ES2139591T5 - Asialoglicoproteinas del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (HCV) seleccionada entre una asialigricoproteína expresada en la región E1 del HCV y una asialoglicoproteína expresada en la región E2 del HCV, y agregados de las mismas, pudiéndose obtener dicha asialoglicoproteína mediante el método que comprende las etapas de:<br /><br />(i) cultivar una célula hospedante de mamífero tranformada con un gen estructural que codifica una asialoglicoproteína de HCV expresada en la región E1 de HCV, de la región E2 de HCV o de ambas, en un medio de cultivo adecuado, estando dicho gen estructural unido a una secuencia que codifica un conductor de la secreción que dirige a la asialoglicoproteína hacia el retículo endoplásmico;<br /><br />(ii) provocar la expresión de dicho gen estructural y conductor de la secreción, bajo condiciones que inhiben la sialilación; en el que dichas condiciones que inhiben la sialilación comprenden inhibir el transporte de las glicoproteínas desde el retículo endoplásmico hacia el aparato de Golgi de las células; y<br /><br />(iii) aislar dicha asialoglicoproteína de HCV del cultivo celular peoniendo en contacto dicha asialoglicoproteína de HCV con una proteína de unión a manosa, específica para glicoproteínas terminadas en manosa, en la que menos de aproximadamente 10% de los carbohidratos N-unidos totales son ácido siálico.<br /><br /><br /><br />

Description

Asialoglicoproteínas del virus de la hepatitis C.

Ámbito técnico

Esta invención trata de los ámbitos generales de la expresión de proteínas recombinantes y a virología. Más en concreto, la invención trata de glicoproteínas que resultan útiles para el diagnóstico, el tratamiento y la profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis C (HCV), y de métodos para producir dichas glicoproteínas.

Antecedentes de la invención

La hepatitis no A, no B (NANBH) es una enfermedad transmisible (o una familia de enfermedades) de lo cual se cree que está inducida por virus, y que puede distinguirse de otras formas de enfermedades hepáticas asociadas con virus, tales como las provocadas por el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis delta (HDV), el citomegalovirus (CMV) o el virus de EpsteinBarr (EBV). Las pruebas epidemiológicas sugieren que pueden existir tres tipos de NANBH: el tipo epidérmico que es portado por el agua; el tipo asociado a agujas o sanguíneo; y el tipo adquirido en comunidades que se produce de forma esporádica. El número de agentes causales es desconocido. Sin embargo, recientemente se ha identificado una nueva especie vírica, el virus de la hepatitis C (HCV), como la principal (sino la única) causa de la NANBH portada por sangre (BB-NANBH). Véase por ejemplo, el documento PCT WO89/04699. La hepatitis C parece ser la principal forma de hepatitis asociada a transfusiones en una serie de países o regiones, incluyendo Estados Unidos, Europa y Japón. También existen prueba que implican al HCV en la inducción del carcinoma hepatocelular. Por tanto, existe la necesidad de obtener un método eficaz para prevenir y tratar la infección por HCV.

La demanda de métodos específicos y sensibles para la búsqueda y la identificación de portadores del HCV y de sangre o productos sanguíneos contaminados con el HCV, resulta significativa. La hepatitis post-transfusión (PTH) se produce en aproximadamente 10% de los pacientes transfusionados, y el HCV es el responsable de hasta 90% de estos casos. El principal problema de esta enfermedad es su frecuente evolución hacia una lesión hepática crónica (25-55%).

El cuidado de los pacientes, así como la prevención de la transmisión del HCV mediante la sangre y los productos sanguíneos o mediante un contacto personal cercano, requiere unas herramientas de diagnóstico y pronóstico fiables para detectar ácidos nucleicos, antígenos y anticuerpos relacionados con el HCV. Además, también existe la necesidad de vacunes eficaces y de agentes terapéuticos inmunoterapéuticos para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad.

El HCV aparece en la sangre de individuos infectados en proporciones muy bajas, en relación a otros virus infecciosos, lo cual provoca que el virus sea muy difícil de detectar. Esta carga vírica baja probablemente sea la razón principal de que el agente causal de la hepatitis NANB no fuese detectado durante tanto tiempo. Aunque incluso en la actualidad se ha clonado, el HCV aún resulta difícil de cultivar y propagar. Por consiguiente, existe una fuerte necesidad de obtener medios recombinantes para producir proteínas del HCV de diagnóstico/terapéuticas/profilácticas.

Además, existe una gran necesidad de obtener una vacuna contra el HCV. Sin embargo, resulta extremadamente difícil cultivar el HCV en líneas celulares. Por tanto, no ha sido posible producir cepas víricas atenuadas mediante transferencias en serie en cultivos de tejidos/células.

Descripción de la invención

Se ha descubierto que dos proteínas del HCV, E1 y E2, parecen ser asialoglicoproteínas asociadas a membranas, cuando se expresan en sistemas recombinantes. Esto resulta sorprendente, porque las glicoproteínas no suelen permanecer en mamíferos en una forma terminada en manosa, sino que son modificadas con otros carbohidratos: la forma terminada en manosa típicamente sólo es transitoria. En el caso de E1 y E2 (tal como se expresan en nuestros sistemas), parece ser que la asialoglicoproteína es la forma final. La E1 (proteína de la envuelta 1) es una glicoproteína que presenta un peso molecular de aproximadamente 35 kD, que es traducida en la región. El predicha del genoma del HCV. La E2 (proteína de la envuelta 2) es una glicoproteína que presenta un peso molecular de aproximadamente 72 kD, que es traducida en la región NS1 (proteína no estructural 1) predicha del genoma del HCV, basándose en el modelo flavovírico del HCV. Puesto que las glicoproteínas víricas a menudo son altamente inmunogénicas, E1 y E2 son unos candidatos principales para su uso en inmunoensayos y en vacunas terapéuticas/profilác-
ticas.

El descubrimiento de que E1 y E2 no están sialiladas resultan significativo. La forma concreta de una proteína a menudo dicta el tipo de células que pueden servir como hospedantes adecuados para la expresión recombinante. Los procariotas, tal como E. coli, no glicosilan proteínas, y en general no resultan adecuados para la producción de glicoproteínas para su uso como antígenos, porque con frecuencia la glicosilación resulta importante para la completa antigenicidad, solubilidad y estabilidad de la proteína. Los eucariotas inferiores, tales como las levaduras y los hongos, glicosilan las proteínas, pero en general resultan incapaces de añadir restos ácido siálico terminales a los complejos de carbohidratos. Por tanto, las proteínas derivadas de levaduras pueden ser antigénicamente distintas de sus equivalentes naturales (no recombinantes). Se prefiere la expresión en células de mamífero para las aplicaciones en las cuales resulta importante la antigenicidad del producto, puesto que la glicosilación de la proteína recombinante debería parecerse en gran medida a la de las proteínas víricas salvajes.

Nuevas pruebas indican que el virus HCV puede obtener la entrada a las células hospedantes durante la infección a través del receptos de asialoglicoproteínas que se encuentra en hepatocitos, o mediante el receptor de manosa que se encuentra en células endoteliales hepáticas y macrófagos (en particular células de Kupffer). De forma sorprendente, se ha descubierto que la gran mayoría de E1 y E2 naturales no contienen restos ácido siálico terminales, sino que sólo están glicosiladas en el interior. Una pequeña fracción contiene además N-acetilglucosamina terminal. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es suministrar glicoproteínas de la envuelta del HCV que carecen (o sustancialmente carecen) de restos ácido siálico terminales.

Otro aspecto de la invención es un método para producir asialo-E1 o E2, en condiciones que inhiben la adición de ácido siálico terminal, por ejemplo mediante expresión en células de mamífero utilizando antibióticos para facilitar la secreción o la liberación.

Otro aspecto de la invención es un método para purificar E1 o E2 mediante la afinidad a las lectinas, que se unen a restos manosa terminales o a restos N-acetilglucosamina terminales.

Otro aspecto de la invención es una composición inmunogénica que incluye una asialoglicoproteína recombinante, seleccionada entre el grupo formado E1 y E2 de HCV, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puede incluirse opcionalmente un adyuvante inmunológico, si se desea.

Otro aspecto de la invención es un reactivo de inmunoensayo, que incluye una asialoglicoproteína recombinante seleccionada entre el grupo formado por E1 y E2 de HCV, junto con un soporte adecuado. Otro reactivo de inmunoensayo de la invención comprende una asialoglicoproteína recombinante seleccionada entre el grupo formado por E1 y E2 de HCV, junto con un marcador detectable adecuado.

Otro aspecto de la invención concierne a dímeros y agregados de mayor orden de E1 y/o E2. Una especie de la invención es un complejo de E2. Otra especie de la invención es un heterodímero E1:E2.

Otro aspecto de la invención es una composición de vacuna contra el HCV, que contiene agregados E1:E2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es un método para purificar complejos E1:E2.

Métodos para llevar a cabo la invención A. Definiciones

La expresión "asialoglicoproteína" hace referencia a una proteína glicosilada que se encuentra sustancialmente exenta de radicales ácido siálico. Las asialoglicoproteínas pueden prepararse de forma recombinante, o mediante purificación a partir de un cultivo celular o de fuentes naturales. Las asialoglicoproteínas que se prefieren en la presente son las derivadas del HCV, preferiblemente las glicoproteínas E1 y E2, más preferiblemente las E1 y E2 recombinantes (rE1 y rE2). Una proteína se encuentra "sustancialmente exenta" de ácido siálico, dentro del alcance de esta definición, si la cantidad de restos ácido siálico no interfiere sustancialmente con la unión de la glicoproteína a las proteínas de unión a manosa, tal como GNA. Este grado de sialilación en general se obtiene cuando menos de aproximadamente 10% de los carbohidratos N-unidos totales sonácido siálico, más preferiblemente menos de aproximadamente 5%, y lo más preferible menos de aproximadamente 2%.

La expresión "E1", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a una proteína o un polipéptido expresado dentro de los primeros 400 aminoácidos de una poliproteína de HCV, denominada a veces proteína E o S. En su forma natural, es una glicoproteína de 35 kD que se encuentra fuertemente asociada a membranas. En las cepas de HCV más naturales, la proteína E1 es codificada en la poliproteína vírica después de la proteína C (central). La proteína E1 se extiende desde aproximadamente el aminoácido 192 a aproximadamente el aa383 de la poliproteína de longitud completa. La expresión "E1", tal como se utiliza en la presente, también incluye análogos y mutantes truncados que presentan inmunorreacción cruzada con la E1 natural.

La expresión "E2", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a una proteína o un polipéptido expresado dentro de los primeros 900 aminoácidos de una poliproteína de HCV, denominada a veces proteína NS1. En su forma natural, es una glicoproteína de 72 kD que se encuentra fuertemente asociada a membranas. En las cepas de HCV más naturales, la proteína E2 sigue a la proteína E1. La proteína E2 se extiende desde aproximadamente el aa384 a aproximadamente el aa820. La expresión "E2", tal como se utiliza en la presente, también incluye análogos y mutantes truncados que presentan inmunorreacción cruzada con la E2 natural.

La expresión "agregado", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a un complejo de E1 y/o E2, que contiene más de un monómero E1 o E2. Los dímeros E1:E1, los dímeros E2:E2 y los heterodímeros E1:E2 son todos "agregados" dentro del alcance de esta definición. Las composiciones de la invención también pueden incluir agregados mayores, y puedan presentar unos pesos moleculares mayores que 800 kD.

La expresión "partícula", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a un agregado de E1, E2 o E1/E2 que resulta visible mediante microcopía electrónica, y que presenta una dimensión de al menos 20 nm. Las partículas preferidas son las que presentan un aspecto aproximadamente 40 nm mediante microscopía electrónica.

La expresión "purificada", cuando se aplica a proteínas en la presente, hace referencia a una composición en la cual la proteína deseada comprende al menos 35% del componente proteico total de la composición. La proteína deseada preferiblemente comprende al menos 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente 60%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 70%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y lo más preferible al menos aproximadamente 95% del componente proteico total. La composición puede contener otros compuestos, tales como carbohidratos, sales, lípidos, disolventes y similares, sin afectar a la determinación del porcentaje de pureza tal como se utiliza en la presente. Una asialoglicoproteína de HCV "aislada" pretende ser una composición de asialoglicoproteína de HCV que es al menos 35% pura.

Una "proteína de unión a manosa", tal como utiliza en la presente, pretende ser una lectina u otra proteína, que se une de forma específica a proteínas que presentan una glicosilación terminada en manosa (por ejemplo, asialoglicoproteína), por ejemplo lectinas de unión a manosa, anticuerpos específicos para la glicosilación terminada en manosa, proteínas del receptor de manosa (R.A.B. Ezekowitz et al., J. Exp. Med. (1990), 176:1785-1794), proteínas del receptor de asialoglicoproteínas (H. Murata et al., J Biol. Chem. (1990), 265:11295-11298), proteína de unión a manosa sérica (I. Schuffenecker et al., Cytogenet Cell Genet (1991), 56:99-102; K. Sastry et al., J. Immuol (1991), 147:692-697), proteína de unión a asialoglicoproteínas sérica y similares. Las lectinas de unión a manosa incluyen, por ejemplo, GNA, concanavalina A (ConA), y otros lectinas con similares propiedades de unión.

La expresión "lectina GNA" hace referencia a la aglutinina de Galanthus nivalus, una lectina disponible en el mercado que se une a glicoproteínas terminadas en manosa.

Una glicoproteína "recombinante", tal como se utiliza en la presente, es una glicoproteína expresada a partir de un polinucleótido recombinante, en el cual el gen estructural que codifica la glicoproteína se expresa bajo el control de secuencias reguladoras, que en la naturaleza no se encuentran adyacentes al gen estructural, o en el cual el gen estructural está modificado. Las modificaciones del gen estructural pueden incluir sustituciones de los diferentes codones con codones degenerados (por ejemplo, para utilizar codones preferidos por el hospedante, para eliminar o generar sitios de rotura por enzimas de restricción, para controlar la formación de horquillas, etc.), y la sustitución inserción o deleción de un número limitado de codones que codifican diferentes aminoácidos (preferiblemente no más de aproximadamente 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente 5% en número de la secuencia de aminoácidos natural debe ser alterada), y similares. De forma similar, un receptor "recombinante" hace referencia a una proteína de receptor expresada a partir de un polinucleótido recombinante, en el cual el gen estructural que codifica el receptor es expresado bajo el control de secuencias reguladoras que en la naturaleza no s encuentran adyacentes al gen estructural, o en el cual el gen estructural está modificado.

El término "polipéptido aislado" hace referencia a un polipéptido que se encuentra sustancialmente exento de otros componentes víricos de HCV, en particular polinucleótidos. Una composición polipeptídica se encuentra "sustancialmente exenta" de otro componente si el peso del polipéptido en la composición es de al menos 70% del peso del polipéptido y otro componente combinados, más preferiblemente de al menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente de al menos aproximadamente 90%, y lo más preferible 95% o mayor. Por ejemplo, una composición que contiene 100 \mug/ml de E1 y sólo 3 \mug/ml de otros componentes de HCV (por ejemplo, DNA, lípidos, etc.) se encuentra sustancialmente exenta de "otros componentes víricos de HCV", y por tanto es una composición de un polipéptido aislado dentro del alcance de esta definición.

La expresión "conductos de la secreción" hace referencia a un polipéptido que cuando es codificado en el extremo N-terminal de una proteína, provoca que la proteína sea segregada hacia el medio de cultivo de la célula hospedante, después de su traducción. El conductor de la secreción en general se deriva de la célula hospedante empleada.

La expresión "modulador del calcio" hace referencia a un compuesto capaz de secuestrar o de unir iones de calcio dentro del retículo endoplásmico, o que afecta a la concentración de iones de calcio dentro del ER mediante su efecto sobre proteínas reguladoras del calcio (por ejemplo, proteínas del canal de calcio, bombas de calcio, etc.). Los moduladores del calcio adecuados incluyen, por ejemplo, tapsigargina, EGTA (ácido etilenglicol-bis[\beta-aminoetil éter]-N,N,N',N'-tetraacético). El modulador preferido en la presente es la tapsigargina (véase por ejemplo, O. Thastrup et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990), 87:2466-2470).

La expresión "inmunogénico" hace referencia a la capacidad que posee una sustancia para provocar una respuesta inmune humoral y/o celular, tanto por sí misma como unida a un vehículo, en presencia o ausencia de un adyuvante. La "neutralización" hace referencia a una respuesta inmune que bloquea la infectividad, parcial o totalmente, de un agente infeccioso. Una "vacuna" es una composición inmunogénica capaz de obtener protección contra el HCV, parcial o completa, que resulta útil para el tratamiento de un individuo.

La expresión "líquido biológico" hace referencia a un fluido obtenido a partir de un organismo, tal como suero, plasma, saliva, secreciones gástricas, mucus y similares. En general, un fluido biológico será examinado para detectar la presencia de partículas de HCV. Algunos fluidos biológicos se utilizan como fuente de otros productos, tales como factores de coagulación (por ejemplo factor VIII:C), albúmina de suero, hormona del crecimiento y similares. En estos casos, es importante que el fluido biológico que actúa como fuente se encuentre exento de contaminación por virus, tal como el HCV.

B. Método general

La región E1 del genoma del HCV se describe en el documento EP 388.232 como la región "E", mientras que E2 se describe como "NS1". La región E1 comprende aproximadamente los aminoácidos 192-383 en la poliproteína vírica de longitud completa. La región E2 comprende aproximadamente los aminoácidos 384-820. Las secuencias completas de prototipos de estas proteínas (cepa HCV-1) se encuentran disponibles en la técnica (véase el documento EP 388.232), así como los métodos generales para clonar y expresar las proteínas. La E1 y la E2 pueden expresarse a partir de un polinucleótido que codifica los primeros 850-900 aminoácidos de la poliproteína de HCV: el procesamiento post-traduccional en la mayoría de los hospedantes eucariotas rompe la poliproteína inicial para producir C, E1 y E2. Puede truncarse el tremo 5' de la región codificadora para reducir la cantidad de proteína C producida.

Puede lograrse la expresión de las asialoglicoproteínas mediante una serie de métodos. Por ejemplo, puede obtenerse la expresión en eucariotas inferiores (tales como levaduras), que normalmente no añaden restos ácido siálico a la proteínas glicosiladas. En sistemas de expresión de levaduras, se prefiere en la presente emplear un conductos de la secreción, tal como el conductor de factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae, de forma que la proteína se expresa hacia el medio de cultivo después de la traducción. También se prefiere en la presente emplear mutantes deficientes en cuanto a la glicosilación tal como pmr1, puesto que estos mutantes suministran sólo una glicosilación interior, y a menudo segregan proteínas heterólogas con una elevada eficacia (H.K. Rudolph et al., Cell (1989), 58:133-145). Como alternativa, puede emplearse otra especie de levadura, tal como Pichia pastoris, que exprese glicoproteínas que contienen 8-9 restos manosa con una disposición de la cual se cree que se parece a la disposición de la glicosilación interior observada en mamíferos y S. cerevisiace.

Como alternativa, se puede modificar la expresión en células de mamífero, y bloquear la glicosilación terminal (adición de ácido siálico). Los constructos recombinantes preferiblemente incluirán una señal de secreción para asegurar que la proteína se dirige hacia el retículo endoplásmico. El transporte hacia el aparato de Golgi parece estar bloqueado por las propias E1 y E2: un elevado nivel de expresión de E1 o E2 en células de mamífero parece detener la secreción de todas las proteínas celulares en el retículo endoplásmico o en el aparato de Golgi. Además puede emplearse un mutante deficiente en cuanto a la glicosilación. Véase por ejemplo, P. Stanley, Ann. Rev. Genet. (1984), 18:525-552. En el caso en que un mutante para la glisolicación o para el transporte exprese la E1 o la E2 con sialilación, los restos ácido siálico terminales pueden eliminarse mediante un tratamiento con neuraminidasa.

El rendimiento debe aumentarse más mediante el uso de un modulador del calcio para obtener la liberación de las proteínas desde el interior del retículo endoplásmico. Los moduladores adecuados incluyen tapsigargina, EGTA y A23817 (véase por ejemplo, O. Thapstrup et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1990), 87:2466-2470). Por ejemplo, puede expresarse una gran cantidad de E1 o E2 de forma intracelular en células de mamífero (por ejemplo, CHO, COS. Células HeLa y similares), mediante la tranfección con un vector de virus de vaccinia recombinante. Después de dejar un tiempo para permitir la expresión de las proteínas y la acumulación en el retículo endoplásmico, las células se exponen a un modulador del calcio en una concentración lo suficientemente grande para provocar la liberación de los contenidos del ER. La proteína luego se recupera del medio de cultivo, que se sustituye para el siguiente
ciclo.

Además, puede resultar ventajoso expresar una forma truncada de la proteína de la envuelta. Ambas E1 y E2 parecen poseer un dominio muy hidrófobo, que al parecer ancla a la proteína dentro del retículo endoplásmico y evita una liberación eficaz. Por tanto, puede resultar deseable eliminar porciones de la secuencia que se encuentran en una o más de las regiones aa170-190, aa260-290 o aa330-380 de E1 (numerando desde el comienzo de la poliproteína), y aa660-830 de E2 (véase por ejemplo la figura 20-1 del documento EP 388.232). Es probable que al menos uno de estos dominios hidrófobos forme una región transmembrana, que no resulta esencial para la antigenicidad de la proteína, y que por tanto puede ser eliminada sin que se produzca un efecto perjudicial. La mejor región para ser eliminada puede determinarse llevando a cabo un pequeño número de experimentos de deleción, que se encuentran dentro de la experiencia de un técnico normal. La deleción del extremo 3' hidrófobo de E2 da como resultado la secreción de una porción de la E2 expresada, con la sialilación de la proteína segregada.

Pueden utilizarse una diversidad de vectores para obtener la expresión. Los eucariotas inferiores, tales como las levaduras, se transforman de forma típica con plásmidos, utilizando el método de precipitación de fosfato de calcio, o son transfectados con un virus recombinante. Los vectores pueden republicarse dentro de la célula hospedante de forma independiente, o pueden integrarse en el genoma de la célula hospedante. Los eucariotas superiores pueden transformarse con plásmidos, pero son infectados de forma típica con un virus recombinante. La vaccinia resulta especialmente preferida, puesto que la infección por vaccinia detiene la expresión de las proteínas de las células hospedante. Las células hospedantes preferidas en la presente incluyen las líneas celulares de plasmacitoma y HeLa. En el presente sistema, esto significa que la E1 y E2 se acumulan como la principal especie glicosilada en el ER del hospedante. Puesto que la rE1 y la rE2 serán las glicoproteínas predominantes que están terminadas en manosa, pueden ser purificadas con facilidad a partir de las células utilizando lectinas, tales como la aglutinina de Galanthus nivalus (GNA), que se unen a los restos manosa terminales.

Las proteínas que en la naturaleza se expresan como glicoproteínas terminadas en manosa son relativamente raras en la fisiología de mamíferos. En la mayoría de los casos, una glicoproteína de mamífero está terminada en manosa sólo como intermedio transitorio en la vía de la glicosilación. El hecho de que las proteínas de la envuelta del HCV, expresadas de forma recombinante, contienen una glicosilación terminada en manosa o (en menor grado) en N-acetilglucosamina, significa que las proteínas del HCV y los viriones completos pueden separarse y purificarse parcialmente de las proteínas endógenas, utilizando lectinas específicas para la manosa o la N-acetilglucosamina terminales. Las proteínas recombinantes parecen auténticas y se cree que son esencialmente idénticas a las proteínas de la envuelta que se encuentran en el virión libre maduro, o a una forma de una proteína de la envuelta asociada a células. Por tanto, pueden emplearse lectinas, tales como la GNA, para proteínas terminadas en manosa, y WGA (aglutinina del germen de trigo) y sus equivalentes para proteínas terminadas en N-acetilglucosamina. Pueden emplearse lectinas unidas a una fase sólida (por ejemplo, una columna de lectina-Sepharose®) para separar la E1 y la E2 de sobrenadantes de cultivos celulares y otros fluidos, por ejemplo para la purificación durante la producción de antígenos para usar en vacunas o en inmunoensayos.

Como alternativa, puede suministrarse una lectina adecuada para aislar la E1, la E2 o los viriones de HCV a partir de muestras de fluidos o de tejidos procedentes de sujetos de los cuales se sospecha que presentan una infección por HCV. Puesto que las glicoproteínas terminadas en manosa son relativamente raras, este procedimiento debe servir para purificar las proteínas presentes en una muestra, reduciendo sustancialmente la señal de fondo. Después de su unión a la lectina, la proteína de HCV puede detectarse utilizando anticuerpos anti-HCV. Si están presentes viriones completos, como alternativa pueden detectarse ácidos nucleicos de HCV utilizando técnicas de PCR u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos dirigidos contra regiones conservadas del genoma de HCV (por ejemplo, la región no codificadora 5'). Este método permite el aislamiento y la caracterización de diferentes cepas de HCV, sin preocuparse por la variación o la deriva antigénica, por ejemplo en casos en los cuales una nueva cepa no presente inmunorreacción cruzada con la cepa utilizada para preparar anticuerpos. Existen otras muchas formas de aprovechas el reconocimiento exclusivo de las glicoproteínas terminadas en manosa por parte de lectinas concretas. Por ejemplo, pueden incubarse muestras de las cuales se sospecha que contengan viriones o proteínas de HCV, con biotina o con lectinas marcadas con avidita, y precipitar el complejo proteína-lectina utilizando avidita o biotina. También puede utilizarse la afinidad de la lectina por las proteínas de HCV para el transporte de compuestos hasta los viriones para un uso terapéutico, por ejemplo conjugando un compuesto antivírico a la GNA. Como alternativa, pueden utilizarse lectinas adecuadas para eliminar las glicoproteínas terminadas en manosa de fracciones de suero o de plasma, reduciendo o eliminando con ello el riesgo de contaminación por HCV.

En la presente se prefiere aislar las asialoglicoproteínas E1 y/o E2 de lisados de células brutos, mediante incubación con una proteína de unión a manosa inmovilizada, en particular una lectina tal comodona o GNA. Las células se lisan, por ejemplo, mediante rotura mecánica en un tampón hipotónico, seguido de centrifugación, para preparar un lisado post-nuclear, que después se centrifuga para obtener una fracción de membranas microsómicas bruta. La fracción de membranas bruta posteriormente se solubiliza en un tampón que contiene un detergente, tal como Triton® X-100, NP40 o similares. De este extracto de detergente con posteridad se elimina el material en partículas insoluble mediante centrifugación, y el lisado aclarado resultante se incuba en una columna de cromatografía que comprende una proteína de unión a manosa inmovilizada, preferiblemente GNA unida a un soporte sólido tal como azarosa o Sepharose®, durante un periodo de tiempo suficiente para la unión, de forma típica de 16 a 20 horas. La suspensión luego se aplica a la columna hasta que E1/E2 comienzan a aparecer en el eluyente, después se incuban en la columna durante un periodo de tiempo suficiente para la unión, de forma típica aproximadamente 12-24 horas. El material unido luego se lava con más tampón que contiene detergente (por ejemplo, Triton® X-100, NP40 o similares), y se eluye con manosa para suministrar la asialoglicoproteína purificada. En la elusión, resulta preferible fluir sólo hasta que la proteína comienza a aparecer en el eluyente, en cuyo momento se detiene la elusión y se permite que la columna se equilibre durante 2-3 horas, antes de llevar a cabo la elusión de la proteína. Se cree que esto permite el tiempo suficiente para la lenta salida esperada de los grandes agregados de proteínas. En los casos en los cuales la E1 y la E2 se expresan juntas en forma nativa (es decir, sin que se trunque el dominio de unión a membranas), una fracción sustancial de las asialoglicoproteínas aparecen como agregados E1:E2. Cuando se examinan mediante microscopía electrónica, una porción importante de estos agregados aparecen como partículas aproximadamente esféricas, que presentan un diámetro de aproximadamente 40 nm, que es el tamaño esperado de los virus intactos. Parece ser que estas partículas son partículas subvíricas de auto-ensamblaje. Se espera que estos agregados muestran una estructura cuaternaria muy similar a la estructura de las partículas de viriones de HVC auténticas, y por tanto se espera que sirvan como vacunas muy inmunogénicas.

Los complejos E1/E2 pueden ser aún más purificados mediante una cromatografía en gel en un medio básico, por ejemplo, Fractogerl-DEAE o DEAE-Sepharose®. Utilizando la cromatografía en gel de Fractogel-DEAE, pueden obtenerse complejos E1/E2 con una pureza aproximada de 60-80%. Puede purificarse posteriormente la E1 mediante un tratamiento con la lisina-proteasa, porque la E1 presenta 0-1 restos Lys. El tratamiento del complejo con lisinaproteasa destruye la E2 y permite una fácil separación de la E1.

La especificad de tejido del HCV, junto con la observación de que las glicoproteínas de la envuelta de HCV están terminadas en manosa, sugiere que el virus emplea el receptor de manosa o el receptor de asialoglicoproteínas (ASGR), con el fin de lograr entrar en las células hospedantes. Los receptores de manosa se encuentran sobre macrófagos y células sinusoidales hepáticas, mientras que los ASGR se encuentran sobre hepatocitos parenquimáticos. Por tato, debería ser posible cultivar el HVC empleando células hospedantes que expresen uno o ambos receptores. Pueden emplearse cultivos celulares primarios que expresen el receptor de forma natural, utilizando condiciones en las cuales se mantiene el receptor, o puede transfectarse otra línea celular, tal como HeLa, CHO, COS y similares, con un vector que suministra la expresión del receptor. La clonación del receptor de manosa y su transfección y expresión en fibroblastos han sido demostrados por M.E. Taylor et al., J. Biol. Chem. (1990), 265:12156-12162. La clonación y la secuenciación del ASGR fueron descritas por K. Drickamer et. al., J. Biol. Chem. (1984), 259:770-778 y M. Spiess et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985), 82:6465-6469; la transfección y la expresión de ASGR funcionales en células HTC de rata han sido descritas por M. McPhaul y P. Berg, Proc. Nat. Acad. Scri. USA (1986), 83:8863-8867, y M. McPhaul y P. Berg, Mol Cell Biol (1987), 7:1841-1847. Por tanto resulta posible transfectar uno o ambos receptores en líneas celulares adecuadas y utilizar las células resultantes como hospedantes para la propagación de HCV en cultivos. Unas transferencias en serie del HCV en dichos cultivos deberían dar como resultado el desarrollo de cepas atenuadas, que resultan adecuadas para su uso como vacunas vivas. Pueden emplearse cultivos celulares primarios que expresen de forma natural el receptor, utilizando condiciones en las cuales se mantiene el receptor, o puede transfectarse otra línea celular, tal como HeLa, CHO, COS y similares, con un vector que suministra la expresión del receptor. La clonación del receptor de manosa y su transfección y expresión en fibroblastos han sido demostrados por M.E. Taylor et al., supra, mientras que la transfección y la expresión de ASGR funcionales en células HTC de rata ha sido descrita por McPhaul et al., supra. En la presente se prefiere emplear una línea celular inmortalizada transfectada con uno o ambos receptores recombinantes.

Pueden prepararse composiciones inmunogénicas según métodos conocidos en la técnica. Las presentes composiciones comprende una cantidad inmunogénica de un polipéptido, por ejemplo composiciones de E1, E2 o partículas E1/E2, combinada habitualmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, que preferiblemente comprende también un adyuvante. Si se desea un "cóctel", puede mezclarse una combinación de polipéptidos de HCV, como por ejemplo los antígenos de E1 más los de E2, para aumentar la eficacia. Se espera que las partículas de tipo vírico formadas por agregados de E1/E2 suministren un antígeno de vacuna particularmente útil. Las composiciones inmunogénicas pueden administrarse a animales para inducir la producción de anticuerpos, para suministrar una fuente de anticuerpos o para inducir una inmunidad protectora en el animal.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que no induce la producción de anticuerpos que resulten perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son de forma típica grandes macromoléculas de metabolización lenta tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos; y partículas de virus inactivas. Estos vehículos son muy conocidos por lo que tiene experiencia en la técnica.

Los adyuvantes preferidos para aumentar la eficacia de la composición incluyen, pero sin limitación: hidróxido de aluminio (alumbre), N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) tal como se encuentra en la patente de EEUU nº 4.606.918, N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmotoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etalamina (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monosfosforil lípido A, dimicolato de trehalosa, y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween® 80. Además pueden utilizarse adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA). También puede utilizarse adyuvante de Freund competo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA) para aplicaciones no humanas y para objetivos de investigación.

Las composiciones inmunogénicas contendrán de forma típica vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además en estos vehículos pueden incluirse sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares.

De forma típica, las composiciones inmunogénicas se preparan como composiciones inyectables, en forma de soluciones líquidas o de suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para lograr un mayor efecto adyuvante.

Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz del polipéptido de HCV, así como cualquiera de los componentes anteriormente mencionados, según sea necesario. Una "cantidad inmunológicamente eficaz" significa que la administración de esta cantidad a un individuo, en una sola dosis o como parte de una serie, resulta eficaz para el tratamiento, según se ha definido con anterioridad. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y las condiciones físicas del individuo que va a ser tratado, del grupo taxonómico del individuo que va a ser tratado (por ejemplo, un primate no humano, un primate, etc.), de la capacidad del sistema inmune del individuo para sinterizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación de la situación médica que realiza el médico encargado, de la cepa de HCV infecciosa, y de otros factores importantes. Se espera que la cantidad se incluirá en un intervalo relativamente amplio, que puede determinarse mediante ensayos habituales.

Los agregados de E1/E2 de auto-ensamblaje también pueden actuar como vehículos de vacunas, para presentar haptenos heterólgos (no HCV), de la misma forma que el antígeno de superficie de la hepatitis B (véase la solicitud de patente europea 174.444). En este uso, los agregados de E1/E2 suministran un vehículo inmunogénico capaz de estimular una respuesta inmune frente a haptenos o a antígenos conjugados con el agregado. El antígeno puede conjugarse mediante métodos químicos convencionales, o puede clonarse en el gen que codifica E1 y/o E2 en un emplazamiento que se corresponde con una región hidrófila de la proteína.

Las composiciones inmunogénica se administran de forma convencional por vía parental, de manera típica mediante inyección, por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular. Otras formulaciones que resultan adecuadas para otras vías de administración incluyen formulaciones orales y supositorios. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis. La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunogénicos.

C. Ejemplos

Los ejemplos presentados a continuación se ofrecen para guiar también al que trabaja en la técnica, y no deben considerarse como limitación de la invención en ninguna forma.

Ejemplo 1 Clonación y expresión

(A) Se construyeron vectores a partir de plásmidos que contienen la porción 5' del genoma de HCV, tal como se describe en los documentos EP 318.216 y EP 388.232. El módulo HCV(S/B) contiene un fragmento de DNA StuI-BgIII que codifica el extremo 5' de la poliproteína desde Met_{1} hasta leu_{906}, comenzando en el nucleótido -63 en relación a la Met_{1}. Esto incluye la proteína central (C), la proteína E1 (a veces denominada S), la proteína E2 (también denominada NS1), y una porción 5' de la región Ns2a. Tras la expresión del constructo, las proteínas individuales C. E1 y E2 son producidas mediante precosamiento proteolítico.

El módulo HCV(A/B) contiene un fragmento de DNA ApaLI-BgIII que codifica el extremo 5' de la poliproteína desde Met_{1} hasta Leu_{906}, comenzando en el nucleótido -6 en relación a la Met_{1}. Esto incluye la proteína central (C), la proteína E1 (a veces denominada S), la proteína E2 (también denominada NS1), y una porción 5' de la región NS2a. Tras la expresión del constructo, las proteínas individuales C, E1 y E2 son producidas mediante procesamiento proteolítico.

El módulo C-E1(S/B) (una porción StuI-BamHI) contiene el extremo 5' desde Met_{1} hasta Ile_{340} (un sitio BamHI en el gen). La expresión de este módulo da como resultado la expresión de C y una E1 algo truncada (E1'). La porción truncada desde el extremo 3' es una región hidrófoba, que se cree que actúa como una señal de translocación.

El módulo NS1(B/B) (una porción BamHI.BgIII) contiene una pequeña porción 3' de E1 (desde Met_{364}), la E2 completa, y una porción de NS2a (hasta Leu_{906}). En este constructo, el fragmento E1 actúa como una señal de translocación.

El módulo TPA-NS1 emplea un conductor del activador de plasminógeno tisular humano (tPA) como señal de translocación, en lugar de la porción 3' de E1. El módulo contiene una forma truncada de E2, desde Cly_{406}, en el cual se elimina el extremo 3' hidrófobo.

Cada módulo se insertó en el vector Pgem3z (Promega) con y sin una secuencia no codificadora 5' de \beta-globina sintética para la transcripción y la traducción, utilizando T7 y la expresión de reticulocitos de conejo in vitro. Se prepararon vectores del virus de la vaccinia recombinantes (rVV) insertando los módulos en el plásmido Psc11 (obtenido del doctor B. Moss, NIH) seguido de la recombinación con virus de vaccinia, tal como se describe Charkrabarty et al., Mol. Cell. Biol. (1985), 5:3403-3409.

(B) Se construyó un vector de expresión alternativo insertando HCV(A/B) entre los sitios StuI y SpeI de pSC59 (obtenido del doctor B. Moss, NIH), seguido de la recombinación con virus de vaccinia, tal como describe Charkrabarty et al., Mol. Cell. Biol. (1985), 5:3403-09.

(C) Se recogieron células HeLa S3 mediante centrifugación durante 7 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente, en botellas de centrífuga de 500 ml estériles (rotor JA-10). Los sedimentos se respondieron a una concentración final de 2 x 10^{7} células/ml en más medio de cultivo (medio de Spinher MEM modificado por Joklik + suero de caballo al 5% y gentimicina) ("medio de Spinner"). Se añadió una cepa de virus vv/SC59-HCV sonicada bruta con una multiplicidad de infección de 8 pfu/célula, y la mezcla se agitó a 37ºC durante 30 minutos. Las células infectadas luego
se trasladaron a un matraz de Spinner que contenía 8 l de medio de Spinner, y se incubaron durante 3 días a 37ºC.

Las células cultivadas luego se recogieron mediante centrifugación, y los sedimentos se resuspendieron en tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 9,0,152 ml). Las células luego se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Dounce de 40 ml (50 golpes), y los núcleos se sedimentaron mediante centrifugación (5 minutos, 1600 rpm, 4ºC, rotor JA-20). Los sedimentos nucleares se resuspendieron en tampón Tris (24 ml), se volvieron a homogeneizar y se sedimentaron de nuevo, reuniendo todos los sobrenadantes.

El lisado reunido se dividió en alícuotas de 10 ml, y se sonicó 3 x 30 minutos en un sonicador de forma de cuerno ajustado a potencia media. El lisado sonicado (15 ml) se dispuso en capas sobre bandas de sacarosa de 17 ml (36%) en tubos de centrífuga SW28, y se centrifugó a 13.500 rpm durante 80 minutos a 4ºC para sedimentar los virus. El sedimento de virus se resuspendió en 1 ml de tampón Tris (Tris HCl mM, pH 9,0) y se congeló a -80ºC.

Ejemplo 2 Comparación de productos in vitro e in vivo

(A) Se expresaron E1 y E2 in vitro e in vivo, y se marcaron con ^{35}S-Met utilizando los vectores descritos en el ejemplo 1 anterior. Se infectaron células BSC-40 y HeLa con los vectores rVV para la expresión in vivo. Se examinaron el medio y los lisados para detectar sproteínas recombinantes. Los productos se inmunoprecipitaron utilizando suero inmune a HCV humano, mientras que las proteínas in vitro se analizaron directamente. Las proteínas resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE.

El sistema de expresión de reticulocitos (pGEM3Z con HCV(s/b) o HCV(A/B)) produjo las proteínas C, E1 y E2, que presentaban un peso molecular de aproximadamente 18 kD, 35 kD y 72 kD, respectivamente. Los lisado procedentes de células BSC-40 y HeLa transfectadas con rVV que contenían HCV(S/B), HCV(A/B) o C-E1(S/B), mostraban las mismas proteínas. Puesto que el sistema de reticulocitos no suministra un procesamiento en el Golgi eficaz, y por tanto no suministra ácido siálico, el hecho de que ambos productos in vitro e in vivo muestren idénticas movilidades sugiere que las proteínas no se sialilaron in vivo. Sólo el vector rVV que contenía TPA-NS1 produjo secreción extracelular de E2, que mostraba una movilidad alterada coherente con la sialilación.

(B) Se expresó HCV(S/B) in vitro y se incubó con una serie de lectinas biotiniladas: GNA, SNA, PNA, WGA y ConA. Después de la incubación, los complejos se recogieron sobre esferas acrílicas-avidina, se lavaron, se eluyeron con tampón de muestras de Laemmli, y se analizaron mediante SDS-PAGE. Los resultados demuestran que E1 y E2 se unían a GNA y ConA, lo cual indica la presencia de manosa. La GNA se une a los grupos manosa terminales, mientras que la ConA se une a cualquier manosa \alpha-unida. La inexistencia de unión a SNA, PNA y WGA indica que ninguna de las proteínas contenía ácido siálico, galactosa-N-acetilgalactosamina o N-acetilglucosamina.

(C) Se produjeron E1 y E2 marcadas de forma radiactiva en células BSC-40 mediante infección con rVV que contenía HCV(S/B) (vv/SC11-HCV), y se inmunoprecipitaron con suero inmune HCV^{+} humano. La mitad del material inmunoprecipitado se trató durante la noche con neuraminidasa para eliminar el ácido siálico. Después del tratamiento, las proteínas tratadas y no tratadas se analizaron mediante SDS-PAGE. No se observó ninguna diferencia significativa en la movilidad, indicando una falta de sialilación in vivo.

(D) Se produjeron E1 y E2 marcadas de forma radiactiva en células BSC-40 mediante infección con rVV que contenía HCV(A/B) (vv/SC59-HCV), y se inmunoprecipitaron con suero inmune a HCV^{+}humano, o se precipitaron utilizando lectina GNA biotinilada unida a esferas acrílicas, utilizando como control vv/SC11 exento de secuencias de HCV. Los precipitados se analizaron mediante SDS-PAGE. Los datos demuestran que E1 y E2 eran las especies principales de proteínas terminadas en manosa en las células infestadas con vv/SC59-HCV. La GNA resultó tan eficaz como antisuero humano para precipitar E1 y E2 desde el medio de cultivo celular. Se observó un componente de 24 kD, pero parece ser específico de las células infectadas con vaccinia.

Ejemplo 3 Purificación utilizando lectina

(A) Se inocularon células HeLa S3 con una cepa de virus vv/SC59-HCV purificada de elevada valoración, con una multiplicidad de infección de 5 pfu/célula, y la mezcla se agitó a 37ºC durante 30 minutos. Las células infectadas luego se trasladaron a un matraz de Spinner que contenía 8 l de medio de Spinner, y se incubaron durante 3 días a 37ºC. Las células se volvieron a recoger mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón hipotónico (HEPES 20 Mm, NaCl 10 Mm, MgCl_{2} 1 mM, 120 ml) con hielo. Las células luego se homogeneizaron con un homogeneizador Dounce (50 golpes), y los núcleos se sedimentaron mediante centrifugación (5 minutos, 1600 rpm, 4ºC rotor JA-20). Los sedimentos se reunieron, se resuspendieron en 48 ml de tampón hipotónico, se rehomogeneizaron, se recentrifugaron, se reunieron otra vez, y se congelaron a -80ºC.

Los sobrenadantes congelados luego se descongelaron, y la fracción de membranas microsómicas del lisado post-nuclear se aisló mediante centrifugación durante 20 minutos en un rotor JA-20 a 13.500 rpm a 4ºC. El sobrenadante se retiró mediante aspiración.

Los sedimentos se suspendieron en 96 ml de tampón detergente (Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 Mm, ddt 1 mM, Triton® X-100 al 0,5%, pH 7,5) y se homogeneizaron (50 golpes). El producto se aclaró mediante centrifugación durante 20 minutos a 13.500 rpm, 4ºC, y se recogieron los sobrenadantes.

Una columna de GNA-agarosa (1 cm x 3 cm, esferas de 3 mg de GNA/ml, 6 ml de volumen del lecho, Vector Labs, Burlingame, CA) se preequilibró con tampón detergente. La muestra de sobrenadante se aplicó a la columna con recirculación, con un caudal de 1 ml/min durante 16-20 horas a 4ºC. La columna luego se lavó con tampón deter-
gente.

Las proteínas E1/E2 purificadas se fluyeron con \alpha-D-manósido (0,9 M en tampón detergente), con un caudal de 0,5 ml/minuto. La elusión se detuvo cuando aparecieron E1/E2 en el eluyente, y se dejó que la columna se re-equilibrase durante 2-3 horas. Las fracciones se analizaron mediante un análisis de transferencia Western y tinción con plata. Las fracciones de los picos se reunieron y se irradiaron con UV para inactivar cualquier virus de vaccinia residual.

(B) Se sedimentaron las asialoglicoproteínas E1 y E2 purificadas en GNA-agarosa a través de gradientes de glicerol al 20-60%. Los gradientes se fraccionaron y las proteínas se analizaron mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western. Las transferencias se ensayaron con GNA, para la identificación de E1 y E2. Los resultados indican la presencia de un heterodímero E1:E2, que sedimenta a la velocidad esperada (es decir, una posición característica de una proteína de 110 kD). También se observan agregados mayores de proteínas de la envuelta de HCV. También se observaron homodímeros E1:E2. La E2 parecía sobre-representada en las especies mayores en relación a la E1, aunque también se detectaron especies discretas de E1:E2. Los agregados mayores sedimentaron de forma significativamente más rápida que el marcador de tiroglobulina.

(C) Se sedimentaron las E1 y E2 purificadas en GNA-agarosa a través de gradientes de glicerol al 20-60% que contenían EDTA 1 mM. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE con y sin \beta-mercaptoetanol (\betaME). Apenas se observó diferencia , o no se observó en absoluto, en la abundancia aparente de E1 y E2 en presencia o ausencia de \betaME, indicando la ausencia de enlaces disulfuro entre heterodímeros.

(D) Se analizaron los complejos E1/E2 (aproximadamente 40% puros) en un analizador de partículas sub-micrónicas Coulter DM-4. Se detectó material en un intervalo de 20-60 nm.

(E) Se analizaron los complejos E1/E2 (aproximadamente 40% puros) mediante microscopía electrónica, utilizando tinción negativa con ácido fosfowolfrámico. La microscopía electrónica reveló la presencia de partículas que presentaban un aspecto esférico, y un diámetro de aproximadamente 40 nm. Los complejos E1/E2 se incubaron con suero inmune humano HCV^{+}, y luego se analizaron mediante microscopía electrónica con tinción negativa. Se observaron complejos de anticuerpos que contenían grandes agregados y partículas más pequeñas.

Ejemplo 4 Purificación cromatográfica

(A) El material purificado mediante lectina GNA preparado según se ha descrito en el ejemplo 3 (0,5-0,8 ml) se diluyó 10x con tampón A (tampón Tris-Cl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM), y se aplicó a una columna 1,8 x 1,5 cm de Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, Nueva Jersey, nº de catálogo 16833), equilibrada en tampón A. La fracción de proteínas que contenía E1/E2 se eluyó con el mismo tampón a un caudal de 0,2 ml/minuto, y se recogieron fracciones de 1 ml. Las fracciones que contenían E1 y E2 (determinadas mediante SDS-PAGE) se reunieron y se almacenaron a -80ºC.

(B) El material purificado en la parte (A) anterior presentaba una pureza de 60-80%, según fue estimada mediante SDS-PAGE. La identificación de las bandas E1 y E2 putativas fue confirmada mediante análisis de la secuencia N-terminal, después de utilizar una técnica de transferencia. Con este fin, el material de E1/E2 purificado mediante Fractogel-DEAE se redujo mediante la adición de tampón de Lemmli (pH 6,8, Tris-Cl 0,06 M, SDS al 2,3%, glicerol al 10%, \beta-mercaptoetanol 0,72 M), y se hirvió durante 3 minutos. La muestra luego fue cargada sobre un gel de poliacrilamida al 10%. Después del SDS-PAGE, la proteína se traslada a una membrana de 0,2 \mum de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (Bio-rad Laboratorios, Richmond, CA). Las respectivas bandas de E1 y E2 putativas se extrajeron de la transferencia, y se sometieron a un análisis de aminoácidos N-terminales, aunque no se tuvo un cuidado excesivo por evitar el bloqueo amino-terminal durante la preparación del material. Los términos 15 ciclos revelaron que la muestra de E1 presentaba la secuencia Tyr-Gl-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Asp, mientras que la secuencia de E2 era Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe. Estos datos de la secuencia de aminoácidos están de acuerdo con los esperados a partir de las correspondientes secuencias de DNA.

Se cree que el producto de E1/E2 purificado anteriormente mediante cromatografía en Fractogel-DEAE es un agregado, tal como prueba el hecho de que una gran cantidad de E1 y de E2 coeluye en la región de volumen de vacío de una columna cromatográfica de permeación en gel Bio-Sil TSK-4000 SW. Esto indica que bajo condiciones nativas, una cantidad significativa del complejo E1/E2 presentaba un peso molecular de al menos 800 kD. También se observó un material de E1/E2 que presentaba un peso molecular de aproximadamente 650 kD.

Claims (24)

1. Una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (HCV) seleccionada entre una asialogricoproteína expresada en la región E1 del HCV y una asialoglicoproteína expresada en la región E2 del HCV, y agregados de las mismas, pudiéndose obtener dicha asialoglicoproteína mediante el método que comprende las etapas de:

(i)

cultivar una célula hospedante de mamífero transformada con un gen estructural que codifica una asialoglicoproteína de HCV expresada en la región E1 de HCV, de la región E2 de HCV o de ambas, en un medio de cultivo adecuado, estando dicho gen estructural unido a una secuencia que codifica un conductor de la secreción que dirige a la asialoglicoproteína hacia el retículo endoplásmico;

(ii)

provocar la expresión de dicho gen estructural y conductor de la secreción, bajo condiciones que inhiben la sialilación; en el que dichas condiciones que inhiben la sialilación comprenden inhibir el transporte de las glicoproteínas desde el retículo endoplásmico hacia el aparato de Golgi de las células; y

(iii)

aislar dicha asialoglicoproteína de HCV del cultivo celular poniendo en contacto dicha asialoglicoproteína de HCV con una proteína de unión a manosa, específica para glicoproteínas terminadas en manosa, en la que menos de aproximadamente 10% de los carbohidratos N-unidos totales son ácido siálico.

2. Una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (HCV) seleccionada entre una asialoglicoproteína expresada en la región E1 del HCV y una asialoglicoproteína expresada en la región E2 del HCV, y agregados de las mismas, en la que dicha asialoglicoproteína se puede obtener mediante el método que comprende las etapas de:

(i)

cultivar una célula hospedante de mamífero transformada con un gen estructural que codifica una asialoglicoproteína de HCV expresada en la región E1 de HCV, de la región E2 de HCV o de ambas, en un medio de cultivo adecuado;

(ii)

provocar la expresión de dicho gen estructural bajo condiciones que inhiben la sialilación; y

(iii)

aislar dicha asialoglicoproteína de HCV del cultivo celular poniendo en contacto dicha asialoglicoprotéina de HCV con una proteína de unión a manosa, específica para glicoproteínas terminadas en manosa en la que menos de aproximadamente 10% de los carbohidratos N-unidos totales son ácido siálico.

3. Una asialoglicoproteína según la reivindicación 2, en las que dichas condiciones que inhiben la sialilación comprenden la expresión de la asialoglicoproteína en una proporción suficiente para inhibir el transporte de glicoproteínas desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi.

4. Una asialoglicoproteína según la reivindicación 2, comprendiendo dichas condiciones que inhiben la sialilación una cantidad suficiente de un modulador del calcio, que provoca la liberación de proteínas dentro del retículo endoplásmico de la célula hospedante.

5. Una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha asialoglicoproteína se expresa en la región E1 del HCV.

6. Una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha asialoglicoproteína se expresa en la región E2 del HCV.

7. Una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha asialoglicoproteína es un agregado E1/E2.

8. Una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha proteína de unión a manosa es una lectina seleccionada entre ConA y GNA.

9. Una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha proteína de unión a manosa está inmovilizada sobre un soporte.

10. Una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho contacto comprende la incubación de dicha composición de la cual se sospecha que contiene dicha asialoglicoproteína, en una columna que comprende una lectina de unión a manosa inmovilizada sobre un soporte durante un período de al menos una hora, y en la que dicho aislamiento comprende fluir dicha asialoglicoproteína con manosa.

11. Una composición que comprende una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (HCV) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Una composición según la reivindicación 11, que comprende una cantidad eficaz de una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (HCV) en un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método para inducir una respuesta inmune en un animal.

13. Un método de inmunoensayo que comprende poner en contacto una muestra biológica con una asialoglicoproteína de HCV según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el cual dicha asialoglicoproteína lleva un marcador detectable.

14. Un método para purificar una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (HCV) seleccionada entre una asialoglicoproteína expresada en la región E1 del HCV, una asialoglicoproteína expresada en células de mamífero en la región E2 del HCV y agregados de las mismas, comprendiendo dicho método poner en contacto una composición de la cual se sospecha que contiene una asialoglicoproteína de HCV, con una proteína de unión a manosa; y aislar la porción de la composición que se une a dicha proteína de unión a manosa en la que menos de aproximadamente 10% de los carbohidratos N-unidos totales son ácido siálico

15. Un método según la reivindicación 14, en el cual dicha proteína de unión a manosa es una lectina seleccionada entre ConA y GNA.

16. Un método según la reivindicación 14 ó 15, en la cual dicha proteína de unión a manosa está inmovilizada sobre un soporte.

17. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el cual dicho contacto comprende la incubación de dicha composición de la cual se sospecha que contiene dicha asialoglicoproteína, en una columna que comprende una lectina de unión a manosa inmovilizada sobre un soporte, durante un periodo de al menos una hora; y en el cual dicho aislamiento comprende fluir dicha asialoglicoproteína con manosa.

18. Una asialoglicoproteína de HCV que puede obtenerse mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17.

19. Una asialoglicoproteína de HCV según la reivindicación 18, en la que dicha asialoglicoproteína es asialo-E1.

20. Una asialoglicoproteína de HCV según la reivindicación 18, en la que dicha asialoglicoproteína es asialo-E2.

21. Una asialoglicoproteína de HCV según la reivindicación 18, en la que dicha asialoglicoproteína es asialo-E1/E2.

22. Una composición que comprende una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21.

23. Un kit de ensayo para detectar la presencia del HCV, comprendido dicho kit de ensayo:

un soporte sólido;

una proteína de unión a manosa específica; para glicoproteínas terminadas en manosa;

y

un anticuerpo específico para un asialoglicoproteína de HCV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos uno de dicho anticuerpo y dicha proteína de unión a manosa está unido a dicho soporte sólido.

24. Un método para determinar la exposición al HCV o la infección por el mismo, en el cual cualquier virión o polipéptido de la hepatitis C presente en una muestra de fluido corporal se concentra poniéndolo en contacto con una proteína de unión a manosa, antes de ensayar con un anticuerpo específico para una asialoglicoproteína de HCV según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y en el cual dicha proteína de unión a manosa es específica para glicoproteínas terminadas en manosa.