)が含まれる。例えば、組
換えワクシニアウィルスベクターによるトランスフェクションにより、哺乳類細
胞(例えば、CHO,CO3ならびにヘラ(HeLa)細胞など)の細胞内に多
量のElあるいはElを発現させ得る。タンパク質の発現および小胞体内の蓄積
後、ER内容物の放出を起こすのに十分な濃度のカルシウムモジコレ−ターに細
胞を曝す。次に、培養培地からタンパク質を回収し、培地は次のサイクル用に取
り替える。
さらに、先端切断型のエンベロープタンパク質を発現させるのが好都合である。
ElおよびElの両方は、高疎水性ドメインを有するようであり、これは明らか
にタンパク質を小胞体内のとどめ、効率よい放出を妨げる。従って、Elの17
0−190アミノ酸、26(1−290アミノ酸あるいは330−380アミノ
酸(ポリタンパク質のはじめからの番号)の1つ以上の領域、並びにElの66
0−830アミノ酸(例えば、欧州特許第388,232号の図20−1を参照
)の配列の部分を欠失することが望まれ得る。これらの疎水性ドメインの少なく
とも1つは、そのタンパク質の抗原性に必須ではなく、不利な影響もなく欠失し
得る、トランスメンプラン領域を形成する。欠失に最も適した領域は、通常専門
家の技術による少数の欠失実験の実施により決定し得る。Elの疎水性3゛末端
の欠失により、発現された62部分の分泌の結果になる。このとき、分泌された
タンパク質のシアル化をともなう。
発現を得るために種々の任意のベクターが使用され得る。
酵母などの下等真核生物は、典型的には、カルシウムリン酸沈澱法を用いてプラ
スミドにより形質転換されるか、あるいは組換えウィルスにより形質転換される
。ベクターは、独立して宿主細胞内で複製され得るか、あるいは宿主細胞ゲノム
に組み込まれ得る。より高等な真核生物は、プラスミドにより形質転換され得る
が、典型的には組換えウィルス、例えば、組換えワクシニアウィルスに感染され
る。ワクシニアは、宿主細胞タンパク質の発現を停止させ得るので、ワクシニア
が特に好ましい。まさに好ましい宿主細胞には、ヘラならびに形質細胞腫(pl
asmacytoma)細胞系が含まれる。この系では、宿主Elr中に主要な
グリコジル化種としてElおよびElが蓄積することを意味する。rElおよび
rE2は、マンノース末端化されている主要な糖タンパク質であるので、末端マ
ンノース残基に結合する虹口nthus n1valusアグルチニン((JA
)などのレクチンを使用して細胞から容易に精製され得る。
マンノース末端糖タンパク質として天然に発現されるタンパク質は、哺乳動物生
理学上比較的まれである。はとんどの場合において、哺乳動物の糖タンパク質は
、グリコジル化経路での一過的な中間産物としてのみマンノース末端化されてい
る。組換え的に発現されたHCvエンベロープタンパク質がマンノース末端グリ
コジル、あるいは(より低い程度の)N−アセチルグルコサミンを有する事実は
、HCVCタンパク質量全ヒ!J t ン(viron)が分離され、そして末
端マンノースあるいはN−アセチルグルコサミンに特異的なレクチンを用いて、
内因性タンパク質から部分的に精製され得ることを意味する。
組換えタンパク質は真正であり、成熟遊離ピリオンに見いだされるエンベロープ
タンパク質、あるいは細胞結合エンベロープタンパク質の形態と本質的に同じで
あると考えられている。従って、GNAなどのレクチンを、マンノース末端タン
パク質、ならびにWGA (コムギ胚芽アグルチニン)およびN−アセチルグル
コサミン末端タンパク質の等傷物に対して使用し得る。
例えばワクチンあるいはイムノアッセイに使用するために抗原を生成するときの
精製のために、ElおよびElを、細胞培養上清および他の液体から分離するた
めに、固相に結合させたレクチンを使用し得る。
あるいは、HCV感染が疑われる被検者からの液体あるいは組織サンプルから、
El、ElあるいはHCVピリオンを分離するために適切なレクチンを供給し得
る。マンノース末端糖タンパク質は比較的まれであるので、このような方法は、
実質的にバックグラウンドを減少させて、試料中に存在するタンパク質を精製す
るのに役立つ。レクチンに結合後、)IcVタンパク質は抗HCV抗体を用いて
検出され得る。あるいは、全ピリオンが存在する場合には、■Cvゲノムの保存
領域(例えば、5°非コーデイング領域)に特異的なPCR法または他の核酸増
幅法によりHCV核酸を検出し得る。この方法で、例えば、新しい株が抗体の調
製に使用される株と免疫学的交差反応性でない場合には、抗原の変動あるいは変
化に関わらずHCVの異なる株の分離および特徴づけができる。特定のレクチン
による、マンノース末端糖タンパク質特有の認識を都合よく利用する多くの他の
方法がある。例えば、HCvピリオンあるいはタンパク質の夾雑が疑われる試料
を、ビオチンあるいはアビジン標識レクチンとインキュベートして、タンパク質
−レクチン複合体を沈澱させ得る。さらに、治療上の使用のために、例えば、
GNAに抗ウィルス化合物を結合することにより、化合物をピリオンに標的づけ
るために、レクチンのHCVタンパク質に対する親和性を使用し得る。あるいは
、血清または血漿からマンノース末端糖タンパク質を除去するために適切なレク
チンを使用して、HCV汚染の危険性を軽減あるいは削除し得る。
固定化マンノース結合タンパク質、特にConAあるいはGNAなどのレクチン
とのインキュベーションにより、粗細胞溶解物からElおよび/またはE2アシ
アロ糖タンパク質を単離するのがまさに好ましい。例えば、細胞を低張緩衝液中
で機械的に破砕して溶解し、その後遠心分離して核溶解物を調製し、さらに遠心
分離して粗ミクロソーム膜画分を得る。次に、粗膜画分をトリトンX−100、
NP40などの界面活性剤を含む緩衝液に溶解する。この界面活性剤抽出物をさ
らに遠心分離して不溶性粒子を沈降させ、得られた透明溶解物を、固定化マンノ
ース結合タンパク質、好ましくはアガロースあるいはセファロース0などに結合
されたGNAを有するクラマドグラフィーカラム中で、結合に十分な時間の間、
典型的には16−20時間インキュベートする。次に、この懸濁物を、El/E
2が溶出液中に現れるまでカラムにかけ、次に、結合に十分な時間の間、典型的
には約12−24時間の間カラム中でインキュベートする。次に、結合された物
質を界面活性剤(トリトンX−100,、NP40など)を含む別の緩衝液で洗
浄し、マンノースで溶出して、精製アシアロ糖タンパク質を供給する。溶出に際
しては、タンパク質が溶出物中に現れはじめるまでのみ溶出するこが好ましく、
その時点で溶出を停止し、そしてタンパク質の溶出を進める前にカラムを2−3
時間平衡化させる。このことで、大きなタンパク質凝集体が徐々に離脱する速度
に対して十分な時間を与えると考えられる。ElおよびElが天然形態(すなわ
ち、膜結合ドメインの切断なしに)でいっしょに発現される場合には、アシアロ
糖タンパク質の実質的な画分は、El:E2凝集体として現れる。電子顕微鏡で
の試験では、この凝集体の有意部分は、直径約4Or+mのだいたい球状の粒子
であり、これは完全なウィルスと予測される大きさである。これらの粒子は、自
己構成サブウィルス粒子(self−assem+abling 5ubvir
al parHcles)であるようだ。これらの凝集体は、真正HCVピリオ
ン粒子に非常に類似した四次構造を示すことが予測され、従って、高免疫原性ワ
クチンとして作用することが予測される。
El/E21[合体はさらに、例えば、Frac togel−DEAEあるい
はDEAE−Sepharosρの塩基性媒体上でのゲルクロマトグラフィーに
より精製され得る。Fractogel−DEAEゲルクロマトグラフィーを使
用して、純度約60−80%のEl/E2複合体が得られる。さらi、:、El
はO−1のLys残基を有するので、リシンプロテアーゼ処理により精製され得
る。複合体のりシンプロテアーゼ処理は、Elを破壊してElを容易に分離する
。
)ICVの組織特異性は、HCVエンベロープ糖タンパク質がマンノース末端化
されていることの観察と組み合わせて、そのウィルスが宿主細胞への入口を得る
ために、マンノースレセプターあるいはアシアロ糖タンパク質レセプター(AS
GR)を使用することを示唆する。マンノースレセプターは、マクロファージお
よび肝ジヌンイド細胞(sinusoidal cells)上に、一方、AS
GRは実質肝細胞(parenchymal hepatocytes)上に見
られる。従って、これらのレセプターの1つあるいは両方を発現する宿主細胞の
使用により、HCYを培養することが可能である。レセプターが維持される条件
を用いて、天然にレセプターを発現する一次細胞培養物を使用するか、あるいは
、レセプター発現用のベクターで、ヘラ、CHOlCOSなどの他の細胞系をト
ランスフェクトし得る。マンノースレセプターのクローニングならびにそのトラ
ンスフェクション、および線維芽細胞での発現は、M、E、 Taylorら、
J Biol Chew (1990) 265:12156−62に実証され
ている。ASGRのクローニングおよび配列決定は、K、 Drickamer
ら、J B o Cem (1984) 259ニア70−78ならびにM、
5piessら、P oc t Acad Set USA (1985) +
12:6465−69に、ラットHTC細胞での、機能性ASGRのトランスフ
ェクションおよび発現は、M、 McPhaulおよびP、 Berg、 Pr
oc at Acad Set USA (1986) 83:8863−67
ならびにM、 McPhaulおよびP。
Berg、 Mol Ce1l iol (1987) 7:1841−47に
記載されている。
従って、1つあるいは両方のレセプターを適切な細胞系にトランスフェクトする
ことは可能であり、得られた細胞をHCVの培養での増殖のために宿主として使
用することが可能である。
このような培養でのHCVの継代により、生ワクチンとしての使用に適した弱毒
化株の開発がなされる。レセプターが維持される条件を用いて、天然にレセプタ
ーを発現する一次細胞培養物を使用するか、あるいは、レセプター発現用のベク
ターで、ヘラ、CHO,COSなどの他の細胞系をトランスフェクトし得る。マ
ンノースレセプターのクローニングならびにそのトランスフェクション、および
線維芽細胞での発現は、Taylorら、上記で示されており、一方、ラットH
TC細胞での機能性ASGRのトランスフェクションおよび発現は、McPha
ulら、上記に記載されている。1つあるいは両方の組換えレセプターでトラン
スフェクトされた固定化細胞系を使用するのが好まし免疫原性組成物は、当該分
野に公知の方法に従って調製され得る。この組成物は、ポリペプチド、例えば、
El、El、あるいはEl/E2粒子組成物の免疫原性量を、通常は薬学的に受
容可能なキャリアと組み合わせて含有し、好ましくはさらにアジュバントを含有
する。[カクテル” cocktail″」が所望である場合には、例えば、E
lにElを加えた抗原など、HCVポリペプチドの組み合わせ物を、効果を高め
るためにともに混合し得る。El/E2凝集体のウィルス様粒子は、ことに有用
なワクチン抗原を提供すると考えられる。免疫原性組成物は、抗体の産生を誘発
するために、抗体原の提供あるいは動物内に防御免疫性を誘導するために、動物
に投与され得る。
薬学的に受容可能なキャリアには、組成物を受け入れる個体に対して、それ自身
が有害な抗体産生を誘発しない任意のキャリアが含まれる。適切なキャリアは、
典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミ
ノ酸、アミノ酸コポリマーなどの、大きな、徐々に代謝される高分子および不活
性ウィルス粒子である。このようなキャリアは、当業者には公知である。
組成物の効果を促進する好ましいアジュ/<ントには、限定はされないが、水酸
化アルミニウム(alum) 、米国特許第4゜606.918号に記載されて
いるN−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−
MDP) 、N−アセチル−ノルムラミルーミル−L−アラニル−D−イソグル
タミニルーム−アラニン−2−(1’−2。
−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチ
ルアミン(MTP−PE)およびRIBIが含まれ、これには、2%squal
ene/ TveJ’ 80乳液中に細菌から抽出された3つの成分、モノホス
ホリルリピッドA, トレハロースジマイコレートおよび細胞壁組織(MPL+
TDM+CWS)が含まれる。さらに、Stimulon (Ca+ibrfd
ge Bioscier+ce, Woreester.MA)などのアジュバ
ントが使用され得る。そのうえに、完全フロインドアジュバント(CFA)およ
び不完全フロインドアジュバント([FA)が、ヒト以外の適用ならびに研究用
に使用され得る。
免疫原性組成物は、典型的には、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールな
どの薬学的に受容可能な賦形剤を含有する。さらに、加湿剤あるいは乳化剤、p
H緩衝剤などの補助物質がこのような賦形剤に含有され得る。
典型的には、免疫原性組成物は、注射し得るように液体あるいは懸濁液のいずれ
かに調製され得、注射前の液体賦形剤に、溶液または懸濁液にするのに適した固
形もまた調製され得る。この調製物はさらに、アジュバントの効果を促進するた
めに乳化あるいはリポソーム中にカプセル化され得る。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫原性的に有効な量のHCVポ
リペプチド、および必要に応じて上記の任意の成分を含有する。「免疫原性的に
有効な量」とは、単回投与量あるいは一連の投与量の一部において、個体に投与
される量が、上記定義のように、治療に有効であることを意味する。この量は、
治療される個体の健康および生理的条件、治療される個体の分類学上の群(例え
ば、ヒト以外の霊長類、霊長類など)、抗体を合成するための個体免疫系の能力
、所望の防御の程度、ワクチンの調剤、治療医の医学上の評価、感染させるHC
’/の株、ならびに他の関連要因に依存して変化する。この量は、比較的に広範
囲にあるので、所定の試験により決定されることが期待される。
自己構成El/E2凝集体はまた、ワクチンキャリアとして働き、B型肝炎表面
抗原と同様の様式で、異種(非HCV)ハブテンを提供し得る(欧州特許第17
4, 444号を参照のこと)。この使用においては、El/E2凝集体は、そ
の凝集体に結合されたハブテンあるいは抗原に対して免疫応答を刺激し得る免疫
原性キャリアを提供する。抗原は、従来の化学的方法により結合されるか、ある
いはElおよび/またはElをコードする遺伝子へ、そのタンパク質の親水性領
域に相当する配置に、クローン化され得る。
免疫原性組成物は、典型的には皮下注射あるいは筋肉内注射などによって、通常
非経口的に投与される。さらに、他の投与形態に適した処方剤には、経口処方剤
あるいは生薬が含まれる。投薬処置は、単回投与計画あるいは複数回投与計画で
あり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
(以下余白)
c. ′LiIJi
以下に示されている実施例は、当該分野の専門家にさらに説明するために提供さ
れていて、いかなる方法においても限定することを意味していない。
尖1」■−
(クローニングおよび発現)
(A)ベクターを、欧州特許第318, 216号および欧州特許第388、
232号に記載されているように、HCVゲノムの5°部分を有するプラスミド
から構築した。カセットHCV (S/B)は、Met,にあたる−63ヌクレ
オチドから始まる、Met 、からLeu9ssまでのポリタンパク質の5゛末
端をコードするStul−Bgl目DNAフラグメントを有する。これには、コ
アタンノ(りN (C) 、El9 :/ノくり質(またときにはSと言う)、
E2タン/<り質(またときにはNS1と言う)、ならびにNS2a領域の5°
部分が含まれる。構築物の発現に際しては、個々のC, ElおよびE2タン/
4り質がタン/fり質分解プロセッシングにより産生される。
カセットHCV(A/B)は、 Met+にあたる一6ヌクレオチドから始まる
、MetlからLet+98aまでのポリタンノくり質の5°末端をコードする
ApaLl−Bglll DNAフラグメントを有する。これには、コアタンパ
ク質(C) 、Elタンノfり質(またときにはSと言う)、E2タンパク質(
またときにはNSIと言う)、ならびにNS2a領域の5′部分が含まれる。構
築物の発現に際しては、個々のC, ElおよびE2タンパク質がタンパク質分
解ブロセ・ノシングにより産生される。
カセットC−El(S/B) (Stul−BalI旧部分)は、Met 1か
らl1e34aまでの5゛末端(遺伝子中のBal旧部位)を有する。このカセ
ットの発現で、Cおよび多少の先端切断型のEl (El’)が発現される。3
°末端から切りだされた部分は、トランスロケーションシグナルとして作用する
と考えられている疎水性領域である。
カセットN5I(B/B) (BamHI−Bgl11部分)は、Elの小さな
3°部分(Net3anから)、全E2、ならびにN52a部分(Leus@a
まで)を有する。この構築では、Elフラグメントはトランスロケーションシグ
ナルとして作用する。
カセットTPA−NSIは、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−(tPA
)リーダーを、 Elの3°部分のかわりにトランスロケーションシグナルとし
て使用する。このカセットは、GlyasaからG1uaa+までのElの先端
切断型を有し、ここでは疎水性3゜末端は欠失されている。
各カセットを、T7およびインビトロにおけるウサギ網状赤血球発現による転写
および翻訳のための、合成β−グロビン5°非コーデイング配列をともなったベ
クターpGEM3Zと、この配列を伴わないベクターとに挿入した。組換えワク
シニアウィル7、 (rV’/)ベクターを、Charkrabartyら、M
o’l Ce月二Biol (1985) 5:3403−09に記載されてい
るように、そのカセットをプラスミド9SCL1 (Dr、 B、 Mo5s、
NIHから得た)に挿入し、その後ワクシニアウィルスと再度組み合わせて調
製した。
(B)かわりの発現ベクターを、Charkrabartyら、Mol Ce1
L肛o1 (1985) i:3403−09に記載されているように、psc
s9 (Dr、 B、 Mo5s、 N[Hから得た)のStu[部位とSpe
[部位との間にHCV(A/B)を挿入し、その後ワクシニアウィルスと再度組
み合わせて構築した。
(C)ヘラS3細胞を、500wLの滅菌遠心ホト/I/ (JA−100−タ
ー)中で、室温にて、20GOrpm、 7分間遠心分離して回収した。
ベレットを、別の培養培地(Joklik改変MEM攪拌培地(5pinnsr
mediu+g) + 5%ウマ血清およびゲンタマイシン)(rffi拌培
地」)中に最終濃度2 x 107細胞/■Lに再懸濁した。音波処理した粗v
v/5C59−HCVウィルスのストックを、細胞あたり8pfuの複数回感染
で加え、混合物を37℃で30分間攪拌した。
次に、感染細胞を8Lの攪拌培地を入れた攪拌フラスコに移し、37℃で3日間
インキュベートした。
次に、培養細胞を遠心分離して回収し、ベレットを緩衝液(10IIMトリスー
HCl、 pH9,0,152mL)・に再懸濁させた。次に、細胞を40 m
LのDounee Homogenizer (50ストローク)によりホモジ
ナイズし、核を遠心分離(5分間、1600 rp+*、 4℃、JA−20ロ
ーター)してベレットにした。核ペレットをトリス緩衝液(24mL)に再懸濁
し、再度ホモジナイズしてベレットにし、全上清を集めた。
集めた溶解物を、1G +gLずつにわけ、カップホルンソニケーターCcup
horn 5onicator)で、中程度の出力で、3 x 30分音波処理
した。音波処理された溶解物(15mL)を、5W28遠心チューブ中で、17
ILのスクロースクッション(36%)に重ねて、4℃で80分間、13,50
0 rp■で遠心分離してウィルスをベレットにした。そのウィルスベレットを
1 !SLのトリス緩衝液(1mMトリスHCI、 pH9,0)に再懸濁し、
−80℃で凍結した。
支息史呈
(インビトロ産生物とインビボ産生物との比較)(A) ElおよびElを、上
記実施例1に記載のベクターを用いて、インビトロおよびインビボの両方で発現
させ、35S−Met標識した。B10−40およびヘラ細胞を、インビボ発現
用にrVVベクターに感染させた。培地および細胞溶解物を組換えタンパク質に
ついて試験した。産生物は、ヒトHCV免疫血清により免疫沈降させ、一方、イ
ンビトロタンパク質は直接分析した。得られたタンパク質を5DS−PAGEに
より分析した。
網状赤血球(reticulocyte)発現系(HCV(S/B>ある4tは
HCV(A/B)を有するpGEM3Z)は、それぞれ分子量18 kD135
kDおよび72 kDを有するC、 ElおよびElを産生した。B10−4
0およびヘラ細胞の溶解物を、同じタンパク質を提示するHCV(S/B>、H
CV (A/B)あルイはC−El(S/B)を有するrvvテトランスフエト
した。網状赤血球系は効率のよいゴルジブロセッシングを供給せず、従ってシア
ル酸を供給しないので、インビトロおよびインビボ産生物が等しい移動度を示す
事実は、タンパク質がインビボにおいてシアル化されていないことを示唆する。
TPA−NSIを有するrVVベクターは、Elの細胞外分泌を促し、これはシ
アル化に一致する移動度の変化を示した。
(B) MCI/(S/B)を、インビトロで発現させ、ピオチン化レクチンの
パネルとインキユベートした。すなわち、GNA、 SNA。
PNA、 WGAおよびConAo イン+1ベージコンの後、複合体をアビジ
ン−アクリルビーズ上に集めて、洗浄し、Lae■mli試料緩衝液で溶出し、
5OS−PAGEで分析した。結果は、ElおよびElがGNAおよびConA
に結合したことを示した。このことはマンノースの存在を示している。GNAは
末端マンノース基に結合し、一方、ConAはα結合マンノースに結合する。5
NASPNAおよびWGAに結合しないことは、タンパク質がシアル酸、ガラク
トース−N−アセチルガラクトサミン、あるいはN−アセチルグルコサミンを含
まないことを示す。
(C)放射標識E1およびElを、HCV(S/B) (vv/5CII−HC
V)を有するrVVに感染させることによりB10−40中に産生じ、ヒトHC
v゛免疫血清で免疫沈降させた。免疫沈降させた物質の半分をノイラミニダーゼ
で一晩処理して、すべてのシアル酸を除去した。処理後、処理および未処理タン
パク質を5DS−PAGEで分析した。移動度には有意な差は観察されなかった
。このことはインビボではシアル化はされていないことを示す。
(D)放射標識E1およびElを、■cv(A/B) (vv/5C59−HC
V)を有するrVVに感染させることによりB10−40細胞中に産生し、コン
トロールとしてHCV配列を含まないvv/5CIIを用いて、ヒトFfCV+
血清で免疫沈降さるか、あるいはアクリルビーズに結合されたビオチン化GNA
レクチンにより沈澱させた。沈澱物を5OS−PAGEで分析した。データーは
、ElおよびElが、vv/5C59−HCv感染細胞中の主要なマンノース末
端タンパク質種であることを実証した。GNAは、ElおよびC2を細胞培養培
地から沈澱させるのに、ヒト抗血清と同程度に有効である。25 kDの成分が
観察されたが、これはワクシニア感染細胞に特異的であるようだ。
実W主
(レクチンを用いた精製)
(A、)ヘラS3細胞に、精製高力価vv/5C59−HCVウィルスのストッ
クを、5 pfu/細胞の感染多重度で接種し、混合物を37℃で30分間攪拌
した。次に、感染細胞を8Lの攪拌培地を入れた攪拌フラスクコに移し、37℃
で3日間インキコベートした。再度、細胞を遠心分離により集めて、氷上で低張
緩衝液(20■M HEPES、 10 d NaC1,1mM MgCl2.
120 mL)に再懸濁させた。
次に、細胞をDounce Ho+aogenizer (50Xトローク)で
ホモジナイズし、核を遠心分離(5分間、1600 rpm、 4℃、JA−2
00−ター)してベレットにした。ベレットを集めて、48 raLの低張緩衝
液に再懸濁し、再度ホモジナイズし、再度遠心分離し、再度集めて、−80°C
で凍結した。
次に、凍結上清を解凍して、核溶解後のミクロソーム膜画分を、JA−200−
ターでの13,500 rpm、 4℃における20分間の遠心分離により単離
した。上清を吸引して除去した。
ベレットを、96mLの界面活性剤緩衝液(20mMトリス−HCl、100
IDM NaC1,1mM EDTA、1 mM DDT、0.5%トリ トン
X−100、p11?、5)に取り出し、ホモジナイズ(50ストローク)した
。生成物を、13.500 rp■、4℃における20分間の遠心分離により透
明にし、上清を集めた。
GNA−アガロースカラム(1cm x 3 cm、 3 B GNA/ml、
ヒ゛−ズ、6 mLベッド容量、Vector Labs、 Burlinga
me、 CA)を界面活性剤緩衝液で予め平衡化した。上清試料を4℃で16−
20時間、流速1 mL/分で繰り返し循環(recirculation)に
よりカラムにかけた。次に、カラムを界面活性剤緩衝液で洗浄した。
精製El/E2タンパク質を、流速0.5mL/分でα−D−マンノシド(界面
活性剤緩衝液中0.9M)により溶出した。E 1/E 2が溶出液中に出現し
たとき溶出を停止し、カラムを2−3時間前度平衡化した。画分をウェスタンプ
ロットおよび銀染色により分析した。ピーク画分を集め、UV照射して残存する
ワクシニアウィルスを不活性化した。
(B) GNA−7カロース精製のElおよびC2アシアロ糖タンパク質を20
−60%グリセロールグラジェントで沈澱させた。グラジェントにかけたものを
分画し、タンパク質を5O5−PAGEおよびウェスタンブロッティングにより
分析した。プロットをGNAでプローブしてElおよびC2を同定した。得られ
た結果により、El:C2ヘテロダイマーの存在が示され、これは予測された速
度で沈澱する(すなわち、110 kDタンパク質の位置の特徴)。
HCVエンベロープタンパク質のより大きな凝集体もまた出現する。C2:C2
ホモダイマーもまた出現した。分別したEl:C2種もまた検出されたが、 C
2が、Elに比較してより大きな種であって、重なって再出現したようであった
。より大きな凝集体は、チログロブリンマーカーより有意に速(沈澱した。
(C) GNA−アガロース精製の61およびE、2を、l d EDTAを含
有する20−60%グリセロールグラジェントにより沈澱させた。
画分を、β−メルカプトエタノール(βME)の存在および不存在で5DS−P
AGEにより分析した。βMHの存在あるいは不存在でのElおよびC2の外見
上の量には、はとんどあるは全く相違は観察されなかった。このことは、ヘテロ
ダイマー間のジスルフィド結合がないことを示す。
(D) El/22m合体く純度約40%)を、Coulter DM−4サブ
ミクロン粒子分析機で分析した。220−60nレンジで物質を検出した。
(E) El/E2?!!合体(純度約40%)を、ホスホタングステン酸によ
るネガティブ染色で電子顕微鏡により分析した。電子顕微鏡写真は、直径約40
nmの球状形の粒子の存在を示した。E1/E2複合体をHCV” ヒト免疫血
清とインキユベートし、次に、ネガティブ染色でEMにより分析をした。大きな
凝集体を有する抗体複合体および小さな粒子を観察した。
尖鳳且ま
(クロマトグラフフィーによる精製)
(A)実施例3に記載のように調製したGNAレクチン精製物質(0,5−(1
,11mL)を10 x緩衝液A(20mM)リス−C1緩衝液、pH8,0,
I IDM EDTA)で希釈し、緩衝液Aで平衡化した、1.8x 1.5
CmのFractogel EMD DEAE−650(EM 5eparat
tons、Gibbstown、 New Jersey、カタログ番号161
1113)にかけた。El/E2を含むタンパク質画分を、同じ緩衝液で流速0
.2mL/分で溶出し、l mLずつの画分を集めた。ElおよびC2を含む画
分(5DS−PAGEで決定した)を集めて、−80℃で凍結した。
(B)上記パート(A)で精製した物質は、5OS−PAGEによる評価で、6
0−80%の純度を有する。推定E1およびC2のバンドの同定は、転移法(t
ransfer techntque)を用いた後のト末端配列分析により確認
した。実際には、fractogel−DEAE精製のEl/E2物質を、La
eitlf緩衝液(pH6,8,0,06M +−リス−CI、2.3%SDS
、 10%グリセロール、0.72 Mβ−メルカプトエタノール)を加えて還
元し、3分間煮沸した。次に、試料を10%ポリアクリルアミドゲルにのせた。
5DS−PAGE後、タンパク質を、0.2μmのポリビニリデンジフルオライ
ド(PVDF) 膜(Bio−Rad Laboratories、 Rfch
mond、 CA)に移した。予測される推定E1およびC2タンパク質のバン
ドをプロットから切り出し、ト末端アミノ酸分析を行った。物質の調製の間のア
ミノ末端のブロックを妨げることは特別にはしなかった。最初の15サイクルで
、E1試料は、Tyr−Gln−val−Arg−X−3er−Thr−Gly
−X−Tyr−His−Val−X−Asn−Aspの配列を有し、一方、C2
の配列は、Thr−Hi 5−Va t−T hr−G 1 y−X−X−A
l a−G I y−Hi 5−X−Va 1−X−G 1 y−Pheである
ことを示した。このアミノ酸配列のデーターは、DNA配列に対して予測された
配列と一致する。
上記のfraetogel−DEAEクロマトグラフィーによる精製El/E2
産物は、ゲル透過クロマトグラフ イーBfoSfil TSK−4000SV
Iカラムの排除容積領域に、多重のElおよびC2がともに溶出する事実によっ
て明確にされるように、凝集されると考えられる。このことは、天然条件下では
、有意量のEl/E2複合体は、少なくとも800kDの分子量を有することを
示す。分子量約650kDのEl/E2物質もまた観察された。
補正書の写しく翻訳文)提出書(特許法第184条の8)
Claims (20)
- 1.E1およびE2からなる群より選択される、単離HCVアシアロ糖タンパク 質。
- 2.前記E1アシアロ糖タンパク質が、組換えE1である、請求項1に記載のア シアロ糖タンパク質。
- 3.前記E1アシアロ糖タンパク質が、組換えE2である、請求項1に記載のア シアロ糖タンパク質。
- 4.ワクチンあるいはイムノアッセイに使用するために適したHCVアシアロ糖 タンパク質を産生する方法であって、E1およびE2からなる群より選択される HCVアシアロ糖タンパク質をコードする構造遺伝子で形質転換された下等真核 生物を適切な培養培地中で増殖させる工程;該構造遺伝子を発現させる工程;お よび該HCVアシアロ糖タンパク質を該細胞培養物から回収する工程; を包含する、方法。
- 5.前記下等真核生物が酵母である、請求項4に記載の方法。
- 6.ワクチンあるいはイムノアッセイに使用するために適したHCVアシアロ糖 タンパク質を産生する方法であって、E1およびE2からなる群より選択される HCVアシアロ糖タンパク質をコードする構造遺伝子で形質転換された哺乳類宿 主細胞を適切な培養培地中で増殖させる工程;該構造遺伝子を、シアル化を阻害 する条件下で発現させる工程;および 該HCVナシアロ糖タンパク質を該細胞培養物から回収する工程; を包含する、方法。
- 7.前記シアル化を阻害する条件が、小胞体からゴルジ体への糖タンパク質の移 送を阻害するのに十分な割合でのE1あるいはE2の発現を含む、請求項6に記 載の方法。
- 8.前記シアル化を障害する条件が、 宿主細胞の小胞体内にタンパク質を放出するのに十分な量のカルシウムモジュレ ーターの存在;を含む、請求項6に記載の方法。
- 9.HCVアシアロ糖タンパク質を精製する方法であって、HCVアシアロ糖タ ンパク質を含有する組成物をマンノース結合タンパク質に接触させる工程;およ び該マンノース結合タンパク質と結合する該組成物の部分を単離する工程; を包含する、方法。
- 10.前記マンノース孝吉合タンパク質が、ConAおよびGNAからなる群よ り選択されるレクチンである、請求項9に記載の方法。
- 11.請求項9に記載の方法であって、前記接触させる工程が、支持体に固定化 されたマンノース結合レクチンを有するカラム中で、HCVアシアロ糖タンパク 質を含有する前記組成物を、少なくとも1時間の間インキュベートすることを包 含し;そして 前記単離する工程が、マンノースを有する該HCVアシアロ糖タンパク質を溶出 する工程; を包含する、方法。
- 12.固体支持体、マンノース結合タンパク質、およびHCVアシアロ糖タンパ ク質に特異的な抗体を含み、該抗体およびレクチンの1つが該固体支持体に結合 されている、HCVアシアロ糖タンパク質の存在を検出するためのアッセイキッ ト。
- 13.HCVの露出あるいは感染を決定する方法において、体液試料中のいかな るHCVも、アッセイ前に、マンノース結合タンパク質に接触させることにより 濃縮される、方法。
- 14.HCVアシアロ糖タンパク質の組換え発現用のベクターで形質転換された 細胞であって、該ベクターが、グリコシル化シグナルHCVアシアロ糖タンパク 質該宿主細胞中で機能し得、そしてHCVアシアロ糖タンパク質の発現を調節し 得る調節配列および選択マーカーをコードする構造遺伝子を有し、該細胞が糖タ ンパク質をシアル化しない、細胞。
- 15.前記細胞が、グリコシル化欠損酵母株である、請求項14に記載の細胞。
- 16.前記ベクターが、ワクシニアウイルスベクターを有する、請求項14に記 載の細胞。
- 17.血漿、血清または他の生物学的液体中のHCVの存在を減少あるいは消滅 させる方法であって、該生物学的液体を、マンノース末端糖タンパク質に特異的 なマンノース結合タンパク質に接触させる工程;および 該生物学的液体を該マンノース結合タンパク質から分離する工程; を包含する、方法。
- 18.動物中での免疫応答を誘発する方法であって、薬学的に受容可能な賦形剤 中にHCVアシアロ糖タンパク質の有効量を含むワクチン組成物を提供する工程 ;該ワクチン組成物を該動物に投与する工程;を包含する、方法。
- 19.精製HCVE1/E2アシアロ糖タンパク質凝集体を含む、HCVアシア ロ糖タンパク質組成物。
- 20.細胞培養でHCVを増殖する方法であって、(a)マンノースレセプター およびアシアロ糖タンパク質レセプターからなる群より選択されるレセプターを 発現する細胞を供給する工程; (b)該細胞をHCVに感染させる工程;および(c)該感染細胞を培養する工 程; を包含する、方法。
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