KR20070114209A - 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법 - Google Patents

리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070114209A
KR20070114209A KR1020077023368A KR20077023368A KR20070114209A KR 20070114209 A KR20070114209 A KR 20070114209A KR 1020077023368 A KR1020077023368 A KR 1020077023368A KR 20077023368 A KR20077023368 A KR 20077023368A KR 20070114209 A KR20070114209 A KR 20070114209A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ala
gly
val
thr
Prior art date
Application number
KR1020077023368A
Other languages
English (en)
Inventor
마티 살버그
카타리나 헐트그렌
Original Assignee
트리펩 아베
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 트리펩 아베 filed Critical 트리펩 아베
Publication of KR20070114209A publication Critical patent/KR20070114209A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

본 명세서에서는 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물 및 인간 등의 동물에서 백신의 효과를 증강시키기 위한 조성물 및 방법에 대해 개시한다. 보다 구체적으로, 질병, 바람직하게는 HCV 감염을 치료 및 예방하는 데 사용하기 위한 리바비린 및 항원, 바람직하게는 간염 C 바이러스(HCV)에 존재하는 에피토프를 보유하는 항원을 함유하는 백신 조성물에 대해 개시한다.

Description

리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법{VACCINES CONTAINING RIBAVIRIN AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물과 인간 등의 동물에게서 백신 효과를 증강시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 바람직한 구체예는 리바비린의 면역 보강제(adjuvant)로서의 용도 및 리바비린과 항원을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
인간, 사육 가축, 스포츠용 동물, 및 가정 애완 동물의 질병을 예방하기 위해 백신을 사용하는 것은 일반적인 일이다. 그러나, 백신에 사용되는 항원은 추후의 항원에의 노출에 대한 보호를 제공하기에 충분한 농도로 항체 역가를 높이거나 또는 장기간에 걸쳐 그러한 농도를 나타낼 수 있는 잠재력을 유지하기에 충분한 면역원성을 보유하지 못한 경우가 빈번하다. 또한, 다수의 백신은 대체로 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 1차 면역 방어 작용인 세포 매개 면역을 유도하는 기능이 부족하다. 더 강력한 백신의 개발 및 항원 함유 제제의 면역원성을 증강시키는 방법에 대해 현재 상당히 많은 연구가 집중되고 있다[참고 문헌의 예: 미국 특허 제6,056,961호; 제6,060,068호; 제6,063,380호; 및 Li 등의 문헌, Science 288:2219- 2222(2000)].
그러한 "약한" 백신 중에서도 악명이 높은 것은 간염 B 백신이다. 예를 들어, 간염 B 바이러스에 대한 재조합 백신, 예컨대 Genhevacb(Pasteur Merieux Serums et Vaccines, 58, Avenue Leclerc 69007 Lyon, France), Engerixb(스미스, 클라인 앤드 심볼 프렌치) 및 Recombivaxhb(머크, 샤프, 앤드 돔)는 0일, 30일, 및 60일 또는 80일 째 3회 이상 접종한 후 1년 후에 반드시 추가 접종하는 경우에만 효력이 나타난다(Chedid 등, 미국 특허 제6,063,380호). 또한, 이들 백신을 접종받은 다수의 피험자들은 반응을 나타낸다고 하더라도 미미하게 반응한다. HBV 감염은 세계 여러 지역의 풍토병이기 때문에, 기존의 HBV 백신이 지닌 낮은 면역원성 특성은 매우 심각한 문제로 대두되었다.
더 강력한 체액 및/또는 세포 반응을 얻기 위해, 백신에 존재하는 항원에 대한 환자의 면역 반응을 증강시키는 물질 중에 함유된 백신을 투여하는 것은 보편적인 일이다. 백신 프로토콜에 가장 일반적으로 사용되는 면역 보강제는 오일 제제와 명반이다(Chedid 등, 미국 특허 제6,063,380호). 더 많은 종류의 안전하고 효과적인 면역 보강제가 요구되고 있다.
뉴클레오사이드 유사체는 바이러스 복제를 감소시킬 수 있는 능력으로 인해 항-바이러스 요법에 널리 사용되어 왔다[Hosoya 등, J. Inf. Dis., 168:641-646(1993)]. 리바비린 (1-β-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)는 RNA 및 DNA 바이러스 복제를 억제하기 위해 사용되어 온 합성 구아노신 유사체이다(Huffman 등, Antimicrob. Agents. Chemother., 3:235(1973); Sidwell 등, Science, 177:705(1972)]. 리바비린은 IMP를 IMX(IMX는 후에 GMP로 전환된다)전환시키는 이노시톨 모노-포스페이트(IMP) 디하이드로게나제(IMPDH)의 경쟁적 억제제인 것으로 밝혀졌다. 이에 대해서는 De Clercq의 문헌[Anti viral Agents: characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact, Academic press, Inc., New York N.Y., pp. 1-55(1993)]을 참조할 수 있다. GTP의 세포내 풀은 장기간의 리바비린 치료로 인해 고갈되었다.
연구자들은 일부 구아노신 유사체가 항바이러스 활성을 지닐 뿐 아니라 면역계에도 영향을 미친다는 것을 알게 되었다(미국 특허 제6,063,772호 및 제4,950,647호). 리바비린은 기능성 체액 면역 반응을 억제하고[Peavy 등, J. Immunol., 126:861-864(1981); Powers 등, Antimicrob. Agents. Chemother., 22:108-114(1982)], 비만 세포 분비의 IgE-매개 조절을 억제하는 것으로 확인되었다[Marquardt 등, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 240:145-149(1987)]. 몇몇 연구자들은 리바비린의 일일 경구 요법은 인간과 마우스에 면역 조절 효과를 나타낸다고 보고하였다[Hultgren 등, J. Gen. Virol., 79:231-2391(1998) 및 Cramp 등, Gastron. Enterol., 118:346-355(2000)]. 그러나, 리바비린이 면역계에 미치는 영향에 관한 현재의 지식은 아직 미미한 수준이다.
본 발명은 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물과 인간 등의 동물에게서 백신 효과를 증강시키기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로, 바람직한 구체예는 리바비린의 면역 보강제(adjuvant)로서의 용도 및 리바비린과 항원을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명자들은 리바비린이 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 면역 보강제로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 명세서에서 개시하는 본 발명의 구체예는 항원 및 리바비린을 함유하는 "강력한" 백신 제제를 포함한다. 일반적으로 이들 제제는 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 충분한 양의 리바비린을 함유한다. 본 발명의 다른 양태는 인간을 비롯한 동물의 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 방법을 포함한다. 한 방법의 예를 들어 보면, 항원에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 먼저 확인한 다음, 항원과 함께 일정량의 리바비린을 투여한다. 어떤 방법에서는, 리바비린과 항원을 함께(예컨대, 단일 조성물로서) 투여하고, 다른 방법에서는 리바바린과 항원을 개별적으로 투여한다. 몇몇 구체예는 또한 리바비린과 항원을 함유하는 조성물의 제조 방법과 그 용도에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 리바비린 및 사실상 어떠한 종류의 항원 또는 에피토프 도 포함하지만, 바람직한 조성물은 리바비린과 간염 바이러스 항원 또는 에피토프를 함유한다. 항원 또는 에피토프는 펩티드 또는 핵산계(예컨대, 펩티드 항원을 암호화하는 RNA 또는 피험체에 도입되면 펩티드 항원을 발현하는 작제물)일 수 있다. 리바비린 및 간염 A 바이러스(HAV) 유래의 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물이 한 구체예가 된다. 리바비린 및 간염 B 바이러스(HBV) 유래의 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물 역시 한 구체예가 된다. 적절한 HBV 항원의 예로는 간염 B 표면 항원(HBsAg), 간염 코어 항원(HBcAg), 간염 e 항원(HBeAg) 및 이들 분자를 암호화하는 핵산을 들 수 있다. 그 밖에도 리바비린 및 간염 C 바이러스(HCV) 유래의 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물도 한 구체예가 된다. 적절한 HCV 항원으로는 HCV 서열(예컨대, NS3 및/또는 NS4A)의 하나 이상의 도메인 및 이들 분자를 암호화하는 핵산을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
새로운 HCV 서열 역시 발견되었다. HCV에 감염된 환자로부터 HCV 게놈의 신규 NS3/4A 단편을 클로닝하고 그 서열을 분석하였다(서열 번호 16). 이 서열은 가장 밀접하게 관련된 HCV 서열과의 상동성이 93%에 불과한 것으로 확인되었다. 이 신규 펩티드(서열 번호 17) 및 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 및 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 본 발명의 한 구체예가 된다. 특히 바람직한 구체예는 리바비린 및 서열 번호 17의 HCV 펩티드 또는 아미 노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들(서열 번호 25) 또는 상기 펩티드 또는 단편들을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물이다.
또한, 본 발명자들은 NS3/4A 펩티드의 절두형 돌연변이체 및 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이체가 면역원성이 크다는 사실을 발견하였다. 이들 신규 펩티드(서열 번호 29-32 및 43-49) 및 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이들의 단편들(예, 서열 번호 26, 17 및 33-42), 이들 분자들을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 및 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 한 구체예가 된다. 특히 바람직한 구체예는 리바비린 및 서열 번호 29-32및 43-49의 하나 이상의 HCV 펩티드 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들(서열 번호 26, 27 및 33-42) 또는 상기 펩티드 또는 단편들을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물이다.
또한, 상기 항원의 혼합물을 함유한 조성물도 본 발명의 한 구체예가 된다. 예를 들어, 몇몇 조성물은 HBV 항원, HAV 항원 및 리바비린; 또는 HBV 항원, HCV 항원 및 리바비린; 또는 HAV 항원, HCV 항원 및 리바비린; 또는 HBV 항원, HAV 항원, HCV 항원 및 리바비린을 포함한다. 다른 구체예는 리바비린 및 전술한 항원의 혼합물을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예는 비제한적인 예로 명반, 오일 및 면역 반응을 증강시키는 기타 화합물을 비롯하여 당업계에 공지된 다른 면역 보강제, 결합제, 유화제, 캐리어 및 충전제를 포함하기도 한다.
본 명세서에 개시된 조성물의 제조 방법 및 사용 방법 역시 본 발명의 한 양 태이다. 몇몇 방법은 단일 조성물(예, 백신 조성물)로 제제화하기 위해 펩티드 또는 핵산 항원(예, HAV, HBV, HCV 항원)과 리바비린을 혼합하여 실시한다. 바람직한 방법은 HCV의 하나 이상의 도메인 상에 존재하는 에피토프를 갖는 HCV 항원(예, NS3 및/또는 NS4A)과 리바비린을 혼합하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 바람직한 방법은 이를 필요로 하는 동물에게 충분한 양의 리바비린 및 간염 바이러스 항원(예, HBV 항원, HAV 항원, HCV 항원, 이들 항원 중 하나를 암호화하는 핵산 또는 이들의 임의의 조합물)을 투여하는 것을 포함한다. 한가지 실시 방법의 예를 들면, 간염 바이러스 항원에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물(예컨대, 간염에 감염될 위험이 있거나 이미 감염된 동물)을 먼저 확인하고, 간염 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 유효한 양의 리바비린 및 간염 바이러스 항원(단일 조성물로 또는 개별적으로)을 투여한다. 바람직하게는, HCV에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 확인한 후, 상기 동물에게 리바비린 및 서열 번호 1, 6, 7, 또는 17에 존재하는 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 투여한다. 특히 바람직한 방법은 HCV에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 확인한 후, 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 충분한 양의 리바비린 및 HCV 항원[예, NS3/4A(서열 번호 17), 돌연변이 NS3/4A(서열 번호 29-32 및 43-49), 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4-10, 10-20, 20-30, 또는 30-50개인 이들의 단편(예, 서열 번호 25-27 및 33-42), 또는 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산]을 함유하는 조성물을 상기 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 가축, 스포츠용 동물 또는 애완 동물과 인간 등의 동물에게서 백신 효과를 증강시키는 효과가 있고, 본 발명의 신규 펩티드 및 이 펩티드를 암호화하는 핵산은 수용체에게 유효 면역 반응을 제공하는 조성물을 제조할 수 있는 강력한 면역원으로서 작용하는 효과가 있다.
본 발명자들은 리바비린 및 항원(예컨대, 바이러스, 박테리아, 사상균, 효모 또는 기생충 등의 병원균의 에피토프를 포함하는 분자)을 함유하는 조성물이 항원에 대한 동물의 면역 반응을 증강 및/또는 촉진한다는 사실을 발견하였다. 즉, 리바비린은 효과적인 "면역 보강제(adjuvant)"라는 사실을 발견하였는데, "면역 보강제"는 본 명세서에서 특정 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 능력을 보유한 물질을 의미하는 용어로 사용된다. 리바비린의 면역 보강 활성은 항원에 대한 면역-매개 보호작용의 현저한 증가, 항원에 대해 생성된 항체 역가의 증가 및 증식성 T 세포 반응의 증가에 의해 분명히 확인되었다.
본 명세서에서는 리바비린 및 항원 또는 에피토프를 함유하는 몇 가지 조성물(예, 백신)에 대해 기술한다. 리바비린을 함유하는 백신 조성물은, 예컨대 리바비린의 양, 리바비린의 형태, 및 항원의 종류에 따라 다양할 수 있다. 항원은 펩티드 또는 핵산(예컨대, 펩티드 항원을 암호화하는 RNA 또는 피험체에 도입되면 펩티드 항원을 발현하는 작제물)일 수 있다. 바람직한 조성물은 리바비린 및 간염 바이러스 항원(예, HAV 항원, HBV 항원, HCV 항원, 이들 분자들을 암호화하는 핵산, 또 는 이들의 임의의 조합물)을 함유한다. 특히, 서열 번호 1에 존재하는 하나 이상의 HCV 항원 또는 에피토프, 또는 상기 HCV 항원을 암호화하는 핵산을 리바비린과 혼합하여 상기 조성물을 제조하는 것이 바람직하다. 즉, 일부 비제한적인 구체예는 리바비린 및 서열 번호 1을 포함하는 펩티드, 또는 서열 번호 1의 연속 아미노산 길이가 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 또는 3개인 이들의 단편을 함유하는 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예는 리바비린 및 서열 번호 13을 암호화하는 핵산, 또는 서열 번호 13의 연속 뉴클레오타이드의 길이가 최소한 9, 12, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 200, 500개인 이의 단편들을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
다른 구체예는 리바비린 및 서열 번호 1의 특정 단편을 함유하는 조성물(예, 백신)을 포함하는데, 이때 상기 단편은 HCV의 특정 도메인에 해당한다. 일부 구체예는, 예컨대 서열 번호 1의 아미노산 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1917, 또는 1972-3011에 상응하는 HCV의 단편을 포함한다. 리바비린 및 상기 단편들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물 역시 본 발명의 한 구체예가 된다.
그 밖에도, 새로운 HCV 서열을 발견하였다. HCV에 감염된 환자로부터 HCV의 NS3/4A 도메인에 상응하는 새로운 핵산 및 단백질을 클로닝하였다(서열 번호 16). 진뱅크(Genebank) 검색을 통해 클로닝된 서열이 HCV 서열과 최대 상동성을 가졌으나, 가장 밀접하게 관련된 HCV 계통(수탁 번호 AJ 278830)과의 상동성이 93%에 불과하다는 것을 알게 되었다. 이러한 신규 펩티드(서열 번호 17) 및 아미노산 길이 가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 본 발명의 한 구체예가 된다. 또한, 본 명세서에서 개시하는 백신 예 중 일부는 리바비린 및 이들 신규 NS3/4A 펩티드 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편(예, 서열 번호 25), 또는 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 포함한다.
신규 NS3/4A 펩티드의 돌연변이체 역시 생성하였다. 본 발명자들은 절두형 돌연변이체(예, 서열 번호 29) 및 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이체가 면역원성이 크다는 것을 발견하였다. 이들 신규 펩티드 서열 번호 29-32 및 43-49 및 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편(예, 서열 번호 26, 27 및 33-42), 이들 분자를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 보유하는 벡터, 및 상기 벡터, 핵산 또는 펩티드를 보유하는 세포 역시 한 구체예가 된다. 또한, 본 명세서에 기술된 조성물 중 일부는 리바비린 및 전술한 돌연변이 HCV 펩티드 중 하나 이상, 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편을 포함한다. 다른 백신 예는 리바비린 및 전술한 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산(예, DNA)을 포함한다.
이러한 조성물의 제조 방법 및 사용 방법 역시 구체예가 된다. 예를 들어, 전술한 조성물은 리바비린을 제공하는 단계, 항원(예, HCV 항원을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 핵산)을 제공하는 단계, 및 상기 리바비린과 상기 항원을 혼합하여 피험체에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 데 사용될 수 있는 조성물을 제제화함으로써 제조할 수 있다. 바람직한 방법은 바람직한 항원 또는 에피토프(예, 서열 번호 1, 6, 7, 또는 17을 포함하는 펩티드 또는 이의 특정 단편들, 예컨대 서열 번호 1의 아미노산 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 1972-3011 및 이들 분자를 암호화하는 핵산)과 리바비린을 혼합하는 것을 포함한다. 다른 항원 또는 에피토프 역시 리바비린과 혼합할 수 있는데, 그 예로는 연속 아미노산 길이가 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 또는 3개인 서열 번호 1의 단편과 이들 단편을 암호화하는 핵산을 들 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 방법은 새로 발견된 NS3/4A 단편 또는 NS3/4A 돌연변이체(예, 절두형 돌연변이체 또는 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이체), 또는 아미노산 길이가 4개 이상인 이의 단편 또는 이들 분자들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인간을 비롯한 동물의 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 방법은 본 발명의 한 구체예가 된다. 이러한 방법은, 예를 들어 항원/에피토프에 대한 유효 면역 반응이 필요한 동물을 확인하는 단계 및 항원/에피토프와 항원/에피토프에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기에 유효한 양의 리바비린을 함유하는 조성물을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서는, 리바비린 및 항원을 단일 혼합물 형태로가 아니라 개별적으로 투여한다. 이 경우 리바비린은 항원 투여 직전 또는 직후에 투여하는 것이 바람직하다. 바람직한 방법은 필요로 하는 동물에게 리바비린 및 간염 항원(예, HAV 항원, HBV 항원, HVC 항원, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물)을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법 중 일부는 HCV 항원, 예컨대 서열 번호 1을 포함하는 펩티드, 서열 번호 1의 연속 아미노산을 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10 또는 3개 갖는 이의 단편들을 포함한다. 또 다른 방법은 리바바린 및 서열 번호 13을 암호화하는 핵산 또는 상기 단편들 중 하나 이상의 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 포함한다.
일부 바람직한 방법은, 예컨대 리바바린 및 서열 번호 1을 포함하는 펩티드 또는 HCV 도메인에 상응하는 이의 특정 단편(비제한적인 예로 서열 번호 1의 아미노산 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011을 포함하는 펩티드가 있음)을 함유하는 조성물(예, 백신)의 용도에 관한 것이다. 특히 바람직한 방법은 서열 번호 17의 NS3/4A 단편 또는 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이 NS3/4A(예, 서열 번호 29-32 및 43-49), 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편들(예, 서열 번호 26, 27 및 33-42)을 함유하는 백신 조성물의 용도에 관한 것이다. 리바비린 및 상기 단편들을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물 역시 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
다른 구체예는 HCV 감염을 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다. 한 방법의 예를 들면, 리바비린 및 HCV 항원 또는 에피토프를 HCV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제를 제조하는 데 사용한다. 다른 방법으로는, HCV 감염을 예방 및/또는 치료하는 약제를 필요로 하는 개체를 확인하고, 이 개체에 리바비린 및 HCV 항원 또는 에피토프, 바람직하게는 서열 번호 1에 존재하는 에피토프, 보다 바람직하게 는 연속 아미노산 길이가 최소한 2500, 2000, 1600, 1200, 800, 400, 200, 100, 50, 10, 또는 3개인 서열 번호 1의 단편, 또는 가장 바람직하게는 1-182, 183-379, 380-792, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011과 같은 서열 번호 1의 단편, 또는 서열 번호 1 또는 상기 단편들을 암호화하는 핵산을 포함하는 약제를 투여한다. 특히 바람직한 방법은 리바비린 및 서열 번호 17의 NS3/4A 단편 또는 단백질 분해 절단 부위가 없는 돌연변이 NS3/4A(예, 서열 번호 29-32 및 43-49) 또는 아미노산 길이가 최소한 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편(예, 서열 번호 25-27 및 33-42) 또는 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물의 용도에 관한 것이다. 하기 섹션에서는 리바비린의 면역 보강제로서의 용도에 대해 더 상세히 설명한다.
리바비린
본 명세서에 기술된 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에게 투여하기 위한 약제를 제조하는 종래의 생약 조제술에 따라 제조할 수 있다. 리바비린은 시판업체(예컨대 시그마 및 ICN)로부터 구입할 수 있다. 리바비린 및/또는 항원은 변형을 가하거나 가하지 않고 백신으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 리바비린 및/또는 항원을 변형시키거나 유도체화하여 보다 안정한 분자 및/또는 보다 강력한 면역 보강제를 제조할 수 있다. 한 방법으로, 리바비린 및/또는 항원의 안정성은 친수성 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜)와 같은 지지체에 이 분자들을 결합시켜서 증강시킬 수 있다.
합리적 약물 디자인 및 조합 화학법에서의 통상적인 기법을 이용하여 더 많 은 리바비린 유도체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 몰리큘러 시뮬레이션즈 인코포레이티드(MSI)와 다수의 기타 공급업체는 기술자들이 유기 분자의 조합 라이브러리를 구축할 수 있도록 하는 소프트웨어를 제공한다. 예를 들어 C2.아날로그 빌더 (C2.Analog Builder) 프로그램과 세리우스2 분자 다이버시티(Cerius2 molecular diversity) 소프트웨어의 MSI 스위트를 통합하여 본 명세서에 기술된 구체예와 함께 사용될 수 있는 리바비린 유도체의 라이브러리를 제작할 수 있다(참조 사이트 예: http://msi.com/life/products/cerius2/index.html).
한 방법으로서, 리바비린의 화학 구조를 컴퓨터로 판독가능한 매체 상에서 기록하고, 하나 이상의 모델링 소프트웨어 응용 프로그램으로 그 정보를 호출한다. C2.아날로그 빌더 프로그램과 C2 다이버시티 프로그램을 함께 사용하면, 사용자가 예컨대 각 치환기 위치에 대한 R-기의 다양성을 기초로 하여 대규모의 가상 라이브러리를 생성할 수 있다. 그 후 가상 라이브러리에서 생성된 모델링된 리바비린 유도체와 구조가 동일한 화합물을 통상적인 화학적 방법을 이용하여 제조하거나, 또는 시판업체로부터 구입할 수 있다.
그 후 새로 제조된 리바비린 유도체를, 분자의 면역 보강 활성 정도 및/또는 면역 반응을 조절할 수 있는 능력의 정도를 측정하는 분석을 통해 스크리닝한다. 몇몇 분석은 C2.루디(C2.Ludi)와 같은 가상 약물 스크리닝 소프트웨어를 포함할 수 있다. C2.루디는 사용자로 하여금, 관심있는 단백질(예, RAC2 또는 다른 GTP 결합 단백질)의 활성 부위와 상호작용하는 능력에 대해 분자들(예, 리바비린 유도체)의 데이터베이스를 검색할 수 있게 하는 소프트웨어 프로그램이다. 가상 약물 스크리 닝 소프트웨어를 사용하여 발견한 예측 상호작용을 기초로 하여, 분자의 면역 보강 활성 및/또는 면역 반응을 조절하는 정도를 측정하는 통상적인 분석을 통한 추가 특성 규명을 위해 리바비린 유도체에 우선 순위를 매길 수 있다. 실시예 1에서는 리바비린의 면역 보강 활성을 평가하는 데 사용된 몇 가지 분석법에 대해 설명한다.
[실시예]
실시예 1
하기 분석에서는 특정 조성물의 면역 보강 활성의 정도를 측정하기 위해 임의의 리바비린 유도체 또는 리바비린 유도체의 조합물을 사용할 수 있다. 제1 세트의 실험에서는, 3∼5 마리의 Balb/c 마우스(BK 유니버설, 스웨덴 웁살라 소재) 그룹에 재조합 간염 C 바이러스 비구조 3(rNS3) 단백질 10 ㎍ 또는 100 ㎍을 0주 및 4주 째에 복강 또는 피하(예컨대, 꼬리 밑둥에) 주사로 접종하였다. rNS3는 단독의 인산염 완충 염수(PBS) 또는 1 mg의 리바비린을 함유하는 PBS(캘리포니아주 코스타 메사 소재의 ICN으로부터 입수)에 용해시켰다. 마우스에 1회 접종당 총 용량 100 ㎕를 주사하였다.
1차 복강 접종 후 2주, 4주 및 6주 째에, 모든 마우스로부터 안와후방 샘플링으로 채혈하였다. 혈청 샘플을 모아서, rNS3에 대한 항체의 존재에 대해 분석하였다. 항체 역가를 측정하기 위해, 효소면역분석(EIA)을 실시하였다[참고 문헌의 예: Hultgren 등, J. Gen. Virol. 79:2381-91(1998) 및 Hultgren 등, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630-632(1997)]. 항체 농도는 405 nm에서의 흡광도가 비접종 마우 스의 것의 2배 이상으로 나타난 최고 혈청 희석액으로 기록하였다.
PBS 중에서 1 mg 리바비린과 함께 혼합된 10 ㎍ 또는 100 ㎍의 rNS3를 접종한 마우스는 고농도의 NS3 항체를 지속적으로 나타내었다. 접종 후 2주 째에 EIA로 검출된 항체 역가를 도 1에 도시하였다. 1 mg의 리바비린 및 10 ㎍ 또는 100 ㎍의 rNS3를 함유하는 백신 조성물은 rNS3만으로 이루어진 백신 조성물보다 현저히 더 높은 항체 역가를 유도하였다.
제2 세트의 실험에서는, 8 마리의 Balb/c 마우스 그룹에 0주 및 4주에 0 mg, 1 mg, 3 mg, 또는 10 mg의 리바비린(시그마)을 함유하는 인산염 완충 염수 100 ㎕ 중의 10 ㎍ 또는 50 ㎍의 rNS3를 복강 주사하였다. 4주, 6주 및 8주 째에, 마우스로부터 채혈하고 혈청을 분리하여 동결시켰다. 실험 완료 후, 전술한 바와 같이 재조합 NS3에 대한 항체의 농도에 대해 혈청을 테스트하였다. rNS3에 대한 평균 항체 농도를 스튜던트 t-테스트(모수 분석) 또는 맨-휘트니(비-모수 분석) 및 소프트웨어 패키지 StatView 4.5(아바쿠스 컨셉츠, 캘리포니아주 버클리 소재)를 이용하여 그룹들간에 서로 비교하였다. rNS3를 최대 10 ㎍까지 3가지 용량으로 첨가하였을 때의 리바비린의 면역 보강 효과를 표 1에 기재하였다. rNS3를 최대 50 ㎍까지 3가지 용량으로 첨가하였을 때의 리바비린의 면역 보강 효과는 표 2에 기재하였다. 10 ㎍ 또는 50 ㎍의 상이한 양의 rNS3와 상이한 양의 리바비린을 접종한 마우스에서의 평균 rNS3 항체 역가의 모수 비교를 각각 표 3 및 4에 기재하였다. 10 ㎍ 또는 50 ㎍의 상이한 양의 rNS3와 상이한 양의 리바비린을 접종한 마우스에서의 평균 NS3 항체 역가의 비-모수 비교 결과는 각각 표 5 및 6에 기재하였다. 제시된 값은 재조 합 rNS3에 대한 종점 역가를 나타낸다.
Figure 112007073080177-PAT00001
Figure 112007073080177-PAT00002
Figure 112007073080177-PAT00003
Figure 112007073080177-PAT00004
Figure 112007073080177-PAT00005
Figure 112007073080177-PAT00006
상기 데이터는 리바비린이 HCV 항원 또는 HCV 에피토프에 대한 면역 반응을 촉진 또는 증강시킨다는 것을 입증하는 것이다. 1 mg 정도의 리바비린과 10 ㎍의 rNS3 항원을 함유하는 백신 조성물을 접종한 후에 rNS3에 대한 강력한 면역 반응이 유도되었다. 상기 데이터는 또한 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 데 충분한 리바비린의 양이 25∼30 g의 Balb/c 마우스의 경우 1회 접종당 1∼3 mg이라는 증거를 제시한다. 그러나, 이러한 양은 단지 기준을 위해 제시한 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든지 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하지만, 데이터는 약 1∼3 mg의 리바비린을 함유하는 백신 조성물이 리바비린 없이 유도된 면역 반응보다 12배 더 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다(표 3 및 4). 따라서, 리바비린은 동물의 체액 면역 반응에 대해 현저한 면역 보강 효과를 나타냄으로써, 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진한다. 하기 실시예에서는 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 데 필요한 리바비린의 양에 대해 더 쉽게 이해하기 위해 실시된 실험에 대해 설명한다.
실시예 2
면역 보강 효과를 제공하기에 충분한 리바비린의 양을 결정하기 위해, 아래의 실험을 수행하였다. 제1 세트의 실험에서는, 마우스 그룹(그룹당 3 마리)에 20 ㎍ rNS3 단독 또는 20 ㎍ rNS3와 0.1 mg, 1 mg 또는 10 mg의 리바비린의 혼합물을 접종하였다. 그 후 항원에 대한 항체의 농도를 EIA로 측정하였다. 1주 및 3주 째의 평균 종점 역가를 그래프로 작성하여 도 2에 나타내었다. 본 발명자들은 리바비린에 의한 면역 보강 효과는 투여된 리바비린의 양에 따라 상이한 키네틱을 나타낸다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 적은 용량(< 1 mg)의 리바비린은 1주 째 항체 농도를 증가시켰으나 3주 째에는 증가시키지 못한 반면, 더 많은 용량(1∼10 mg)은 3주 째에 항체 농도를 증가시키는 것으로 확인되었다.
제2 세트의 실험 역시 수행하였다. 이 실험에서는, 마우스 그룹에 다양한 양의 리바비린과 rNS3를 함유하는 백신 조성물을 주사하였고, 이 동물들에서 IgG 반응을 모니터하였다. 백신 조성물은 약 100 ㎕의 인산염 완충 염수 및 20 ㎍의 rNS3를 포함하고, 0.1 mg, 1.0 mg 또는 10 mg의 리바비린(시그마)을 함유하거나 함유하지 않았다. 6주 째에 마우스로부터 채혈하여, 전술한 바와 같이 EIA로 rNS3-특이적 IgG 농도를 측정하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 지속적 항체 농도에 대한 면역 보강 효과는 25∼30 g 마우스의 경우 1회 주사당 1∼10 mg을 투여하였을 때 가장 두드러졌다.
Figure 112007073080177-PAT00007
제3 세트의 실험에서는, 1차 백신 접종 및 추가 접종 후의 리바비린의 면역 보강 효과를 조사하였다. 이 실험에서는, 리바비린을 함유하거나 함유하지 않고, 10 ㎍의 rNS3를 함유하는 백신 조성물을 마우스에게 2회 복강 주사하고, 전술한 바와 같이 항원에 대한 IgG 서브클래스 반응을 모니터하였다. 따라서, 마우스에게 0.1 또는 1.0 mg의 리바비린(시그마)을 함유하거나 함유하지 않고, 재조합 NS3 10 ㎍만을 함유하는 인산염 완충 염수 100 ㎕를 0주와 4주 째에 접종하였다. 6주 째에 마우스로부터 채혈하여, 전술한 바와 같이 EIA로 NS3-특이적 IgG 서브클래스를 측정하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 전에 면역원에 리바비린을 첨가하는 것은 NS3-특이적 면역 반응에 있어서 IgG 서브클래스 반응을 변화시키지 않는다. 따라서, 리바비린 및 항원을 함유하는 백신 조성물의 면역 보강 효과는 Th1/Th2 균형의 이동에 의해서는 설명될 수 없다. 리바비린의 면역 보강 효과에는 또 다른 메카니즘이 관여하는 것으로 보인다.
Figure 112007073080177-PAT00008
이 실시예에 제시된 데이터는 리바비린이 면역 보강제로서 투여될 수 있다는 것을 추가로 확인해 주고, 리바비린의 양이 면역 보강 효과의 키네틱을 조절할 수 있다는 것을 입증한다. 하기 실시예에서는 항원에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하는 리바비린의 능력을 평가하기 위해 수행된 또 다른 분석에 대해 설명한다.
실시예 3
이 분석은 특정 백신 조성물이 세포 면역 반응을 조절하는 정도를 측정하기 위해 임의의 리바비린 유도체 또는 리바비린 유도체의 조합물을 사용하여 실시할 수 있다. 리바비린 함유 백신에 대한 CD4+ T 세포 반응을 측정하기 위해, 마우스 그룹에 PBS 중의 100 ㎍ rNS3 또는 PBS 중의 100 ㎍ rNS3 및 1 mg 리바비린을 피하 주사하였다. 마지막 접종한 후 10일 째 마우스를 죽이고, 이들의 림프절을 회수하여 배액시켰다. 그 후 시험관내 리콜 분석을 실시하였다(참고 문헌의 예: Hultgren 등, J. Gen. Virol. 79:2381-91(1998) 및 Hultgren 등, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630:632(1997)]. 배양 96시간 째에 [3H] 티미딘의 혼입 정도를 통해 CD4+ T 세포 증식의 양을 측정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 1 mg의 리바비린과 혼합된 100 ㎍의 rNS3를 접종한 마우스는 PBS 중의 100 ㎍ rNS3를 접종한 마우스보다 더 큰 T 세포 증식성 반응을 나타내었다. 이러한 데이터는 리바비린이 세포 면역 반응을 증강 또는 촉진한다(예컨대, T 세포의 효과적인 프라이밍을 촉진함으로써)는 또 다른 증거를 제시하는 것이다. 하기 섹션에서는 본 발명의 구체예에 사용될 수 있는 항원 및 에피토프 중 몇 가지에 대해 설명한다.
항원 및 에피토프
동물의 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있는 사실상 모든 항원을 리바비린과 함께 사용하여 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다. 즉, 이러한 조성물(예, 백신)에 혼입될 수 있는 항원은 박테리아 항원 또는 에피토프, 진균 항원 또는 에피토프, 식물 항원 또는 에피토프, 사상균 항원 또는 에피토프, 바이러스 항원 또는 에피토프, 암 세포 항원 또는 에피토프, 독소 항원 또는 에피토프, 화학적 항원 또는 에피토프 및 자가 항원 또는 에피토프를 포함한다. 이들 분자 중 다수는 면역 보강제 없이도 현저한 면역 반응을 유도하지만, 상기 항원 또는 에피토프에 대한 면역 반응을 증강 또는 촉진하기 위해 리바비린을 "강력한" 또는 "약한" 항원 또는 에피토프와 병용하여 투여하거나, 또는 함께 혼합하여 투여할 수 있다. 또한, 리바비린을 면역 보강제로서 사용하면 더 적은 양의 항원을 사용하면서도 면역원성을 유지할 수 있게 된다.
본 발명의 백신 조성물에는 펩티드 항원 외에도, 핵산계 항원을 사용할 수 있다. 각종 핵산계 백신이 공지되어 있으며, 이러한 면역요법 조성물 및 방법은 리바비린을 포함하도록 재구성함으로써 확대될 수 있다(참고 문헌의 예: 미국 특허 제5,589,466호 및 제6,235,888호). 한 방법의 예를 들면, 목적 폴리펩티드 항원을 암호화하는 유전자를, 피험체에 도입되면 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터내로 클로닝한다. 발현 작제물을 리바비린과의 혼합물로서, 또는 리바비린과 병용하여(예컨대, 리바비린 투여 직후 동일 부위에 발현 작제물을 투여한다) 피험체에 투여한다. 대안으로, 목적 폴리펩티드 항원을 암호화하는 RNA를 리바비린과의 혼합물로서, 또는 리바비린과 병용하여 피험체에 투여한다.
항원이 DNA(예컨대, DNA 백신 조성물 제제)일 경우, 적절한 프로모터는 유인원 바이러스 40(SV40), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍증 바이러스(HIV), 예컨대 HIV 롱 터미널 리피트(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 사이토메갈로바이러스(CMV), 예컨대 CMV 초기 발현 프로모터, 엡슈타인 바 바이러스(EBV), 라우스 육종 바이러스(RSV)를 포함할 뿐 아니라, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인 등의 인간 유전자 유래의 프로모터를 포함한다. 몇몇 구체예, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 제조에 유용한 폴리아데닐화 시그널의 비제한적인 예로는 SV40 폴리아데닐화 시그널 및 LTR 폴리아데닐화 시그널이 있다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그널로서 불리는, pCEP4 플라스미드(인비트로겐, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 시그널이 사용된다.
유전자 작제물에는 유전자 발현에 필요한 조절성 요소 외에도 다른 요소를 포함시킬 수 있다. 이러한 추가적인 요소에는 인핸서가 포함된다. 비제한적인 인핸서의 예로는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 유래의 인핸서 등의 인간 유래 인핸서 및 바이러스 인핸서, 예컨대 CMV, RSV 및 EBV 유래의 인핸서를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 유전자 작제물에는 포유동물 복제 기점을 포함시켜서, 세포 내에서 작제물을 염색체 외부에 유지시키고 작제물을 여러 카피 생산할 수 있도록 할 수 있다. 인비트로겐(캘리포니아주 샌 디에고 소재)에서 시판하는 pCEP4 및 pREP4는 엡슈타인 바 바이러스의 복제 기점과 핵 항원 EBNA-1 암호화 영역을 포함하는데, 이 플라스미드는 염색체로 통합되지 않고 많은 카피수의 에피좀 복제를 유도한다. 복제되는 것이든 복제되지 않는 것이든 간에 게놈으로 통합되지 않고 발현될 수 있는 모든 형태의 DNA가 사용될 수 있다. 하기 실시예에서는 핵산계 항원 및 리바비린을 함유하는 조성물의 용도에 대해서 설명한다.
실시예 4
다음은 핵산계 항원 및 리바비린을 함유하는 백신을 동물에게 접종하는 것에 대한 설명이다. 5∼6주령의 암컷 및 수컷 Balb/C 마우스에 2.5% 아버틴 0.3 ㎖를 복강 주사하여 마취시킨다. 전방 대퇴부에 1.5 cm를 절제하여, 사두근이 직접 보이게 한다. 제1 그룹의 마우스에, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 발현이 유도되는 gp-120 유전자를 보유한 발현 작제물 약 20 ㎍을 주사하고, 제2 그룹에는 gp-120을 암호화하는 시험관내에서 전사되고 캡핑된 RNA[예컨대, SP6, T7, 또는 T3, (암비온)] 약 5 ㎍을 주사한다. 이들 두 그룹은 대조군이다. 제3 그룹의 마우스에는 1 mg의 리바비린과 혼합된 gp-120 유전자 및 CMV 프로모터를 보유한 발현 벡터 약 20 ㎍을 주사하고, 제4 그룹의 마우스에는 1 mg의 리바비린과 혼합된 시험관내에서 전사되고 캡핑된 RNA 약 5 ㎍을 주사한다. 1 cc 주사기 내 용액(PBS) 0.1 ㎖의 백신을 27 게이지 바늘을 통해 근육의 말단 삽입 부위로부터 무릎 쪽으로 약 0.5 cm 위치에 약 0.2 cm 깊이로 1분 동안 주사하였다. 나중의 위치 확인을 위해 주사 부위에 봉합사를 올려 둔 후, 스테인레스 스틸 클립으로 피부를 닫는다.
접종 전(0일)과 접종 후 40일 이상까지 혈액 샘플을 채취한다. 각 샘플로부터 얻은 혈청을 연속 희석시키고, 효모에서 제조된 재조합 gp-120 단백질을 항원으로서 사용하여 항체의 검출을 위한 표준 ELISA 기법으로 분석한다. gp-120에 대해 특이적인 IgG 및 IgM 항체 둘 다 모든 샘플에서 검출되겠지만, 리바비린을 함유하는 그룹 3 및 4는 혈청에서 검출된 항체의 양 및/또는 역가에 의해 측정시 gp-120에 대해 더 큰 면역 반응을 나타낼 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 리바비린과 바이러스, 바람직하게는 간염 바이러스 상에 존재하는 바이러스 항원 또는 에피토프를 포함한다. 조성물은, 예컨대 리바비린 및 HAV 항원, HBV 항원, HCV 항원 또는 이들 바이러스 중 하나 이상에 존재하는 이들 항원 또는 에피토프의 임의의 조합물을 포함한다. 간염 항원은 펩티드 또는 핵산일 수 있다. HAV 감염에 대한 백신 접종에 사용될 수 있는 조성물은, 예컨대 리바비린 및 서열 번호 12의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-200개인 연속 아미노산, 200-400개인 연속 아미노산, 400-800개인 연속 아미노산, 800-1200개인 연속 아미노산, 1200-1600개인 연속 아미노산, 1600-2000개인 연속 아미노산 및 2000-2227개인 연속 아미노산으로 이루어진 HAV 펩티드를 포함한다.
또한, 리바비린 및 전술한 HAV 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물은 HAV 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 핵산계 항원은 HAV 서열의 연속 뉴클레오타이드 길이가 9개 이상인 뉴클레오타이드 서열(예, 서열 번호 15)을 포함한다. 즉, 핵산계 항원은 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 길이가 최소한 9-25개인 연속 뉴클레오타이드, 25-50개인 연속 뉴클레오타이드, 50-100개인 연속 뉴클레오타이드, 100-200개인 연속 뉴클레오타이드, 200-500개인 연속 뉴클레오타이드, 500-1000개인 연속 뉴클레오타이드, 1000-2000개인 연속 뉴클레오타이드, 2000-4000개인 연속 뉴클레오타이드, 4000-8000개인 연속 뉴클레오타이드 및 8000-9416개인 연속 뉴클레오타이드 또는 이들 서열에 상응하는 RNA를 포함한다.
유사하게, 바람직한 HBV 백신 예는 리바비린 및 HBsAg(서열 번호 10) 또는 HBcAg 및 HBeAg(서열 번호 11)의 3개 이상의 연속 아미노산으로 이루어진 HBV 펩티드를 포함한다. 즉, 일부 구체예는 리바비린 및 서열 번호 10 또는 서열 번호 11의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-150개인 연속 아미노산, 150-200개인 연속 아미노산 및 200-226개인 연속 아미노산으로 이루어진 HBV 펩티드를 포함한다.
또한, 리바비린 및 전술한 HBV 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물은 HBV 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 핵산계 항원은 HBV의 9개 이상의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열(예, 서열 번호 14)을 포함한다. 즉, 핵산계 항원은 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 길이가 최소한 9-25개인 연속 뉴클레오타이드, 25-50개인 연속 뉴클레오타이드, 50-100개인 연속 뉴클레오타이드, 100-200개인 연속 뉴클레오타이드, 200-500개인 연속 뉴클레오타이드, 500-1000개인 연속 뉴클레오타이드, 1000-2000개인 연속 뉴클레오타이드, 2000-4000개인 연속 뉴클레오타이드, 4000-8000개인 연속 뉴클레오타이드 및 8000-9416개인 연속 뉴클레오타이드 또는 이들 서열에 상응하는 RNA를 포함한다. 하기 실시예에서는 리바비린을 시판되는 HBV 백신 제제와 병용하여 사용하는 것에 대해 설명한다.
실시예 5
HBsAg 및 명반을 함유하는 시판되는 백신(엥게릭스, SKB)의 2가지 용량과 혼합하였을 때의 리바비린의 면역 보강 효과를 테스트하였다. 엥게릭스 백신 약 0.2 ㎍ 또는 2 ㎍을 PBS 또는 PBS 중의 1 mg 리바비린과 함께 혼합하고, 이 혼합물을 마우스 그룹(그룹당 3 마리)에 복강 주사하였다. 4주 째에 동일한 혼합물을 함유하는 추가 접종분을 주사하고 6주 째 모든 마우스로부터 채혈하였다. 혈청 샘플을 1:60∼1:37500으로 희석시키고, 희석액을 전술한 바와 같이 EIA로 테스트하였는데, 단, 정제된 인간 HBsAg는 고체상 항원 상태로 사용하였다. 하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 리바비린을 함유하는 백신 조성물은 백신이 이미 명반을 함유하고 있음에도 불구하고 기존 백신 2 ㎍에 대한 반응을 증강시켰다. 즉, 최적 용량보다 적은 백신 용량(즉, 검출가능한 항체를 단독으로는 유도하지 못하는 용량)에 리바비린을 첨가함으로써 항체를 검출가능한 정도로 생성할 수 있으며, 이는 리바비린의 첨가가 면역 반응을 감소시키지 않으면서 백신 조성물에 더 적은 양의 항원을 사용할 수 있도록 한다는 증거가 된다.
Figure 112007073080177-PAT00009
몇몇 HCV 백신 조성물은 리바비린 및 서열 번호 1의 3개 이상의 연속 아미노산으로 이루어진 HCV 펩티드 또는 상기 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유한다. 즉, 백신 조성물은 리바비린 및 서열 번호 1의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-200개인 연속 아미노산, 200-400개인 연속 아미노산, 400-800개인 연속 아미노산, 800-1200개인 연속 아미노산, 1200-1600개인 연속 아미노산, 1600-2000개인 연속 아미노산, 2000-2500개인 연속 아미노산, 및 2500-3011개인 연속 아미노산인 HCV 펩티드 중 하나 이상 또는 상기 단편들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다.
바람직한 HCV 조성물은 리바비린 및 HCV 코어 단백질(서열 번호 2), HCV E1 단백질(서열 번호 3), HCV E2 단백질(서열 번호 4), HCV NS2(서열 번호 5), HCV NS3(서열 번호 6), HCV NS4A(서열 번호 7), HCV NS4B(서열 번호 8), 또는 HCV NS5A/B(서열 번호 9)의 3개 이상의 연속 아미노산으로 이루어진 펩티드 또는 이들 도메인의 조합으로 이루어진 펩티드를 함유한다. 즉, 바람직한 HCV 백신은 리바비린 및 서열 번호 2∼9 중 하나 이상의 아미노산 길이가 최소한 3-10개인 연속 아미노산, 10-50개인 연속 아미노산, 50-100개인 연속 아미노산, 100-200개인 연속 아미노산, 200-400개인 연속 아미노산, 400-800개인 연속 아미노산 및 800-1040개인 연속 아미노산인 펩티드를 함유한다. 이들 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011에 상응한다. 따라서, 바람직한 구체예는 또한 서열 번호 1의 1-182, 183-379, 380-729, 730-1044, 1045-1657, 1658-1711, 1712-1971, 또는 1972-3011 중 하나 이상 또는 이들의 단편을 포함한다.
리바비린 및 전술한 펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 백신 조성물 역시 한 구체예가 된다. 바람직한 핵산계 항원은 HCV의 9개 이상인 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 13)을 포함한다. 즉, 핵산계 항원은 서열 번호 13 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 길이가 최소한 9-25개인 연속 뉴클레오타이드, 25-50개인 연속 뉴클레오타이드, 50-100개인 연속 뉴클레오타이드, 100-200개인 연속 뉴클레오타이드, 200-500개인 연속 뉴클레오타이드, 500-1000개인 연속 뉴클레오타이드, 1000-2000개인 연속 뉴클레오타이드, 2000-4000개인 연속 뉴클레오타이드, 4000-8000개인 연속 뉴클레오타이드, 및 8000-9416개인 연속 뉴클레오타이드 또는 이들 서열에 상응하는 RNA를 포함한다. 하기 섹션에서는 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물 중 몇 가지에 대해 설명한다.
리바비린 및 항원을 함유하는 조성물
리바비린 및 병원균(예, 바이러스, 박테리아, 사상균, 효모 및 기생충)의 항원 또는 에피토프를 함유하는 조성물(예, 백신)은 비제한적인 예로 면역 보강제, 결합제, 부형제, 예컨대 안정화제(장기간 보관을 촉진하기 위한 것), 유화제, 증점제, 염, 방부제, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡수 지연제 등의 기타 성분들을 함유할 수 있다. 이들 조성물은 질병 또는 증상을 피하기 위한 예방적 조치로서, 또는 이미 질병 또는 증상이 있는 동물을 치료하기 위한 치료제로서 동물을 치료하는 데 적합하다.
다수의 기타 성분들이 백신에 함유될 수 있다. 예를 들어, 리바비린 및 항원은 통상적인 부형제(예컨대, 리바비린 및/또는 항원과 해로운 반응을 하지 않는 비경구, 장(예, 경구) 또는 국소 투여에 적합한 약학적 허용 유기 또는 무기 캐리어 성분)과 함께 사용될 수 있다. 적절한 약학적 허용 캐리어로는 물, 염 용액, 알코올, 아라비아 검, 식물유, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예컨대 락토스, 아밀로스 또는 전분, 스테아르산마그네슘, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 방향유, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 히드록시 메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등이 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 더 많은 적절한 캐리어가 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15판, Easton:Mack Publishing Company, 1405-1412 및 1461-1487쪽(1975)] 및 국립 약전 XIV 14판(Washington, American Pharmaceutical Association(1975))에 개시되어 있다.
본 발명의 유전자 작제물은 이 물질 없이 동일한 유전자 백신을 투여한 경우 발생하는 세포에 의한 유전자 작제물의 업테이크 및/또는 발현에 비해 세포에 의한 유전자 작제물의 업테이크 및/또는 발현을 증가시키는 물질과 함께 제제화하거나, 또는 병용 투여할 수 있다. 이러한 물질 및 유전자 작제물과 이러한 물질을 병용 투여하는 데 대한 프로토콜은 1993년 1월 26일에 출원된 미국 출원 제08/008,342호, 1993년 3월 11일에 출원된 미국 출원 제08/029,336호, 1993년 9월 21일에 출원된 미국 출원 제08/125,012호, 1994년 1월 26일에 출원된 PCT 특허 출원 번호 PCT/US94/00899 및 1994년 4월 1일에 출원된 미국 출원 제08/221,579호에 기술되어 있다. 이러한 물질의 예로는 CaPO4, DEAE 덱스트란, 음이온 지질; 세포외 기질-활성 효소; 사포닌; 렉틴; 에스트로겐 화합물 및 스테로이드 호르몬; 히드록실화 저급 알킬; 디메틸 설폭시드(DMSO); 우레아; 및 벤조산 에스테르, 아닐리드, 아미딘, 우레탄 및 이의 염산염, 예컨대 국소 마취제 계열의 것을 들 수 있다. 또한, 유전자 작제물은 지질/다중 양이온 복합체 내로 캡슐화되거나, 또는 이와 병용 투여될 수 있다.
백신은 멸균시킬 수 있으며, 필요에 따라 리바비린 또는 항원과 해로운 반으을 하지 않는 보조제, 예컨대 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 착색제, 풍미제 및/또는 방향 성분 등과 혼합될 수 있다.
특정 백신 조성물의 유효 투여량 및 투여 방법은 환자 개개인과 질병의 유형 및 단계에 따라 달라질 뿐 아니라 당업자에게 잘 알려져 있는 기타 요인들에 따라 달라진다. 백신의 치료 효능과 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해, 예컨대 ED50(집단의 50%에서 치료 효과를 나타내는 용량)에 의해 측정할 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 실험으로부터 얻은 데이터는 인간에 사용할 수 있는 용량 범위로 제제화하는 데 이용될 수 있다. 백신의 투여량은 독성을 나타내지 않고 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 속하는 것이 바람직하다. 투여량은 상기 범위 내에서 리바비린 유도체 및 항원의 유형, 사용되는 제형, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 달라진다.
리바비린은 수년간 시판되어 왔기 때문에, 다수의 제형과 투여 경로가 공지되어 있다. 본 명세서에 개시된 구체예에는 공지된 모든 제형과 투여 경로가 제공될 수 있다. 동물에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기에 효과적인 리바비린의 양은 그 동물에서, 약 0.25∼12.5 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 2.5 ㎍/㎖의 항원의 혈청 농도를 달성하기에 충분한 양인 것으로 간주할 수 있다. 몇몇 구체예에서는 리바비린의 양은 백신을 접종하는 동물의 체중에 따라 결정된다. 따라서 백신 조성물 중의 리바비린의 양은 체중 1 kg당 약 0.1∼6.0 mg일 수 있다. 즉, 몇몇 구체예는 동물의 체중 1 kg당 약 0.1-1.0 mg, 1.1-2.0 mg, 2.1-3.0 mg, 3.1-4.0 mg, 4.1-5.0 mg, 5.1-6.0 mg에 해당하는 양의 리바비린을 함유한다. 보다 일반적으로는 백신은 약 0.25-2000 mg의 리바비린을 함유한다. 즉, 몇몇 구체예는 약 250 ㎍, 500 ㎍, 1 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 1.1 g, 1.2 g, 1.3 g, 1.4 g, 1.5 g, 1.6 g, 1.7 g, 1.8 g, 1.9 g 및 2 g의 리바비린을 함유한다.
통상적인 백신 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 충분한 양의 리바비린을 첨가함으로써 개질시킬 수 있다. 즉, 기존의 통상적인 백신 조성물은 이 조성물에 단순히 리바비린을 첨가하거나, 또는 통상적인 백신과 리바비린을 병용 투여함으로써(예컨대, 항원 투여 직전 또는 직후에) 개질시킬 수 있다. 당업자라면 백신 내 항원의 양은 항원의 종류와 그 면역원성에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 따라서, 백신 중의 항원의 양은 다양할 수 있다. 그러나, 대체적으로 백신은 약 0.25-5 mg, 5-10 mg, 10-100 mg, 100-500 mg 및 최대 2000 mg의 항원(예, 간염 바이러스 항원)을 함유할 수 있다.
본 명세서에 개시된 몇몇 방법에서는, 리바비린 및/또는 항원의 정확한 양은 치료 대상 환자의 개별 주치의가 선택한다. 또한, 리바비린의 양은 동일한 또는 동등한 양의 항원과 함께 또는 이와 별도로 첨가할 수 있으며, 이들 양은 환자 특이적 또는 항원 특이적으로 고려하여 충분한 농도를 제공하도록 특정 백신 접종 프로토콜 실시 중에 조절할 수 있다. 이러한 상황에서, 고려될 수 있는 환자 특이적 요인과 항원 특이적 요인에는 환자의 질병 상태의 심각도, 나이, 환자의 체중, 식이요법, 투여 시기 및 빈도, 병용 약물, 반응 감수성 및 치료법에 대한 내성/반응을 들 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 다음 섹션에서는 신규 HCV 유전자의 발견 및 본 명세서에 개시된 구체예에 사용될 수 있는 돌연변이 HCV 서열의 생성에 대해 설명한다.
신규 NS3/4A 및 돌연변이 NS3/4A 서열
HCV에 감염된 환자로부터 HCV의 NS3/4A 도메인에 상응하는 신규 핵산 및 단백질을 클로닝하였다(서열 번호 16 및 17). 진뱅크 검색을 통해 클로닝된 서열이 HCV 서열과 가장 큰 상동성을 지녔으나, 가장 밀접하게 관련된 HCV 서열(수탁 번호 AJ 278830)과의 상동성이 93%에 불과하다는 것을 알게 되었다. 신규 NS3/4A 펩티드의 절두형 돌연변이체 및 단백질 분해 절단 부위가 없는 NS3/4A 돌연변이체 역시 생성하였다. 이들 신규 펩티드 및 이 펩티드를 암호화하는 핵산은 리바비린과 혼합하여 수용체에게 HCV에 대한 유효 면역 반응을 제공하는 조성물을 제조할 수 있는 강력한 면역원임을 발견하였다. 신규 NS3/4A 도메인의 클로닝 및 각종 NS3/4A 돌연변이체의 생성에 대해서는 하기 실시예에서 설명한다.
실시예 6
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 HCV에 감염된 환자의 혈청(HCV 유전자형 1a)으로부터 NS3/4A 서열을 증폭하였다. 혈청으로부터 전체 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하고, 표준 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였다[Chen M 등, J. Med. Virol. 43:223:226(1995)]. cDNA 합성은 안티센스 프라이머 "NS4KR"(5'-CCG TCT AGA TCA GCA CTC TTC CAT TTC ATC-3'(서열 번호 18))을 이용하여 개시하였다. 이 cDNA로부터 NS3 및 NS4A 유전자를 포함하는, 아미노산 1007∼1711에 상응하는 HCV의 2079 염기쌍 DNA 단편을 증폭하였다. 정확도가 높은 폴리머라제(Expand High Fidelity PCR, 독일 만하임 소재의 뵈링거-만하임)를 "NS3KF" 프라이머(5'-CCT GAA TTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC TAT-3'(서열 번호 19)) 및 NS4KR 프라이머와 함께 사용하였다. NS3KF 프라이머는 EcoRI 제한 효소 절단 부위와 출발 코돈을 포함하였고, 프라이머 NS4KR은 XbaI 제한 효소 절단 부위와 종결 코돈을 포함하였다.
그 후 증폭된 단편을 서열을 분석하였는데, 그 서열이 서열 번호 16의 서열이다. 서열 비교 분석을 통해 그 유전자 단편이 정말 유전자형 1a의 바이러스 균주로부터 유래된 것임을 알게 되었다. NCBI 웹사이트를 이용하여 진뱅크 데이터베이스에 대해 전산화된 BLAST 검색을 통해 가장 가까운 HCV 상동체와의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 93%임을 알게 되었다.
그 후 증폭된 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI으로 분해하여, 같은 효소로 분해한 pcDNA3.1/His 플라스미드(인비트로겐)에 삽입하였다. 그 후 NS3/4A-pcDNA3.1 플라스미드를 EcoRI 및 XbaI으로 분해하고, 삽입물을 QiaQuick 키트(퀴아젠, 독일 함부르크)를 이용하여 정제하고, EcoRI/XbaI으로 분해한 pVAX 벡터(인비트로겐)에 결찰시켜서 NS3/4A-pVAX 플라스미드를 생성하였다.
NS3/4A DNA로부터 NS4A 서열을 결실시켜서 rNS3 절두형 돌연변이체를 얻었다. 따라서, EcoRI 및 NotI 제한 부위를 각각 포함하는 프라이머 NS3KF 및 3'NotI(5'-CCA CGC GGC CGC GAC GAC CTA CAG-3'(서열 번호 20))를 이용하여 NS3/4A-pVAX의 NS3 유전자 서열을 PCR로 증폭하였다. 그 후 NS3 단편(1850 bp)을 EcoRI 및 NotI으로 분해한 pVAX 플라스미드에 결찰시켜서 NS3-pVAX 벡터를 생성하였다. 플라스미드를 BL21 E. 콜라이 세포에서 증폭시켰다. 플라스미드의 서열을 분석하고, 제한 절단으로 검증하였으며, 그 결과는 원래 서열을 기초로 한 예상 결과와 동일하였다.
NS3와 NS4A 사이의 단백질 분해 절단 부위를 변화시키기 위해, QUICKCHANGETM 돌연변이 유발 키트(스트라타진)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 NS3/4A-pVAX 플라스미드를 돌연변이시켰다. "TPT" 돌연변이를 유발하기 위해, 프라이머 5'-CTGGAGGTCGTCACGCCTACCTGGGTGCTCGTT-3'(서열 번호 21) 및 5'-ACCGAGCACCCAGGTAGGCGTGACGACCTCCAG-3'(서열 번호 22)을 이용하여 플라스미드를 증폭시켜서 NS3/4A-TPT-pVAX를 얻었다. "RGT" 돌연변이를 생성하기 위해서는 프라이머 5'-CTGGAGGTCGTCCGCGGTACCTGGGTGCTCGTT-3'(서열 번호 23)과 5'-ACCGAGCACCCAGGTACC-GCGGACGACCTCCAG-3'(서열 번호 24)를 이용하여 플라스미드를 증폭시켜서 NS3/4A-RGT-pVAX를 얻었다.
모든 돌연변이된 작제물의 서열을 분석하여 돌연변이가 정확히 생성되었는지를 확인하였다. 플라스미드는 컴피턴트 BL21 E. 콜라이에서 증폭시켰다. 생체내 주입에 사용된 플라스미드 DNA는 퀴아젠(Quiagen) DNA 정제 컬럼을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하였다(퀴아젠 게엠베하, FRG 힐덴 소재). 얻어진 플라스미드 DNA의 농도는 분광광도법으로 측정하였고(Dynaquant, 파마시아, 스웨덴 웁살라 소재), 정제된 DNA를 1 mg/㎖의 농도로 멸균 인산염 완충 염수(PBS)에 용해시켰다. 야생형과 돌연변이의 접합점의 아미노산 서열을 하기 표 10에 나타내었다. 하기 섹션에서는 HCV 펩티트를 암호화하는 몇 가지 핵산에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00010
HCV 펩티드를 암호화하는 핵산
핵산 구체예는 전술한 HCV 펩티드(예컨대, 서열 번호 17, 29, 31, 32 및 43-49) 또는 아미노산 길이가 최소한 4, 6, 8, 10, 12, 15, 또는 20개인 그 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 32-42)을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇 가지 구체예는, 예를 들어 이들 HCV 펩티드를 암호화하는 게놈 DNA, RNA 및 cDNA를 포함한다. HCV 뉴클레오타이드의 구체예는 서열 목록에 제시된 DNA 서열(예, 서열 번호 16) 뿐만 아니라 서열 목록에 제시된 아미노산 서열(예, 서열 번호 17)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 엄중 조건(예컨대, 0.5 M NaHPO4, 7.0% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA 중에서 50℃에서, 필터에 결합된 DNA에 대해 하이브리드화하고, 0.2 x SSC/0.2% SDS 중에서 50℃에서 세척하는 조건) 하에 서열 목록에 제시된 DNA 서열에 하이브리드화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열 및 덜 엄중한 조건(예컨대, 0.5 M NaHPO4, 7.0% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA 중에서 37℃에서 하이브리드화하고, 0.2 x SSC/0.2% SDS 중에서 37℃에서 세척하는 조건) 하에 서열 목록에 제시된 아미노산 서열(서열 번호 17)을 암호화하는 DNA 서열에 하이브리드화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
핵산 구체예는 또한 전술한 서열의 단편, 변형체, 유도체 및 변이체를 포함한다. 바람직한 구체예로는 신규 HCV 서열 또는 이의 상보 서열 중 하나의 12개 이상의 연속 염기를 포함하는 핵산을 들 수 있으며, 바람직한 단편은 서열 번호 17의 NS3/4A 분자를 암호화하는 핵산 또는 이의 상보 서열의 12개 이상의 연속 염기를 포함하는 것이다.
이러한 점에서, 본 발명의 핵산 구체예는 12∼약 2079개의 연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 DNA 단편은, 예컨대 서열 번호 16의 연속 뉴클레오타이드가 최소한 12-15, 15-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 1000-1500, 1500-2079개인 핵산 또는 이의 상보 서열을 포함한다. 핵산 구체예는 또한 치환, 추가, 또는 결실과 같은 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 암호화 서열의 축퇴성으로 인해, 예컨대 서열 번호 17에 제시된 것과 실질적으로 동일한 HCV 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열이 몇몇 구체예에 사용될 수 있다. 이러한 것의 비제한적인 예로는 서열 내에서 기능적으로 동등한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈으로 치환시켜서 침묵 변화를 유도하거나, 또는 서열 내에서 기능적으로 동등하지 않는 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈으로 치환시켜서 검출가능한 변화를 생성함으로써 변형시킨, NS3/4A의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열(서열 번호 16) 또는 이러한 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산을 들 수 있다.
전술한 핵산 서열을 이용함으로써, 이들 분자에 상보적인 프로브를 디자인하여 이를 올리고뉴클레오타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 바람직한 프로브는 이러한 HCV 분리물 고유의 핵산 서열(서열 번호 16)을 포함한다. 이러한 프로브는 HCV의 천연 공급원(이 중 일부는 그 자체가 신규 HCV일 수 있다)을 분리하기 위해 환자로부터 cDNA를 스크리닝하는 데 이용할 수 있다. 스크리닝은, 예컨대 필터 하이브리드화 또는 PCR로 실시할 수 있다. 필터 하이브리드화로 실시하려면, 표지된 프로브는 이 NS3/4A 펩티드 고유의 핵산 서열(서열 번호 16)의 15-30개 이상의 염기쌍을 포함하는 것이 바람직하다. 이용되는 하이브리드화 세척 조건은 중간 정도에서 높은 정도의 엄중도로 하는 것이 바람직하다. 하이브리드화는 0.5 M NaHPO4, 7.0% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA 중에서 42℃에서 밤새 수행할 수 있으며, 세척은 0.2 x SSC/0.2% SDS 중에서 42℃에서 수행할 수 있다. 이러한 조건에 관한 정보에 대해서는, 예컨대 Sambrook 등의 문헌[1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.]; 및 Ausubel 등의 문헌[1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Intersciences, N.Y.]을 참고로 할 수 있다.
HCV 핵산은 또한 전술한 핵산을 사용하여 HCV에 감염된 환자로부터 분리할 수 있다(역시 실시예 6 참조). 따라서, HCV에 감염된 환자로부터 얻은 RNA를 역전사시키고, 얻어진 cDNA를 PCR 또는 다른 증폭 기법을 이용하여 증폭시킨다. 프라이머는 NS3/4A 서열(서열 번호 16)로부터 얻은 것이 바람직하다.
PCR 기법의 개요에 대해서는 문헌[Molecular Cloning to Genetic Engineering, White, B.A. Ed. in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa(1997)] 및 "PCR Methods and Applications"이라의 표제의 문헌(1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참고로 할 수 있다. mRNA 증폭에 대해서는, mRNA를 cDNA로 역전사시킨 후 PCR(RT-PCR)을 수행하는 방법이나, 또는 미국 특허 제5,322,770호에 기술된 바와 같이 상기 두 단계에 한가지 효소를 사용하는 방법은 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 또 다른 기법은 Marshall R.L. 등의 문헌[PCR Methods and Applications 4:80-84, 1994]에 기술된 바와 같이 역전사효소 비대칭 갭 리가제 연쇄 반응(RT-AGLACR)을 이용하는 것을 포함한다.
요약하면, 하기 표준 절차에 따라서 RNA를 분리한다. 첫번 째 가닥 합성의 프라이머로서 증폭된 단편의 5' 최말단에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 RNA 상에서 역전사 반응을 수행한다. 그 후 얻어진 RNA/DNA 하이브리드를 표준 말단 트랜스퍼라제 반응을 이용하여 구아닌으로 "테일링(tailed)"한다. 이어서 하이브리드를 RNAse H로 분해하고, 폴리-C 프라이머를 사용하여 제2 가닥 합성을 프라이밍한다. 이렇게 하면 증폭된 단편의 상류의 cDNA 서열이 쉽게 분리된다. 이용될 수 있는 클로닝 기법의 개요에 대해서는, 예컨대 상기 Sambrook 등의 문헌(1989)을 참고로 할 수 있다.
이러한 증폭 방법 각각에서는 증폭시킬 서열의 어느 한 쪽 상의 프라이머를 dNTP 및 열에 안정한 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제, Pfu 폴리머라제 또는 Vent 폴리머라제와 함께 적절히 제조된 핵산 샘플에 추가한다. 샘플 내의 핵산을 변성시키면 프라이머가 샘플 내의 상보적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화한다. 이어서 하이브리드화된 프라이머를 연장시킨다. 그 후 변성, 하이브리드화, 및 연장 반응으로 이루어진 사이클을 한번 더 실시한다. 프라이머 부위 사이의 핵산 서열을 포함하는 증폭된 단편이 생성되도록 사이클을 다수회 반복한다. PCR에 대해서는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호를 비롯하여 여러 특허에 추가로 설명되어 있다.
프라이머는 NS3/4A 분자 고유의 핵산 서열(서열 번호 16)의 일부분에 실질적으로 상보적이 되도록 선택함으로써 프라이머 사이의 서열이 증폭되도록 한다. 프라이머의 뉴클레오타이드 길이는 최소한 16-20, 20-25, 또는 25-30개인 것이 바람직하다. 안정한 하이브리드의 형성은 DNA의 융점(Tm)에 의존한다. Tm은 프라이머의 길이, 용액의 이온 강도 및 G+C 함량에 의해 결정된다. 프라이머의 G+C 함량이 더 많을수록, 융점은 더 높아지는데, 그 이유는 G:C 쌍은 3개의 H 결합에 의해 유지되는 반면, A:T 쌍은 2개의 H 결합에 의해서만 유지되기 때문이다. 본 명세서에 개시된 증폭 프라이머의 G+C 함량은 10∼75%인 것이 바람직하고, 35∼60%인 것이 보다 바람직하며, 40∼55%인 것이 가장 바람직하다. 특정한 분석 조건 설정 하의 적절한 프라이머의 길이는 당업자가 실험에 의해 결정할 수 있다.
프라이머의 간격은 증폭될 세그먼트의 길이와 관련이 있다. 본 명세서에 기술된 구체예에서 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 보유하는 증폭된 세그먼트의 크기는 약 25 bp 이상에서 HCV 게놈의 전체 길이에 이를 수 있다. 25∼1000 bp의 증폭 단편이 일반적이며, 50∼1000 bp의 단편이 바람직하고, 100∼600 bp가 가장 바람직하다. 증폭 프라이머로는 NS3/4A 영역의 특이적 증폭이 일어나게 하는 어떠한 서열도 가능하며, 예컨대 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위와 같은 변형을 포함할 수 있다.
PCR 생성물을 서브클로닝하고 서열을 분석하여 증폭된 서열이 HCV 펩티드의 서열을 나타내는지를 확인할 수 있다. 그 후 PCR 단편을 이용하여 다양한 방법에 의해 전체 길이 cDNA를 분리할 수 있다. 예를 들어, 증폭된 단편을 표지하여 cDNA 라이브러리, 예컨대 박테리오파지 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 이용할 수 있다. 또는, 게놈 라이브러리의 스크리닝을 통해 게놈 클론을 분리하는 데 표지된 단편을 이용할 수도 있다. 또한, 예컨대 감염된 환자로부터 분리한 RNA로부터 합성한 cDNA를 이용하여 발현 라이브러리를 작제할 수 있다. 이와 같은 방식으로, HCV 유전자 생성물에 대해 생성된 항체와 함께 표준 항체 스크리닝 기법을 이용하여 HCV 유전자 생성물을 분리할 수 있다(스크리닝 기법에 대해서는, 예컨대 Harlow, E. 및 Lane 편저, 1998, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor]를 참조로 할 수 있다).
구체예는 또한 (a) 선행 핵산 및/또는 이의 상보 서열(즉, 안티센스) 중 임의의 것을 포함하는 DNA 벡터; (b) 핵산의 발현을 지령하는 조절성 요소와 작동가능하게 결합된 선행 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하는 DNA 발현 벡터; (c) 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지령하는 조절성 요소와 작동가능하게 결합된 선행 핵산 서열 중 임의의 것을 보유하는 유전자 조작된 숙주 세포를 포함한다. 이들 재조합 작제물은 숙주 세포에서 스스로 복제할 수 있다. 또는, 재조합 작제물은 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 이러한 재조합 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 HCV 게놈 또는 인간의 조작에 의한 반합성 또는 합성에 의해 생성된 cDNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 자연적으로 발생하지 않는 서열 및 이의 상보 서열을 포함하는 재조합 핵산이 제공된다.
HCV 펩티드를 암호화하는 핵산 또는 HCV 유전자의 상보 서열인 서열을 갖는 핵산은 자연 상태로 이용될 수도 있지만, 이들을 때로, 예컨대 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형시킬 수 있으며, 인간에 존재하지 않는 서열을 부가시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 조절성 요소에는 유도성 및 비유도성 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 발현을 유도 및 조절하는 당업자에게 공지된 기타 요소가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 조절성 요소의 비제한적인 예로는 사이토메갈로바이러스 hCMV 이른 초기 발현 유전자, SV40 아데노바이러스의 초기 또는 후기 발현 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파지 A의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 및 효모 α-접합 인자의 프로모터를 들 수 있다.
또한, 재조합 HCV 펩티드 암호화 핵산 서열 및 이의 상보 서열을 조작하여 이들의 프로세싱 또는 발현을 변형시킬 수 있다. 비제한적인 예로, 본 발명의 HCV 핵산을 프로모터 서열 및/또는 리보좀 결합 부위와 결합시키거나, 또는 시그널 서열을 HCV 펩티드 암호화 서열의 상류에 삽입시켜서 펩티드의 분비를 가능하게 함으로써 회수 또는 생체 이용률을 촉진시킬 수 있다. 그 밖에도, 번역, 개시 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴하거나, 또는 암호화 영역 내에 변형을 유발하고/유발하거나, 새로운 제한 부위를 형성하거나 기존의 제한 부위를 파괴하거나, 또는 시험관내 변형을 더 촉진하기 위해 특정 HCV 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 돌연변이시킬 수 있다(실시예 6 참조). 당업계에 공지된 임의의 돌연변이 유발 기법을 이용할 수 있으며, 이의 비제한적인 예로 시험관내 특정 부위 지정 돌연변이 유발이 있다[Hutchinson 등, J. Biol. Chem., 253:6551(1978)].
또한, 다른 단백질 또는 다른 단백질의 도메인을 암호화하는 핵산을 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산에 결합시켜서 융합 단백질을 생성할 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드는 전체 길이 NS3/4A 서열(서열 번호 16), 절두형 NS3/4A 서열 또는 비관련 단백질 또는 펩티드, 예컨대 후술하는 바와 같은 폴리 히스티딘, 헤마글루티닌, 효소, 형광 단백질, 또는 발광 단백질에 융합된 NS3/4A 서열의 펩티드 단편을 포함할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
놀랍게도, 본 발명자들은 NS3-pVAX 및 NS3/4A-pVAX 벡터를 면역 경쟁력이 있는 포유동물에게 주사하면 강력한 면역 반응을 유발할 수 있다는 사실을 발견하였다. 하기 실시예에서는 이러한 실험에 대해 더 상세히 설명한다.
실시예 7
체액 면역 반응이 NS3-pVAX 및 NS3/4A-pVAX 벡터에 의해 유발되는지를 확인하기 위해, 실시예 6에서 설명한 발현 작제물을 퀴아젠 DNA 정제 시스템을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하고, 정제된 DNA 벡터를 4∼10 마리로 구성된 Balb/c 마우스 그룹에 접종하는 데 사용하였다. 전술한 바와 같이 플라스미드를 재생 전경골(TA) 근육에 직접 주사하였다[Davis 등, Human Gene Therapy 4(6):733(1993)]. 요약하면, 마우스에 0.9% 멸균 NaCl 중의 0.01 mM 카디오톡신(cadiotoxin)(라톡산, 프랑스 로잔 소재) 50 ㎕/TA로 근육 주사하였다. 5일 후, 각 TA 근육에 rNS3 또는 DNA를 함유하는 PBS 50 ㎕를 주사하였다.
덴마크의 묄레가드, 스웨덴 웁살라의 찰스 리버, 스웨덴의 B&K 솔렌투나에 있는 분양소로부터 동종 교배한 마우스 종 C57/BL6(H-2b), Balb/C(H-2d) 및 CBA(H-2k) 입수하였다. 모든 마우스는 암컷이었으며, 4∼8주령에 사용하였다. 체액 반응의 모니터를 위해, 모든 마우스에 4주마다 플라스미드 DNA 50 ㎕/TA를 추가 접종하였다. 또한, 일부 마우스에는 전술한 바와 같이 정제한 재조합 NS3(rNS3) 단백질을 주사하였다. rNS3를 접종한 마우스는 2회 이상 접종하지 않았다. 모든 마우스로부터 한달에 2회 채혈하였다.
마우스 중 NS3 항체의 존재를 검출하기 위해 효소 면역흡착 분석(EIA)을 이용하였다. 이들 분석은 Chen 등의 문헌[Hepatology 28(1):219(1998)]에 기술된 것과 사실상 동일하게 수행하였다. 요약하면, 96-웰 미량역가 플레이트(넌크, 덴마크 코펜하겐 소재)에서 50 mM 탄산나트륨 완충액(pH 9.6) 중 1 ㎍/㎖ 농도로 rNS3를 4℃에서 밤새 수동적으로 흡착시켰다. 그 후 PBS, 2% 염소 혈청 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 희석 완충액과 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하여 플레이트를 블로킹시켰다. 그 후 1:60에서부터 시작한 마우스 혈청의 연속 희석액을 플레이트 상에서 1시간 동안 항온처리하였다. 결합된 마우스 혈청 항체는 알칼라인 포스파타제 접합 염소 항-마우스 IgG(시그마 셀 프로덕츠, 미주리주 세인트 루이스 소재)로 검출한 다음, 기질 pNPP(0.5 M MgCl2를 함유한 1 M 디에탄올 아민 완충액 5 ㎖당 1 정제)를 첨가하였다. 반응을 1 M NaOH를 첨가하여 중단시키고, 405 nm에서 흡광도를 읽었다.
4주 후, NS3/4A-pVAX를 접종한 마우스는 5 마리 마우스 중 4 마리가 NS3 항체를 생성한 반면, NS3-pVAX를 접종한 마우스는 5 마리 마우스 중 1 마리가 항체를 생성하였다(도 4). 6주 후, NS3/4A-pVAX를 접종한 5 마리 마우스 중 4 마리가 고농도(>104)의 NS3 항체(평균 농도 10800 ±4830)를 생성하였고, 1 마리는 역가가 2160이었다. NS3-pVAX를 접종한 모든 마우스가 NS3 항체를 생성하였으나, 이들 중 어느 것도 NS3/4A-pVAX 작제물에 의해 생성된 정도의 농도로 항체를 생성하지는 않았다(평균 농도 1800 ±805). NS3/4A 융합 작제물에 의해 생성된 항체 농도는 6주 째 NS3-pVAX에 의해 유도된 항체의 농도보다 훨씬 높았다(평균 계수 7.6 대 3.4, p<0.05, 맨-휘트니 계수 합 테스트, 및 p<0.01, 스튜던트 t-테스트). 따라서, NS3-pVAX 또는 NS3/4A-pVAX의 접종은 항-NS3 항체의 생성을 유도하였으나, NS3/4A 융합 유전자가 더 강력한 면역원이었다. 하기 실시예에서는 NS3/4A-TPT-pVAX 작제물이 강력한 면역 반응을 유발하는지를 확인하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
실시예 8
NS3/4A의 증강된 면역원성이 단지 NS4A의 존재에 의한 것인지, 또는 그 밖에도 NS3/4A 융합 단백질이 NS3/4A 접합점에서 절단되어야만 하는지를 테스트하기 위해 새로운 실험을 수행하였다. 첫번 째 실험에서는, Balb/c 마우스에서 NS3-pVAX, NS3/4A-pVAX 및 NS3/4A-TPT-pVAX 벡터의 면역원성을 비교하였다. 0주에 전술한 바와 같이 마우스에 접종하고, 2주 후 모든 마우스로부터 채혈하여 1:60의 혈청 희석액에서 NS3에 대한 항체의 존재를 확인하였다(표 11). 4주 째 다시 마우스로부터 채혈하였다. NS3/4A-TPT-pVAX 벡터는 NS3-pVAX 벡터와 유사하였지만(4/10 대 0/10; NS, 피셔 정확성 테스트), NS3/4A-pVAX 벡터는 지속적으로 가장 강력한 면역원이 되었다. 따라서, 마우스에 접종된 HCV 작제물 모두는 NS3에 대한 면역 반응을 유발할 수 있었으나, NS4A 서열 및 NS3와 NS4A 서열 사이의 기능적 단백질 분해 절단 부위가 가장 강력한 면역 반응을 유발하였다.
Figure 112007073080177-PAT00011
만성 감염 단계시에는 HCV는 간세포에서 복제되어 간 내로 확산된다. 만성 및 지속성 바이러스 감염을 퇴치하는 데 있어서 주된 요소는 세포 매개 면역 방어 시스템이다. CD4+ 및 CD8+ 림프구는 만성 HCV 감염기 동안 간에 침윤하지만, 바이러스를 제거하거나 간 손상을 예방하지는 못한다. 또한, 지속성 HCV 감염은 간세포 암종(HCC)의 발병과 연관이 있다. 하기 실시예에서는 NS3 및 NS3/4A 작제물이 NS3에 대한 T-세포 매개 면역 반응을 유발할 수 있는지를 확인하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
실시예 9
전술한 작제물이 NS3에 대한 세포 매개 반응을 유발할 수 있는지를 조사하기 위해, 생체내 종양 성장 분석을 수행하였다. 이 목적을 위해, NS3/4A 유전자를 안정하게 형질감염시킨 SP2/0 종양 세포주를 제조하였다. NS3/4A 유전자를 보유하는 pcDNA3.1 플라스미드를 BglII 분해로 선형화시켰다. 선형화된 플라스미드 DNA 총 5 ㎍을 형질감염 시약(Superfect, 퀴아젠, 독일) 60 ㎍과 혼합하고, 이 혼합물을 35 mm 디쉬 중의 SP2/0 세포의 50% 융합층에 첨가하였다. 형질감염된 SP2/0 세포(NS3/4A-SP2/0)를 제네티신 800 ㎍/㎖의 존재 하에 14일간 배양하고, 개개의 클론을 분리하였다. 안정한 NS3/4A-발현 SP2/0 클론을 PCR과 RTPCR로 확인하였다. 클로닝된 세포주를 10% 태아 소 혈청, L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에서 유지시켰다.
그 후 Balb/c 마우스에서 SP2/0 및 NS3/4A-SP2/0 세포주의 생체내 성장 속도를 평가하였다. 마우스의 오른 쪽 옆구리에 2 x 106개의 종양 세포를 피하 주사하였다. 매일 피부를 통해 종양의 크기를 측정하였다. 2가지 세포주의 성장 속도를 비교하였다. 예를 들어, 매 시점 평균 종양 크기는 2가지 세포주에 있어서 서로 다르지 않았다(표 12a 및 표 12b 참조). 하기 실시예에서는 NS3/4A 작제물을 접종한 마우스가 NS3에 대한 T-세포 반응을 나타내는지를 확인하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00012
Figure 112007073080177-PAT00013
실시예 10
T-세포 반응이 NS3/4A 접종에 의해 유발되는지를 조사하기 위해, 면역화시킨 마우스의 면역 방어 시스템이 NS3-발현 종양 세포주를 공격하는 능력을 분석하였다. Balb/c 마우스에서 SP2/0 골수종 세포주의 종양 성장의 생체내 억제율을 테스트하기 위한 프로토콜은 이미 상세히 개시된 바 있다[Encke 등, J. Immunol. 161:4917(1998)]. 이 모델에서의 종양 성장 억제는 세포독성 T 림프구(CTL)의 프라이밍에 의존한다. 요약하면, 10 마리의 마우스 그룹에 NS3-pVAX 100 ㎍ 또는 NS3/4A-pVAX 100 ㎍을 한달 간격으로 5회 근육 주사하였다. 마지막 접종 2주 후, 2 x 106 SP2/0 또는 NS3/4A-SP2/0 세포를 각 마우스의 오른 쪽 옆구리에 주사하였다. 2주 후, 마우스를 죽이고, 최대 종양 크기를 측정하였다. NS3-pVAX를 접종한 마우스에서의 SP2/0와 NS3/4A-SP2/0의 평균 종양 크기에는 차이가 없었다(표 13a 및 표 13b 참조).
Figure 112007073080177-PAT00014
Figure 112007073080177-PAT00015
다음의 실험에서는 NS3/4A-pVAX를 접종한 Balb/c 마우스에서 SP2/0 또는 NS3/4A-SP2/0 종양 성장의 억제를 평가하였다. NS3/4A-pVAX 플라스미드를 접종한 마우스에서 NS3/4A-SP2/0 종양 세포의 성장은 비형질감염 SP2/0 세포의 성장과 비교하여 현저히 억제되었다(표 14a 및 표 14b 참조). 따라서, NS3/4A-pVAX 접종은 생체내에서 NS3/4A를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 CTL을 유도한다. 하기 실시예에서는 NS3에 대한 세포 매개 반응을 유발하는 데 있어서의 각종 NS3 함유 조성물의 효능을 분석하기 위해 수행한 실험에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00016
Figure 112007073080177-PAT00017
실시예 11
각종 NS3 함유 조성물의 투여가 세포 매개 면역 반응의 유발에 영향을 미치는지를 분석하기 위해서 마우스에 PBS, rNS3, 비관련 DNA 또는 NS3/4 작제물을 접종하고, 전술한 바와 같이 종양 크기를 측정하였다. NS3/4A 작제물은 종양 크기를 통계학적으로 유의적인 수준으로 감소시키기에 충분한 T-세포 반응을 유발할 수 있었다(표 15a 및 표 15b 참조). 하기 실시예에서는 종양 크기의 감소가 NS3-특이적 T-림프구의 생성에 의한 것인지를 확인하기 위해 수행된 실험에 대해 설명한다.
Figure 112007073080177-PAT00018
Figure 112007073080177-PAT00019
실시예 12
NS-3 특이적 T-세포가 NS3/4A 접종에 의해 생성된 것인지를 확인하기 위해 시험관내 T-세포 매개 종양 세포 용해 분석을 이용하였다. 이 분석에 대해서는 기존의 문헌[Townsend 등, J. Virol. 71:3365(1997)]에 상세히 개시되어 있다. 요약하면, 5 마리의 Balb/c 마우스 그룹에 NS3/4A-pVAX 100 ㎍을 3회 근육 주사하였다. 마지막 접종 2주 후 마우스를 죽이고 비장 세포를 회수하였다. 3 x 106개의 비장 세포 및 3 x 106개의 NS3/4A-SP20 세포를 사용하여 재자극 배양을 시작하였다. 5일 후, NS3/4A-SP2/0 또는 SP2/0 세포를 표적으로 사용하여 표준 Cr51-방출 분석을 수행하였다. NS3/4A-SP2/0 세포의 용해와 SP2/0 세포의 용해간의 비로서 특이적 용해율(%)을 계산하였다. 이펙터 대 표적의 비를 20:1로 하였을 때, NS3/4A-pVAX를 접종한 마우스만이 테스트한 5 마리 중에서 4 마리에서 10% 이상의 특이적 용해율을 나타내었다(도 5A 및 B 참조). 따라서, NS3/4A를 접종한 마우스는 암 세포 증식 감소를 나타내고/나타내거나, NS3/4A는 암 세포의 용해를 유발하였다. 하기 섹션에서는 HVC 폴리펩티드의 몇 가지 예에 대해 더 상세히 설명한다.
HCV 펩티드
이전 섹션에서 기술한 바와 같이 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산을 분자생물학의 통상적인 기법을 이용하여 조작하여 HCV 펩티드를 발현하는 재조합 작제물을 생성할 수 있다. 본 발명의 HCV 펩티드 또는 이의 유도체는 실질적으로 서열 목록에 제시된 것과 같은 모든 아미노산 서열의 1차 아미노산 서열(서열 번호 17, 29-32 및 43-49) 및 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 서열 내에서 침묵 변화를 초래하는 잔기로 치환된 변형된 서열을 비롯하여 아미노산 길이가 4개 이상인 이의 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42)을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 서열 번호 17, 29-32 및 43-49의 서열의 바람직한 단편은 4개 이상의 아미노산이며, 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 서열 내에서 침묵 변화를 초래하는 잔기로 치환된 변형된 서열을 비롯하여 발견된 NS3/4A 펩티드 고유의 아미노산 서열(서열 번호 17)을 포함한다. HCV 펩티드는, 예컨대 아미노산의 길이가 최소한 12-15, 15-20, 20-25, 25-50, 50-100, 100-150, 150-250, 250-500 또는 500-704개일 수 있다. 다른 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42) 역시 본 발명의 또 다른 양태이다.
본 발명의 구체예는 또한 전술한 것과 실질적으로 동일한 HCV 펩티드를 포함한다. 즉, 서열 번호 17 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 HCV 펩티드 및 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 또 다른 아미노산으로 치환되어 침묵 변형이 일어난 이의 단편이다. 서열 내에서의 아미노산의 치환체는 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양전하(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함된다. 음전하(산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 방향족 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함된다.
본 발명의 HCV 펩티드는 화학적 합성 방법(예컨대, 고체상 펩티드 합성)에 의해 문헌[Merrifield 등, J. Am. Chem. Soc. 85:2149(1964), Houghten 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:51:32(1985), Stewart and Young(Solid phase peptide syntheis, Pierce Chem Co., Rockford, IL(1984) and Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freemand & Co., N.Y.]에 개시된 기법 등의 당업계에 공지된 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 아미노산 말단 상에 메티오닌을 포함시키거나 포함시키지 않고 합성할 수 있다. 화학적으로 합성된 HCV 펩티드는 상기 참고문헌에 개시된 방법을 이용하여 산화시켜서 이황화 다리를 형성할 수 있다.
본 발명의 HCV 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있지만, 재조합 DNA 기법에 의해 이들 폴리펩티드를 제조하는 것이 더 효과적일 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 전술한 바와 같은 HCV 뉴클레오타이드 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 서열을 함유하는 발현 벡터를 작제하는 데 이용될 수 있다. 이러한 방법에는, 예컨대 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 대안으로, HCV 뉴클레오타이드 서열을 암호화할 수 있는 RNA를, 예컨대 합성기를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예컨대 문헌[Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford]에 기술된 기법을 참고할 수 있다. 따라서, 몇몇 구체예는 본 발명의 HCV 펩티드를 발현하도록 조작한 세포주에 관한 것이다. 예를 들어, 몇몇 세포는 서열 번호 17, 23-32 및 43-49의 HCV 펩티드 또는 이들 분자의 단편을 발현하도록 제조된다.
본 발명의 HCV 펩티드를 발현하기 위해 각종 숙주-발현 벡터 시스템을 이용할 수 있다. 적절한 발현 시스템의 비제한적인 예로는 미생물, 예컨대 HCV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아(예컨대, E. 콜라이 또는 B. 서브틸리스); HCV 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모(예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); HCV 서열을 보유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 배큘로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; HCV 서열을 보유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염시키거나 또는 HCV 서열을 보유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예, Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈 유래의 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 발현 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)을 들 수 있다.
박테리아 시스템에서는 발현시킨 HCV 유전자 생성물의 사용 목적에 따라서 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 단백질을 생산하고자 하는 경우, HCV 펩티드의 약학 조성물의 생성 또는 HCV 펩티드에 대한 항체의 생성을 위해, 예컨대 정제가 용이한 고농도의 융합 단백질 생성물의 발현을 유도하는 벡터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 벡터의 비제한적인 예로는 E. 콜라이 발현 벡터 pUR278[Ruther 등, EMBO J., 2:1791(1983)](이 벡터에서는 HCV 암호화 서열을 lacZ 암호화 영역과 리딩 프레임이 맞게 벡터에 개별적으로 결찰시켜서 융합 단백질을 생성할 수 있다); pIN 벡터[Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13:3101-3109(1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509(1989)] 등을 들 수 있다. pGEX 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 이종 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비이드에 흡착시킨 후 유리 글루타티온의 존재 하에 용리시켜서 용해된 세포로부터 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인하여 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 방출되도록 할 수 있다.
곤충 시스템에서는, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)를 이종 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용한다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 증식한다. HCV 암호화 서열을 바이러스의 비필수 영역(예컨대, 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝하고, AcNPV 프로모터(예컨대, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 배치한다. HCV 유전자 암호화 서열을 성공적으로 삽입하면 폴리헤드린 유전자가 불활성화되고 비폐색 재조합 바이러스(즉, 폴리헤드린 유전자에 의해 암호화되는 단백질 코트가 없는 바이러스)가 생성된다. 그 후 이러한 재조합 바이러스를 사용하여 스포돕테라 프루기페르다 세포를 감염시키며, 이 세포에서 삽입된 유전자가 발현된다[참고 문헌의 예: Smith 등, J. Virol. 46:584(1983) 및 Smith의 미국 특허 제4,215,052호].
포유동물 숙주 세포에서는 다수의 바이러스계 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우, 목적하는 HCV 뉴클레오타이드 서열을 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예컨대 후기 발현 프로모터 및 3분열(tripartite) 리더 서열에 결찰시킬 수 있다. 그 후 이러한 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입시킬 수 있다. 바이러스 게놈을 비필수 영역(예컨대, 영역 E1 또는 E3)으로 삽입하면 감염된 숙주에서 생존할 수 있고 HCV 유전자 생성물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 얻어진다[참고 문헌의 예: Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659(1984)]. 삽입된 HCV 뉴클레오타이드 서열의 효율적인 번역에는 특이적 개시 시그널이 필요할 수도 있다. 이러한 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다.
그러나, HCV 암호화 서열의 일부분만이 삽입되는 경우, 아마도 ATG 개시 코돈을 비롯하여 외생 번역 조절 시그널이 제공될 수 있다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역을 확실히 하기 위해 목적 암호화 서열의 리딩 프레임과 일치하도록 삽입할 수 있다. 이러한 외생 번역 조절 시그널 및 개시 코돈은 그 기원이 다양할 수 있으며, 천연 및 합성된 것일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결서열 등을 포함시켜서 증대시킬 수 있다[참고 문헌의 예: Bittner 등, Methods in Enzymol., 153:516-544(1987)].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하고, 원하는 특이적인 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예, 글리코실화) 및 프로세싱(예, 절단)은 단백질의 기능에 있어서 중요한 것이다. 서로 다른 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 보유한다. 발현된 이종 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이 목적을 위해, 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 유전자 생성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 소기관을 보유하는 진핵생물 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포의 비제한적인 예로는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38이 있다.
장기간의 고수율 재조합 단백질 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 전술한 HCV 펩티드를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는 숙주 세포를 적절한 발현 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 서열, 전자 종결서열, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커에 의해 제어된 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 이종 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 농축 배지에서 1∼2일간 배양하고 나서, 배지를 선별 배지로 교환한다. 재조합 플라스미드 내의 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하여, 세포가 그 플라스미드를 자신의 염색체에 안정하게 통합시켜서 성장하게 함으로써 성장점을 형성하게 되며, 이를 클로닝하여 세포주로 증폭시킨다. 이 방법은 HCV 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 조작하는 데 편리하게 이용된다.
허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제[Wigler 등, Cell 11:223(1977)], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026(1962)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Lowy 등, Cell 22:817(1980)]를 비롯하여 다수의 선별 시스템을 이용할 수 있으며, 유전자들은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 이용될 수 있다. 또한, 하기 유전자에 대한 선별의 기초로서 항대사물질 내성을 이용할 수 있다: dhfr; 이는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다[Wigler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567(1980); O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527(1981)]; gpt, 이는 미코페놀산에 대한 내성을 부여한다[Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072(1981); neo, 이는 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여한다[Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol. 150:1(1981)]; 및 hygro, 이는 하이그로마이신에 대한 내성을 부여한다[Santerre 등, Gene 30:147(1984)].
대안으로, 발현되는 융합 단백질에 특이적인 항체를 이용함으로써 임의의 융합 단백질을 쉽게 정제할 수 있다. 예를 들어, Janknecht 등에 의해 기술된 시스템은 인간 세포주에서 발현되는 비변성 융합 단백질의 즉석 정제를 가능하게 한다[Janknecht 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976(1991)]. 이 시스템에서는, 목적 유전자를 백시니아 재조합 플라스미드에 서브클로닝하여, 유전자의 오픈 리딩 프레임이 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노 말단 태그에 번역 가능하게 융합되도록 한다. 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 세포로부터의 추출물을 Ni2+ 니트릴로아세트산-아가로스 컬럼 상에 로딩하고, 이미다졸-함유 완충액을 사용하여 히스티딘-태그 단백질을 선택적으로 용리시킨다. 하기 실시예에서는 본 발명의 핵산에 의해 암호화된 HCV 펩티드를 발현하는 데 이용된 방법에 대해 설명한다.
실시예 13
NS3/4A 융합 단백질, 이의 절두형 및 돌연변이형의 특성을 규명하기 위해, 실시예 6에 기술된 벡터 작제물을 생체내에서 전사 및 번역시키고, 생성된 폴리펩티드를 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 시각화하였다. 시험관내 전사 및 번역은 T7이 결합된 망상적혈구 용해물 시스템(프로메가, 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 발현 작제물의 모든 시험관내 번역 반응은 35S-표지 메티오닌(아머샴 인터내셔널, Plc, 영국 버킹엄셔 소재)을 사용하여 30℃에서 수행하였다. 표지된 단백질은 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, X-선 필름(Hyper Film-MP, 아머샴)에 6∼18시간 동안 노출시켜서 시각화하였다.
시험관내 분석 결과 모든 단백질이 그 개개의 발현 작제물로부터 다량 발현되었음이 확인되었다. rNS3 작제물(NS3-pVAX 벡터)은 약 61 kDa의 단일 펩티드를 생성한 반면, TPT 작제물(NS3/4A-TPT-pVAX) 및 RGT 작제물(NS3/4A-RGT-pVAX)은 약 67 kDa의 단일 폴리펩티드를 생성하였으며, 이는 NS3/4A-pVAX 작제물로부터 생성된 절단되지 않은 NS3/4A 펩티드의 분자량과 동일한 것이다. 발현된 NS3/4A 펩티드로부터 생성된 절단된 생성물은 약 61 kDa였으며, 이는 NS3-pVAX 벡터로부터 생성된 rNS3와 크기가 동일하였다. 이러한 결과는 발현 작제물이 기능을 나타내었고, NS3/4A 작제물은 효소 활성이 있으며, rNS3는 예상 크기의 펩티드를 생성하였고, TPT 및 RGT 돌연변이는 NS3-NS4A 접합점에서의 절단을 완전히 파괴하였음을 입증하는 것이었다.
본 발명의 HCV 핵산 및 펩티드를 포함하는 서열, 작제물, 벡터, 클론 및 기타 물질은 농축된 형태이거나 분리된 형태일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "농축된(enriched)"이란 용어는 물질의 농도가 자연 상태의 농도의 약 2, 5, 10, 100, 또는 1000배 이상인 것을 의미하며, 예를 들어 유용하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량% 이상인 것을 의미한다. 약 0.5 중량%, 1 중량%, 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량%의 농축 제제 역시 고려될 수 있다. "분리된"이란 용어는 물질이 원래 환경(예컨대, 자연 발생적인 것이라면 자연 환경)으로부터 제거될 것을 요한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적 폴리뉴클레오타이드는 분리된 상태가 아니지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 격리시킨 동일한 폴리펩티드는 분리된 상태이다. 서열은 정제된 형태로 존재하는 것이 유용할 수 있다. "정제된"이란 용어는 절대 순도를 요하지는 않으며, 상대적 개념으로 사용된 것이다. 분리된 단백질은 통상적으로, 예를 들어 전기영동 결과가 코마시 염색법에 의해 균질한 상태로 확인될 정도로 정제된다. 출발 물질 또는 천연 물질을 적어도 1배 이상, 바람직하게는 2∼3배, 보다 바람직하게는 4배 또는 5배 정도로 정제하는 것은 분명히 포함된다.
본 발명의 HCV 유전자 생성물을 식물, 곤충 및 동물에서 발현시켜서 형질전환 생물체를 생성할 수도 있다. HCV 펩티드를 보유하는 바람직한 형질전환 식물체로는 아라비돕시스(Arabidopsis), 옥수수 및 클라마이도모나스(Chlamydomonas)가 있다. HCV 펩티드를 보유하는 바람직한 곤충 시스템의 비제한적인 예로는 D. 멜라노개스터(D. melanogaster) 및 C. 엘레간스(C. elegans)가 있다. 비제한적인 예로서 양서류, 파충류, 조류, 마우스, 햄스터, 래트, 토끼, 기니 피그, 돼지, 소형 돼지, 염소, 개, 고양이 및 비인간 영장류, 예컨대 버분, 원숭이 및 침팬지를 비롯하여 임의의 종의 동물을 본 발명의 HCV 분자를 보유하는 형질전환 동물을 생성하는 데 이용할 수 있다. 이러한 형질전환 생물체는 바람직하게는 본 발명의 HCV 펩티드의 생식 세포 전달을 나타낸다.
형질전환 동물의 기초 혈통을 구축하기 위해 동물에 HCV 트랜스유전자를 도입하거나, 또는 기존의 HCV 유전자를 넉 아웃시키거나 대체하는 데에는 당업계에 공지된 임의의 기법이 바람직하게 이용된다. 이러한 기법의 비제한적인 예로는 전핵 마이크로인젝션[Hoppe, P.C. 및 Wagner, T.E., 1989, 미국 특허 제4,873,191호]; 레트로바이러스를 매개로 생식 세포에 유전자를 전달하는 방법[Van der Putten 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152(1985)]; 배아 줄기 세포로의 유전자 표적화[Thompson 등, Cell 56:313-321(1989)]; 배아의 일렉트로포레이션[Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814(1983)]; 및 정자를 매개로 한 유전자 전달[Lavitrano 등, Cell 57:717-723(1989); Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229(1989)]이 있다. 하기 섹션에서는 본 발명의 HCV 펩티드와 상호작용하는 항체의 제조에 대해 설명한다.
항-HCV 항체
HCV 펩티드의 합성 또는 발현 및 분리 또는 정제 후에, 분리된 또는 정제된 펩티드를 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. 문맥에 따라서 "항체"란 용어는 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체, 키메릭 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편들을 포괄할 수 있다. HCV 펩티드를 인식하는 항체는 비제한적인 예로서 생물공학적 용도, 치료/예방 용도 및 진단 용도를 비롯하여 다수의 용도에 사용될 수 있다.
항체의 생산을 위해서는, 염소, 토끼, 래트, 마우스 및 인간 등의 각종 숙주에 HCV 펩티드를 주사하여 면역화시킬 수 있다. 숙주의 종에 따라서 다양한 면역 보강제를 사용하여 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 이러한 면역 보강제로는 리바비린, 프로인트, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 및 표면 활성 성분, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 들 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. BCG(바실러스 칼멧-구에린) 및 코리네박테리움 파르범(Corynebacterium parvum) 역시 유효하게 사용될 수 있는 면역 보강제이다.
특이적 항체를 유도하는 데 사용된 펩티드는 4개 이상의 아미노산, 바람직하게는 최소한 10∼15개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 방법의 예로, NS3/4A의 단편을 암호화하는 아미노산의 짧은 스트레치를 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 다른 단백질에 융합시켜서 항체가 키메라 분자에 대해 생성되도록 한다. 또한, 리바비린 및 NS3/4A(서열 번호 17), 아미노산 길이가 최소한 4, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개인 이의 단편, 이들 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 동물에게 투여한다. HCV 펩티드에 상응하는 합성 3-머, 10-머, 및 15-머 펩티드를 마우스에 주사함으로써 HCV를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 생성할 수 있지만, 전술한 바와 같이 제조한 재조합 HCV 펩티드를 사용하여 더 다양한 종류의 항체를 생성할 수 있다.
HCV 펩티드에 대한 항체를 생성하기 위해, 형질감염 또는 형질전환된 세포로부터 실질적으로 순수한 펩티드를 분리한다. 최종 제조물 내의 펩티드의 농도를, 예컨대 아미콘 필터 장치 상에서 농축시켜서 수 ㎍/㎖가 되도록 조정한다. 그 후 아래와 같이 목적 펩티드에 대한 모노클로널 또는 폴리클로널 항체를 제조할 수 있다.
HCV 펩티드에 대한 모노클로널 항체는 배양시 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 기법에는 Koehler 및 Milstein의 문헌[Nature 256:495-497(1975)]에서 처음 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법[Kosbor 등, Immunol. Today 4:72(1983); Cote 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030(1983)] 및 EBV 하이브리도마 기법[Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York N.Y., pp 77-96(1985)]을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기법, 적절한 항원 특이성과 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻기 위해 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱하는 기법을 이용할 수도 있다[Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855(1984); Neuberger 등, Nature 312:604-608(1984); Takeda 등, Nature 314:452-454(1985)]. 대안으로, 단일 쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기법(미국 특허 제4,946,778호)을 HCV-특이적 단일 쇄 항체를 생산하는 데 이용할 수 있다. Orlandi 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837(1989)] 및 Winter G. 및 Milstein C의 문헌[Nature 349:293-299(1991)]에 개시된 바와 같이, 항체는 림프구 군집에서의 생체내 생산을 유도하거나, 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 고도로 특이적인 결합 반응물질류를 스크리닝함으로써 생산할 수도 있다.
HCV 펩티드에 대한 특이적 결합 부위를 포함하는 항체 단편 역시 생성할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편의 비제한적인 예로는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황화 다리를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 들 수 있다. 또는, Fab 발현 라이브러리는 목적하는 특이성을 갖는 모노클로널 Fab 단편을 신속하고 쉽게 확인할 수 있도록 하기 위해 제작될 수 있다[Huse W.D. 등, Science 256:1275-1281(1989)].
한 방법으로서, HCV 펩티드에 대한 모노클로널 항체를 다음과 같이 제조한다. 요약하면, 선별된 단백질 또는 이로부터 유래된 펩티드 몇 마이크로그램을 수주일에 걸쳐서 마우스에 반복적으로 접종한다. 그 후 마우스를 죽이고, 비장의 항체 생산 세포를 분리한다. 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에 마우스 골수종 세포와 비장 세포를 융합시키고, 아미노프테린을 포함하는 선별 배지(HAT 배지) 상에서 세포를 성장시켜 과량의 비융합 세포를 파괴한다. 성공적으로 융합된 세포를 희석시키고, 희석물 분약을 미량역가 플레이트의 웰에 넣고 거기에서 배양을 계속한다. Engvall, E. 등의 문헌[Meth. Enzymol. 70:419(1980)]에 처음 개시된 ELISA 등의 면역분석 방법 및 이 방법의 변형 방법에 의해 웰의 상청액 중에서 항체를 검출함으로써 항체-생산 클론을 확인한다. 선별된 양성 클론을 증폭시키고, 이의 모노클로널 항체 생성물을 사용 목적으로 회수할 수 있다. 모노클로널 항체 생산에 대한 상세한 절차는 Davis 등의 문헌[Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, 섹션 21-2]에 기술되어 있다.
단일 단백질의 이종 에피토프에 대한 항체를 함유하는 폴리클로널 항혈청은 전술한 것으로부터 유래된 발현된 단백질 또는 펩티드를 적절한 동물에 접종함으로써 제조할 수 있으며, 면역원성을 증강시키기 위해 이를 변형시킬 수도 있고 변형시키지 않을 수도 있다. 효율적인 폴리클로널 항체 생산은 항원 또는 숙주 종 둘 다와 관련된 다수의 요인에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 작은 분자들은 다른 것보다 면역원성이 더 적은 경향이 있으며, 캐리어 및 면역 보강제의 사용이 필요할 수 있다. 또한, 숙주 동물은 접종 부위와 투여량에 따른 반응이 다양하며, 부적절한 양이나 과량의 항원은 항혈청의 역가를 떨어뜨리게 된다. 소량(ng 수준)의 항원을 여러 부위에 피내 주사하는 것이 가장 확실한 것으로 보인다. 토끼에 대한 면역화 프로토콜에 대해서는 Vaitukaitis 등의 문헌[J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991(1971)]에서 찾아볼 수 있다.
정기적으로 추가 접종을 실시하고, 반정량적으로, 예컨대 아가에서 알고 있는 농도의 항원에 대해 이중 면역확산을 실시하여 측정한 항체 역가가 떨어지기 시작할 때 항혈청을 회수한다. 이에 대해서는, 예를 들어 Ouchterlony, O. 등의 문헌[Handbook of Experimental Immunology, 19장, D. Wier(ed) Blackwell(1973)]을 참조로 할 수 있다. 항체의 안정기 농도는 일반적으로 혈청 1 ㎖당 0.1∼0.2 mg(약 12 μM)이다. 항원에 대한 항혈청의 친화력은, 예컨대 Fisher, D.의 문헌[Manual of Clinical Immunology, 42장, 2판(Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C.(1980)]에 기술된 바와 같이 경쟁적 결합 곡선을 작성하여 결정한다. 어느 프로토콜에 따라 제조된 항체 제조물이라도 생물학적 샘플 중의 항원-보유 물질의 농도를 측정하는 정량적 면역분석에 유용하며, 이들은 또한 반정량적으로 또는 정성적으로(예컨대, 생물학적 샘플 중의 HCV의 존재를 확인하기 위한 진단적 목적으로) 사용되기도 한다. 하기 섹션에서는 진단 구체예 몇 가지를 더 상세히 설명한다.
진단 구체예
일반적으로, 본 발명의 진단법은 핵산을 이용하는 분석인지 단백질을 이용한 분석인지에 따라 분류된다. 일부 진단적 분석은 환자로부터 얻은 샘플 중의 본 발명의 HCV 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하지만, 다른 분석은 본 발명의 HCV 펩티드가 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 중에 존재하는지를 확인하고자 하는 것이다. 또한, HCV의 신속한 검출 및 확인을 가능하게 하는 본 명세서에 기술된 시약 및 방법을 포함시킨 키트의 제조 역시 본 발명의 구체예가 된다. 이러한 진단 키트는, 예를 들어 HCV를 특이적으로 검출하는 본 발명의 핵산 프로브 또는 항체를 포함한다. 이러한 키트의 검출 성분은 일반적으로 하기 시약 중 하나 이상과 함께 제공된다. DNA, RNA 또는 단백질을 흡착 또는 결합시킬 수 있는 지지체가 종종 제공된다. 유용한 지지체로는 니트로셀룰로스 멤브레인, 나일론 멤브레인 또는 양전하 치환기의 어레이를 보유함으로써 특성화될 수 있는 유도체화된 나일론 멤브레인을 포함한다. 1종 이상의 제한 효소, 조절 시약, 완충액, 증폭 효소 및 비인간 폴리뉴클레오타이드 유사 송아지-흉선 DNA 또는 연어 정자 DNA를 이들 키트에 제공할 수 있다.
유용한 핵산 기초 진단법에는 직접 DNA 시퀀싱, 서든 블롯 분석, 닷 블롯 분석, 핵산 증폭 및 이러한 방법의 병용법을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 분석을 위한 출발점은 HCV에 감염된 것으로 의심되는 환자 또는 HCV 감염 위험이 있는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 분리 또는 정제된 핵산이다. 이 샘플로부터 핵산을 추출하고, 본 발명의 HCV 핵산 서열[예컨대, NS3/4A(서열 번호 16)]에 인접한 영역에 상응하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR 및/또는 DNA 증폭에 의해 핵산을 증폭시킬 수 있다.
몇몇 구체예에서는, HCV 서열과 특이적으로 하이브리드화하는 핵산 프로브를 정렬된 어레이로 지지체 상에 부착시키는데, 이때 핵산 프로브를 서로 중첩되지 않도록 지지체의 서로 다른 영역에 부착시킨다. 바람직하게는, 이러한 정렬된 어레이는, 프로브의 개별 위치를 기록하고, 분석 절차의 일부로서 그 기록을 호출할 수 있는 "어드레서블(addressable)"이 되도록 디자인한다. 이러한 프로브를 지지체의 서로 다른 알고 있는 지점에 결합시킨다. 각 핵산 프로브의 정확한 위치를 알고 있기 때문에 이들 "어드레서블" 어레이가 결합 분석에서 특히 유용하게 된다. 그 후 여러 생물학적 샘플 제제로부터의 핵산을 통상적인 방법(예컨대, 방사능 또는 형광)에 의해 표지하고, 표지된 샘플을 하이브리드화가 일어날 수 있는 조건하에 상기 어레이에 적용한다.
샘플 중의 핵산이 어레이 상의 프로브에 하이브리드화한다면, 하이브리드의 위치에 상응하는 지지체 상의 지점에서 시그널이 검출될 것이다. 각 표지된 샘플의 실체를 알고 있고, 표지된 샘플이 적용된 지지체 상의 영역을 알고 있기 때문에, 다형 변이체의 존재 확인은 신속하게 결정될 수 있다. 이러한 방법은 고처리량 진단 분석 또는 검출 분석 분야의 기술자에게 공지되어 있는 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다.
또한, 앞서 제시한 것과 반대 방법을 이용할 수도 있다. 생물학적 샘플 중에 존재하는 핵산을 지지체 상에 배치하여 어드레서블 어레이를 형성할 수 있다. 샘플은 지지체 상의 알고 있는 지점에 중첩되지 않도록 배치하는 것이 바람직하다. 각 샘플 중의 HCV 핵산의 존재는, 생물학적 샘플이 배치된 지점에 상응하는 어레이 상의 위치에 HCV 펩티드를 암호화하는 핵산에 대해 상보 서열인 표지된 핵산 프로브를 적용함으로써 결정한다. 생물학적 샘플의 실체 및 어레이 상의 그 위치를 알고 있기 때문에, HCV에 감염된 환자의 확인은 신속하게 결정될 수 있다. 이러한 방법 역시 고처리량 진단 분석 분야의 기술자에게 공지되어 있는 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다.
당업계에 공지된 임의의 어드레서블 어레이 기법을 이용할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 어레이의 한 특정 구체예가 GenechipsTM로서 알려져 있으며, 이는 미국 특허 제5,143,854호; PCT 공개 공보 WO 90/15070 및 92/10092에 개괄적으로 기술되어 있다. 이러한 어레이는 일반적으로 기계적 합성 방법 또는 광 유도 합성 방법을 이용하여 제조되며, 이 방법은 포토리소그래피 및 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성의 병용법을 포함한다[Fodor 등, Science, 251:767-777(1991)]. 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오타이드 어레이를 고정시키는 것은 "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis"(VLSPISTM)로서 일반적으로 알려진 기법의 개발에 의해 가능하게 되었으며, 이 기법에서는 통상 프로브를 칩의 고체 표면 상에 고밀도 어레이로 고정시킨다. VLSPISTM 기법의 예는 미국 특허 제5,143,854호 및 제5,412,087호 및 PCT 공개 공보 WO 90/15070, WO 92/10092 및 WO 95/11995에 제시되어 있으며, 이 문헌들은 광 유도 합성 기법 등의 기법을 통해 올리고뉴클레오타이드 어레이를 형성하는 방법에 대해 설명한다. 고체 지지체 상에 고정된 뉴클레오타이드의 어레이를 제공하기 위한 목적의 방법을 고안하는 데 있어서, 하이브리드화 패턴 및 진단 정보를 최대화하기 위한 시도로 칩 상에 올리고뉴클레오타이드 어레이를 정렬 및 배치하기 위한 추가의 프리젠테이션 기법을 개발하였다. 이러한 프리젠테이션 기법의 예는 PCT 공개 공보 WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212, 및 WO 97/31256에 개시되어 있다.
다양한 표지 및 접합 기법이 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 다양한 핵산 분석에 사용될 수 있다. 올리고표지법, 닉(nick) 번역, 말단 표지법 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭을 비롯하여 하이브리드화 또는 PCR을 위한 표지된 핵산을 제조하기 위한 여러 방법이 존재한다. 대안으로, HCV 펩티드를 암호화하는 핵산을 mRNA 프로브의 생성을 위한 벡터에 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 공지되어 있으며, 시판되기도 하고, 적절한 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오타이드를 첨가하여 시험관내에서 RNA 프로브를 합성하는 데 이용할 수 있다. 파마시아 바이오테크(뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가(위스콘신주 매디슨 소재) 및 U.S. 바이오케미칼 코포레이션(오하이오주 클리브랜드 소재) 등의 다수의 회사가 상기 절차를 위한 상업용 키트 및 프로토콜을 공급한다. 적절한 리포터 분자 또는 표지로는 방사성 핵종, 효소, 형광, 화학발광 또는 색원체는 물론, 기질, 보조 인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함된다.
환자로부터 얻은 단백질 샘플 중의 HCV 펩티드의 존재 역시 통상적인 분석 및 본 명세서에 개시된 구체예에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 HCV 펩티드와 면역반응성인 항체를 사용하여 HCV 감염의 존재에 대해 생물학적 샘플을 스크리닝할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 HCV 펩티드에 반응성인 항체를 사용하여 생물학적 샘플로부터 얻은 본 발명의 HCV 펩티드를 면역침전시키거나, 또는 웨스턴 또는 이뮤노블롯 상에서 생물학적 샘플로부터 얻은 단백질과 반응시킨다. 바람직한 진단 구체예는 또한 효소-결합 면역흡착분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 면역방사계측법(IRMA) 및 면역효소분석(IEMA)을 포함하며, 여기에는 본 발명에 개시된 HCV 펩티드에 대해 특이적인 모노클로널 및/또는 폴리클로널 항체를 이용하는 샌드위치 분석도 포함된다. 대표적인 샌드위치 분석에 대해서는 David 등의 미국 특허 제4,376,110호 및 4,486,530호에 기술되어 있다. 다른 구체예는 미국 특허 제5,290,678호; 제5,604,105호; 제5,710,008호; 제5,744,358호 및 제5,747,274호에 개시된 면역-스트립 기법의 양태를 이용한다.
또 다른 바람직한 단백질계 진단법에서는, 전술한 항체를 정렬된 어레이로 지지체 상에 부착시키는데, 이때 다수의 항체가 서로 중첩되지 않도록 지지체 상의 서로 다른 영역에 부착시킨다. 핵산을 이용한 어레이에서와 마찬가지로, 단백질을 이용한 어레이는, 서로 다른 위치를 기록하고, 분석 절차의 일부로서 그 기록을 호출할 수 있도록 "어드레서블" 어레이가 되도록 디자인된 정렬된 어레이이다. 이러한 프로브를 지지체 상의 알고 있는 서로 다른 위치에 결합시킨다. 각 프로브의 정확한 위치를 알고 있기 때문에 이러한 "어드레서블" 어레이는 특히 결합 분석에 유용하게 된다. 예를 들어, 어드레서블 어레이는 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 펩티드를 특이적으로 인식하는 다수의 항체 프로브가 결합되어 있는 여러 영역을 갖는 지지체를 포함할 수 있고, 그 안에서 확인된 HCV의 아이소타입을 구별할 수 있다.
한 방법으로서, 생물학적 샘플로부터 단백질을 입수한 다음, 통상적인 방법(예컨대, 방사능, 색채 또는 형광)에 의해 표지한다. 그 후 표지된 샘플을 결합이 가능한 조건에서 어레이에 적용한다. 샘플 중의 단백질이 어레이 상의 항체 프로브에 결합한다면, 항체-단백질 복합체의 위치에 해당하는 지지체 상의 지점에서 시그널이 검출될 것이다. 각 표지된 샘플의 실체를 알고 있고, 표지된 샘플이 적용된 지지체 상의 영역을 알고 있기 때문에, 존재의 확인, 농도 및/또는 발현 수준을 신속히 결정할 수 있다. 즉, 알고 있는 농도의 표지된 HCV 펩티드 스탠더드를 사용함으로써 연구자들은 테스트 샘플 중의 특정 펩티드의 단백질 농도를 정확히 측정할 수 있으며, 또한 HCV 펩티드의 발현 수준을 평가할 수 있다. HCV 펩티드의 농도 또는 발현 수준을 보다 정확히 측정하기 위해 통상적인 농도 측정법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 고처리량 진단 분석 분야의 기술자에게 공지된 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다.
또 다른 구체예에서, 전술한 방법과 반대 방법을 이용할 수 있다. 생물학적 샘플 중에 존재하는 단백질을 지지체 상에 배치하여 어드레서블 어레이를 형성할 수 있다. 바람직하게는 단백질 샘플은 지지체 상에 서로 중첩되지 않도록 알고 있는 지점에 배치한다. 그 후 HCV 펩티드에 특이적인 에피토프를 인식하는 표지된 항체 프로브를 적용함으로써 각 샘플 중의 HCV 펩티드의 존재를 확인한다. 생물학적 샘플의 실체와 어레이 상의 그 지점을 알고 있기 때문에, HCV 펩티드의 존재의 확인, 농도 및/또는 발현을 신속히 결정할 수 있다.
즉, 알고 있는 농도의 표지된 HCV 펩티드 스탠더드를 사용함으로써, 연구자들은 샘플 중의 펩티드 농도를 정확히 측정할 수 있고, 이 정보로부터 펩티드의 발현 수준을 평가할 수 있다. 또한, 통상적인 농도 측정법을 이용하여 HCV 펩티드의 농도 또는 발현 수준을 보다 정확히 측정할 수 있다. 이러한 방법 역시 고처리량 진단 분석 분야의 기술자에게 공지된 기법을 이용하면 쉽게 자동화된다. 앞서 상세히 설명한 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 어드레서블 어레이 기법을 이용할 수 있다. 하기 섹션에서는 본 발명의 HCV 핵산 또는 HCV 펩티드 중 하나 이상의 함유할 수 있는 조성물 중 몇 가지에 대해 설명한다.
본 발명의 HCV 핵산 또는 펩티드를 함유하는 조성물
몇몇 구체예는 지지체에 결합된 HCV 핵산 또는 펩티드 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는 이러한 지지체는 다량체를 형성하기 위해 제조된다. 이러한 다량체는 HCV 펩티드 또는 핵산을 분자에 대한 충분한 친화력이 얻어지는 형태 또는 방식이 되도록 한다. HCV 핵산 또는 펩티드를 지닌 다량체는 목적 분자를 고분자 지지체 상에 결합시킴으로써 얻을 수 있다. "지지체"란 캐리어, 단백질, 수지, 세포 막, 또는 이러한 분자들을 결합 또는 고정시키는 데 사용되는 임의의 고분자 구조를 칭할 수 있다. 고체 지지체의 비제한적인 예로는 반응 트레이의 웰의 벽, 시험관, 폴리스티렌 비이드, 자기 비이드, 니트로셀룰로스 스트립, 멤브레인, 미립자, 예컨대 라텍스 입자, 동물 세포, Duracyte
Figure 112007073080177-PAT00020
, 인공 세포 등이 있다. HCV 핵산 또는 펩티드를 무기 캐리어, 예컨대 산화규소 재료(예컨대, 실리카 겔, 제올라이트, 규조토 또는 아민화된 유리)에, 예를 들어 캐리어 상의 히드록시기, 카르복시기 또는 아미노기 및 반응성 기를 통한 공유 결합에 의해 결합시킬 수도 있다.
몇몇 다량체에서는, 고분자 지지체는 소수성 비공유 결합에 의해 HCV 핵산 또는 펩티드의 일부분과 상호작용하는 소수성 표면을 가진다. 몇몇 경우, 지지체의 소수성 표면은 플라스틱 또는 소수성 기가 결합되어 있는 임의의 다른 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌 또는 폴리비닐이다. 또한, HCV 핵산 또는 펩티드는 단백질 및 올리고당류/다당류(예컨대, 셀룰로스, 전분, 글리코겐, 키토산 또는 아민화된 세파로스)를 비롯한 캐리어에 공유 결합시킬 수 있다. 상기한 후자의 다량체에서는 분자 상의 반응성 기, 예컨대 히드록시기 또는 아미노기를 이용하여 캐리어 상의 반응성 기에 결합시켜서 공유 결합을 형성할 수 있다. 그 밖의 다량체는 HCV 핵산 또는 펩티드를 부착시키기 위해 화학적으로 활성화된 다른 반응성 기를 가진 지지체를 포함한다. 예를 들어, 브롬화시아노겐 활성화 매트릭스, 에폭시 활성화 매트릭스, 티오 및 티오프로필 겔, 니트로페닐 클로로포르메이트 및 N-히드록시 숙신이미드 클로로포르메이트 결합, 또는 옥시란 아크릴 지지체가 사용된다(시그마).
체내에 사용하기 위한(즉, 예방용 또는 치료용) 캐리어는 생리적이고 비독성이어야 하며, 면역 반응성이 없는 것이 바람직하다. 체내에 사용하기 위한 적절한 캐리어에는 폴리-L-리신, 폴리-D, L-알라닌, 리포좀 및 Chromosorb
Figure 112007073080177-PAT00021
(존스-맨빌 프로덕츠, 덴버 컴퍼니)가 있다. 리간드 접합된 Chromosorb
Figure 112007073080177-PAT00022
(Sybsorb-Pk)는 용혈성 요독증의 예방에 대해 인간에서 테스트되었으며, 부작용을 나타내지 않는 것으로 보고되었다[Amstrong 등, J. Infectious Diseases 171:1042-1045(1995)]. 몇몇 구체예의 경우, 생물체의 체내에서 HCV 핵산 또는 펩티드에 대한 결합 능력을 보유하는 "네이키드(naked)" 캐리어(즉, HCV 핵산 또는 펩티드가 결합되지 않은 것)를 투여한다. 한 방법으로서, 네이키드 캐리어를 HCV 핵산 또는 펩티드와 별도로 투여하고, 생물체의 체내에 이 둘다가 존재하게 되면, 캐리어와 HCV 핵산 또는 펩티드가 다중결합 복합체로 조립되도록 "전구약물형" 요법을 고안한다.
또한, 링커, 예컨대 HCV 핵산 또는 펩티드와 지지체 사이에 적절한 길이의 링커(예컨대, λ파지의 가요성 영역을 모방하도록 제작된 "λ링커")를 삽입함으로써 HCV 펩티드, 하이브리드, 또는 결합 파트너의 가요성을 더욱 증가시켜서 지지체에 의해 부과될 수 있는 임의의 공간적 장애를 극복하는 것도 고려된다. 최적 세포 반응 또는 이의 부족을 정하는 링커의 길이의 결정은 본 명세서에 상세히 설명된 분석에서 다양한 링커를 사용하여 HCV 핵산 또는 펩티드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
한 종류 이상의 HCV 핵산 또는 펩티드를 포함하는 복합 지지체 역시 고려된다. "복합 지지체"는 캐리어, 수지, 또는 2종 이상의 상이한 HCV 핵산 또는 펩티드를 결합 또는 고정시키는 데 사용되는 임의의 고분자 구조일 수 있다. 전술한 바와 같이, HCV 핵산 또는 펩티드와 지지체 사이에 적절한 길이의 λ링커 등의 링커를 삽입함으로써 분자 내의 가요성을 증가시켜서 발생할 수 있는 임의의 공간적 장애를 극복하는 것도 고려된다. 최적 세포 반응 또는 이의 부족을 정하는 링커의 길이의 결정은 본 명세서에 상세히 설명된 분석에서 다양한 링커를 사용하여 HCV 핵산 또는 펩티드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
다른 구체예에서는, 전술한 다량체 지지체 및 복합 지지체는 다량체화된 HCV 핵산 또는 펩티드를 결합시켜서 각각 "다량체화된-다량체 지지체"와 "다량체화된-복합 지지체"를 형성할 수 있다. 다량체화된 리간드는, 예컨대 분자생물학의 통상적인 기법을 이용하여 2 이상의 HCV 핵산 또는 펩티드를 직렬로 결합시켜서 얻을 수 있다. HCV 핵산 또는 펩티드의 다량체 형태는, 예를 들어 더 큰 친화력을 갖는 물질을 얻을 수 있는 능력으로 인해 다수의 용도에서 유용하게 사용될 수 있다. 다량체화된 물질을 보완하기 위해 개개의 도메인 사이에 링커 또는 스페이서, 예컨대 가요성 λ링커를 병입하는 것 역시 몇몇 구체예에서 유용할 수 있다. 예를 들어 단백질 결합 도메인 사이에 적절한 길이의 λ링커를 삽입하면 분자 내의 가요성을 더욱 증가시켜서 공간적 장애를 극복할 수 있다. 유사하게, 다량체화된 HCV 핵산 또는 펩티드와 지지체 사이에 링커를 삽입하면 가요성을 더욱 증가시키고 지지체에 의해 부과되는 공간적 장애를 제한할 수 있다. 적절한 링커 길이의 결정은 본 명세서에서 상세히 설명한 분석에서 HCV 핵산 또는 펩티드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 구체예는 전술한 바와 같이 유전자 백신을 포함하기도 있다. 이러한 조성물은 리바비린 및 NS3/4A(서열 번호 17), NS3(서열 번호 29), 또는 돌연변이(예컨대, 서열 번호 30-32 및 43-49) 또는 이의 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42)을 암호화하는 핵산을 함유한다. 하기 실시예에서는 인간에게 사용하기에 적합한 유전자 백신의 제조에 대해 설명한다.
실시예 14
HCV 발현 플라스미드는 NS3/4A 펩티드를 발현하도록 조작된다. NS3/4A-pVAX의 NS3/4A 암호화 서열을 EcoRI 및 XbaI으로 분해한 후, 분리된 단편을 플라스미드 A에 삽입시켜서 이것이 CMV 프로모터와 RSV 인핸서 요소의 전사 제어 범위에 들도록 한다(Pachuk 등의 미국 특허 제6,235,888호 참조). 플라스미드 골격 A는 그 길이가 3969 염기쌍이고, 이 플라스미드는 E. 콜라이에서의 복제를 위한 PBR 복제 기점 및 가나마이신 내성 유전자를 보유하고 있다. NS3/4A와 같은 삽입체를 폴리링커 영역에 클로닝하면, 이는 삽입체를 프로모터와 폴리아데닐화 시그널 사이에 배치하여 작동가능하게 결합시킨다. 클로닝된 삽입체는 CMV 프로모터와 RSV 인핸서 요소의 제어 범위에 든다. 클로닝 부위의 바로 옆 3'쪽에 위치한 SV40 폴리 A 시그널의 존재에 의해 폴리아데닐화 시그널이 제공된다. 그 후 rNS3/4A 작제물 500 ㎍과 리바비린 1 mg을 혼합하여 NS3/4A 함유 백신을 제조한다.
상기 백신 조성물은 포유동물(예컨대, 마우스 또는 토끼)에서 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 바람직하게는 HCV 바이러스에 만성 감염된 인간에게서 항체를 생성하기 위해 근육 주사할 수 있다. 역시 수용체에게는 바람직하게는 4주 간격으로 혼합물을 3회 추가 접종한다. 3차 접종시까지 HCV에 특이적인 항체의 역가는 현저히 증가할 것이다. 또한, 이 시점에서, 상기 피험체는 NS3에 대한 항체 및 T-세포 매개 면역 반응의 증가를 나타낼 것이며, 이는 EIA로 검출시 NS3 특이적 항체의 증가된 분획 및 RT-PCR로 검출시 바이러스 로드의 감소에 의해 입증이 가능하다.
구체예는 또한 NS3/4A 융합 단백질 또는 이들 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 재조합 단백질의 생산 및 정제는 보조 아미노산을 첨가하여 "태그"를 형성함으로써 촉진할 수 있다. 이러한 태그의 비제한적인 예로는 His-6, Flag, Myc 및 GST가 있다. 태그는 C-말단, N-말단에 부가할 수 있거나, 또는 NS3/4A 아미노산 서열 내에 부가할 수 있다. 또 다른 구체예는 아미노 또는 카르복시 말단이 절단되거나, 내부 결실이 있거나, 또는 추가의 폴리펩티드 서열이 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 내부에 부가된 NS3/4A 융합 단백질을 포함한다. 다른 구체예는 NS3/4A 단백질 분해 절단 부위의 잔기가 치환된 NS3/4A 융합 단백질, 또는 이의 절두형 또는 돌연변이형을 포함한다. 상기 치환의 비제한적인 예로는 P1' 부위가 Ser, Gly, 또는 Pro이거나, P1 지점이 Arg이거나, 또는 P8∼P4' 서열이 Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-Ser-Thr-Trp-Val(서열 번호 28)인 서열이 있다.
다른 구체예는 NS3에 대한 증강된 면역 반응을 유발할 수 있는 NS3/4A 융합 단백질, 또는 이의 절두형 또는 변형을 포함하는 면역원에 관한 것이다. 면역원은 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있는데, 실질적으로 정제된 형태란 면역원에 다른 단백질, 지질, 탄수화물 또는 자연 상태에서 결합되어 있는 기타 화합물이 실질적으로 없도록 했음을 의미한다. 구체예는 또한 NS3/4A 융합 단백질(서열 번호 17) 또는 이의 절두형 또는 돌연변이형(예컨대, 서열 번호 29-32 및 43-49) 또는 이의 단편(예컨대, 서열 번호 25-27 및 33-42) 및 면역 보강제, 예컨대 리바비린을 함유하는 백신 조성물을 포함한다. 하기 실시예에서는 NS3/4A 융합 단백질 및 면역 보강제를 함유하는 백신 조성물을 제조하는 한 방법에 대해 설명한다.
실시예 15
태깅된 NS3/4A 작제물을 생성하기 위해, NS3/4A-pVAX의 NS3/4A 암호화 서열을 EcoRI 및 XbaI으로 분해하고, 분리된 단편을 Xpress 벡터(인비트로겐)에 삽입한다. Xpress 벡터를 사용하면 2가 양이온에 대한 친화력이 높은 짧은 N-말단 리더 펩티드를 보유한 재조합 융합 단백질의 생산이 가능하다. 니켈-킬레이트화 수지(인비트로겐)를 사용하여 재조합 단백질을 1 단계로 정제할 수 있으며, 그 후 엔테로키나제를 사용하여 리더를 절단할 수 있다. 바람직한 벡터는 pBlueBacHis2 Xpess이다. pBlueBacHis2 Xpess 벡터는 다중 클로닝 부위, 암피실린 내성 유전자 및 lac Z 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터이다. 따라서, 분해된 증폭 단편을 pBlueBacHis2 Xpess 벡터로 클로닝하고, 이 벡터로 SF9 세포를 감염시킨다. 그 후 제조업자의 지시에 따라 발현 단백질을 분리하거나 정제한다. 그 후 rNS3/4A 100 ㎍과 리바비린 1 mg을 혼합하여 NS3/4A 함유 백신 조성물을 제조한다.
상기 백신 조성물은 포유동물(예컨대, 마우스 또는 토끼)에서 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 바람직하게는 HCV 바이러스에 만성 감염된 인간에게서 항체를 생성하기 위해 근육 주사할 수 있다. 수용체에는 바람직하게는 4주 간격으로 혼합물을 3회 추가 접종한다. 3차 접종시까지 HCV에 특이적인 항체의 역가는 현저히 증가할 것이다. 또한, 이 시점에서, 상기 피험체는 NS3에 대한 항체 및 T-세포 매개 면역 반응의 증가를 나타내게 될 것이며, 이는 EIA로 검출시 NS3 특이적 항체의 증가된 분획 및 RT-PCR로 검출시 바이러스 로드의 감소에 의해 확인이 가능하다. 하기 섹션에서는 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 방법에 대한 추가 설명을 제공한다.
리바비린 및 항원을 함유하는 조성물의 사용 방법
본 명세서에서 기술된 백신의 투여 경로에는 경피, 비경구, 위장관, 경기관지 및 경폐포가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 경피 투여는 크림, 린스, 겔 또는 리바비린 및 항원이 피부에 침투할 수 있게 하는 기타 화합물을 도포하여 이루어질 수 있다. 비경구 투여 경로의 예로는 전기적 또는 직접 주사, 예컨대 중앙 정맥류로의 직접 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사, 피내 주사 또는 피하 주사가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 위장관 투여 경로의 예로는 섭취 및 직장 투여가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 경기관지 및 경폐포 투여 경로로는 구강 또는 비강을 통한 흡입이 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.
경피 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 피부에 직접 도포하거나, 보호성 캐리어, 예컨대 경피 디바이스("경피 패치")에 혼입하여 사용하는 약학적 허용 현탁액, 오일, 크림 및 연고를 포함하지만, 이들에만 국한되는 것은 아니다. 적절한 크림, 연고 등의 예는, 예컨대 문헌[Physician's Desk Reference]에서 찾아볼 수 있다. 적절한 경피 디바이스의 예는 1989년 4월 4일에 등록된 Chinen 등의 미국 특허 제4,818,540호에 기술되어 있다.
비경구 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 비제한적인 예로 약학적 허용 멸균 등장성 용액을 포함한다. 이러한 용액은 염수, 인산염 완충 염수 및 중앙 정맥류 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사, 피내 주사 또는 피하 주사용 오일 제제를 포함하나 이것에만 국한되는 것은 아니다.
경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 흡입을 위한 다양한 유형의 에어로졸을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 것들의 경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 디바이스 역시 본 발명의 구체예가 된다. 이러한 디바이스의 비제한적인 예로는 분무기와 증발기가 있다. 현재 사용되고 있는 분무기 및 증발기의 여러 형태를 리바비린 및 항원을 함유하는 백신을 전달하는 데 쉽게 적용할 수 있다.
위장관 투여에 적합한 리바비린 및 항원을 함유하는 조성물은 비제한적인 예로 약학적 허용 분말, 환약 또는 내복액 및 직장 투여용 좌약을 포함한다.
특히 본 명세서에서 기술한 유전자 작제물은 전통적인 주사기, 무바늘 주입 디바이스, 또는 "마이크로프로젝타일 충격 유전자 총" 등을 비롯하여 여러 수단에 의해 투여할 수 있다. 대안으로, 유전자 백신은 개체로부터 분리한 세포에 다양한 수단을 통해 도입할 수 있다. 이러한 수단의 예로는 체외 형질감염, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션 및 마이크로프로젝타일 충격을 들 수 있다. 유전자 작제물은 세포에 의해 업테이크된 후, 이는 개체로 재이식된다. 백신화된 세포가 원래 다른 개체로 취한 것일지라도 유전자 작제물이 혼입된 다른 비면역원성 세포를 개체에 이식할 수도 있다.
몇몇 구체예에 따르면, 유전자 작제물을 무바늘 주입 디바이스를 사용하여 개체에 투여한다. 일부 구체예에 따르면, 유전자 작제물은 무바늘 주입 디바이스를 사용하여 피내, 피하 및 근육에 동시에 투여한다. 무바늘 주사 디바이스는 널리 공지되어 있고 널리 이용되고 있다. 당업자라면 본 명세서의 교시에 따라 유전 물질을 개체의 세포에 전달하는 데 무바늘 주사 디바이스를 이용할 수 있다. 무바늘 주사 디바이스는 유전 물질을 모든 조직에 전달하는 데 매우 적합하다. 이들은 특히 유전 물질을 피부 및 근육 세포에 전달하는 데 유용하다. 몇몇 구체예에서는 DNA 분자를 함유하는 액체를 개체의 피부 표면을 향하여 추진시키는 데 무바늘 주사 디바이스를 사용할 수 있다. 액체는 피부에 충돌시 액체가 피부 표면을 침투하고 피부 및 그 아래의 근육 조직을 관통할 수 있을 정도의 충분한 속도로 추진된다. 이로써, 유전 물질이 피내, 피하 및 근육으로 동시에 투여된다. 몇몇 구체예에서는 핵산 분자를 기관의 세포에 도입하기 위해 다른 기관의 조직에 유전 물질을 전달하는 데 무바늘 주사 디바이스를 사용할 수 있다.
리바비린 및 항원을 함유하는 백신은 다양한 질병을 치료 및 예방하고, 항원에 대한 동물의 면역 반응을 증강시키는 데 사용될 수 있다. 당업자라면 박테리아 질병, 바이러스 질병, 진균 질병 및 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체에게 통상적인 백신을 투여했음을 알 것이다. 본 명세서에 개시된 백신은 리바비린을 첨가하여 변형시킨 종래의 백신을 포함하기 때문에 본 명세서에 개시된 방법은 항원 및 리바비린을 함유하는 백신을 사용하여 질병을 치료 및 예방하는 방법을 포함한다.
바람직한 구체예는 간염 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 치료 또는 예방을 요하는 동물에게 간염 항원(예컨대, 펩티드 항원 또는 핵산계 항원)과 상기 동물에서 면역 보강 활성을 나타내기에 충분한 양의 리바비린을 투여한다. 따라서, 현재 이용되고 있는 진단 테스트 또는 임상적 평가방법을 이용하여 동물이 치료 또는 예방이 필요한지를 확인할 수 있다. 이러한 구체예에 이용될 수 있는 간염 바이러스 항원의 범주는 다양하다. 바람직한 간염 바이러스 항원에는 HBV 항원, HAV 항원, HCV 항원, 이들 항원을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 매우 바람직한 구체예는 간염 B 표면 항원(HBsAg), 간염 코어 항원(HBcAg) 및 간염 E 항원(HBeAg)으로 구성된 군에서 선택된 HBV 항원, 특히 전술한 펩티드 및 핵산계 항원을 포함한다. 리바비린 및 항원은 별도로, 또는 함께 투여할 수 있으며, 다른 면역 보강제(예, 오일, 명반 또는 면역 반응을 증강시키는 기타 물질)를 필요로 하는 동물에게 투여할 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예는 감염된 동물 또는 감염 위험이 있는 동물을 확인하고, 상기 동물에 간염 항원(예컨대, HBsAg, HBcAg 및 HBeAg) 및 면역 보강 활성을 나타내기에 충분한 양의 리바비린을 투여함으로써 동물의 간염(예컨대, HBV)을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
다른 구체예는 필요로 하는 동물에게 면역 반응을 증강시키기에 유효한 양의 리바리린과 함께 항원을 투여함으로써 면역 반응을 증강시키는 방법을 포함한다. 이러한 구체예에서, 항원에 대한 면역 반응 증강이 필요한 동물은 현재 이용되고 있는 진단 테스트 또는 임상적 평가 방법을 이용하여 확인한다. 종종 이들 개체는 질병(예컨대, 박테리아, 진균, 사상균, 바이러스 또는 암)을 앓고 있거나, 또는 이들 질병에 걸릴 위험이 있다. 그러나, 증강된 면역 반응을 요하는 동물은 중독된 동물(예컨대, 독이 있는 곤충이나 동물에게 물린 동물)이나, 독소 또는 기타 독성 화합물에 노출된 동물일 수 있다. 일단 필요한지가 확인되면, 그 동물에서 면역 반응을 증강시키기에 유효한 양의 리바비린 및 적절한 항원을 이들 동물에게 투여한다.
전술한 바와 같이, 상기 구체예에 이용될 수 있는 간염 바이러스 항원의 비제한적인 예는 HBV 항원, HAV 항원, HCA 항원, 이들 분자를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 매우 바람직한 구체예는 간염 B 표면 항원(HBsAg), 간염 코어 항원(HBcAg) 및 간염 E 항원(HBeAg)으로 구성된 군에서 선택된 HBV 항원, 특히 전술한 펩티드 및 핵산계 항원을 포함한다. 리바비린 및 항원은 별도로, 또는 함께 투여할 수 있으며, 다른 면역 보강제(예, 오일, 명반 또는 면역 반응을 증강시키는 기타 물질)를 필요로 하는 동물에게 투여할 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예는 치료를 요하는 동물을 확인하고, 상기 동물에 간염 항원(예컨대, HBsAg, HBcAg 및 HBeAg) 및 그 동물에서 면역 반응을 증강시키기에 유효한 양의 리바비린을 투여함으로써 동물의 간염 항원(예컨대, HBV)에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 포함한다.
한 방법의 예로서, 개체가 HCV에 감염되는 것으로부터 보호하기 위해 NS3에 대한 세포 및 체액 면역 반응을 유발하기에 충분한 양의 상기 백신 조성물을 비감염 개체에 투여한다. 다른 구체예에서는, HCV-감염 개체를 확인하고, HCV 감염을 감소 또는 제거하기 위해 NS3에 대한 세포 및 체액 면역 반응을 증강시키기에 충분한 양의 NS3 및 리바비린을 함유하는 백신 조성물을 투여한다. 이러한 개체의 감염 단계는 만성 또는 급성 단계일 수 있다. 또 다른 구체예에서는, HCC를 앓고 있는 HCV에 감염된 개체에게 NS3-발현 종양 세포에 대한 세포 및 체액 면역 반응을 유발하기에 충분한 양의 NS3/4A 융합 유전자 및 리바비린을 함유하는 조성물을 투여한다.
본 발명을 구체예와 실시예를 참조로 하여 설명하였으나, 본 발명의 발명 사상으로부터 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
도 1은 리바비린 1 mg의 단일 용량과 재조합 간염 C 바이러스(HCV) 비구조 3 단백질(NS3) 10 및 100 ㎍을 동시에 투여하였을 때 이에 대한 체액 반응을 평균 종점 역가로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 리바비린 0.1, 1.0, 또는 10 mg의 단일 용량과 재조합 간염 C 바이러스(HCV) 비구조 3 단백질(NS3) 20 ㎍을 동시에 투여하였을 때 이에 대한 체액 반응을 평균 종점 역가로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 NS3-특이적 림프절 증식 반응에 리바비린 1 mg의 단일 용량이 미치는 효과를 시험관내 리콜(recall) 반응으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 1차 접종 후 시간이 경과함에 따른 H-2d 마우스에서의 NS3에 대한 항체 역가를 나타낸 그래프이다. ◇는 NS3/4A-pVAX를 접종한 마우스에서의 항체 역가를 나타내고, □는 NS3-pVAX를 접종한 마우스에서의 항체 역가를 나타낸다.
도 5A는 이펙터 대 표적의 비가 변화함에 따른 SP2/0 표적 세포의 특이적 CTL-매개 용해의 비율(%)을 나타낸 그래프이다. 대조군 면역원으로 인산염 완충 염수(PBA)를 사용하였다.
도 5B는 이펙터 대 표적의 비가 변화함에 따른 SP2/0 표적 세포의 특이적 CTL-매개 용해의 비율(%)을 나타낸 그래프이다. 면역원으로 플라스미드 NS3/4A-pVAX를 사용하였다.
SEQUENCE LISTING <110> TRIPEP AB SALLBERG, Matti HULTGREN, Catharina <120> VACCINES CONTAINING RIBAVIRIN AND METHODS OF USE THEREOF <130> TRIPEP.023QPC <140> PCT/IB01/01808 <141> 2001-08-01 <150> US 09/705,547 <151> 2000-11-03 <150> US 60/229,175 <151> 2000-08-29 <150> US 60/225,767 <151> 2000-08-17 <160> 49 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3011 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus sequence <400> 1 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr 180 185 190 Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro 195 200 205 Asn Ser Ser Val Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro 210 215 220 Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val 225 230 235 240 Ala Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr 245 250 255 Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys 260 265 270 Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly 275 280 285 Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg His His Trp Thr Thr Gln Asp Cys 290 295 300 Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp 305 310 315 320 Asn Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln 325 330 335 Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His 340 345 350 Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp 355 360 365 Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu 370 375 380 Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val 385 390 395 400 Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr 405 410 415 Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser 420 425 430 Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn 435 440 445 Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp 450 455 460 Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu 465 470 475 480 Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile 485 490 495 Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser 500 505 510 Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser 515 520 525 Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro 530 535 540 Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe 545 550 555 560 Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn 565 570 575 Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys Tyr Pro Glu Ala 580 585 590 Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Arg Ile Thr Pro Arg Cys Met 595 600 605 Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr 610 615 620 Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu 625 630 635 640 Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp 645 650 655 Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp 660 665 670 Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly 675 680 685 Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly 690 695 700 Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val 705 710 715 720 Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp 725 730 735 Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val 740 745 750 Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly Leu Val Ser Phe 755 760 765 Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu Lys Gly Arg Trp Val Pro 770 775 780 Gly Ala Val Tyr Ala Leu Tyr Gly Met Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu 785 790 795 800 Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala Leu Asp Thr Glu Val Ala Ala 805 810 815 Ser Cys Gly Gly Val Val Leu Val Gly Leu Met Ala Leu Thr Leu Ser 820 825 830 Pro Tyr Tyr Lys Arg Tyr Ile Ser Trp Cys Met Trp Trp Leu Gln Tyr 835 840 845 Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gln Leu His Val Trp Val Pro Pro Leu 850 855 860 Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val Ile Leu Leu Thr Cys Val Val 865 870 875 880 His Pro Ala Leu Val Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Phe 885 890 895 Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gln Ala Ser Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe 900 905 910 Val Arg Val Gln Gly Leu Leu Arg Ile Cys Ala Leu Ala Arg Lys Ile 915 920 925 Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu 930 935 940 Thr Gly Thr Cys Val Tyr Asn His Leu Ala Pro Leu Arg Asp Trp Ala 945 950 955 960 His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val Phe 965 970 975 Ser Arg Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala 980 985 990 Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Gln 995 1000 1005 Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp Arg 1010 1015 1020 Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu 1025 1030 1035 1040 Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu 1045 1050 1055 Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr 1060 1065 1070 Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg 1075 1080 1085 Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Thr Tyr Thr Asn Val 1090 1095 1100 Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu 1105 1110 1115 1120 Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 1125 1130 1135 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu 1140 1145 1150 Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro 1155 1160 1165 Leu Leu Cys Pro Thr Gly His Ala Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val 1170 1175 1180 Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn 1185 1190 1195 1200 Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro 1205 1210 1215 Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr 1220 1225 1230 Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Lys Gly 1235 1240 1245 Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe 1250 1255 1260 Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr 1265 1270 1275 1280 Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr 1285 1290 1295 Gly Lys Phe Leu Ala Asp Ala Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile 1300 1305 1310 Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Ser Gly 1315 1320 1325 Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val 1330 1335 1340 Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro 1345 1350 1355 1360 Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr 1365 1370 1375 Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile 1380 1385 1390 Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val 1395 1400 1405 Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser 1410 1415 1420 Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu 1425 1430 1435 1440 Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr 1445 1450 1455 Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile 1460 1465 1470 Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg 1475 1480 1485 Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro 1490 1495 1500 Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys 1505 1510 1515 1520 Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr 1525 1530 1535 Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln 1540 1545 1550 Asp His Leu Gly Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile 1555 1560 1565 Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Phe Pro 1570 1575 1580 Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro 1585 1590 1595 1600 Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Arg Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro 1605 1610 1615 Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln 1620 1625 1630 Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys 1635 1640 1645 Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly 1650 1655 1660 Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val 1665 1670 1675 1680 Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro 1685 1690 1695 Asp Arg Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser 1700 1705 1710 Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala Glu Gln Phe 1715 1720 1725 Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Ser Arg His Ala Glu 1730 1735 1740 Val Ile Thr Pro Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu Val Phe 1745 1750 1755 1760 Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala 1765 1770 1775 Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala 1780 1785 1790 Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gly Gln Thr Leu Leu 1795 1800 1805 Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Ala Pro Gly 1810 1815 1820 Ala Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Leu Asp 1825 1830 1835 1840 Ser Val Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly 1845 1850 1855 Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu 1860 1865 1870 Val Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser 1875 1880 1885 Pro Gly Ala Leu Ala Val Gly Val Val Phe Ala Ser Ile Leu Arg Arg 1890 1895 1900 Arg Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile 1905 1910 1915 1920 Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro 1925 1930 1935 Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu Thr 1940 1945 1950 Val Thr Gln Leu Leu Arg Arg Leu His Gln Trp Ile Ser Ser Glu Cys 1955 1960 1965 Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile 1970 1975 1980 Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met 1985 1990 1995 2000 Pro Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg 2005 2010 2015 Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly 2020 2025 2030 Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly 2035 2040 2045 Pro Arg Thr Cys Lys Asn Met Trp Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Ala 2050 2055 2060 Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe 2065 2070 2075 2080 Ala Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val 2085 2090 2095 Gly Asp Phe His Tyr Val Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys 2100 2105 2110 Pro Cys Gln Ile Pro Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val 2115 2120 2125 Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu 2130 2135 2140 Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu 2145 2150 2155 2160 Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr 2165 2170 2175 Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg 2180 2185 2190 Gly Ser Pro Pro Ser Met Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala 2195 2200 2205 Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala 2210 2215 2220 Glu Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn 2225 2230 2235 2240 Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe 2245 2250 2255 Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala 2260 2265 2270 Glu Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala Pro Ala Leu Pro Val Trp 2275 2280 2285 Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro 2290 2295 2300 Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg 2305 2310 2315 2320 Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr 2325 2330 2335 Glu Ser Thr Leu Pro Thr Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe 2340 2345 2350 Gly Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser 2355 2360 2365 Ser Glu Pro Ala Pro Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser 2370 2375 2380 Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu 2385 2390 2395 2400 Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp 2405 2410 2415 Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr 2420 2425 2430 Pro Cys Ala Ala Glu Glu Gln Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn 2435 2440 2445 Ser Leu Leu Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser 2450 2455 2460 Ala Cys Gln Arg Lys Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu 2465 2470 2475 2480 Asp Ser His Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser 2485 2490 2495 Lys Val Lys Ala Asn Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Ser Leu Ala 2500 2505 2510 Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val 2515 2520 2525 Arg Cys His Ala Arg Lys Ala Val Ala His Ile Asn Ser Val Trp Lys 2530 2535 2540 Asp Leu Leu Glu Asp Ser Val Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala 2545 2550 2555 2560 Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro 2565 2570 2575 Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys 2580 2585 2590 Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly 2595 2600 2605 Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu 2610 2615 2620 Val Gln Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly Leu Ser Tyr Asp 2625 2630 2635 2640 Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu 2645 2650 2655 Glu Ala Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala 2660 2665 2670 Ile Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn 2675 2680 2685 Ser Arg Gly Glu Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Arg Val 2690 2695 2700 Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Arg Tyr Ile Lys Ala Arg 2705 2710 2715 2720 Ala Ala Cys Arg Ala Ala Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys 2725 2730 2735 Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Val Gln Glu Asp 2740 2745 2750 Ala Ala Ser Leu Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala 2755 2760 2765 Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr 2770 2775 2780 Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His Asp Gly Ala Gly Lys Arg 2785 2790 2795 2800 Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala 2805 2810 2815 Trp Glu Thr Ala Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile 2820 2825 2830 Ile Met Phe Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His 2835 2840 2845 Phe Phe Ser Val Leu Ile Ala Arg Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asn 2850 2855 2860 Cys Glu Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro 2865 2870 2875 2880 Pro Ile Ile Gln Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser 2885 2890 2895 Tyr Ser Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Cys Leu Arg Lys Leu 2900 2905 2910 Gly Val Pro Pro Leu Arg Ala Trp Arg His Arg Ala Trp Ser Val Arg 2915 2920 2925 Ala Arg Leu Leu Ala Arg Gly Gly Lys Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr 2930 2935 2940 Leu Phe Asn Trp Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Thr 2945 2950 2955 2960 Ala Ala Gly Arg Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser 2965 2970 2975 Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Val Ser His Ala Arg Pro Arg Trp Phe 2980 2985 2990 Trp Phe Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu 2995 3000 3005 Pro Asn Arg 3010 <210> 2 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus core protein sequence <400> 2 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu 180 <210> 3 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus E1 protein sequence <400> 3 Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ser Ser 1 5 10 15 Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Val Val Tyr 20 25 30 Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val 35 40 45 Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala Val Thr Pro Thr Val 50 55 60 Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln Leu Arg Arg His Ile 65 70 75 80 Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly 85 90 95 Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser 100 105 110 Pro Arg His His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro 115 120 125 Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asn Met Met Met Asn Trp 130 135 140 Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln 145 150 155 160 Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly 165 170 175 Ile Lys Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val 180 185 190 Leu Leu Leu Phe Ala 195 <210> 4 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus E2 protein sequence <400> 4 Gly Val Asp Ala Glu Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr 1 5 10 15 Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile 20 25 30 Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu 35 40 45 Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr 50 55 60 Gln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys 65 70 75 80 Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala 85 90 95 Asn Gly Ser Gly Leu Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro 100 105 110 Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr 115 120 125 Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly 130 135 140 Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu 145 150 155 160 Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met 165 170 175 Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile 180 185 190 Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg 195 200 205 Lys Tyr Pro Glu Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Arg Ile 210 215 220 Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro 225 230 235 240 Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly 245 250 255 Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg 260 265 270 Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu 275 280 285 Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro 290 295 300 Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val 305 310 315 320 Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys 325 330 335 Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala 340 345 350 <210> 5 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS2 protein sequence <400> 5 Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly 20 25 30 Thr His Gly Leu Val Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr 35 40 45 Leu Lys Gly Arg Trp Val Pro Gly Ala Val Tyr Ala Leu Tyr Gly Met 50 55 60 Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala 65 70 75 80 Leu Asp Thr Glu Val Ala Ala Ser Cys Gly Gly Val Val Leu Val Gly 85 90 95 Leu Met Ala Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Arg Tyr Ile Ser Trp 100 105 110 Cys Met Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gln Leu 115 120 125 His Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val 130 135 140 Ile Leu Leu Thr Cys Val Val His Pro Ala Leu Val Phe Asp Ile Thr 145 150 155 160 Lys Leu Leu Leu Ala Ile Phe Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gln Ala Ser 165 170 175 Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Val Gln Gly Leu Leu Arg Ile 180 185 190 Cys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala 195 200 205 Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu Thr Gly Thr Cys Val Tyr Asn His Leu 210 215 220 Ala Pro Leu Arg Asp Trp Ala His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val 225 230 235 240 Ala Val Glu Pro Val Val Phe Ser Arg Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr 245 250 255 Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro 260 265 270 Val Ser Ala Arg Arg Gly Gln Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly 275 280 285 Met Val Ser Lys Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala 290 295 300 Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile 305 310 315 <210> 6 <211> 613 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS3 protein sequence <400> 6 Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln 1 5 10 15 Ile Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly 20 25 30 Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Thr Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu 50 55 60 Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr 65 70 75 80 Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile 85 90 95 Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg 100 105 110 Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro 115 120 125 Thr Gly His Ala Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly 130 135 140 Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr 145 150 155 160 Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro 165 170 175 Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys 180 185 190 Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Val Leu 195 200 205 Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met 210 215 220 Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr 225 230 235 240 Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu 245 250 255 Ala Asp Ala Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp 260 265 270 Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Ser Gly Ile Gly Thr Val 275 280 285 Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr 290 295 300 Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu 305 310 315 320 Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile 325 330 335 Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser 340 345 350 Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile 355 360 365 Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr 370 375 380 Ser Gly Asp Val Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe 385 390 395 400 Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln 405 410 415 Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr 420 425 430 Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly 435 440 445 Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro 450 455 460 Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly 465 470 475 480 Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg 485 490 495 Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Gly 500 505 510 Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe 515 520 525 Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala 530 535 540 Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp 545 550 555 560 Asp Gln Met Arg Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly 565 570 575 Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr 580 585 590 Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser Ala Asp 595 600 605 Leu Glu Val Val Thr 610 <210> 7 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS4A protein sequence <400> 7 Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser 20 25 30 Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe 35 40 45 Asp Glu Met Glu Glu Cys 50 <210> 8 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS4B protein sequence <400> 8 Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Ser Arg His Ala 20 25 30 Glu Val Ile Thr Pro Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu Val 35 40 45 Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu 50 55 60 Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met 65 70 75 80 Ala Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gly Gln Thr Leu 85 90 95 Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Ala Pro 100 105 110 Gly Ala Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Asp Ser Val Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr 130 135 140 Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly 145 150 155 160 Glu Val Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu 165 170 175 Ser Pro Gly Ala Leu Ala Val Gly Val Val Phe Ala Ser Ile Leu Arg 180 185 190 Arg Arg Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu 195 200 205 Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val 210 215 220 Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu 225 230 235 240 Thr Val Thr Gln Leu Leu Arg Arg Leu His Gln Trp Ile Ser Ser Glu 245 250 255 Cys Thr Thr Pro 260 <210> 9 <211> 1040 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS5A/B protein sequence <400> 9 Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val 1 5 10 15 Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu 20 25 30 Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp 35 40 45 Arg Gly Asp Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile 50 55 60 Thr Gly His Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr 65 70 75 80 Cys Lys Asn Met Trp Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Ala Tyr Thr Thr 85 90 95 Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp 100 105 110 Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe 115 120 125 His Tyr Val Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln 130 135 140 Ile Pro Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His 145 150 155 160 Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe 165 170 175 Arg Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu 180 185 190 Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser 195 200 205 His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro 210 215 220 Pro Ser Met Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu 225 230 235 240 Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile 245 250 255 Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg 260 265 270 Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu 275 280 285 Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu 290 295 300 Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala Pro Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro 305 310 315 320 Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu 325 330 335 Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro 340 345 350 Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr 355 360 365 Leu Pro Thr Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser 370 375 380 Ser Thr Ser Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro 385 390 395 400 Ala Pro Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser 405 410 415 Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys 435 440 445 Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Cys Ala 450 455 460 Ala Glu Glu Gln Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu 465 470 475 480 Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser Ala Cys Gln 485 490 495 Arg Lys Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Ser His 500 505 510 Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser Lys Val Lys 515 520 525 Ala Asn Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Ser Leu Ala Pro Pro His 530 535 540 Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Cys His 545 550 555 560 Ala Arg Lys Ala Val Ala His Ile Asn Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu 565 570 575 Glu Asp Ser Val Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu 580 585 590 Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu 595 600 605 Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu 610 615 620 Tyr Asp Val Val Ser Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr 625 630 635 640 Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Gln Ala 645 650 655 Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly Leu Ser Tyr Asp Thr Arg Cys 660 665 670 Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ala Ile 675 680 685 Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala Ile Lys Ser 690 695 700 Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Arg Gly 705 710 715 720 Glu Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Arg Val Leu Thr Thr 725 730 735 Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Arg Tyr Ile Lys Ala Arg Ala Ala Cys 740 745 750 Arg Ala Ala Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp 755 760 765 Leu Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Val Gln Glu Asp Ala Ala Ser 770 775 780 Leu Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly 785 790 795 800 Asp Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser 805 810 815 Ser Asn Val Ser Val Ala His Asp Gly Ala Gly Lys Arg Val Tyr Tyr 820 825 830 Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr 835 840 845 Ala Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Phe 850 855 860 Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser 865 870 875 880 Val Leu Ile Ala Arg Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asn Cys Glu Ile 885 890 895 Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Pro Ile Ile 900 905 910 Gln Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro 915 920 925 Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro 930 935 940 Pro Leu Arg Ala Trp Arg His Arg Ala Trp Ser Val Arg Ala Arg Leu 945 950 955 960 Leu Ala Arg Gly Gly Lys Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn 965 970 975 Trp Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ala Ala Gly 980 985 990 Arg Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp 995 1000 1005 Ile Tyr His Ser Val Ser His Ala Arg Pro Arg Trp Phe Trp Phe Cys 1010 1015 1020 Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg 1025 1030 1035 1040 <210> 10 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis B virus S antigen (HBsAg) sequence <400> 10 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 11 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis B virus C antigen and e antigen (HBcAg/HBeAg) sequence <400> 11 Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 1 5 10 15 Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile 20 25 30 Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu 35 40 45 Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser 50 55 60 Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His 65 70 75 80 His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr 85 90 95 Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp 100 105 110 Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln 115 120 125 Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 130 135 140 Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala 145 150 155 160 Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr 165 170 175 Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro 180 185 190 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg 195 200 205 Glu Ser Gln Cys 210 <210> 12 <211> 2227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis A virus sequence <400> 12 Met Asn Met Ser Lys Gln Gly Ile Phe Gln Thr Val Gly Ser Gly Leu 1 5 10 15 Asp His Ile Leu Ser Leu Ala Asp Ile Glu Glu Glu Gln Met Ile Gln 20 25 30 Ser Val Asp Arg Thr Ala Val Thr Gly Ala Ser Tyr Phe Thr Ser Val 35 40 45 Asp Gln Ser Ser Val His Thr Ala Glu Val Gly Ser His Gln Ile Glu 50 55 60 Pro Leu Lys Thr Ser Val Asp Lys Pro Gly Ser Lys Lys Thr Gln Gly 65 70 75 80 Glu Lys Phe Phe Leu Ile His Ser Ala Asp Trp Leu Thr Thr His Ala 85 90 95 Leu Phe His Glu Val Ala Lys Leu Asp Val Val Lys Leu Leu Tyr Asn 100 105 110 Glu Gln Phe Ala Val Gln Gly Leu Leu Arg Tyr His Thr Tyr Ala Arg 115 120 125 Phe Gly Ile Glu Ile Gln Val Gln Ile Asn Pro Thr Pro Phe Gln Gln 130 135 140 Gly Gly Leu Ile Cys Ala Met Val Pro Gly Asp Gln Ser Tyr Gly Ser 145 150 155 160 Ile Ala Ser Leu Thr Val Tyr Pro His Gly Leu Leu Asn Cys Asn Ile 165 170 175 Asn Asn Val Val Arg Ile Lys Val Pro Phe Ile Tyr Thr Arg Gly Ala 180 185 190 Tyr His Phe Lys Asp Pro Gln Tyr Pro Val Trp Glu Leu Thr Ile Arg 195 200 205 Val Trp Ser Glu Leu Asn Ile Gly Thr Gly Thr Ser Ala Tyr Thr Ser 210 215 220 Leu Asn Val Leu Ala Arg Phe Thr Asp Leu Glu Leu His Gly Leu Thr 225 230 235 240 Pro Leu Ser Thr Gln Met Met Arg Asn Glu Phe Arg Val Ser Thr Thr 245 250 255 Glu Asn Val Val Asn Leu Ser Asn Tyr Glu Asp Ala Arg Ala Lys Met 260 265 270 Ser Phe Ala Leu Asp Gln Glu Asp Trp Lys Ser Asp Pro Ser Gln Gly 275 280 285 Gly Gly Ile Lys Ile Thr His Phe Thr Thr Trp Thr Ser Ile Pro Thr 290 295 300 Leu Ala Ala Gln Phe Pro Phe Asn Ala Ser Asp Ser Val Gly Gln Gln 305 310 315 320 Ile Lys Val Ile Pro Val Asp Pro Tyr Phe Phe Gln Met Thr Asn Thr 325 330 335 Asn Pro Asp Gln Lys Cys Ile Thr Ala Leu Ala Ser Ile Cys Gln Met 340 345 350 Phe Cys Phe Trp Arg Gly Asp Leu Val Phe Asp Phe Gln Val Phe Pro 355 360 365 Thr Lys Tyr His Ser Gly Arg Leu Leu Phe Cys Phe Val Pro Gly Asn 370 375 380 Glu Leu Ile Asp Val Thr Gly Ile Thr Leu Lys Gln Ala Thr Thr Ala 385 390 395 400 Pro Cys Ala Val Met Asp Ile Thr Gly Val Gln Ser Thr Leu Arg Phe 405 410 415 Arg Val Pro Trp Ile Ser Asp Thr Pro Tyr Arg Val Asn Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Ser Ala His Gln Lys Gly Glu Tyr Thr Ala Ile Gly Lys Leu Ile 435 440 445 Val Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Thr Ser Pro Ser Asn Val Ala Ser His 450 455 460 Val Arg Val Asn Val Tyr Leu Ser Ala Ile Asn Leu Glu Cys Phe Ala 465 470 475 480 Pro Leu Tyr His Ala Met Asp Val Thr Thr Gln Val Gly Asp Asp Ser 485 490 495 Gly Gly Phe Ser Thr Thr Val Ser Thr Glu Gln Asn Val Pro Asp Pro 500 505 510 Gln Val Gly Ile Thr Thr Met Arg Asp Leu Lys Gly Lys Ala Asn Arg 515 520 525 Gly Lys Met Asp Val Ser Gly Val Gln Ala Pro Arg Gly Ser Tyr Gln 530 535 540 Gln Gln Leu Asn Asp Pro Val Leu Ala Lys Lys Val Pro Glu Thr Phe 545 550 555 560 Pro Glu Leu Lys Pro Gly Glu Ser Arg His Thr Ser Asp His Met Ser 565 570 575 Ile Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ser His Phe Leu Cys Thr Phe Thr Phe 580 585 590 Asn Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro Ile Thr Leu Ser Ser Thr 595 600 605 Ser Asn Pro Pro His Gly Leu Pro Ser Thr Leu Arg Trp Phe Phe Asn 610 615 620 Leu Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Pro Leu Asp Leu Thr Ile Ile Ile Thr 625 630 635 640 Gly Ala Thr Asp Val Asp Gly Met Ala Trp Phe Thr Pro Val Gly Leu 645 650 655 Ala Val Asp Pro Trp Val Glu Lys Glu Ser Ala Leu Ser Ile Asp Tyr 660 665 670 Lys Thr Ala Leu Gly Ala Val Arg Phe Asn Thr Arg Arg Thr Gly Asn 675 680 685 Ile Gln Ile Arg Leu Pro Trp Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ala Val Ser Gly 690 695 700 Ala Leu Asp Gly Leu Gly Asp Lys Thr Asp Ser Thr Phe Gly Leu Phe 705 710 715 720 Leu Phe Glu Ile Ala Asn Tyr Asn His Ser Asp Glu Tyr Leu Ser Phe 725 730 735 Ser Cys Tyr Leu Ser Val Thr Glu Gln Ser Glu Phe Tyr Phe Pro Arg 740 745 750 Ala Pro Leu Asn Ser Asn Ala Met Leu Ser Thr Glu Ser Met Met Ser 755 760 765 Arg Ile Ala Ala Gly Asp Leu Glu Ser Ser Val Asp Asp Pro Arg Ser 770 775 780 Glu Glu Asp Arg Arg Phe Glu Ser His Ile Glu Cys Arg Lys Pro Tyr 785 790 795 800 Lys Glu Leu Arg Leu Glu Val Gly Lys Gln Arg Leu Lys Tyr Ala Gln 805 810 815 Glu Glu Leu Ser Asn Glu Val Leu Pro Pro Pro Arg Lys Met Lys Gly 820 825 830 Leu Phe Ser Gln Ala Lys Ile Ser Leu Phe Tyr Thr Glu Glu His Glu 835 840 845 Ile Met Lys Phe Ser Trp Arg Gly Val Thr Ala Asp Thr Arg Ala Leu 850 855 860 Arg Arg Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ala Gly Arg Ser Val Trp Thr Leu 865 870 875 880 Glu Met Asp Ala Gly Val Leu Thr Gly Arg Leu Ile Arg Leu Asn Asp 885 890 895 Glu Lys Trp Thr Glu Met Lys Asp Asp Lys Ile Val Ser Leu Ile Glu 900 905 910 Lys Phe Thr Ser Asn Lys Tyr Trp Ser Lys Val Asn Phe Pro His Gly 915 920 925 Met Leu Asp Leu Glu Glu Ile Ala Ala Asn Ser Lys Asp Phe Pro Asn 930 935 940 Met Ser Glu Thr Asp Leu Cys Phe Leu Leu His Trp Leu Asn Pro Lys 945 950 955 960 Lys Ile Asn Leu Ala Asp Arg Met Leu Gly Leu Ser Gly Val Gln Glu 965 970 975 Ile Lys Glu Gln Gly Val Gly Leu Ile Ala Glu Cys Arg Thr Phe Leu 980 985 990 Asp Ser Ile Ala Gly Thr Leu Lys Ser Met Met Phe Gly Phe His His 995 1000 1005 Ser Val Thr Val Glu Ile Ile Asn Thr Val Leu Cys Phe Val Lys Ser 1010 1015 1020 Gly Ile Leu Leu Tyr Val Ile Gln Gln Leu Asn Gln Asp Glu His Ser 1025 1030 1035 1040 His Ile Ile Gly Leu Leu Arg Val Met Asn Tyr Ala Asp Ile Gly Cys 1045 1050 1055 Ser Val Ile Ser Cys Gly Lys Val Phe Ser Lys Met Leu Glu Thr Val 1060 1065 1070 Phe Asn Trp Gln Met Asp Ser Arg Met Met Glu Leu Arg Thr Gln Ser 1075 1080 1085 Phe Ser Asn Trp Leu Arg Asp Ile Cys Ser Gly Ile Thr Ile Phe Lys 1090 1095 1100 Ser Phe Lys Asp Ala Ile Tyr Trp Leu Tyr Thr Lys Leu Lys Asp Phe 1105 1110 1115 1120 Tyr Glu Val Asn Tyr Gly Lys Lys Lys Asp Ile Leu Asn Ile Leu Lys 1125 1130 1135 Asp Asn Gln Gln Lys Ile Glu Lys Ala Ile Glu Glu Ala Asp Asn Phe 1140 1145 1150 Cys Ile Leu Gln Ile Gln Asp Val Glu Lys Phe Asp Gln Tyr Gln Lys 1155 1160 1165 Gly Val Asp Leu Ile Gln Lys Leu Arg Thr Val His Ser Met Ala Gln 1170 1175 1180 Val Asp Pro Asn Leu Gly Val His Leu Ser Pro Leu Arg Asp Cys Ile 1185 1190 1195 1200 Ala Arg Val His Gln Lys Leu Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asn Gln Ala 1205 1210 1215 Met Val Thr Arg Cys Glu Pro Val Val Cys Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg 1220 1225 1230 Gly Gly Gly Lys Ser Leu Thr Ser Ile Ala Leu Ala Thr Lys Ile Cys 1235 1240 1245 Lys His Tyr Gly Val Glu Pro Glu Lys Asn Ile Tyr Thr Lys Pro Val 1250 1255 1260 Ala Ser Asp Tyr Trp Asp Gly Tyr Ser Gly Gln Leu Val Cys Ile Ile 1265 1270 1275 1280 Asp Asp Ile Gly Gln Asn Thr Thr Asp Glu Asp Trp Ser Asp Phe Cys 1285 1290 1295 Gln Leu Val Ser Gly Cys Pro Met Arg Leu Asn Met Ala Ser Leu Glu 1300 1305 1310 Glu Lys Gly Arg His Phe Ser Ser Pro Phe Ile Ile Ala Thr Ser Asn 1315 1320 1325 Trp Ser Asn Pro Ser Pro Lys Thr Val Tyr Val Lys Glu Ala Ile Asp 1330 1335 1340 Arg Arg Leu His Phe Lys Val Glu Val Lys Pro Ala Ser Phe Phe Lys 1345 1350 1355 1360 Asn Pro His Asn Asp Met Leu Asn Val Asn Leu Ala Lys Thr Asn Asp 1365 1370 1375 Ala Ile Lys Asp Met Ser Cys Val Asp Leu Ile Met Asp Gly His Asn 1380 1385 1390 Ile Ser Leu Met Asp Leu Leu Ser Ser Leu Val Met Thr Val Glu Ile 1395 1400 1405 Arg Lys Gln Asn Met Ser Glu Phe Met Glu Leu Trp Ser Gln Gly Ile 1410 1415 1420 Ser Asp Asp Asp Asn Asp Ser Ala Val Ala Glu Phe Phe Gln Ser Phe 1425 1430 1435 1440 Pro Ser Gly Glu Pro Ser Asn Trp Lys Leu Ser Ser Phe Phe Gln Ser 1445 1450 1455 Val Thr Asn His Lys Trp Val Ala Val Gly Ala Ala Val Gly Ile Leu 1460 1465 1470 Gly Val Leu Val Gly Gly Trp Phe Val Tyr Lys His Phe Ser Arg Lys 1475 1480 1485 Glu Glu Glu Pro Ile Pro Ala Glu Gly Val Tyr His Gly Val Thr Lys 1490 1495 1500 Pro Lys Gln Val Ile Lys Leu Asp Ala Asp Pro Val Glu Ser Gln Ser 1505 1510 1515 1520 Thr Leu Glu Ile Ala Gly Leu Val Arg Lys Asn Leu Val Gln Phe Gly 1525 1530 1535 Val Gly Glu Lys Asn Gly Cys Val Arg Trp Val Met Asn Ala Leu Gly 1540 1545 1550 Val Lys Asp Asp Trp Leu Leu Val Pro Ser His Ala Tyr Lys Phe Glu 1555 1560 1565 Lys Asp Tyr Glu Met Met Glu Phe Tyr Phe Asn Arg Gly Gly Thr Tyr 1570 1575 1580 Tyr Ser Ile Ser Ala Gly Asn Val Val Ile Gln Ser Leu Asp Val Gly 1585 1590 1595 1600 Phe Gln Asp Val Val Leu Met Lys Val Pro Thr Ile Pro Lys Phe Arg 1605 1610 1615 Asp Ile Thr Gln His Phe Ile Lys Lys Gly Asp Val Pro Arg Ala Leu 1620 1625 1630 Asn Arg Leu Ala Thr Leu Val Thr Thr Val Asn Gly Thr Pro Met Leu 1635 1640 1645 Ile Ser Glu Gly Pro Leu Lys Met Glu Glu Lys Ala Thr Tyr Val His 1650 1655 1660 Lys Lys Asn Asp Gly Thr Thr Val Asp Leu Thr Val Asp Gln Ala Trp 1665 1670 1675 1680 Arg Gly Lys Gly Glu Gly Leu Pro Gly Met Cys Gly Gly Ala Leu Val 1685 1690 1695 Ser Ser Asn Gln Ser Ile Gln Asn Ala Ile Leu Gly Ile His Val Ala 1700 1705 1710 Gly Gly Asn Ser Ile Leu Val Ala Lys Leu Val Thr Gln Glu Met Phe 1715 1720 1725 Gln Asn Ile Asp Lys Lys Ile Glu Ser Gln Arg Ile Met Lys Val Glu 1730 1735 1740 Phe Thr Gln Cys Ser Met Asn Val Val Ser Lys Thr Leu Phe Arg Lys 1745 1750 1755 1760 Ser Pro Ile His His His Ile Asp Lys Thr Met Ile Asn Phe Pro Ala 1765 1770 1775 Ala Met Pro Phe Ser Lys Ala Glu Ile Asp Pro Met Ala Met Met Leu 1780 1785 1790 Ser Lys Tyr Ser Leu Pro Ile Val Glu Glu Pro Glu Asp Tyr Lys Glu 1795 1800 1805 Ala Ser Val Phe Tyr Gln Asn Lys Ile Val Gly Lys Thr Gln Leu Val 1810 1815 1820 Asp Asp Phe Leu Asp Leu Asp Met Ala Ile Thr Gly Ala Pro Gly Ile 1825 1830 1835 1840 Asp Ala Ile Asn Met Asp Ser Ser Pro Gly Phe Pro Tyr Val Gln Glu 1845 1850 1855 Lys Leu Thr Lys Arg Asp Leu Ile Trp Leu Asp Glu Asn Gly Leu Leu 1860 1865 1870 Leu Gly Val His Pro Arg Leu Ala Gln Arg Ile Leu Phe Asn Thr Val 1875 1880 1885 Met Met Glu Asn Cys Ser Asp Leu Asp Val Val Phe Thr Thr Cys Pro 1890 1895 1900 Lys Asp Glu Leu Arg Pro Leu Glu Lys Val Leu Glu Ser Lys Thr Arg 1905 1910 1915 1920 Ala Ile Asp Ala Cys Pro Leu Asp Tyr Thr Ile Leu Cys Arg Met Tyr 1925 1930 1935 Trp Gly Pro Ala Ile Ser Tyr Phe His Leu Asn Pro Gly Phe His Thr 1940 1945 1950 Gly Val Ala Ile Gly Ile Asp Pro Asp Arg Gln Trp Asp Glu Leu Phe 1955 1960 1965 Lys Thr Met Ile Arg Phe Gly Asp Val Gly Leu Asp Leu Asp Phe Ser 1970 1975 1980 Ala Phe Asp Ala Ser Leu Ser Pro Phe Met Ile Arg Glu Ala Gly Arg 1985 1990 1995 2000 Ile Met Ser Glu Leu Ser Gly Thr Pro Ser His Phe Gly Thr Ala Leu 2005 2010 2015 Ile Asn Thr Ile Ile Tyr Ser Lys His Leu Leu Tyr Asn Cys Cys Tyr 2020 2025 2030 His Val Cys Gly Ser Met Pro Ser Gly Ser Pro Cys Thr Ala Leu Leu 2035 2040 2045 Asn Ser Ile Ile Asn Asn Ile Asn Leu Tyr Tyr Val Phe Ser Lys Ile 2050 2055 2060 Phe Gly Lys Ser Pro Val Phe Phe Cys Gln Ala Leu Arg Ile Leu Cys 2065 2070 2075 2080 Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ile Val Phe Ser Arg Asp Val Gln Ile Asp 2085 2090 2095 Asn Leu Asp Leu Ile Gly Gln Lys Ile Val Asp Glu Phe Lys Lys Leu 2100 2105 2110 Gly Met Thr Ala Thr Ser Ala Asp Lys Asn Val Pro Gln Leu Lys Pro 2115 2120 2125 Val Ser Glu Leu Thr Phe Leu Lys Arg Ser Phe Asn Leu Val Glu Asp 2130 2135 2140 Arg Ile Arg Pro Ala Ile Ser Glu Lys Thr Ile Trp Ser Leu Met Ala 2145 2150 2155 2160 Trp Gln Arg Ser Asn Ala Glu Phe Glu Gln Asn Leu Glu Asn Ala Gln 2165 2170 2175 Trp Phe Ala Phe Met His Gly Tyr Glu Phe Tyr Gln Lys Phe Tyr Tyr 2180 2185 2190 Phe Val Gln Ser Cys Leu Glu Lys Glu Met Ile Glu Tyr Arg Leu Lys 2195 2200 2205 Ser Tyr Asp Trp Trp Arg Met Arg Phe Tyr Asp Gln Cys Phe Ile Cys 2210 2215 2220 Asp Leu Ser 2225 <210> 13 <211> 9416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus sequence <400> 13 gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga ggaactactg 60 tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120 cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180 gacgaccggg tcctttcttg gataaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240 gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300 gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac 360 ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gtcgcccaca ggacgtcaag ttcccgggtg 420 gcggtcagat cgttggtgga gtttacttgt tgccgcgcag gggccctaga ttgggtgtgc 480 gcgcgacgag gaagacttcc gagcggtcgc aacctcgagg tagacgtcag cctatcccca 540 aggcacgtcg gcccgagggc aggacctggg ctcagcccgg gtacccttgg cccctctatg 600 gcaatgaggg ttgcgggtgg gcgggatggc tcctgtctcc ccgtggctct cggcctagct 660 ggggccccac agacccccgg cgtaggtcgc gcaatttggg taaggtcatc gataccctta 720 cgtgcggctt cgccgacctc atggggtaca taccgctcgt cggcgcccct cttggaggcg 780 ctgccagggc cctggcgcat ggcgtccggg ttctggaaga cggcgtgaac tatgcaacag 840 ggaaccttcc tggttgctct ttctctatct tccttctggc cctgctctct tgcctgactg 900 tgcccgcttc agcctaccaa gtgcgcaatt cctcggggct ttaccatgtc accaatgatt 960 gccctaactc gagtgttgtg tacgaggcgg ccgatgccat cctgcacact ccggggtgtg 1020 tcccttgcgt tcgcgagggt aacgcctcga ggtgttgggt ggcggtgacc cccacggtgg 1080 ccaccaggga cggcaaactc cccacaacgc agcttcgacg tcatatcgat ctgcttgtcg 1140 ggagcgccac cctctgctcg gccctctacg tgggggacct gtgcgggtct gtctttcttg 1200 ttggtcaact gtttaccttc tctcccaggc accactggac gacgcaagac tgcaattgtt 1260 ctatctatcc cggccatata acgggtcatc gcatggcatg gaatatgatg atgaactggt 1320 cccctacggc agcgttggtg gtagctcagc tgctccgaat cccacaagcc atcatggaca 1380 tgatcgctgg cgcccactgg ggagtcctgg cgggcataaa gtatttctcc atggtgggga 1440 actgggcgaa ggtcctggta gtgctgctgc tatttgccgg cgtcgacgcg gaaacccacg 1500 tcaccggggg aaatgccggc cgcaccacgg ctgggcttgt tggtctcctt acaccaggcg 1560 ccaagcagaa catccaactg atcaacacca acggcagttg gcacatcaat agcacggcct 1620 tgaactgcaa tgaaagcctt aacaccggct ggttagcagg gctcttctat cagcacaaat 1680 tcaactcttc aggctgtcct gagaggttgg ccagctgccg acgccttacc gattttgccc 1740 agggctgggg tcctatcagt tatgccaacg gaagcggcct cgacgaacgc ccctactgct 1800 ggcactaccc tccaagacct tgtggcattg tgcccgcaaa gagcgtgtgt ggcccggtat 1860 attgcttcac tcccagcccc gtggtggtgg gaacgaccga caggtcgggc gcgcctacct 1920 acagctgggg tgcaaatgat acggatgtct tcgtccttaa caacaccagg ccaccgctgg 1980 gcaattggtt cggttgtacc tggatgaact caactggatt caccaaagtg tgcggagcgc 2040 ccccttgtgt catcggaggg gtgggcaaca acaccttgct ctgccccact gattgcttcc 2100 gcaaatatcc ggaagccaca tactctcggt gcggctccgg tcccaggatt acacccaggt 2160 gcatggtcga ctacccgtat aggctttggc actatccttg taccatcaat tacaccatat 2220 tcaaagtcag gatgtacgtg ggaggggtcg agcacaggct ggaagcggcc tgcaactgga 2280 cgcggggcga acgctgtgat ctggaagaca gggacaggtc cgagctcagc ccgttgctgc 2340 tgtccaccac acagtggcag gtccttccgt gttctttcac gaccctgcca gccttgtcca 2400 ccggcctcat ccacctccac cagaacattg tggacgtgca gtacttgtac ggggtagggt 2460 caagcatcgc gtcctgggcc attaagtggg agtacgtcgt tctcctgttc cttctgcttg 2520 cagacgcgcg cgtctgttcc tgcttgtgga tgatgttact catatcccaa gcggaggcgg 2580 ctttggagaa cctcgtaata ctcaatgcag catccctggc cgggacgcat ggtcttgtgt 2640 ccttcctcgt gttcttctgc tttgcgtggt atctgaaggg taggtgggtg cccggagcgg 2700 tctacgccct ctacgggatg tggcctctcc tcctgctcct gctggcgttg cctcagcggg 2760 catacgcact ggacacggag gtggccgcgt cgtgtggcgg cgttgttctt gtcgggttaa 2820 tggcgctgac tctgtcgcca tattacaagc gctatatcag ctggtgcatg tggtggcttc 2880 agtattttct gaccagagta gaagcgcaac tgcacgtgtg ggttcccccc ctcaacgtcc 2940 ggggggggcg cgatgccgtc atcttactca cgtgtgtagt acacccggcc ctggtatttg 3000 acatcaccaa actactcctg gccatcttcg gacccctttg gattcttcaa gccagtttgc 3060 ttaaagtccc ctacttcgtg cgcgttcaag gccttctccg gatctgcgcg ctagcgcgga 3120 agatagccgg aggtcattac gtgcaaatgg ccatcatcaa gttaggggcg cttactggca 3180 cctgtgtgta taaccatctc gctcctcttc gagactgggc gcacaacggc ctgcgagatc 3240 tggccgtggc tgtggaacca gtcgtcttct cccgaatgga gaccaagctc atcacgtggg 3300 gggcagatac cgccgcgtgc ggtgacatca tcaacggctt gcccgtctct gcccgtaggg 3360 gccaggagat actgcttggg ccagccgacg gaatggtctc caaggggtgg aggttgctgg 3420 cgcccatcac ggcgtacgcc cagcagacga gaggcctcct agggtgtata atcaccagcc 3480 tgactggccg ggacaaaaac caagtggagg gtgaggtcca gatcgtgtca actgctaccc 3540 agaccttcct ggcaacgtgc atcaatgggg tatgctggac tgtctaccac ggggccggaa 3600 cgaggaccat cgcatcaccc aagggtcctg tcatccagac gtataccaat gtggatcaag 3660 acctcgtggg ctggcccgct cctcaaggtt cccgctcatt gacaccctgc acctgcggct 3720 cctcggacct ttacctggtc acgaggcacg ccgatgtcat tcccgtgcgc cggcgaggtg 3780 atagcagggg tagcctgctt tcgccccggc ccatttccta cttgaaaggc tcctcggggg 3840 gtccgctgtt gtgccccacg ggacacgccg tgggcctatt cagggccgcg gtgtgcaccc 3900 gtggagtggc taaggcggtg gactttatcc ctgtggagaa cctagagaca accatgagat 3960 ccccggtgtt cacggacaac tcctctccac cagcagtgcc ccagagcttc caggtggccc 4020 acctgcatgc tcccaccggc agcggtaaga gcaccaaggt cccggctgcg tacgcagcca 4080 agggctacaa ggtgttggtg ctcaacccct ctgttgctgc aacactgggc tttggtgctt 4140 acatgtccaa ggcccatggg gttgatccta atatcaggac cggggtgaga acaattacca 4200 ctggcagccc catcacgtac tccacctacg gcaagttcct tgccgacgcc gggtgctcag 4260 gaggtgctta tgacataata atttgtgacg agtgccactc cacggatgcc acatccatct 4320 cgggcatcgg cactgtcctt gaccaagcag agactgcggg ggcgagactg gttgtgctcg 4380 ccactgctac ccctccgggc tccgtcactg tgtcccatcc taacatcgag gaggttgctc 4440 tgtccaccac cggagagatc cccttttacg gcaaggctat ccccctcgag gtgatcaagg 4500 ggggaagaca tctcatcttc tgccactcaa agaagaagtg cgacgagctc gccgcgaagc 4560 tggtcgcatt gggcatcaat gccgtggcct actaccgcgg tcttgacgtg tctgtcatcc 4620 cgaccagcgg cgatgttgtc gtcgtgtcga ccgatgctct catgactggc tttaccggcg 4680 acttcgactc tgtgatagac tgcaacacgt gtgtcactca gacagtcgat tttagccttg 4740 accctacctt taccattgag acaaccacgc tcccccagga tgctgtctcc aggactcaac 4800 gccggggcag gactggcagg gggaagccag gcatctatag atttgtggca ccgggggagc 4860 gcccctccgg catgttcgac tcgtccgtcc tctgtgagtg ctatgacgcg ggctgtgctt 4920 ggtatgagct cacgcccgcc gagactacag ttaggctacg agcgtacatg aacaccccgg 4980 ggcttcccgt gtgccaggac catcttggat tttgggaggg cgtctttacg ggcctcactc 5040 atatagatgc ccactttcta tcccagacaa agcagagtgg ggagaacttt ccttacctgg 5100 tagcgtacca agccaccgtg tgcgctaggg ctcaagcccc tcccccatcg tgggaccaga 5160 tgcggaagtg tttgatccgc cttaaaccca ccctccatgg gccaacaccc ctgctataca 5220 gactgggcgc tgttcagaat gaagtcaccc tgacgcaccc aatcaccaaa tacatcatga 5280 catgcatgtc ggccgacctg gaggtcgtca cgagcacctg ggtgctcgtt ggcggcgtcc 5340 tggctgctct ggccgcgtat tgcctgtcaa caggctgcgt ggtcatagtg ggcaggatcg 5400 tcttgtccgg gaagccggca attatacctg acagggaggt tctctaccag gagttcgatg 5460 agatggaaga gtgctctcag cacttaccgt acatcgagca agggatgatg ctcgctgagc 5520 agttcaagca gaaggccctc ggcctcctgc agaccgcgtc ccgccatgca gaggttatca 5580 cccctgctgt ccagaccaac tggcagaaac tcgaggtctt ttgggcgaag cacatgtgga 5640 atttcatcag tgggatacaa tacttggcgg gcctgtcaac gctgcctggt aaccccgcca 5700 ttgcttcatt gatggctttt acagctgccg tcaccagccc actaaccact ggccaaaccc 5760 tcctcttcaa catattgggg gggtgggtgg ctgcccagct cgccgccccc ggtgccgcta 5820 ccgcctttgt gggcgctggc ttagctggcg ccgcactcga cagcgttgga ctggggaagg 5880 tcctcgtgga cattcttgca ggctatggcg cgggcgtggc gggagctctt gtggcattca 5940 agatcatgag cggtgaggtc ccctccacgg aggacctggt caatctgctg cccgccatcc 6000 tctcacctgg agcccttgca gtcggtgtgg tctttgcatc aatactgcgc cggcgtgttg 6060 gcccgggcga gggggcagtg caatggatga accggctaat agccttcgcc tcccggggga 6120 accatgtttc ccccacacac tacgtgccgg agagcgatgc agccgcccgc gtcactgcca 6180 tactcagcag cctcactgta acccagctcc tgaggcgact gcatcagtgg ataagctcgg 6240 agtgtaccac tccatgctcc ggttcctggc taagggacat ctgggactgg atatgcgagg 6300 tgctgagcga ctttaagacc tggctgaaag ccaagctcat gccacaactg cctgggattc 6360 cctttgtgtc ctgccagcgc gggtataggg gggtctggcg aggagacggc attatgcaca 6420 ctcgctgcca ctgtggagct gagatcactg gacatgtcaa aaacgggacg atgaggatcg 6480 tcggtcctag gacctgcaag aacatgtgga gtgggacgtt cttcattaat gcctacacca 6540 cgggcccctg tactcccctt cctgcgccga actataagtt cgcgctgtgg agggtgtctg 6600 cagaggaata cgtggagata aggcgggtgg gggacttcca ctacgtatcg ggcatgacta 6660 ctgacaatct caaatgcccg tgccagatcc catcgcccga atttttcaca gaattggacg 6720 gggtgcgcct acataggttt gcgccccctt gcaagccctt gctgcgggag gaggtatcat 6780 tcagagtagg actccacgag tacccggtgg ggtcgcaatt accttgcgag cccgaaccgg 6840 acgtagccgt gttgacgtcc atgctcactg atccctccca tataacagca gaggcggccg 6900 ggagaaggtt ggcgagaggg tcaccccctt ctatggccag ctcctcggct agccagctgt 6960 ccgctccatc tctcaaggca acttgcaccg ccaaccatga ctcccctgac gccgagctca 7020 tagaggctaa cctcctgtgg aggcaggaga tgggcggcaa catcaccagg gttgagtcag 7080 agaacaaagt ggtgattctg gactccttcg atccgcttgt ggcagaggag gatgagcggg 7140 aggtctccgt acccgcagaa attctgcgga agtctcggag attcgcccca gccctgcccg 7200 tctgggcgcg gccggactac aaccccctgc tagtagagac gtggaaaaag cctgactacg 7260 aaccacctgt ggtccatggc tgcccgctac cacctccacg gtcccctcct gtgcctccgc 7320 ctcggaaaaa gcgtacggtg gtcctcaccg aatcaaccct acctactgcc ttggccgagc 7380 ttgccaccaa aagttttggc agctcctcaa cttccggcat tacgggcgac aatacgacaa 7440 catcctctga gcccgcccct tctggctgcc cccccgactc cgacgttgag tcctattctt 7500 ccatgccccc cctggagggg gagcctgggg atccggatct cagcgacggg tcatggtcga 7560 cggtcagtag tggggccgac acggaagatg tcgtgtgctg ctcaatgtct tattcctgga 7620 caggcgcact cgtcaccccg tgcgctgcgg aggaacaaaa actgcccatc aacgcactga 7680 gcaactcgtt gctacgccat cacaatctgg tgtattccac cacttcacgc agtgcttgcc 7740 aaaggaagaa gaaagtcaca tttgacagac tgcaagttct ggacagccat taccaggacg 7800 tgctcaagga ggtcaaagca gcggcgtcaa aagtgaaggc taacttgcta tccgtagagg 7860 aagcttgcag cctggcgccc ccacattcag ccaaatccaa gtttggctat ggggcaaaag 7920 acgtccgttg ccatgccaga aaggccgtag cccacatcaa ctccgtgtgg aaagaccttc 7980 tggaagacag tgtaacacca atagacacta ccatcatggc caagaacgag gttttctgcg 8040 ttcagcctga gaaggggggt cgtaagccag ctcgtctcat cgtgttcccc gacctgggcg 8100 tgcgcgtgtg cgagaagatg gccctgtacg acgtggttag caagctcccc ttggccgtga 8160 tgggaagctc ctacggattc caatactcac caggacagcg ggttgaattc ctcgtgcaag 8220 cgtggaagtc caagaagacc ccgatggggc tctcgtatga tacccgctgt tttgactcca 8280 cagtcactga gagcgacatc cgtacggagg aggcaattta ccaatgttgt gacctggacc 8340 cccaagcccg cgtggccatc aagtccctca ctgagaggct ttatgttggg ggccctctta 8400 ctaattcaag gggggaaaac tgcggctacc gcaggtgccg cgcgagcaga gtactgacaa 8460 ctagctgtgg taacaccctc actcgctaca tcaaggcccg ggcagcctgt cgagccgcag 8520 ggctccagga ctgcaccatg ctcgtgtgtg gcgacgactt agtcgttatc tgtgaaagtg 8580 cgggggtcca ggaggacgcg gcgagcctga gagccttcac ggaggctatg accaggtact 8640 ccgccccccc cggggacccc ccacaaccag aatacgactt ggagcttata acatcatgct 8700 cctccaacgt gtcagtcgcc cacgacggcg ctggaaagag ggtctactac cttacccgtg 8760 accctacaac ccccctcgcg agagccgcgt gggagacagc aagacacact ccagtcaatt 8820 cctggctagg caacataatc atgtttgccc ccacactgtg ggcgaggatg atactgatga 8880 cccacttctt tagcgtcctc atagccaggg atcagcttga acaggctctc aactgcgaga 8940 tctacggagc ctgctactcc atagaaccac tggatctacc tccaatcatt caaagactcc 9000 atggcctcag cgcattttca ctccacagtt actctccagg tgaaattaat agggtggccg 9060 catgcctcag aaaacttggg gtcccgccct tgcgagcttg gagacaccgg gcctggagcg 9120 tccgcgctag gcttctggcc agaggaggca aggctgccat atgtggcaag tacctcttca 9180 actgggcagt aagaacaaag ctcaaactca ctccgataac ggccgctggc cggctggact 9240 tgtccggctg gttcacggct ggctacagcg ggggagacat ttatcacagc gtgtctcatg 9300 cccggccccg ctggttctgg ttttgcctac tcctgcttgc tgcaggggta ggcatctacc 9360 tcctccccaa ccgatgaaga ttgggctaac cactccaggc caataggcca ttccct 9416 <210> 14 <211> 3182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis B virus sequence <400> 14 aattccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60 gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttctga ctactgcctc tcccttatcg 120 tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180 ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240 ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 300 cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaact 360 tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 420 ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480 ctaattccag gatcctcaac aaccagcacg ggaccatgcc ggacctgcat gactactgct 540 caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 600 tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 660 cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720 actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 780 ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840 ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 900 atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 960 ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 1020 ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 1080 ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 1140 acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200 ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 1260 tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1320 acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 1380 tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440 cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1500 gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560 cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620 cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 1680 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1740 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800 ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1860 actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat 1920 aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1980 gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 2040 cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg 2100 actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag cgtctagaga cctagtagtc 2160 agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct 2220 tgtctcactt ttggaagaga aacagttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2280 cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggagact 2340 actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400 aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 2460 ttggactcat aaggtgggga actttactgg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520 tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2580 atgtgaacag tttgtaggcc cactcacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat 2640 gcctgccagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 2700 ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct 2760 atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2820 accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2880 tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacacc gcaaatccag 2940 attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 3000 cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 3060 agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagtcag 3120 gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3180 gg 3182 <210> 15 <211> 7478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis A virus sequence <400> 15 ttcaagaggg gtctccggag gtttccggag cccctcttgg aagtccatgg tgaggggact 60 tgatacctca ccgccgtttg cctaggctat aggctaaatt tccctttccc tgtccctccc 120 ttatttccct ttgttttgct tgtaaatatt aattcctgca ggttcagggt tctttaatct 180 gtttctctat aagaacactc aattttcacg ctttctgtct tctttcttcc agggctctcc 240 ccttgcccta ggctctggcc gttgcgcccg gcggggtcaa ctccatgatt agcatggagc 300 tgtaggagtc taaattgggg acgcagatgt ttgggacgtc accttgcagt gttaacttgg 360 ctctcatgaa cctctttgat cttccacaag gggtaggcta cgggtgaaac ctcttaggct 420 aatacttcta tgaagagatg ctttggatag ggtaacagcg gcggatattg gtgagttgtt 480 aagacaaaaa ccattcaacg ccggaggact ggctctcatc cagtggatgc attgagtgga 540 ttgattgtca gggctgtctc taggtttaat ctcagacctc tctgtgctta gggcaaacac 600 catttggcct taaatgggat cctgtgagag ggggtccctc cattgacagc tggactgttc 660 tttggggcct tatgtggtgt ttgcctctga ggtactcagg ggcatttagg tttttcctca 720 ttcttaaaca ataatgaata tgtccaaaca aggaattttc cagactgttg ggagtggcct 780 tgaccacatc ctgtctttgg cagatattga ggaagagcaa atgattcagt ccgttgatag 840 gactgcagtg actggagctt cttacttcac ttctgtggac caatcttcag ttcatactgc 900 tgaggttggc tcacatcaaa ttgaaccttt gaaaacctct gttgataaac ctggttctaa 960 gaaaactcag ggggaaaagt ttttcctgat tcattctgct gattggctca ctacacatgc 1020 tctctttcat gaagttgcaa aattggatgt ggtgaaacta ctgtataatg agcagtttgc 1080 cgtccaaggt ttgttgagat accatacata tgcaagattt ggcattgaga ttcaagttca 1140 gataaatccc acaccctttc agcaaggagg actaatttgt gccatggttc ctggtgacca 1200 aagttatggt tcaatagcat ccttgactgt ttatcctcat ggtctgttaa attgcaatat 1260 caacaatgta gttagaataa aggttccatt tatttatact agaggtgctt atcattttaa 1320 agatccacag tacccagttt gggaattgac aatcagagtt tggtcagagt tgaatattgg 1380 aacaggaact tcagcttaca cttcactcaa tgttttagct aggtttacag atttggagtt 1440 gcatggatta actcctcttt ctacacagat gatgagaaat gaatttaggg tcagtactac 1500 tgaaaatgtt gtaaatttgt caaattatga agatgcaagg gcaaaaatgt cttttgcttt 1560 ggatcaggaa gattggaagt ctgatccttc ccaaggtggt ggaattaaaa ttactcattt 1620 tactacctgg acatccattc caaccttagc tgctcagttt ccatttaatg cttcagattc 1680 agttggacaa caaattaaag ttattccagt ggacccatac tttttccaaa tgacaaacac 1740 taatcctgat caaaaatgta taactgcctt ggcctctatt tgtcagatgt tctgcttttg 1800 gaggggagat cttgtttttg attttcaggt ttttccaacc aaatatcatt caggtagact 1860 gttgttttgt tttgttcctg ggaatgagtt aatagatgtt actggaatta cattaaaaca 1920 ggcaactact gctccttgtg cagtgatgga cattacagga gtgcagtcaa ccttgagatt 1980 tcgtgttcct tggatttctg atacacctta tcgagtgaat aggtacacga agtcagcaca 2040 tcaaaaaggt gagtacactg ccattgggaa gcttattgtg tattgttata acagactgac 2100 ttctccttct aatgttgcct ctcatgttag agttaatgtt tatctttcag caattaattt 2160 ggaatgtttt gctcctcttt accatgctat ggatgttact acacaggttg gagatgattc 2220 aggaggtttc tcaacaacag tttctacaga gcagaatgtt cctgatcccc aagttgggat 2280 aacaaccatg agggatttaa aaggaaaagc caatagggga aagatggatg tttcaggagt 2340 gcaagcacct cgtgggagct atcagcaaca attgaacgat ccagttttag caaagaaagt 2400 acctgagaca tttcctgaat tgaagcctgg agagtccaga catacatcag atcacatgtc 2460 tatttataaa ttcatgggaa ggtctcattt tttgtgcact tttactttca attcaaataa 2520 taaagagtac acatttccaa taaccctgtc ttcgacttct aatcctcctc atggtttacc 2580 atcaacatta aggtggttct tcaatttgtt tcagttgtat agaggaccat tggatttaac 2640 aattataatc acaggagcca ctgatgtgga tggtatggcc tggtttactc cagtgggcct 2700 tgctgtcgac ccttgggtgg aaaaggagtc agctttgtct attgattata aaactgccct 2760 tggagctgtt agatttaata caagaagaac aggaaacatt caaattagat tgccgtggta 2820 ttcttatttg tatgccgtgt ctggagcact ggatggcttg ggggataaga cagattctac 2880 atttggattg tttctattcg agattgcaaa ttacaatcat tctgatgaat atttgtcctt 2940 cagttgttat ttgtctgtca cagagcaatc agagttctat tttcctagag ctccattaaa 3000 ttcaaatgct atgttgtcca ctgaatccat gatgagtaga attgcagctg gagacttgga 3060 gtcatcagtg gatgatccca gatcagagga ggatagaaga tttgagagtc atatagaatg 3120 taggaaacca tacaaagaat tgagactgga ggttgggaaa caaagactca aatatgctca 3180 ggaagagtta tcaaatgaag tgcttccacc tcctaggaaa atgaaggggt tattttcaca 3240 agctaaaatt tctctttttt atactgagga gcatgaaata atgaagtttt cttggagagg 3300 agtgactgct gatactaggg ctttgagaag atttggattc tctctggctg ctggtagaag 3360 tgtgtggact cttgaaatgg atgctggagt tcttactgga agattgatca gattgaatga 3420 tgagaaatgg acagaaatga aggatgataa gattgtttca ttaattgaaa agttcacaag 3480 caataaatat tggtctaaag tgaattttcc acatggaatg ttggatcttg aagaaattgc 3540 tgccaattct aaggattttc caaatatgtc tgagacagat ttgtgtttcc tgttacattg 3600 gctaaatcca aagaaaatca atttagcaga tagaatgctt ggattgtctg gagtgcagga 3660 aattaaggaa cagggtgttg gactgatagc agagtgtaga actttcttgg attctattgc 3720 tgggactttg aaatctatga tgtttgggtt tcatcattct gtgactgttg aaattataaa 3780 tactgtgctt tgttttgtta agagtggaat cctgctttat gtcatacaac aattgaacca 3840 agatgaacac tctcacataa ttggtttgtt gagagttatg aattatgcag atattggctg 3900 ttcagttatt tcatgtggta aagttttttc caaaatgtta gaaacagttt ttaattggca 3960 aatggattct agaatgatgg agctgaggac tcagagcttc tctaattggt taagagatat 4020 ttgttcagga attactattt ttaaaagttt taaggatgcc atatattggt tatatacaaa 4080 attgaaggat ttttatgaag taaattatgg caagaaaaag gatattctta atattctcaa 4140 agataatcag caaaaaatag aaaaagccat tgaagaagca gacaattttt gcattttgca 4200 aattcaagat gtagagaaat ttgatcagta tcagaaaggg gttgatttaa tacaaaagct 4260 gagaactgtc cattcaatgg cgcaagttga ccccaatttg ggggttcatt tgtcacctct 4320 cagagattgc atagcaagag tccaccaaaa gctcaagaat cttggatcta taaatcaggc 4380 catggtaaca agatgtgagc cagttgtttg ctatttgtat ggcaaaagag ggggagggaa 4440 aagcttgact tcaattgcat tggcaaccaa aatttgtaaa cactatggtg ttgaacctga 4500 gaaaaatatt tacaccaaac ctgtggcctc agattattgg gatggatata gtggacaatt 4560 agtttgcatt attgatgata ttggccaaaa cacaacagat gaagattggt cagatttttg 4620 tcaattagtg tcaggatgcc caatgagatt gaatatggct tctctagagg agaagggcag 4680 acatttttcc tctcctttta taatagcaac ttcaaattgg tcaaatccaa gtccaaaaac 4740 agtttatgtt aaggaagcaa ttgatcgtag gcttcatttt aaggttgaag ttaaacctgc 4800 ttcatttttt aaaaatcctc acaatgatat gttgaatgtt aatttggcca aaacaaatga 4860 tgcaattaag gacatgtctt gtgttgattt aataatggat ggacacaata tttcattgat 4920 ggatttactt agttccttag tgatgacagt tgaaattagg aaacagaata tgagtgaatt 4980 catggagttg tggtctcagg gaatttcaga tgatgacaat gatagtgcag tggctgagtt 5040 tttccagtct tttccatctg gtgaaccatc aaattggaag ttatctagtt ttttccaatc 5100 tgtcactaat cacaagtggg ttgctgtggg agctgcagtt ggcattcttg gagtgcttgt 5160 gggaggatgg tttgtgtata agcatttttc ccgcaaagag gaagaaccaa ttccagctga 5220 aggggtttat catggcgtga ctaagcccaa acaagtgatt aaattggatg cagatccagt 5280 agagtcccag tcaactctag aaatagcagg attagttagg aaaaatctgg ttcagtttgg 5340 agttggtgag aaaaatggat gtgtgagatg ggtcatgaat gccttaggag tgaaggatga 5400 ttggttgtta gtaccttctc atgcttataa atttgaaaag gattatgaaa tgatggagtt 5460 ttacttcaat agaggtggaa cttactattc aatttcagct ggtaatgttg ttattcaatc 5520 tttagatgtg ggatttcaag atgttgtttt aatgaaggtt cctacaattc ccaagtttag 5580 agatattact caacacttta ttaagaaagg agatgtgcct agagccttaa atcgcttggc 5640 aacattagtg acaaccgtta atggaactcc tatgttaatt tctgagggac cattaaagat 5700 ggaagaaaaa gccacttatg ttcataagaa gaatgatggt actacagttg atttgactgt 5760 agatcaggca tggagaggaa aaggtgaagg tcttcctgga atgtgtggtg gggccctagt 5820 gtcatcaaat cagtccatac agaatgcaat tttgggtatt catgttgctg gaggaaattc 5880 aattcttgtg gcaaagctgg ttactcaaga aatgtttcaa aacattgata agaaaattga 5940 aagtcagaga ataatgaaag tggaatttac tcaatgttca atgaatgtag tctccaaaac 6000 gctttttaga aagagtccca ttcatcacca cattgataaa accatgatta attttcctgc 6060 agctatgcct ttctctaaag ctgaaattga tccaatggct atgatgttgt ccaaatattc 6120 attacctatt gtggaggaac cagaggatta caaggaagct tcagtttttt atcaaaacaa 6180 aatagtaggc aagactcagc tagttgatga ctttttagat cttgatatgg ctattacagg 6240 ggctccaggc attgatgcta tcaatatgga ttcatctcct gggtttcctt atgttcaaga 6300 aaaattgacc aaaagagatt taatttggtt ggatgaaaat ggtttgctgt taggagttca 6360 cccaagattg gcccagagaa ttttatttaa tactgtcatg atggaaaatt gttctgactt 6420 agatgttgtt tttacaactt gtccaaaaga tgaattgaga ccattagaga aagttttgga 6480 atcaaaaaca agagccattg atgcttgtcc tttggattat acaattctat gtcgaatgta 6540 ttggggtcca gctatcagtt atttccattt gaatccaggg tttcacacag gtgttgctat 6600 tggcatagat cctgatagac agtgggatga attatttaaa acaatgataa gatttggaga 6660 tgttggtctt gatttagatt tctctgcttt tgatgccagt cttagtccat ttatgattag 6720 ggaagcaggt agaatcatga gtgaattatc tggaacacca tctcattttg gaacagctct 6780 tatcaatact atcatttatt ctaaacatct gctgtacaac tgttgttatc atgtttgtgg 6840 ttcaatgcct tctgggtctc cttgcacagc tttgttgaat tcaattatta ataatattaa 6900 tctgtattat gtgttttcta aaatatttgg aaagtctcca gttttctttt gtcaagcttt 6960 gaggatcctt tgttacggag atgatgtttt gatagttttt tccagagatg ttcaaattga 7020 caatcttgac ttgattggac agaaaattgt agatgagttc aaaaaacttg gcatgacagc 7080 cacctcagct gataaaaatg tgcctcaact gaagccagtt tcagaattga cttttctcaa 7140 aagatctttc aatttggtgg aggatagaat tagacctgca atttcagaaa agacaatttg 7200 gtctttgatg gcttggcaga gaagtaacgc tgagtttgag cagaatttag aaaatgctca 7260 gtggtttgct tttatgcatg gctatgagtt ctatcagaaa ttttattatt ttgttcagtc 7320 ctgtttggag aaagagatga tagaatatag acttaaatct tatgattggt ggagaatgag 7380 attttatgac cagtgtttca tttgtgacct ttcatgattt gtttaaacaa attttcttac 7440 tctttctgag gtttgtttat ttcttttgtc cgctaact 7478 <210> 16 <211> 2061 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS3/4A coding region <400> 16 atggcgccta tcacggccta tgcccagcag acaaggggcc ttttgggatg cataatcacc 60 agcttgaccg gccgggacaa aaaccaggtg gagggtgagg ttcagatcgt gtcaactgct 120 gcccagactt tcttggcaac ctgcattaac ggggtgtgtt ggactgtcta ccatggagcc 180 ggaacaagga ccattgcgtc acctaagggt cctgttatcc agatgtacac caatgtggac 240 caagacctcg taggctggcc cgctccccaa ggtgcccgct cattaacacc atgcacttgc 300 ggctcctcgg acctttacct ggtcacgagg cacgccgatg tcattcctgt gcgccgacgg 360 ggtgatggca ggggcagcct gctttcgccc cggcctatct cttacttgaa aggctcctcg 420 ggaggccctc tgctgtgccc cgcaggacat gccgtaggca tattcagagc cgcggtatgc 480 acccgtggag tggctaaggc ggtggacttc atccccgtag agagcttaga gacaaccatg 540 aggtccccgg tgttctcaga caactcctcc ccaccagcag tgccccagag ctaccaagtg 600 gcccacctgc atgctcccac cggcagcggt aagagcacca aggtcccggc cgcatacgca 660 gctcagggct acaaggtgct ggtgctcaac ccctccgttg ctgcaacaat gggctttggt 720 gcttacatgt ccaaggccca tgggattgat cctaacatca ggactggggt gaggacaatt 780 actactggca gcccgatcac gtattccacc tacggcaagt tccttgccga cggcgggtgt 840 tcagggggtg cttatgacat aataatttgt gacgagtgcc actccacgga tgcaacatcc 900 atcttgggca ttggcactgt ccttgaccaa gcagagaccg cgggggcgag actgactgtg 960 ctcgccaccg ctacccctcc gggctccgtc actgtgcccc atcctaacat cgaggaggtt 1020 gctctgtcca ctaccggaga gatccccttt tatggcaagg ctattcccct tgaagcaatt 1080 aaggggggga gacatctcat cttctgccac tcaaagaaga agtgcgacga gctcgccgca 1140 aaactggtcg cgttgggcgt caatgccgtg gcttactacc gcggccttga tgtgtccgtc 1200 atcccgacca gtggtgacgt tgtcgtcgtg gcaactgacg ccctcatgac cggctttacc 1260 ggcgacttcg attcggtgat agactgcaac acgtgtgtca cccagacagt cgacttcagc 1320 cttgacccta ccttcaccat tgagacaatc acgcttcccc aggatgctgt ctcccgtact 1380 caacgtcggg gtaggactgg cagagggaag ccaggcatct acagatttgt ggcaccgggg 1440 gagcgtcctt ctggcatgtt tgactcgtct gtcctctgcg agtgctatga cgcgggttgt 1500 gcttggtatg agcttacgcc cgccgagacc acagttaggc tacgagcata catgaacacc 1560 ccgggacttc ccgtgtgcca agaccatctt gaattttggg agggcgtctt tacgggtctc 1620 acccacatag acgcccactt cctatcccag acaaagcaga gtggggaaaa ccttccctat 1680 ctggtagcgt accaagccac cgtgtgcgct agagctcaag cccctccccc gtcgtgggac 1740 cagatgtgga agtgcttgat ccgtctcaag cccaccctcc atgggccaac acctctgcta 1800 tatagactgg gcgctgtcca gaatgaagtc accctgacgc acccagtcac caagtatatc 1860 atgacatgta tgtcggctga cctggaggtc gtcacgagta cctgggtgct cgttggcggc 1920 gttctggctg ctttggccgc gtattgccta tccacaggct gcgtggtcat agtaggtagg 1980 attgtcttgt ccggaaagcc ggcaatcata cccgacaggg aagtcctcta ccgggagttc 2040 gatgaaatgg aagagtgctg a 2061 <210> 17 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 17 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning oligonucleotide <400> 18 ccgtctagat cagcactctt ccatttcatc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning oligonucleotide <400> 19 cctgaattca tggcgcctat cacggcctat 30 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning oligonucleotide <400> 20 ccacgcggcc gcgacgacct acag 24 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning oligonucleotide <400> 21 ctggaggtcg tcacgcctac ctgggtgctc gtt 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning oligonucleotide <400> 22 accgagcacc caggtaggcg tgacgacctc cag 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning oligonucleotide <400> 23 ctggaggtcg tccgcggtac ctgggtgctc gtt 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning oligonucleotide <400> 24 accgagcacc caggtaccgc ggacgacctc cag 33 <210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 25 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 26 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 26 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 27 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Gly 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 28 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val 1 5 10 <210> 29 <211> 632 <212> PRT <213> Hepatitis C virus NS3 peptideArtificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS3 peptide <400> 29 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr 625 630 <210> 30 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS4A peptide <400> 30 Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser 20 25 30 Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe 35 40 45 Asp Glu Met Glu Glu Cys 50 <210> 31 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 31 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Gly Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 32 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 32 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Gly Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 33 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Pro 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 34 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 35 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 35 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro 1 5 10 15 Ala Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 36 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 36 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Cys Ser 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 37 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Cys Cys Ser 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 38 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 38 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Ser Ser Ser 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 39 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 39 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 40 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A peptide <400> 40 Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Val Val Val Val Thr Ser 1 5 10 15 Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu 20 25 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis C virus NS5 peptide <400> 41 Ala Ser Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly 1 5 10 15 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS5A/B peptide <400> 42 Ser Ser Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Trp Val Leu Val Gly Gly 1 5 10 15 Val Leu <210> 43 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 43 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Pro Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 44 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 44 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 45 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 45 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro Ala Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 46 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 46 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Cys Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 47 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 47 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Cys Cys Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 48 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 48 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Leu Glu Val Ser Ser Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 <210> 49 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Hepatitis C virus NS3/4A <400> 49 Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 80 Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly 225 230 235 240 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 325 330 335 Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 400 Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 480 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 565 570 575 Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val 645 650 655 Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp 660 665 670 Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685

Claims (32)

  1. 서열 번호 16의 서열로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산 또는 이의 상보물.
  2. 서열 번호 16의 100개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산 또는 이의 상보물.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 16의 200개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산.
  4. 제2항에 있어서, 서열 번호 16의 500개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산.
  5. 제2항에 있어서, 서열 번호 16의 1000개 이상의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 정제 또는 단리된 핵산.
  6. 제1항의 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제1항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  8. 제1항의 핵산을 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 면역 보강제(adjuvant)를 더 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 제2항의 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제2항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  12. 제3항의 핵산을 포함하는 벡터.
  13. 제3항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  14. 제4항의 핵산을 포함하는 벡터.
  15. 제4항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  16. 제5항의 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 제5항의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
  18. 제1항의 핵산을 포함하는 조성물.
  19. 제2항의 핵산을 포함하는 조성물.
  20. 제3항의 핵산을 포함하는 조성물.
  21. 제4항의 핵산을 포함하는 조성물.
  22. 제5항의 핵산을 포함하는 조성물.
  23. 제18항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  25. 제20항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  27. 제22항에 있어서, 면역 보강제를 더 포함하는 조성물.
  28. 제18항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  29. 제19항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  30. 제20항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  31. 제21항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
  32. 제22항에 있어서, 리바비린을 더 포함하는 조성물.
KR1020077023368A 2000-08-17 2001-08-15 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법 KR20070114209A (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22576700P 2000-08-17 2000-08-17
US60/225,767 2000-08-17
US22917500P 2000-08-29 2000-08-29
US60/229,175 2000-08-29
US70554700A 2000-11-03 2000-11-03
US09/705,547 2000-11-03

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020037002227A Division KR100801123B1 (ko) 2000-08-17 2001-08-15 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070114209A true KR20070114209A (ko) 2007-11-29

Family

ID=27397520

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020037002227A KR100801123B1 (ko) 2000-08-17 2001-08-15 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법
KR1020077023368A KR20070114209A (ko) 2000-08-17 2001-08-15 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020037002227A KR100801123B1 (ko) 2000-08-17 2001-08-15 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6960569B2 (ko)
EP (3) EP2332574A1 (ko)
JP (1) JP5175417B2 (ko)
KR (2) KR100801123B1 (ko)
CN (1) CN100400101C (ko)
AT (2) ATE517184T1 (ko)
AU (4) AU9215101A (ko)
CA (1) CA2419418A1 (ko)
DE (1) DE60130998T2 (ko)
ES (1) ES2296803T3 (ko)
PL (1) PL360990A1 (ko)
WO (2) WO2002014362A2 (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6858590B2 (en) * 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6680059B2 (en) * 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6960569B2 (en) * 2000-08-17 2005-11-01 Tripep Ab Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
EP1395262A4 (en) * 2001-06-15 2006-04-12 Ribapharm Corp NUCLEOSIDE-VACCINE-ADJUVANTS
JP2005537032A (ja) * 2002-08-27 2005-12-08 コンパウンド セラピューティクス インコーポレーティッド アドザイムおよびその用途
AU2003302152A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-18 Tripep Ab Hepatisis c virus nonstructural protein 4a (ns4a) is an enhancer element
US7419912B2 (en) 2004-04-01 2008-09-02 Cree, Inc. Laser patterning of light emitting devices
ATE374838T1 (de) * 2004-04-29 2007-10-15 Hoffmann La Roche Nukleotidsequenzvariation im gen ns5a als marker
US7381705B2 (en) * 2004-09-29 2008-06-03 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Inhibitors of hepatitis C virus
AU2012200012B8 (en) * 2004-09-29 2014-05-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Inhibitors of hepatitis C virus
US7968697B2 (en) * 2005-05-25 2011-06-28 Chrontech Pharma Ab Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene
WO2008004992A2 (en) * 2005-05-25 2008-01-10 Tripep Ab Transdermal formulations containing hepatitis c virus immunogens and an ethoxylated oil
ES2334472B1 (es) * 2006-06-09 2011-01-21 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Combinacion inmunoestimuladora para profilaxis y tratamiento de hepatitis c.
US20100047231A1 (en) * 2005-10-07 2010-02-25 Aintzane Zabaleta Azpiroz Immuno-Stimulant Combination for Prophylaxis and Treatment of Hepatitis C
EP2185195A2 (en) 2007-08-16 2010-05-19 Tripep Ab Immunogen platform
US20100310605A1 (en) * 2007-12-18 2010-12-09 Peking University People's Hospital anti-hcv vaccine and preparation methods and uses thereof
WO2009130588A2 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Tripep Ab Immunogen platform
CN108148121B (zh) * 2018-03-06 2021-07-09 中美赛尔生物科技(广东)有限公司 丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗

Family Cites Families (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2933693A (en) 1957-05-03 1960-04-19 Lyle R Battersby Sensitivity control circuit
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4818540A (en) 1985-02-25 1989-04-04 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal fertility control system and process
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US5322770A (en) 1989-12-22 1994-06-21 Hoffman-Laroche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5714596A (en) 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
US5350671A (en) 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
US5698390A (en) 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US5712088A (en) 1987-11-18 1998-01-27 Chiron Corporation Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
US5968775A (en) 1987-11-18 1999-10-19 Chiron Corporation Hepatitis C virus infected cell systems
US6171782B1 (en) 1987-11-18 2001-01-09 Chiron Corporation Antibody compositions to HCV and uses thereof
WO1989004669A1 (en) * 1987-11-18 1989-06-01 Chiron Corporation Nanbv diagnostics and vaccines
US5679342A (en) 1987-11-18 1997-10-21 Chiron Corporation Hepatitis C virus infected cell systems
US5683864A (en) 1987-11-18 1997-11-04 Chiron Corporation Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US4950647A (en) 1988-10-04 1990-08-21 Nucleic Acid Research Institute T cell immunopotentiator
WO1990011089A1 (en) 1989-03-17 1990-10-04 Chiron Corporation Nanbv diagnostics and vaccines
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6027729A (en) 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
DK0398748T3 (da) 1989-05-18 2002-03-18 Chiron Corp NANBV-diagnostika: polynukleotider anvendelige til screening for hepatitis C virus
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
DK0414475T3 (da) 1989-08-25 1998-02-09 Chiron Corp Fremgangsmåder til dyrkning af HCV i B- eller T-lymfocyt-cellelinier
CA2065287C (en) * 1989-09-15 1999-12-21 Tatsuo Miyamura New hcv isolates
US5372928A (en) 1989-09-15 1994-12-13 Chiron Corporation Hepatitis C virus isolates
EP0527788B1 (en) 1990-04-04 2004-06-30 Chiron Corporation Hepatitis c virus protease
US5712087A (en) 1990-04-04 1998-01-27 Chiron Corporation Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens
BR9106309A (pt) 1990-04-04 1993-04-20 Chiron Corp Combinacao de antigenos sinteticos de hepatite c viral (hcv),processo de detectar anticorpos para o virus da hepatite c e estojo para realizar teste
US6194140B1 (en) 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
RO109952B1 (ro) 1990-08-10 1995-07-28 Chiron Corp Procedeu si reactiv pentru detectarea secventei de hcv, intr-o secventa suspectata a contine polinucleotida hcv, care cuprinde o regiune tinta, selectata
US5604105B1 (en) 1990-10-12 1999-08-24 Spectral Diagnostics Inc Method and device for diagnosingand distinguishing chest pain in early onset thereof
US5710008B1 (en) 1990-10-12 1999-09-07 Spectral Diagnostics Inc Method and device for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof
CA2027434C (en) 1990-10-12 1999-01-05 George Jackowski Diagnostic kit for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof
CA2095521C (en) 1990-11-08 2009-06-30 Robert O. Ralston Hepatitis c virus asialoglycoproteins
US6274148B1 (en) 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
AU663300B2 (en) 1990-12-06 1995-10-05 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6190864B1 (en) 1991-05-08 2001-02-20 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
HU227548B1 (en) 1991-05-08 2011-08-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Process for production of non-naturally occuring non-hcv-1 nucleic acids, forming a hybridization product, and detecting hcv genotypes
FR2677372B1 (fr) * 1991-06-06 1994-11-10 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques.
UA40572C2 (uk) 1991-06-24 2001-08-15 Чірон Корпорейшн Поліпептид, що містить укорочену послідовність вірусу гепатиту с, ізольований епітоп, реагент для імуноаналізу на вірус гепатиту с (варіанти), спосіб виявлення наявності антитіл (варіанти)
AU679429B2 (en) 1991-09-13 1997-07-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Immunoreactive hepatitis C virus polypeptide compositions
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US5795714A (en) 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
DE4239311C2 (de) 1992-11-23 1996-04-18 Guehring Joerg Dr Bohrer, insbesondere Spitzbohrwerkzeug mit austauschbarem Schneideinsatz
ES2249760T3 (es) 1993-01-26 2006-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania (A Corporation Of Pennsylvania) Composiciones y procedimientos de administracion de materias geneticas.
DE69435023T2 (de) 1993-04-27 2008-09-11 N.V. Innogenetics S.A. Sequenzen der genotype des hepatitis-c-virus sowie ihre verwendung als arzneimittel und diagnostika
AU8126694A (en) 1993-10-26 1995-05-22 Affymax Technologies N.V. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
EP0789590B1 (en) 1994-09-23 2002-09-04 Zonagen, Inc. Chitosan induced immunopotentiation
US6235888B1 (en) 1994-10-05 2001-05-22 The General Hospital Corporation Hepatitis C virus vaccine
EP1076092A3 (en) 1994-10-21 2001-03-28 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis C virus type10 and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents
FR2730935A1 (fr) 1994-12-21 1996-08-30 Vacsyn Sa Vaccin presentant une immunogenicite accrue
US5932556A (en) 1995-09-17 1999-08-03 Tam; Robert C Methods and compositions for regulation of CD28 expression
WO1996028162A1 (en) 1995-03-14 1996-09-19 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey New drug combination for the treatment of viral diseases
US6150337A (en) 1996-01-23 2000-11-21 Icn Pharmaceuticals, Inc. Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by Ribavirin in activated T-lymphocytes
KR100298158B1 (ko) 1996-01-23 2001-09-06 와트 씨 데이빗, 해리 에이 루스제 활성화된T림프구에서리바비린R및리바비린R유사체에의해Th1/Th2시토킨발현을조절하기위한약제조성물
US5767097A (en) 1996-01-23 1998-06-16 Icn Pharmaceuticals, Inc. Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by ribavirin in activated T-lymphocytes
AU2189397A (en) 1996-02-08 1997-08-28 Affymetrix, Inc. Chip-based speciation and phenotypic characterization of microorganisms
CA2244891C (en) 1996-02-09 2008-12-30 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6514731B1 (en) 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
CA2257137A1 (en) 1996-06-11 1997-12-18 Merck & Co., Inc. Synthetic hepatitis c genes
JP2001500738A (ja) 1996-09-17 2001-01-23 カイロン コーポレイション 細胞内疾患を処置するための組成物および方法
CN1233254A (zh) 1996-10-16 1999-10-27 Icn药品公司 嘌呤l－核苷、其类似物及其用途
WO1998016186A2 (en) 1996-10-16 1998-04-23 Icn Pharmaceuticals, Inc. Monocyclic l-nucleosides, analogs and uses thereof
IL119833A (en) 1996-12-15 2001-01-11 Lavie David Hypericum perforatum extracts for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of hepatitis
SI9820003A (sl) 1997-01-17 1999-06-30 Icn Pharmaceuticals, Inc. Zdravljenje bolezni povezano s citokini
PL335050A1 (en) 1997-02-07 2000-03-27 Merck & Co Inc Synthetic genes gag hiv
WO1998037180A2 (en) * 1997-02-22 1998-08-27 Abbott Laboratories Hcv fusion protease and polynucleotide encoding same
US6153421A (en) 1997-07-18 2000-11-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Cloned genomes of infectious hepatitis C viruses and uses thereof
WO1999028482A2 (en) 1997-11-28 1999-06-10 Schering Corporation Single-chain recombinant complexes of hepatitis c virus ns3 protease and ns4a cofactor peptide
US6541011B2 (en) 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
TR200003024T2 (tr) * 1998-04-17 2000-12-21 Innogenetics N.V. İndirgeme ajanlarını kullanarak geliştirilen immünodiagnostik tahliller.
GB9820525D0 (en) 1998-09-21 1998-11-11 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
US20020187945A1 (en) 1999-01-29 2002-12-12 Robert Tam Modulation of immune response by ribavirin
HUP0200027A2 (en) 1999-01-29 2002-04-29 Icn Pharmaceuticals Modulation of immune response by ribavirin
CN101684146A (zh) * 1999-11-24 2010-03-31 诺华疫苗和诊断公司 新颖的hcv非结构多肽
JP4837229B2 (ja) * 2000-06-15 2011-12-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 抗ｈｃｖ抗体についてのイムノアッセイ
US6960569B2 (en) 2000-08-17 2005-11-01 Tripep Ab Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene
JP4475561B2 (ja) 2001-10-11 2010-06-09 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション Ｃ型肝炎ウイルスワクチン
KR20140137679A (ko) 2013-05-23 2014-12-03 삼성전자주식회사 카드 소켓 장치

Also Published As

Publication number Publication date
AU9215101A (en) 2002-02-25
WO2002013855A3 (en) 2003-01-09
CN1469755A (zh) 2004-01-21
AU2006203358A1 (en) 2006-08-31
EP1311289B1 (en) 2007-10-17
WO2002014362A2 (en) 2002-02-21
JP5175417B2 (ja) 2013-04-03
EP1311289A2 (en) 2003-05-21
ATE517184T1 (de) 2011-08-15
EP1947185A1 (en) 2008-07-23
WO2002014362A3 (en) 2003-11-13
WO2002013855A2 (en) 2002-02-21
AU2001290178A1 (en) 2002-02-25
ATE375804T1 (de) 2007-11-15
JP2004506018A (ja) 2004-02-26
AU2001292151B2 (en) 2006-05-04
DE60130998T2 (de) 2008-07-17
AU2006203358B2 (en) 2008-07-17
KR100801123B1 (ko) 2008-02-05
EP2332574A1 (en) 2011-06-15
EP1947185B1 (en) 2011-07-20
KR20030024876A (ko) 2003-03-26
CA2419418A1 (en) 2002-02-21
ES2296803T3 (es) 2008-05-01
CN100400101C (zh) 2008-07-09
US6960569B2 (en) 2005-11-01
AU2001292151C1 (en) 2002-02-25
US20040092730A1 (en) 2004-05-13
PL360990A1 (en) 2004-09-20
DE60130998D1 (de) 2007-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100801123B1 (ko) 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법
US7223743B2 (en) Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
US7244715B2 (en) Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6680059B2 (en) Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
AU2001292151A1 (en) Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid