JP2001500738A - 細胞内疾患を処置するための組成物および方法 - Google Patents

細胞内疾患を処置するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも1つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を投与する工程、そしてさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応答が生成される工程を包含する、細胞内感染を処置するための方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞内疾患を処置するための組成物および方法技術分野 本発明は、一般に、広範な種々の細胞内疾患（例えば、ウイルス疾患、寄生生 物疾患、および特定の細菌性疾患を含む）を処置するための組成物および方法に 関する。発明の背景 現代医学の出現によって、多くの疾患が、今や、広範な種々の医薬で処置され 得る。それにもかかわらず、感染性疾患は、発展途上国において、免疫システム が損なわれた個体において、そして適切な処置がない特定の疾患について深刻な 関心事である。 発展途上国において、不十分な衛生および適切な衛生設備の欠如は、感染性疾 患を促進する環境を提供する。適切な衛生設備を有する国でさえ、感染性因子の 定常的な猛威が、標準以下のレベルまで免疫系防御にストレスをかけ得、従って 、これは疾患の進展を可能にし得る。 これらの疾患のいくつかに対して防御するために、ワクチンは利用可能である けれど、ワクチン接種は、感染後におけるあまりにも遅い時期における送達また はワクチンに対して免疫応答を増大させる患者の不能のような因子に起因して常 に適しているわけではない。このような疾患の１つは、肝炎（これは、主に肝臓 に影響する全身的な疾患である）である。簡略には、この疾患は、最初の症状の 発症（例えば、食欲不振、悪心、嘔吐、疲労、倦怠、関節痛、筋肉痛、および頭 痛）、続く黄疸の発症によって分類される。この疾患はまた、アミノトランスフ ェラーゼASTおよびALTの上昇した血清レベルによって特徴づけられ得る。血清に おけるこれらの酵素の定量は、肝臓損傷の程度を示す。 肝炎に関連するウイルス因子の５つの一般的な分類が存在する：Ａ型肝炎ウイ ルス（HAV）；Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）；２つの型の非Ａ非Ｂ（NANB）因子、一 方は血液媒介性（Ｃ型肝炎）および他方は腸伝播性（Ｅ型肝炎）；ならびにHBV 関連デルタ因子（Ｄ型肝炎）。 肝炎の２つの一般的な臨床的分類（急性肝炎および慢性肝炎）が存在する。急 性肝炎の症状は無症候性かつ非顕在性のものから胎児感染のものにまでに及ぶ。 この疾患は、無症状性かつ持続性であり得るか、または肝硬変を有する慢性の肝 疾患まで、いくつかの場合では、肝臓癌まで迅速に進行する。アメリカ合衆国に おける成人白人の急性Ｂ型肝炎感染は、約５％〜10％の場合で慢性Ｂ型肝炎まで 進行する。残りの場合では、約65％が無症状性である。極東の場合において、感 染は、通常、出生時であり、そして50％〜90％は慢性状態に進行する。進行の異 なる割合は、宿主の遺伝的差異よりもむしろ感染年齢に関連するようである。ア メリカ合衆国において、ハイリスクの群（例えば、内科医、薬物常用者、および 腎臓透析患者）におけるより高い割合を伴って、人口の約0.2％が慢性的に感染 している。台湾、香港、およびシンガポールのような国では、人口における肝炎 感染を有するレベルは、10％程度の高さであり得る。 アメリカ合衆国において、慢性肝炎を有する患者の約20％が肝不全で死亡し、 そしてさらに５％がＢ型肝炎に関連する癌を発症する。極東の場合において、人 口の大きな割合がHBVに感染し、そして長期の慢性感染（20〜40年）後、これら の約25％が、肝細胞癌を発症する。 Ａ型肝炎およびＢ型肝炎の両方についての血清学的試験の開発の後、研究者ら は、肝炎様症状を有し、そして感染性疾患と一致するインキュベーション期間お よび伝播様式を有するが、Ａ型肝炎感染またはＢ型肝炎感染の血清学的証拠を有 さない他の患者を同定した。ほぼ15年後、原因因子がRNAウイルスとして同定さ れた。このウイルス（「Ｃ型肝炎」と命名された）は、HBV、レトロウイルス、 または他の肝炎ウイルスとのホモロジーを有さない。 Ｃ型肝炎（HCV）は、世界中で、輸血後および散発性非Ａ非Ｂ（NANB）型肝炎 の主な原因であるようであり、そして慢性肝臓疾患の発症に主な役割をはたす。 これは、肝細胞癌（Kuoら、Science 244:362-364，1989 Chooら、British Medic al Bulletin 46(2):423-441，1990）を含む。毎年、輸血を受けた３百万人の内 、約150,000人が急性Ｃ型肝炎を発症する（Davisら、New Eng．J．Med．321(22) :1 501-1506，1989）。さらに、急性Ｃ型肝炎を発症する人の内、少なくとも半分が 慢性Ｃ型肝炎を発症する。 最近まで、治療が、急性Ｂ型肝炎もしくは慢性Ｂ型肝炎または急性Ｃ型肝炎も しくは慢性Ｃ型肝炎の処置に有効であると判明せず、そして肝炎に感染した患者 は、一般に、その疾患に対してその治療単位を行わなけれなばならない。ほとん どの抗ウイルス薬物（例えば、アシクロビル）ならびにコルチコステロイドの使 用を介する免疫系を増強する試みは、効果的でないことが判明している（Alter ，「Viral hepatitis and liver disease」，Zuckerman（編）、New York:Alan R．Liss，537〜42頁、1988）。いくらかの抗ウイルス活性は、アデノシンアラビ ノシドで観察されている（Jacynaら、British Med．Bull．46：368-382、1990） が、この薬物と関連する毒性の副作用がこのような処置を容認し難いものにして いる。 慢性Ｂ型肝炎感染および慢性Ｃ型肝炎感染に対していくらかの利益を提供した １つの処置は、組換えαインターフェロンの使用である（Davisら、New Eng．J ．Med．321(22):1501-1506，1989;Perrilloら、New Eng．J．Med．323:295-301 ，1990）。しかし、Ｂ型肝炎感染を有する患者について、被感染者の約35％のみ がこのような処置に反応し、そして出生時感染において約10％のみが処置に応答 した。Ｃ型肝炎感染について、このような治療を利用する明らかな短期間の成功 にもかかわらず、処置の終結の６ケ月後で、治療に応答した患者の半分が再発し た。さらに、αインターフェロン治療に伴うさらなる困難さは、この成分が、し ばしば、感受性の患者に対して低減した薬用量を必要とする毒性の副作用（例え ば、悪心および流感様症状）を有することである。 従って、当該分野で、細胞内細菌性感染もしくは寄生生物性感染、またはウイ ルスのような感染因子に起因する疾患（例えば、肝炎）を処置または予防するた めの治療剤に対する必要性が存在する。本発明は、このような治療剤を提供し、 そして他の関連する利点をさらに提供する。発明の要旨 簡略にいうと、本発明は、細胞内細菌性感染、寄生生物性感染、ウイルス性感 染を処置する方法に関する。このような細胞内感染の代表的な例には、細菌感染 （例えば、レジオネラ、結核、およびクラジミア感染症）、寄生生物性感染（例 えば、リッケチア、リーシュマニア、またはマラリア）、ならびにHBV、HCV、HS V、HIV、およびFIVのようなウイルス感染が挙げられる。 本発明の１つの局面において、温血動物内の細胞内感染を処置するための方法 が提供される。この方法は、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原 性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そしてさら に抗原上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応 答が生成される、工程を包含する。特定の実施態様において、免疫調節補因子も また投与され得る。さらに、以下により詳細に議論されるように、タンパク質は ベクター構築物の投与の前に、同時に、またはその後のいずれかで投与され得る 。 本発明の特定の実施態様において、細胞内病原体はウイルスであり、そして抗 原はウイルス抗原である。ウイルス抗原の代表的な例は、肝炎、ネコ免疫不全ウ イルス、およびHIVからなる群から選択されるウイルスから得られるウイルス抗 原を含む。特定の実施態様において、抗原はＢ型肝炎抗原（例えば、HBeAg、HBc Ag、およびHBsAg（例えば、Ｓ、プレ-S1、またはプレ-S2））、ORF5、ORF6、HBVp ol抗原）、またはＣ型肝炎抗原（例えば、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、N S4、およびNS5）である。関連する実施態様において、いくつかの抗原が、組み 合わせられ得る（例えば、HBeAgおよび有BcAg）。他の実施態様において、細胞 内病原体は寄生生物である。 本発明の関連する局面において、ポリタンパク質抗原の免疫原性部分の発現を 指向するか、またはこの抗原を免疫調節補因子と共に同時発現するベクター構築 物が提供される。さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との組み合 わせでこれらの組換えウイルスを含む薬学的組成物が提供される。 さらなる実施態様において、ベクター構築物は、組換えレトロウイルス、アル ファウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはパルボウイルスによって運ばれる。 あるいは、ベクター構築物は、核酸発現ベクター（例えば、DNAベクターまたは 真核生物層化ベクター開始系（eukaryotic layered vector initiation system ））であり得る。ベクター構築物、または関連する免疫原性部分をコードする 核酸は、例えば、トランスフェクション法（例えば、リポフェクション、直接DN A注入、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リポソーム、CaPO4、もし くはDNAリガンド）によって直接的に、または間接的に（例えば、細胞の選択さ れた集団へのエクソビボ）患者に投与され得る。 本発明はまた、組成物（例えば、種々のアジュバントを含む）を提供する。１ つの局面において、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の 発現を指向するベクター構築物、上記抗原の免疫原性部分を含むタンパク質、お よび必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物が提供 される。特定の実施態様において、このような組成物は、免疫調節補因子をさら に含み得る。上記のように、細胞内病原体は、例えば、ウイルス、寄生生物、細 菌であり得る。ウイルス抗原の代表的な例は、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、お よびHIVからなる群から選択されるウイルスから得られるウイルス抗原を含む。 特定の実施態様において、抗原はＢ型肝炎抗原（例えば、HBeAg、HBcAg、および HBsAg）またはＣ型肝炎抗原（例えば、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4 、およびNS5）である。 本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面 への参照において明らかである。図面の簡単な説明 図１は、ATCC 45020からのＢ型肝炎配列の回収を概説する概略図である。 図２は、HBV（adw）プレコア／コアのヌクレオチド配列（配列番号56）および pAM6（ATCC 95020）クローン由来の不正確な配列（配列番号57）の領域のヌクレ オチド配列の図表である。 図３は、pAM6（ATCC 45020）由来のHBプレコア／コア配列における変異を訂正 するために利用したプロトコールの概略図である。 図４は、SK+HBe-c由来の訂正されたヌクレオチド配列を示す、DNA配列決定ゲ ルである。 図５は、以下のレトロウイルスで形質導入したマウス細胞株、BC10Me、B1/6,L -M(TK-)、EA2Kb、およびレトロウイルスで形質導入したヒトＴ細胞株JA2/Kb由来 のHBVeタンパク質およびHBVコアタンパク質のELISAで決定した発現のレベルを示 す表である。 図６は、レトロウイルスで形質導入したBC10MEおよびB1/6細胞によって分泌さ れたp17kD HBV eタンパク質およびp23kDプレコア中間体タンパク質の免疫沈降／ 発現を示すウェスタンブロットである。このブロットはまた、レトロウイルスで 形質導入したBC10ME細胞由来の細胞溶解物におけるp21 HBVコアタンパク質の発 現を示す。 図７は、処方したHB Fコア/neoRベクターを注射したC3H He CRマウスにおける HBVコア抗原に対する抗体応答の誘導を示す表である。 図８は、HBVコアおよびB7タンパク質の両方を発現するベクター構築物KT-HBV コア/B7の模式図である。 図９は、HBVコア処方HB Fコア/neoRベクターのi.m.投与後のC3H Heマウスにお けるHBVコア抗原およびHBV e抗原に対するCTL応答の誘導を示すグラフである。 図10は、C3H/He CRマウスにおけるHBVコア抗原に対するCTL応答がMHCクラスＩ 制限性であることを示すグラフである。 図11（パネルＡおよびパネルＢ）は、C3H/He CRマウスにおけるHBVコア抗原に 対するCTL応答がCD4-CD8+細胞であることを示す１対のグラフである。 図12は、処方したHB Fコア/neoRベクターを注射したC3H/HeCRマウスにおけるH BVコア抗原およびHBV e抗原に対する抗体応答のイソ型を示す表である。 図13は、処方したHB Fコア/neoRベクターの筋肉内注射後のアカゲザルマカク におけるHBVコア抗原およびHBV e抗原に対するCTLの応答の誘導を示すグラフで ある。 図14（パネルＡおよびパネルＢ）は、アカゲザルマカクにおけるHBVコア抗原 に対するCTL応答がCD4-CD8+細胞であることを示す１対のグラフである。 図15（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）は、CFA(a)、２×100μｌ（HBc[3A4](b)、ま たは２×100μｌ Hbc/neo[6A3]における後ろ足パッドへの10μｇ rHBcAgのs.c注 射によるHBc/eAgＴ細胞プライミング効率の比較を示す。３匹マウスの群をプラ イムし（レトロウイルスベクターで免疫化したマウスを５日後に追加免疫した） 、そして９日〜11日後に屠殺した。排出LNを採取し、そして単一の懸濁液を、示 さ れる抗原の非存在下または存在化で96時間培養した。値を、抗原を伴う１分当た りのカウント（CPM）から抗原を伴わないウェルの平均CPMを引いた∂CPMとして 示す。 図16は、HBe[5A2]レトロウイルスベクターで免疫化後のB10およびB10.S LNな らびに脾臓Ｔ細胞のrHBcAgに対する増殖応答（パネルａおよびｂ）ならびにサイ トカイン応答（パネルｃ）を示す。マウスをプライムし、そして図15の解説に示 したように後ろ足パッドに追加免疫した。増殖を96時間目で測定し、サイトカイ ンmRNAを48時間培養物から抽出した。値を∂CPMで示す。 図17は、HBc[3A4]（パネルａ）、HBe［5A2］（パネルｂ）、およびHBc/neo［6 A3］（パネルｃ）レトロウイルスでの免疫化後のB10マウスにおける抗体応答は 、HBc/eAgの残基129〜140に対応する合成Th細胞部位での先のプライミングによ って増強され得る。２匹〜３匹のマウスの群を、レトロベクター免疫化の９〜11 日前に不完全フロイントのアジュバンド中の100μｇのペプチドでプライムし、 そしてその後６週間毎週プライムした。コントロールとして、レトロベクター免 疫化のみを受けただけの同数のマウスを供給した。各値を２〜３匹のマウスの群 の終点力価の平均を表す。発明の詳細な説明 本発明を記載する前に、以下に使用される特定の用語を最初に定義することは 本発明の理解に有用であり得る。以下に引用される全ての参考文献は、それらの 全体で本明細書によって参考として援用される。 本発明において利用される「免疫原性タンパク質」は、適切な条件下で免疫応 答（すなわち、細胞媒介性または体液性）を引き起こし得るそれぞれの抗原の部 分をいう。「部分」は可変性の大きさであり得るが、好ましくは少なくとも９の アミノ酸長であり、そして抗原全体を含み得る。免疫原性（例えば、細胞媒介性 免疫応答）を決定するために利用され得る代表的なアッセイは、以下ならびに実 施例15Aiにより詳細に記載される。細胞媒介性免疫応答は、主要組織適合性複合 体（「MHC」）クラスＩ提示、MHCクラスII提示、または両方を介して媒介され得 る。 「免疫調節補因子」は、免疫応答に関与する１以上の細胞によって生成される 場合、または細胞に外来的に添加される場合、補因子の非存在下で生じる免疫応 答とは質または強さにおいて異なる免疫応答を引き起こす因子をいう。応答の質 または強さは、当業者に公知の種々のアッセイによって測定され得る。これには 、例えば、細胞増殖（例えば、3Hチミジン取り込み）を測定するインビトロアッ セイ、およびインビトロサイトカインアッセイ（例えば、51Cr放出を測定する） （Warnerら、AIDS Res．and Human Retroviruses 7:645-655，1991を参照のこと ）が挙げられる。免疫調節補因子は、インビボおよびエキソビトロの両方で活性 であり得る。このような補因子の代表的な例は、サイトカイン（例えば、インタ ーロイキン２、４、６、および12（とりわけ）、αインターフェロン、βインタ ーフェロン、γインターフェロン、GM-CSF．G-CSF、および腫瘍壊死因子（TNF） を含む。他の免疫調節補因子は、例えば、CD3、ICAM-1、ICAM-2、LFA-1、LFA-3 、MHCクラスＩ分子、MHCクラスII分子、B7、β2-ミクログロブリン、シャペロン 、またはそれらのアナログを含む。 「ベクター構築物」は、目的の配列（単数もしくは複数）または遺伝子（単数 もしくは複数）の発現を指向し得る集合体をいう。ベクター構築物は、プロモー ターエレメントを含まなければならず、そして好ましくはポリアデニル化を指向 するシグナルを含む。さらに、ベクター構築物は、転写される場合、目的の配列 （単数もしくは複数）または遺伝子（単数もしくは複数）に作動可能に連結され 、そして翻訳開始配列として作用する配列を含まなければならない。好ましくは 、ベクター構築物はまた、選択マーカー（例えば、Neo、SV2Neo、TK、ハイグロ マシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、ピューロマイシンN-アセチルトラン スフェラーゼ、またはDHFR）、および１つ以上の制限部位、および翻訳終結配列 を含む。さらに、ベクター構築物がレトロウイルス中に配置される場合、ベクタ ー構築物は、使用されるレトロウイルスに適切なパッケージングシグナルおよび 長末端反復（LTR）（これらが既に存在しない場合）を含まなければならない。 「レトロウイルスベクター構築物」は、本発明の好ましい実施態様において、 目的の配列（単数もしくは複数）または遺伝子（単数もしくは複数）の発現を指 向し得る集合体をいう。好ましくは、レトロベクター構築物は、5'LTR、tRNA結 合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異種配列、第２の鎖のDNA合成起 点、および3'LTRを含む。広範な種々の異種配列は、ベクター構築物において含 まれ得る。これには、例えば、タンパク質（例えば、細胞傷害性タンパク質、疾 患関連抗原、免疫付属分子、もしくは置換タンパク質）をコードする配列、また は分子自身として（例えば、リボザイムもしくはアンチセンス配列として）有用 な配列が挙げられる。あるいは、異種配列はまた、単に、「スタッファー」また は「フィラー（filler）」配列であり得る。これは、RNAゲノムを含むウイルス 粒子の産生を可能にするに十分な大きさである。好ましくは、異種配列は、長さ が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８kbである。 レトロベクター構築物はまた、転写プロモーター／エンハンサーもしくは部位 決定エレメント（単数もしくは複数）、またはオルタナティブスプライシング、 核RNA輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、もしくはタンパク質の転写後修飾の ような手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含み得る。必要に応 じて、レトロベクター構築物は、選択マーカー（例えば、Neo、TK、ハイグロマ イシン、フェロマイシン、ヒスチジノール、またはDHFR）、ならびに１つ以上の 特異的制限部位および翻訳終結配列を含み得る。 「核酸配列ベクター」は、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る集合体 をいう。核酸発現ベクターは、転写される場合、目的の配列（単数もしくは複数 ）または遺伝子（単数もしくは複数）に作動可能に連結されたプロモーター、な らびにポリアデニル化配列を含まなければならない。 本発明の特定の実施態様において、本明細書中に記載される核酸発現ベクター は、プラスミド構築物内に含まれ得る。核酸発現ベクターの成分に加えて、プラ スミド構築物はまた、細菌性の複製起点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド 構築物が１本鎖DNAとして存在することを可能にするシグナル（例えば、M13複製 起点）、複数クローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、SV40複 製起点またはアデノウイルス複製起点）を含み得る。 上記のように、本発明は、温血動物における細胞内感染を処置するための方法 および組成物に関し、この方法は、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの 免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そし てさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結 果免疫応答が生成される、工程を包含する。簡略には、外来病原体を認識し、そ してこれらに対して防御する能力は、免疫系の機能の中核をなす。この系は、免 疫認識を介して、「非自己」（外来）から「自己」を区別し得、これは防御機構 が宿主組織ではなく、浸入した存在に向けられることを確実にするに不可欠であ る。以下により詳細に記載される方法は、強力なクラスＩ制限性の防御的かつ、 治療的CTL応答、ならびに体液性応答を誘導する、有効な手段を提供する。 細胞内疾患 上記のように、本発明の１つの局面において、温血動物における細胞内感染を 処置するための方法が提供され、この方法は、細胞内病原体由来の抗原の少なく とも１つの免疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する 工程、そしてさらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与 し、その結果免疫応答が生成される、工程を包含する。このような細胞内疾患の 代表的な例は、細胞内細菌性感染、寄生生物感染、およびウイルス感染を含む。 本発明の１つの局面において、上記の方法は、細菌性疾患（例えば、放線菌疾 患（例えば、結核、クラジミア感染症）を含む）を処置または予防するために利 用され得る。適切な放線菌抗原の代表的な例には、フィブロネクチン結合抗原複 合体（Ag85）由来のMycobacteria tuberculosis抗原を含む（例えば、Launoisら 、Infection and Immnity 62(9):3679-3687，1994を参照のこと）。フィブロネ クチン結合複合体の特に好ましい免疫原性部分は、アミノ酸41〜80および241〜2 95を含み、これは強力かつ無差別のＴ細胞刺激特性を有する。当業者によって理 解されるべきであるように、M．tuberculosis複合体（例えば、M．bovisおよびM ．bovis BCG）内のこのような抗原は、疾患の処置のために利用され得るが、他 の関連する放線菌（例えば、M．leprae）内のこのような抗原においても同様で ある。 本発明の別の局面において、上記の方法はクラジミア感染症のような細菌性疾 患を処置または予防するために利用され得る。簡略には、Chlamydia trachomati s servars Ａ、Ｂ，およびＣは、トラコーマの原因因子であり、予防可能な失明 の世界の主要な原因である。適切な抗原の例は、クラジミアの主要な外膜タンパ ク質（「MOMP」；Westbayら、Infect．Immun．63:1391-1393，1995;SuおよびCal dweIl，Vaccine 11:1159-1166，1993；AllenおよびStephens，Eur．J．Immunol ．23:1169-1172，1993；SuおよびCaldwell，J．Exp．Med．175:227035，1992；S uら、J．Exp．Med．172:203-212，1990；およびGuagliardiら、Infect．Immun 5 7:1561-1567，1989）を含む。 本発明の別の局面において、上記の方法は、例えば、マラリアのような寄生生 物性感染を処置または予防するために利用され得る。適切な抗原の例は、Plasmo dium falciparumのcircumsporozoiteタンパク質を含む。 本発明の他の局面において、温血動物におけるウイルス感染を処置するための 方法が提供され、この方法は、ウイルス由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性 部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そしてさらに 抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果免疫応 答が生成される工程を包含する。このようなウイルスの代表的な例は、HIVおよ び肝炎を含む。 HIVについて、特に好ましい抗原は、HIV gag遺伝子およびenv遺伝子を含む。 適切な免疫原性部分は、関連するエピトープの合成および広範な種々の技術を利 用する分析によって容易に同定され得る（MancaらEur．J．Immunol．25:1217-12 23，1995；Sarobeら、J．Acquir．Immune．Defic．Syndr．7:635-40，1994；Shi raiら、J．Immunol．152:549-56，1994；Mancaら、Int．Immunol．5:1109-1117, 1993；Ahlersら、J．Immunol．150:5647-65，1993；KunduおよびMerigan、Aids 6:643-9，1992；Lasarteら、Cell immunol．141:211-8，1992；およびHosmalin ら、J．Immunol．146:1667-73，1991）。 本発明の他の局面において、温血動物内の肝炎感染を処置および／または予防 するための方法が提供され、この方法は、肝炎由来の抗原の少なくとも１つの免 疫原性部分の発現を指向するベクター構築物を温血動物に投与する工程、そして さらに抗原の上記免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与し、その結果 免疫応答が生成される工程を包含する。本発明の好ましい実施態様において、肝 炎ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスである。 簡略には、Ｂ型肝炎ゲノムは、約3.2kb長の環状DNAから構成され、そして十分 に特徴づけられている（Tiollaisら、Science 213:406-411，1981；Tiollaisら 、Nature 317:489-495，1985；およびGanemおよびVarmus，Ann．Rev．Biochem． 56:651-693，1987；EP 0 278,940、EP 0 241,021、WO 88/10301、および米国特 許第4,696,898号および同第5,024,938号もまた参照のこと）（これらは、本明細 書によって参考として援用される）。Ｂ型肝炎ウイルスには、いくつかの異なる 抗原を示す。これは、とりわけ、３つのHB「Ｓ」抗原（HBsAg）、HBc抗原（HBcA g）、HBe抗原（HBeAg）、およびHBx抗原（HBxAg）（Blumら、「The Molecular B iology of Hepatitis B Virus」TIG 5(5):154-158，1989を参照のこと）を含む 。簡略には、HBeAgは、P22プレコア中間体のタンパク質分解性切断から生じ、そ して細胞から分泌される。HbeAgは17kDaタンパク質として血清において見出され る。HBcAgは、183アミノ酸のタンパク質であり、そしてHBxAgは、サブタイプに 依存して、145アミノ酸〜154アミノ酸のタンパク質である。 動物細胞において合成されるHbsAgはグリコシル化され、アセンブリされ、そ して細胞上清中へ分泌される（Tiollaisら、Nature 317:489-495，1985）。３つ の異なるenvタンパク質が、HBVゲノムのＳ領域によってコードされる。これは３ つの翻訳開始コドンを含む（Heermanら、J．Virol 52:396-402，1984；Tiollais ら、Nature 317:489-495，1985）。ラージenvタンパク質、中間envタンパク質、 および主要なenvタンパク質は、第１のATG、第２のATG、第３のATGで翻訳を開始 し、そして合成はORFの末端まで進行する。このORFのプレS1、プレS2、およびＳ 遺伝子セグメントは、それぞれ、第１のATGと第２のATGとの間、第２のATGと第 ３のATGとの間、および第３のATGとORFの末端との間に位置する。３つのセグメ ントは、それぞれ、119、55、または226アミノ酸をコードする。プレS2産物はpH SAに結合し得る（Machidaら、Gastroenterology 86:910-918，1984;Michelら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 82:7708-7712，1985；Pertsingら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 82:3440-3444．1985）。肝細胞は、HSAに対する受容体を発現する ので、pHSAが中間体受容体として作用し、中間Ｓタンパク質および肝細胞に結合 する（これはウイルス付着を生じる）ことが示唆される（Michelら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 81:7708-7712，1985）。主要なenvタンパク質およびラージ envタンパク質は、Ｓ領域（gp27、gp42）の部位において非グリコシル化（p24、 p39）されているか、またはグリコシル化されているかのいずれかである。中間e nvタンパク質は、プレS2領域（gp33）内の部位でグリコシル化されていて、そし てさらにＳ領域においてグリコシル化（gp36）され得る。 当業者に明らかであるように、上記の抗原の種々の免疫原性部分は、本明細書 中で記載されるベクター構築物の１つによって投与される場合、免疫応答を表す ために組み合わせら得る。さらに、HBVのＳオープンリーディンフレームについ ての、異なる地理学的領域において見出される大きな免疫学的可変性に起因して 、抗原の特定の組み合わせが、特定の地理学的領域においての投与について好ま しくあり得る。簡略には、全てのヒトＢ型肝炎ウイルスＳサンプルに見出される エピトープは、決定基「ａ」として規定される。しかし、相互に排他的なサブタ イプ決定基はまた、２次元二重免疫拡散法（Ouchterlony，Progr．Allergy 5:1 ，1958）によって同定された。これらの決定基は、「ｄ」または「ｙ」および「 ｗ」または「ｒ」と命名された（LeBouvier，J．Infect．123:671，1971；Bancr oftら、J．Immunol．109:842，1972；Courouceら、Bibl．Haematol．42:1-158， 1976）。免疫学的可変性は、以下のアミノ酸変化を生じるＢ型肝炎ウイルスＳオ ープンリーディングフレームの２つの領域における単一のヌクレオオチド置換に 起因する：（１）Ｂ型肝炎ウイルスＳオープンリーディングフレームにおけるリ ジン-122のアルギニンへの交換は、ｄからｙへのサブタイプシフトを引き起こし 、そして（２）アルギニン-160のリジンへの交換はサブタイプｒからｗへのシフ トを引き起こす。アフリカ黒人において、サブタイプaywが優性であるが、アメ リカ合衆国および北ヨーロッパでは、サブタイプadw2がより多い（Molecular Bi ology of the Hepatitis B Virus，McLachlan（編）、CRC Press，1991）。当業 者に明らかであるように、投与の地理学的領域において優性である特定のＢ型肝 炎ウイルスサブタイプに適切である、投与のためのベクターを構築することが一 般に好ましい。特定の領域のサブタイプは、２次元二重免疫拡散法によって、ま たは好ましくはその領域内の個体から単離されたHBVウイルスのＳオープンリー ディングフレームを配列決定することによって決定され得る。 pol（「HBV pol」）、ORF 5、およびORF 6抗原はまた、HBVによって提示され る。簡略には、HBVのポリメラーゼオープンリーディングフレームは、感染した 肝臓におけるビリオンおよびコア様粒子に見出される逆転写活性をコードする。 ポリメラーゼタンパク質は、少なくとも２つのドメインからなる：逆転写をプラ イムするタンパク質をコードするアミノ末端ドメイン、および逆転写酵素および RNase H活性をコードするカルボキシル末端ドメイン。HBV polの免疫学的部分は 、以下に記載されるベクター構築物を利用し、本明細書中に記載の方法（例えば 、以下ならびに実施例15Aiおよび16）を利用して決定され得、そして温血動物内 で免疫応答を生成するために投与され得る。同様に、ORF 5およびORF 6のような 他のHBV抗原、（Millerら、Hepatology 9:322-327，1989）は、本明細書中に記 載されるベクター構築物を利用して発現され得る。ORF 5およびORF 6を利用する ベクター構築物の代表的な例は、以下の実施例5Iおよび5Jに記載される。 Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子的にクローン化されたゲノムは、例えば、 アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC，Rockville，Maryland）を含 む種々の供給原から得られ得る。例えば、ATCC No.45020は、pBR322（Moriarty ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2606-2610，1981）のBamHI部位にＢ型肝炎 の全ゲノムDNA（精製したDane粒子から抽出した）（Blumら、TIG 5(5):154-159 ，1989の図３を参照のこと）を含む（実施例2Aに記載されるように、そして図２ に示されるように、修正可能な間違いが、ATCC No.45020の配列に存在すること に留意のこと）。 上記のように、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分がベクター構築 物中に組み込まれる。ベクター構築物中に組み込まれる免疫原性部分（単数また は複数）は種々の長さであり得るが、一般に、その部分は少なくとも９アミノ酸 長であることが好ましく、そして全抗原を含み得る。特定の配列の免疫原性は、 しばしば、予測することが困難であるが、Ｔ細胞エピトープはFalkら（Nature 3 51:290，1991）によって記載されるHLA A2.1モチーフを利用して予想され得る。 この分析から、ペプチドが合成され得、そしてインビトロ細胞傷害性アッセイ（ 例えば、実施例15Aiにおいて記載されるアッセイ）において標的として使用され 得る。しかし、他のアッセイもまた利用され得る。これは、例えば、新たに導入 したベクターに対する抗体の存在を検出するELISA、ならびにＴヘルパー細胞 について試験するアッセイ（例えば、γインターフェロンアッセイ、IL-2産生ア ッセイ、および増殖アッセイ（実施例15Bおよび15C））を含む。 免疫原性部分はまた、他の方法によって選択され得る。例えば、HLA A2.1/Kb トランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識についてのモデル として有用であることが示されている。簡略には、インフルエンザおよびＢ型肝 炎ウイルス系において、マウスＴ細胞レセプターレパトリーは、ヒトＴ細胞によ って認識される同じ抗原性決定基を認識する。両方の系において、HLA A2.1/Kb トランスジェニックマウスにおいて生成されるCTL応答は、HLA A2.1ハプロタイ プのヒトCTLによって認識されるエピトープと同一のエピトープに実質的に向け られる（Vitielloら、J.Exp.Med．173:1007-1015，1991；Vitielloら、Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia，1992）。 ベクター構築物への取り込みのために特に好ましい免疫原性部分は、以下の実 施例5A、5B、および5Gでそれぞれより詳細に記載されるHBeAg、HBcAg、およびHB sAgを含む。Ｂ型肝炎ウイルスのさらなる免疫原性部分は、例えば、以下の部位 を含む種々の位置でコード配列を短縮することによって得られ得る：Bst UI、Ss p I、Ppu M1，およびMsp I（Valenzuelaら、Nature 280:815-19，1979;Valenzue laら、Animal Virus Genetics:ICN/UCLA Symp．Mol．Cell Biol.，1980，B.N.Fi eldsおよびR．Jaenisch（編）、57-70頁、New York:Academic）。 なお他の好ましい免疫優性Ｔ細胞エピトープは、コア分子中のaa 50-69(PHHTA LRQAILCWGELMTLA;配列番号84)を含み、急性HBV感染および異なるHLAハプロタイ プの95％の患者によって認識され、そしてコア抗原のペプチド１〜20（MDIDPYKE FGATVELLSFLP;配列番号85）および117-131（EYLVSFGVWIRTPPA;配列番号86）はま た、Ｔ細胞増殖を誘導し得る。 適切な免疫原性部分を決定するさらなる方法および方法もまた、以下により詳 細に記載される（Ferrariら、J．Clin．Invest．88:214-222，1991もまた参照の こと）。 本発明の別の局面において、Ｃ型肝炎感染を処置するための方法が提供される 。この方法は、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向させ るベクター構築物を温血動物に投与する工程、およびまた免疫応答を生じるよう に 抗原の前述の免疫原性部分を含むタンパク質を温血動物に投与する工程を包含す る。簡単には、上記のように、Ｃ型肝炎（非Ａ、非Ｂ（NANB）肝炎）は、輸血後 に発症する肝炎の症例の90％より多くを占める一般的な疾患である（Chooら、Sc ience 244:359-362，1989）。NANB肝炎に関するほとんどの情報は、チンパンジ ー伝染研究に由来していた。これらの研究は、NANB肝炎がほとんどのヒト感染に おいて、ほんの102〜103CID/ml（チンパンジー感染性用量/ml）の力価で存在し たことを示した。さらに、この疾患は、実験的に感染したチンパンジーの肝細胞 内にはっきりとした膜状の細管の出現を引き起こすことが見出された。この「細 管形成」（tubule forming）因子は、その後Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）と名付け られた。 HCVのゲノムRNAは、9379ヌクレオチドの配列を有することが最近になって決定 されている(Chooら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:2451-2455，1991;Chooら 、Brit．Med．Bull．46(2):423-441，1990;Okamotoら、J．Gen．Vir．72:2697-2 704，1991;Genbank Accession No．M67463，Intelligenetics(Mountain View，C alifornia)もまた参照のこと)。この配列は、3011アミノ酸のポリタンパク質前 駆体を発現する。これは、フラビウイルスファミリーのタンパク質に対する有意 な相同性を有する。ポリタンパク質前駆体は、切断されて、Ｃ（ヌクレオキャプ シドタンパク質）E1、E2/NS1、および非構造タンパク質NS2、NS3、NS4、およびN S5を含むいくつかの異なるウイルスタンパク質を生じる（Houghtonら、Hepatolo gy 14:381-388，1991）。 上記のように、本発明の１つの実施態様において、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも １つの免疫原性部分は、ベクター構築物中に組み込まれる。Ｃ型肝炎の好ましい 免疫原性部分は、ＣおよびNS3-NS4領域内で見出され得る。なぜなら、これらの 領域は、種々の型のＣ型肝炎ウイルス間で最も保存されているからである（Houg htonら、Hepatology 14:381-388，1991）。特に好ましい免疫原性部分は、種々 の方法によって決定され得る。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスについて上記のように 、ポリタンパク質の免疫原性部分の同定は、アミノ酸配列に基づいて予想され得 る。簡単には、当業者に公知の種々のコンピュータープログラムがCTLエピトー プを予想するために利用され得る。例えば、HLA A2.1ハプロタイプについてのCT Lエ ピトープは、Falkら（Nature 351:290，1991）によって記載されるHLA A2.1モチ ーフを利用することが予想され得る。この分析から、ペプチドは、合成され、そ して実施例15Aに記載されるようなインビトロ細胞傷害性アッセイにおける標的 として使用される。 好ましい免疫原性部分はまた、以下の様式で選択され得る。簡単には、HCVの 患者からの血液サンプルが、個々のHCVポリタンパク質領域（例えば、HCVコア、 E1、E2/SNI、およびNS2-NS5領域）に対する抗体を用いて、患者血清中にどの抗 原性フラグメントが存在するかを決定するために分析される。一時的な寛解を得 るためにαインターフェロンで処置した患者において、いくつかの抗原性決定基 が消失し、そして抗原に対する内因性の抗体によって取って代わられる。このよ うな抗原は、本発明の状況内で免疫原性部分として有用である（Hayataら、Hepa tology 13:1022-1028，1991;Davisら、N．Eng．J．Med．321:1501-1506，1989;C hooら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:2451-2455，1991もまた参照のこと）。 抗原の多数の特定の免疫原性部分は、本明細書中に、広範な種々の細胞内疾患 の処置および/または予防のために提供されてきたが、本発明はそのように限定 されるべきではないことに注意すべきである。特に、さらなる追加的な免疫原性 部分は、種々の方法によって決定され得る。例えば、上記のように、好ましい免 疫原性部分は、アミノ酸配列に基づいて予想され得る。簡単には、当業者に公知 の種々のコンピュータープログラムは、CTLエピトープを予想するために利用さ れ得る。例えば、HLA A2.1ハプロタイプのCTLエピトープは、Falkら（Nature 35 1:290，1991）によって記載されるHLA A2.1モチーフを利用することよって予想 され得る。 この分析から、ペプチドは、合成され、そしてCTLエピトープを同定するため に使用される。次に、これらのペプチドは、急性のＢ型肝炎感染を有する個体に おいて、またはHLA A2.1もしくはHLA A2.1/Kbトランスジェニックマウスにおい て試験される。急性Ｂ型肝炎感染を有する個体からのエフェクター細胞は、イン ビトロで形質導入された自己LCL（実施例11 Aiii）で刺激され、そしてペプチド でコートされた自己LCLにおいて試験される。クロム放出アッセイは、ペプチド が最終濃度１〜100μｇ/mlで、非形質導入Na2 51CrO4標識LCLに、エフェクター細 胞とともに添加されることを除き、実施例15Aivにおいて記載されるように行わ れる。反応物は、４〜６時間インキュベートされ、そして標準的なクロミウム放 出アッセイが実施例12Aiに記載されるように行われる。 HLA A2.1またはHLA A2.1/Kbトランスジェニックマウスからのエフェクター細 胞を収集し、そしてCTLアッセイを実施例15Aiiに記載されるように行う。ペプチ ドは、最終濃度１〜10μｇ/mlで、非形質導入Na2 51CrO4標識ELA A2/Kb細胞に添 加する。これらのペプチドでコートされた細胞は、CTLアッセイにおいて標的と して使用される。 免疫原性部分を予想するために同様に利用され得る別の方法は、どの部分がマ ウスにおいてCTLを誘導する特性を有するかをレトロウイルスベクターを利用し て決定することである(Warnerら、AIDS Res．and Human Retroviruses 7:645-65 5，1991を参照のこと)。Warnerらに記載されるように、マウスにおけるCTL誘導 は、細胞性免疫原性をヒトにおいて予想するために利用され得る。好ましい免疫 原性部分はまた、ポリタンパク質抗原またはペプチドのどのフラグメントが、対 応する遺伝子のベクター形質導入の後に,フラグメントを発現する標的細胞（例 えば、自己EBV形質転換リンパ球）の自己患者リンパ球によって溶解を誘導する ことが可能であるかを決定することにより導き出され得る（実施例16）。 本発明において利用される場合、免疫原性部分はまた、それらをより抗原性に するために改変されている抗原を含むことが理解されるべきである。免疫原を改 変するために適切な方法の代表的な例には、以下が含まれる：Ｔヘルパーエピト ープに対応するアミノ酸配列を付加すること；疎水性残基を付加することによっ て細胞の取り込みを促進すること；粒子状の構造を形成すること；またはこれら の任意の組み合わせ（一般には、Hart，op．cit.，Milichら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 85:1610-1614，1988;Willis，Nature 340:323-324，1989;Griffiths ら、J．Virol．65:450-456，1991を参照のこと）。さらに、Ｂ型肝炎ウイルスコ アタンパク質の単量体の非粒子形態は、ベクター構築物の投与前に、CTLのため にＴヘルプをプライムするために利用され得る。これは、実施例14Aiに示される 。 一旦、免疫原性部分が選択されると、それが非腫瘍原性であることを確実にす ることもまた一般に好ましい。これは、例えば、短縮、点変異、成熟前停止コド ンの付加、またはリン酸化部位の変更を含む種々の方法によって達成され得る。 抗原またはその改変形態はまた、上記の方法を利用して腫瘍原性について試験さ れ得る。 上記のように、１つより多くの免疫原性部分が、ベクター構築物中に組み込ま れ得る。例えば、ベクター構築物は、（別々に、または１つの構築物としてのい ずれかで）HBcAg、HBeAg、HBsAgs、HBxAgの全てまたは免疫原性部分、ならびに 以下に議論されるHCV抗原の免疫原性部分を発現し得る。 タンパク質 上記の抗原の免疫原性部分は、多くの公知の様式で、産生され得る（Ellisお よびGerety，J．Med．Virol．31:54-58，1990）。これらの様式には、化学合成 （Bergotら、Applied Biosystems Peptide Synthesizer User Bulletin No．16 ，1986，Applied Biosystems，Foster City，California）、ならびに組換え系 （例えば、昆虫由来のバキュロウイルス系（Doerfler，Current Topics in Immu nology 131:51-68，1986）、哺乳動物由来の系（例えば、CHO細胞）(Bermanら、 J．Virol．63:3489-3498，1989)、酵母由来の系（McAleerら、Nature 307:178-1 80）、および原核生物の系（Burrelら、Nature 279:43-47，1979））におけるDN A発現が含まれる。 次いで、タンパク質またはペプチドは、従来の手段により精製され得、そして 細胞媒介性応答（クラスIおよびクラスII応答を含む）を誘導するために、多く の方法によって送達され得る。これらの方法は、例えば、以下のような種々の型 のアジュバントの使用を含む：ISCOMS(Morein，Immunology Letters 25:281-284 ，1990;Takahashiら、Nature 344:873-875m，1990)、リポソーム(Gergoriadisら 、Vaccine 5:145-151，1987)、脂質結合(Deresら、Nature 342:561-564，1989) 、自己細胞上でのペプチドのコーティング(Staerzら、Nature 329:449-451，198 7)、ピノソーム(Mooreら、Cell，54:777-785，1988)、ミョウバン、完全もしく は不完全フロイントアジュバント(Hartら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 8:9448-9452，1991)、または種々の他の有用なアジュバント（例えば、Allison およびByars，Vaccines 87:56-59，Cold Spring Harbor Laboratory，1987）で あって有効な非経口投与を可能にするもの（Litvinら、Advances in AIDS Vacci ne Development，Fifth Annual Meeting of the National Vaccine Development Groups for AIDS，1992年８月30日）。 あるいは、上記の免疫原性部分に対応するタンパク質またはペプチドは、腸溶 カプセルにおいて（Channockら、J．Amer．Med．Assoc．195:445-452，1966）か 、または他の適切なキャリア（例えば、胃腸放出のためのポリ(DL-ラクチド-co- グリコレート)スフィア（Eldridgeら、Proceedings of the International Conf erence on Advances in AIDS Vaccine Development，DAIDS，NIAID、米国厚生省 1991））において免疫応答を誘発するための経口投与のためにカプセル化され得 る。 免疫調節補因子 さらに、ベクター構築物はまた、αインターフェロン(Finterら、Drugs 42(5) :749-765，1991;米国特許4,892,743;米国特許第4,966,843号；WO 85/02862;Naga taら、Nature 284:316-320，1980;Famillettiら、Methods in Enz．78:387-394 ，1981;Twuら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2046-2050，1989;Faktorら、On cogene 5:867-872，1990)、βインターフェロン(Seifら、J．Virol．65:664-671 ，1991)、γインターフェロン(Radfordら、The American Society of Hepatolog y 20082015，1991;Watanabeら、PNAS 86:9456-9460，1989;Gansbacherら、Cance r Research 50:7820-7825，1990;Maioら、Can．Immunol．Immunother．30:34-42 ，1989;米国特許第4,762,791号；米国特許第4,727,138号)、G-CSF(米国特許第4, 999,291号および同第4,810,643号)、GM-CSF(WO 85/04188)、TNF(Jayaramanら、J ．Immunolgy 144:942-951，1990)、インターロイキン２（IL-2）(Karupiahら、J ．Immunology 144:290-298，1990;Weberら、J．Exp．Med．166:1716-1733，1987 ;Gansbacherら、J．Exp．Med．172:1217-1224，1990;米国特許第4,738,927号)、 IL-4(Tepperら、Cell 57:503-512，1989;Golumbekら、Science 254:713-716，19 91；米国特許第5,017,691号)、IL-6(Brakenhofら、J． Immunol．139:4116-4121，1987;WO 90/06370)、ICAM-I(Altmanら、Nature 338: 512-514，1989)、ICAM-2、LFA-1、LFA-3、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、 β2-ミクログロビン、シャペロン、CD3、B7、MHC連結トランスポータータンパク 質、またはそのアナログ（Powisら、Nature 354:528-531，1991）のような免疫 調節補因子を同時発現し得る。 どの免疫調節補因子をベクター構築物内に含ませるかの選択は、補因子の公知 の治療効果に基づき得るか、または実験的に決定し得る。例えば、慢性のＢ型肝 炎感染において、αインターフェロンは、患者の免疫学的欠損を補うのに有効で あり、それにより疾患からの回復を補助することが見出されている。あるいは、 適切な免疫調節補因子が、実験的に決定され得る。簡単には、血液サンプルが、 まず肝疾患の患者から採取される。末梢血リンパ球（PBL）は、肝炎抗原の免疫 原性部分の発現を指向するベクター構築物および免疫調節補因子で形質導入され た自己またはHLA適合細胞（例えば、EBV形質転換細胞）でインビトロで再刺激さ れる。次いで、これらの刺激されたPBLは、HLA適合形質導入細胞を標的として使 用するCTLアッセイにおけるエフェクターとして使用される。HLA適合刺激因子お よび抗原のみをコードするベクターで形質導入される標的細胞を使用して行われ る同じアッセイにおいて観察されるものに対するCTL応答における増大は、有用 な免疫調節補因子を示す。本発明の１つの実施態様において、免疫調節補因子γ インターフェロンは、特に好ましい。 免疫調節補因子の別の例は、B7同時刺激因子である。簡単には、Ｔ細胞の全機 能活性の活性化は、２つのシグナルを必要とする。１つのシグナルは、抗原特異 的Ｔ細胞レセプターの、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合するペプチド との相互作用によって提供される。そして、第二のシグナルは、同時刺激と呼ば れ、抗原提示細胞によってＴ細胞に送達される。第二のシグナルは、Ｔ細胞によ るインターロイキン２（IL-2）産生に必要とされ、そして抗原提示細胞上のB7分 子のＴリンパ球上のCD28およびCTLA-4レセプターとの相互作用に関与するようで ある（Linsleyら、J．Exp．Med．173:721-730，1991a、およびJ．Exp．Med．174 :561-570，1991）。本発明の１つの実施態様において、B7は、細胞中に導入され 、CD8+Ｔ細胞をプライムする効率的な抗原提示細胞を生成し得る。これらのCD 8+Ｔ細胞は、B7を発現しない細胞を殺傷し得る。なぜなら、同時刺激は、もはや さらなるCTL機能には必要ではないからである。同時刺激B7因子および、例えば 、免疫原性HBVコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書中に記載 される方法を利用して作製され得る。これらのベクターで形質導入された細胞は 、より効率的な抗原提示細胞になる。HBVコア特異的CTL応答は、完全に活性化さ れたCD8+Ｔ細胞から同時刺激リガンドB7を介して増大される。特に好ましい実施 態様は、実施例6Ciおよび6Ciiに示される。 本発明の１つの局面において、１つ以上の免疫調節補因子が、ベクター構築物 中に含められ、そしてそれによって同時発現され（るかまたは別々に投与され） 、TH1とTH2媒介性応答との間のバランスをシフトさせる。簡単には、そのサイト カイン分泌パターンに基づいて、Ｔヘルパー細胞が２つの相互に排他的なセット （Ｔヘルパー１(TH1)またはＴヘルパー２(TH2)として知られる）に分割される。 TH1細胞は、IL-2、IL-12、IL-15、γ-IFN、およびTNFβを分泌し、Ｂ細胞が分化 するのを助け、そしてIgG2aを分泌し、そしてCTLが増殖するのを助ける。TH2細 胞は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、およびIL-10を分泌し、そしてＢ細胞が分化す るのを助け、そしてIgEまたはIgG1を分泌する。本発明の特に好ましい実施態様 において、TH1とTH2との間のバランスをシフトさせることが望ましい。以下によ り詳細に記載されるように、これは、TH1サイトカイン遺伝子（例えば、IL-2、I L-12、IL-15、γ-IFN、またはTNFβ遺伝子）を、（本明細書中に記載されるＢ型 肝炎抗原またはＣ型肝炎抗原をコードする１つ以上の遺伝子とともに）標的細胞 中に導入し、そしてそれによりTH1媒介性CTL応答に対する免疫応答をシフトする ことによって達成され得る。特に好ましい実施態様は、実施例6Eに示される。 上記の免疫調節補因子をコードする分子は、種々の供給源から得られ得る。例 えば、これらの配列を含むプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン(ATCC，Rockville，Maryland)のような寄託機関から入手可能であるか、ま たはBritish Bio-technology Limited（Cowley，Oxford England）のような商業 的供給源から入手可能である。代表的な例には、BBG 12（127アミノ酸の成熟タ ンパク質をコードするGM-CSF遺伝子を含む）、BBG6（γインターフェロンをコー ドする配列を含む）、ATCC番号39656（TNFをコードする配列を含む）、ATCC番号 20663（αインターフェロンをコードする配列を含む）、ATCC番号31902、31902 、および39517（βインターフェロンをコードする配列を含む）、ATCC番号39405 、39452、39516、39626、および39673（インターロイキン２をコードする配列を 含む）、ATCC番号57592（インターロイキン４をコードする配列を含む）、およ びATCC番号67153（インターロイキン６をコードする配列を含む）が含まれる。 同様に、免疫調節補因子をコードする配列は、これらの補因子をコードする配 列を発現または含有する細胞から容易に得られ得る。簡単には、１つの実施態様 において、プライマーは、所望の配列のいずれかの側で調製される。これは、続 いて、PCRによって増幅される（米国特許第4,683,202号、米国特許第4,683,195 号、および米国特許第4,800,159号を参照のこと）（PCR Technology:Principle and Applications for DNA Amplification，Erlich（編）、Stockton Press，19 89もまた参照のこと）。特に、二本鎖DNAは、熱安定性Taqポリメラーゼ、配列特 異的DNAプライマー、ATP、CTP、GTP、およびTTPの存在下で加熱することによっ て変性される。二本鎖DNAは、合成が完了したときに産生される。このサイクル は、多数回反復され得、所望のDNAの階乗増幅を生じる。 免疫調節補因子をコードする配列はまた、例えば、Applied Biosystems Inc.D NA合成機（例えば、ABI DNA合成機モデル392（Foster City，California））で 合成され得る。このような配列はまた、相補的末端を介して一緒に連結され得、 その後PCR増幅されて（Vent polymerase，New England Biomedical，Beverly，M assachusetts）、長い二本鎖DNA分子を形成し得る(Foguetら、Biotechniques 13 :674-675，1992)。 本発明の別の実施態様において、ベクター構築物は、別の因子の存在下で致死 的である（となる）遺伝子を発現するために調製され得る。例えば、HSV-1チミ ジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞は、ガンシクロビルに対して感受性になるが 、正常細胞は影響されない。従って、ベクター構築物は、単純ヘルペスウイルス （HSV-1）チミジンキナーゼ遺伝子のような遺伝子を発現するために調製され得 る（一般には、WO95/14091を参照のこと）。従って、治療遺伝子がベクター構築 物の投与後に患者において発現される時間の長さは、ガンシクロビルの投与によ って制限され得る。代表的なベクター構築物は、以下の実施例5Kにより詳細に記 載される。 ベクター構築物 一旦、免疫原性部分（および、所望であれば、免疫調節補因子）が選択される と、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、その発現を指向するベクター構 築物中に置かれる。一般に、このようなベクターは、これらの遺伝子のみをコー ドし、選択マーカーをコードしない。特定の抗原および免疫調節補因子をコード し、そしてその発現を導くベクターは、当業者によって容易に構築され得る。適 切なベクターの代表的な例には、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベ クター、および広範な種々の他のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含ま れる。 １．レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築 本発明の１つの局面において、目的の抗原の選択された免疫原性部分を有する かまたは発現するように構築されたレトロウイルスベクター構築物が提供される 。多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが、本発明の状況内で利用され得る 。このような遺伝子送達ビヒクルは、例えば、以下を含む： 本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、広範な種々のレトロウイルス （例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤ型レトロウイルス、ならびにスプマウイルス（spum avirus）およびレンチウイルスを含む）から容易に構築され得る（RNA Tumor Vi ruses、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，1985を参照のこと)。簡単に は、ウイルスは、しばしば、電子顕微鏡下で観察されるその形態にしたがって分 類される。「Ｂ」型レトロウイルスは、偏心性のコアを有するようであり、一方 「Ｃ」型レトロウイルスは、中心のコアを有する。Ｄ型レトロウイルスは、Ｂ型 レトロウイルスとＣ型レトロウイルスの中間の形態を有する。適切なレトロウイ ルスの代表的な例には、以下の図17A、B、およびCに示すもの（第2〜7頁のRNA腫 瘍ウイルスを参照のこと）、ならびに種々の異種栄養性レトロウイルス（例えば 、NZB-X1、NXB-X2、およびNZB9-1(O'Neillら、J．Vir．53:100-106，1985を参照 のこと)）、およびポリトロピック（polytropic）レトロウイルス(例えば、MCF およびMCF-MLV（Kellyら、J.Vlr．45(1):291-298，1983を参照のこと)）が含ま れる。このようなレトロウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション （「ATCC」；Rockville，Maryland）のような寄託機関またはコレクションから 容易に得られ得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から 単離され得る。 本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの調製または構築のために特に好 ましいレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白 血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導（Mink-Cell Focus-Inducing）ウイル ス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスから なる群から選択されるレトロウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイル スには、4070Aおよび1504A(HartleyおよびRowe，J．Virol．19:19-25，1976)、A belson(ATCC番号VR-999)、Friend(ATCC番号VR-245)、Graffi、Gross(ATCC番号VR -590)、Kirsten、Harvey肉腫ウイルス、およびRauscher(ATCC番号VR-998)、なら びにモロニーマウス白血病ウイルス（ATCC番号VR-190）が含まれる。特に好まし いラウス肉腫ウイルスには、Bratislava、Bryan高力価（例えば、ATCC番号VR-33 4、VR-657、VR-726、VR-659、およびVR-728）、Bryan標準、Carr-Zilber、Engel breth-Holm、Harrls、Prague（例えば、ATCC番号VR-772および45033）、ならび にSchmidt-Ruppin（例えば、ATCC番号VR-724、VR-725、VR-354）が含まれる。 任意の上記のレトロウイルスは、本明細書中に提供される開示および標準的な 組換え技術（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989;Kunkle，PNAS 82:488，1 985）を考慮すると、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルをアセンブリまたは構 築するために容易に利用され得る。さらに、本発明の特定の実施態様において、 レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得 る。例えば、本発明の１つの実施態様において、レトロベクターLTRはマウス肉 腫ウイルスに、tRNA結合部位はラウス肉腫ウイルスに、パッケージングシグナル はマウス白血病ウイルスに、そして第二鎖合成の起点はトリ白血病ウイルスに由 来し得る。 本発明の１つの局面において、5'LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナ ル、１つ以上の異種配列、第二鎖DNA合成の起点、および3’LTRを含むレトロベ クター構築物が提供される。ここで、ベクター構築物は、gag/polまたはenvコー ド配列を欠失する。簡単には、長末端反復配列（「LTR」）は、３つのエレメン トに分割され、U5、R、およびU3と命名される。これらのエレメントは、レトロ ウイルスの生物学的活性を担う種々のシグナル（例えば、U3内に配置されるプロ モーターおよびエンハンサーエレメントを含む）を含む。LTRは、ゲノムのいず れかの末端での、その正確な重複のためにプロウイルスにおいて容易に同定され 得る。本明細書中で利用される場合、5'LTRは、ベクターのDNA形態の逆転写およ び組み込みを可能にする5'プロモーターエレメントおよび十分なLTR配列を含む ことが理解されるべきである。3'LTRは、ポリアデニル化シグナル、ならびにベ クターのDNA形態の逆転写および組み込みを可能にするのに十分なLTR配列を含む ことが理解されるべきである。 tRNA結合部位および第二鎖DNA合成の起点はまた、レトロウイルスが生物学的 に活性であるために重要であり、そして当業者によって容易に同定され得る。例 えば、レトロウイルスtRNAは、ワトソン-クリック塩基対合によってtRNA結合部 位に結合し、そしてレトロウイルスゲノムによってウイルス粒子中に運ばれる。 次いで、tRNAは、逆転写酵素によるDNA合成のプライマーとして利用される。tRN A結合部位は、5’LTRから直ぐ下流のその位置に基づいて容易に同定され得る。 同様に、第二鎖DNA合成の起点は、その名称が意味するように、レトロウイルス の第二鎖DNA合成に重要である。この領域は、ポリプリントラクトとしても言及 されるが、3’LTRの直ぐ上流に位置する。 5'および3’LTR、tRNA結合部位、および第二鎖DNA合成の起点に加えて、本明 細書中に提供される特定の好ましいレトロベクター構築物はまた、パッケージン グシグナル、ならびに１つ以上の異種配列を含み、これらの各々が以下により詳 細に議論される。 本発明の１つの局面において、gag/polおよびenvコード配列の両方を欠失する レトロベクター構築物が提供される。本明細書中で利用される場合、句「gag/po lまたはenvコード配列を欠失する」は、レトロベクターが、gag/polまたはenv遺 伝子に、特にレトロベクター構築物のためのパッケージング細胞株を構築するた めに使用されるgag/polまたはenv発現カセットに見出される少なくとも20、好ま しくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも10、そして最も好ましくは少な くとも８の連続するヌクレオチドを含まないことを意味すると理解されるべきで ある。 本発明の他の局面において、5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル 、第二鎖DNA合成の起点、および3’LTRを含むレトロベクター構築物が提供され る。ここで、レトロベクター構築物は、5’LTRの上流のレトロウイルス核酸配列 を含まない。本発明の状況内で利用される場合、句「5’LTRの上流のレトロウイ ルス核酸配列を含まない」は、レトロベクターが、レトロウイルスにおいて、そ してより詳細にはレトロベクター構築物に相同であるレトロウイルスにおいて見 出される少なくとも20、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも10 、そして最も好ましくは少なくとも８の連続するヌクレオチドを含まないことを 意味すると理解されるべきである。好ましい実施態様において、レトロベクター 構築物は、5’LTRの上流のenvコード配列を含まない。 本発明のさらなる局面において、5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグ ナル、第二鎖DNA合成の起点、および3’LTRを含むレトロベクター構築物が提供 される。ここで、レトロベクター構築物は、3’LTRの下流のレトロウイルスパッ ケージングシグナル配列を含まない。本明細書中で使用される場合、用語「パッ ケージングシグナル配列」は、RNAゲノムのパッケージングを可能にするのに十 分な配列を意味すると理解されるべきである。 上記のレトロベクター構築物との使用のために適切なパッケージング細胞株は 、容易に調製され得（米国特許第08/437,465号を参照のこと；米国特許第07/800 ,921号もまた参照のこと）、そして組換えベクター粒子の産生のためのプロデュ ーサー細胞株（ベクター細胞株または「VCL」をも呼ばれる）を作製するために 使 用され得る。 ２．アルファウイルスベクター 本発明の他の実施態様において、アルファウイルスベクター、または真核生物 層化ベクター開始系が、目的の抗原の免疫原性部分を温血動物に送達するために 使用され得る。このようなベクターの代表的な例は、米国特許出願第08/405,827 号および同第08/628,594号に記載される。 代表的な目的のみのために、Sindbisウイルス（これは、Togavirusファミリー のアルファウイルス属の原型メンバーである）が議論される。簡単には、Sindbi sウイルスのセグメント化されていないゲノムRNA（49S RNA）は、長さが約11,70 3ヌクレオチドであり、5'キャップおよび3'ポリアデニル化テールを含み、そし て陽性の極性を示す。感染性のエンベロープ化Sindblsウイルスは、ウイルスヌ クレオキャプシドタンパク質の細胞質中でのウイルスゲノムRNA上へのアセンブ リ、およびウイルスコード糖タンパク質で包埋される細胞膜を通しての発芽によ って産生される。ウイルスの細胞への進入は、クラスリンコートピットを介する エンドサイトーシス、ウイルス膜のエンドソームでの融合、ヌクレオキャプシド の放出、およびウイルスゲノムの非コート化による。ウイルス複製の間に、ゲノ ム49S RNAは、相補ネガティブ鎖の合成のための鋳型として作用する。このネガ ティブ鎖は、次いで、ゲノムRNAおよび内部的に開始される26SサブゲノムRNAの 鋳型として作用する。Sindbisウイルス非構造タンパク質は、ゲノムRNAから翻訳 され、一方構造タンパク質は、サブゲノム26S RNAから翻訳される。全てのウイ ルス遺伝子は、ポリタンパク質として発現され、そして翻訳後タンパク質切断に よって個々のタンパク質にプロセスされる。非構造コード領域内にパッケージン グ配列残基は存在し、それゆえ、ゲノム49S RNAのみが、ビリオンにパッケージ ングされる。 いくつかの異なるSindbisベクター系が構築され得、そして本発明において使 用され得る。このような系の代表的な例には、米国特許第5,091,309号および同 第5,217,879号に記載されるものが含まれる。 本発明における使用のための特定の代表的なアルファウイルスベクターは、米 国特許第08/405,827号において記載されるものが含まれる。簡単には、１つの実 施態様において、Sindbisウイルスの転写を開始し得る5'配列、Sindbis非構造タ ンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス結合領域、およびSindbis RN Aポリメラーゼ認識配列を含むSindbisベクター構築物が提供される。他の実施態 様において、ウイルス結合領域は、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が低 減されるように改変されている。別の実施態様において、Sindbisウイルスの転 写を開始し得る5'配列、Sindbis非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配 列、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が防止されるように不活化されてい る第一のウイルス結合領域、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が低減され るように改変されている第二のウイルス結合領域、およびSindbis RNAポリメラ ーゼ認識配列を含むSindbisベクター構築物が提供される。なお別の実施態様に おいて、cDNAからのウイルスRNAの合成を開始し得る5'プロモーターおよび転写 終結を制御する3'配列に加えて、上記のベクター構築物を含むSindbis cDNAベク ター構築物が提供される。 なおさらなる実施態様において、上記のベクター構築物は、Sindbis構造タン パク質をベクター構築物中に含まず、選択された異種配列は、ウイルス結合領域 から下流に位置され得；第二のウイルス結合領域を有する上記のベクター構築物 中で、選択された異種配列は、異種配列が下流に位置される第二のウイルス結合 領域から下流に位置され得、ベクター構築物は、ウイルス結合領域と上記異種配 列との間に位置するポリリンカーを含み得、そして好ましくはポリリンカーは、 野生型Sindbisウイルス制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含まない。 上記のSindbisベクター構築物、および多くの類似のベクター構築物は、本質 的に米国特許第08/198,450号（本明細書中でその全体が参考として援用される） に記載されるように容易に調製され得る。 ３．他のウイルス遺伝子送達ビヒクル レトロウイルスベクターおよびアルファウイルスベクターに加えて、多くの他 のウイルスベクター系はまた、本発明の状況内で利用され得る。このような遺伝 子送達ビヒクルの代表的な例には、ポリオウイルス（Evansら、Nature 339:385- 388，1989;およびSabin，J．Biol．Standardization 1:115-118，1973）；ライ ノウイルス；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイルスまたはワク シニアウイルス）（Fisher-Hochら、PNAS 86:317-321，1989;Flexnerら、Ann.N. Y．Acad．Sci．569:86-103，1989;Flexnerら、Vaccine 8:17-21，1990;米国特許 第4,603,112号、同第4,769,330号、および同第5,017,487号；WO 89/01973）；SV 40(Mulliganら、Nature 277:108-114，1979)；インフルエンザウイルス(Luytjes ら、Cell 59:1107-1113，1989;McMichealら、N．Eng．J．Med．309:13-17，1983 ;およびYapら、Nature 273:238-239，1978)；アデノウイルス(Berkner，Biotech niques 6:616-627，1988;Rosenfeldら、Science 252:431-434，1991;WO93/9191; Kollsら、PNAS 91(1):215-219，1994;Kass-Eislerら、PNAS 90(24):11498-502， 1993;Guzmanら、Circulation 88(6):2838-48，1993;Guzmanら、Cir．Re．73(6): 1202-1207，1993;Zabnerら、Cell 75(2):207-216，1993;Liら、Hum．Gene Ther ．4(4):403-409，1993;Caillaudら、Eur．J．Neurosci．5(10):1287-1291，1993 ;Vincentら、Nat．Genet.5(2):130-134，1993;Jaffeら、Nat．Genet．1(5):372- 378，1992;およびLevreroら、Gene 101(2):195-202，1991);アデノウイルス随伴 ウイルスのようなパルボウイルス（Samulsklら、J．Vir．63:3822-3828，1989； Mendelsonら、Virol．166:154-165，1988;PA7/222,684;Flotteら、PNAS 90(22): 10613-10617，1993);ヘルペス（Kit，Adv．Exp．Med．Biol．215:219-236，1989 ;米国特許第5,288,641号）；SV40;HIV(Poznansky，J．Virol．65:532-536，1991 );麻疹(EP 0 440,219);アストロウイルス(MunroeS.S.ら、J．Vir．67:3611-3614 ，1993);およびコロナウイルス、ならびに他のウイルス系（例えば、EP 0,440,2 19；WO 92/06693;米国特許第5,166,057号）が含まれる。さらに、ウイルスキャ リアは、同種の、非病原性（欠損）の、複製可能なウイルス（例えば、Overbaug hら、Science 239:906-910，1988）であり得、そしてそれにも関わらず、CTLを 含む細胞性免疫応答を誘導し得る。１つの特定の好ましい実施態様において、遺 伝子送達ビヒクルは、真核生物層化ベクター開始系であり得る（米国特許第08/4 04,796号または同第08/405,827号を参照のこと）。 4.非ウイルス遺伝子送達ビヒクル 上記のウイルスベースベクターに加えて、多数の非ウイルス遺伝子送達ビヒク ルが、本発明の状況内で同様に利用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルの 代表例としては、核酸発現ベクターの直接的送達、裸のDNA単独(WO 90/11092)、 殺されたアデノウイルスに連結されるかまたは連結されないポリカチオン濃縮DN A(Curielら，Hum.Gene Ther．3:147-154，1992)、上記の高親和性ペアを有する かまたは有さないリガンドに連結されたDNAリガンド(Wuら，J．of Biol.Chem 26 4:16985-16987，1989)、および特定の真核生物細胞（例えば、プロデューサー細 胞-米国特許第07/800,921号、および第08/437,465号を参照のこと）が挙げられ る。 投与 上記のように、本発明は温血動物内で細胞内感染を処置するための方法を提供 し、それには温血動物に、細胞内病原体に由来する少なくとも１つの免疫原部分 の発現を導くベクター構築物を投与し、そしてまた温血動物へ上述の抗原の免疫 原部分を含むタンパク質を投与する工程を含み、その結果免疫応答が生成される 。簡単には、ベクター構築物を投与する方法は、インビボでの送達、またはエキ ソビボでの送達のいずれかを導くことによって容易に達成され得る。適切な方法 の代表例としては、例えば、皮内（「i.d.」）、頭蓋内（「i.c.」）、腹腔内（ 「i.p.」）、くも膜下内（「i.t.」）、静脈内（「i.v.」）、皮下（「s.c.」） 、筋肉内（「i.m」）が挙げられる。他の方法としては、例えば、種々の物理的 方法（例えば、リポフェクション(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 84:741 3-7417，1989)；直接DNA注入（Acsadiら，Nature 352;815-818，1991）；微粒子 銃(Williamsら，PNAS 88:2726-2730，1991)；リポソーム(Wangら，PNAS 84;7851 -7855,1987)；CaPO4(Dubenskyら，PNAS 81:7529-7533,1984)；DNAリガンド(Wuら ，J.Biol.Chem．264:16985-16987，1989)；またはさらに核酸の直接投与(Curiel ら，Human Gene and Therapy 3:147-154，1992)）による細胞のトランスフェク ションが挙げられる。 本発明の特定の好ましい実施態様において、目的の抗原（単数または複数）の 免疫原部分を含むタンパク質は、ベクター構築物の投与前に投与される。簡単に は、下記により詳細に記載されるように、インビボで存在する抗原の量は、高レ ベルのThプライミングを引き出すには不十分でり得る。従って、特定の実施態様 において、抗原の合成免疫原部分は、ベクター構築物（例えば、レトロウイルス ベクター）の投与の前にThプライミングを増強するために投与され得る。 本発明の特定の好ましい実施態様において、温血動物（例えば、ヒト）からの 血液は、動物中に存在するTヘルパー応答のレベルを決定するためにアッセイさ れる。この様なアッセイを達成するための代表的な方法は、Maruyamaら，J.Clin ical Invest 91:2586-2595,1993、Maruyamaら，Gastro 105:1141-1151，1993に 、より詳細に記載されている。 組成物 本発明の好ましい実施態様において、細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１ つの免疫原部分の発現を導くベクター構築物、その抗原の免疫原部分を含むタン パク質、および必要に応じて薬学的受容可能なキャリアまたｈ希釈剤を含む組成 物が提供される。上記のように、広範な種々のベクター構築物が、例えば組み換 えレトロウイルス、またはパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアルフ ァウイルスからなる群より選択される組み換えウイルスを含む本発明の状況にお いて利用され得る。 そのような組成物は、液体溶液としてか、または投与前に溶液に懸濁される固 体形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで調製され得る。さらに、組成物 は、注射、経口投与、または直腸投与のいずれかのために適切なキャリアまたは 希釈剤を用いて調製され得る。一般的に、ベクター構築物が組み換えウイルスで ある場合、ウイルスは、処方の前に、0.25％〜25％の範囲で、そして好ましくは 約５％〜20％の範囲の濃度で調製される。次いで、組成物の調製後、組換えウイ ルスは、用量あたり約１μｇの材料、そして同時精製夾雑物としてこの量の約10 倍の材料(10μｇ)で構成される。好ましくは、組成物は、下記のように、処方さ れる水性溶液の0.1〜1.0mlにおいて調製される。 本発明の特定の実施態様において、本明細書中で提供される組成物は、アジュ バントとともに処方され得る。適切なアジュバントの代表例は、MF-59、水酸化 アルミニウム（「Alumn」）、MAP(Multiple Antigen Peptides)などが含まれる 。 薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、使用される投与量および濃度で レシピエントに非毒性である。注射可能な溶液のキャリアまたは希釈剤の代表例 は、水、好ましくは生理学的pHで緩衝化される等張性生理食塩水溶液（リン酸緩 衝化生理食塩水またはTris緩衝化生理食塩水のような）、マンニトール、ブドウ 糖、グリセロール、およびエタノール、ならびにヒト血清アルブミンのようなポ リペプチドまたはタンパク質が含まれる。特に好ましい組成物は、10mg/mlマン ニトール、1mg/ml HSA、20mM Tris，pH7.2、および150mM NaClにおいてベクター または組み換えベクターを含む。この場合、組換えウイルスは、材料の約１μｇ を示すので、１％未満の高分子量材料、および全体材料（水を含む）の1/100,00 0未満であり得る。この組成物は、-70℃で少なくとも６ヶ月間安定である。組成 物はまた、静脈内(i.v.)または皮下(s.c.)へ注射され得るが、一般的には筋肉内 (i.m.)に注射されることが好ましい。通常使用される個々の用量は、107〜109c. f.u.(HT1080細胞で力価測定されたネオマイシン耐性のコロニー形成単位)である 。これらは、１〜４週間の間隔で、最初は３または４の用量で投与される。追加 抗原注射は、６〜12ヶ月後、そしてその後は毎年、１または２の用量で与えられ 得る。 経口処方物はまた、セルロース、ラクトース、マンニトール、ポリ(DL-ラクチ ド-co-グリコール酸)スフェア、および／またはデンプンのような炭水化物のよ うなキャリアまたは希釈剤とともに用いられ得る。組成物は、例えば、錠剤、ゲ ルカプセル、ピル、溶液、または懸濁液の形態で服用され得、そしてさらに持続 放出のために処方され得る。直腸投与について、坐薬の調製は、ポリアルキレン グルコース、またはトリグリセリドのような伝統的なキャリアとともに達成され 得る。 上記のように、ベクター構築物は、肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原部分に 、加えて、免疫調節補因子を直接発現し得る。しかし、ベクター構築物がサイト カインである免疫調節補因子を発現しない場合、このサイトカインは上記の組成 物を含み得るか、または上記組成物と別々に（同時または引き続いて）投与され 得る。簡単には、このような実施態様において、免疫調節補因子は、好ましくは 標 準的プロトコールおよびThe Physician's Desk Referenceに指示されるような投 与量に従って投与される。例えば、αインターフェロンは、２〜４ヶ月間100万 〜500万単位／kg体重の投薬量で、IL-2は、２〜12週間10,000〜100,000単位／kg 体重で、１〜３回／日の投薬量で投与され得る。γインターフェロンは、150,00 0〜1,500,000単位、２〜３回／週で、１〜12週間の投薬量で投与され得る。 以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されない。 実施例 実施例１ HBV E/コア配列の単離 Ｂ型肝炎ウイルスの完全なプレコア／コアコード領域を含む1.8Kb BamHIフラ グメントをプラスミドpAM6(ATCC番号45020)から得、そしてKS II+(Stratagene， La Jolla，California)のBamHI部位へ連結する。このプラスミドを、KSII+HBpc/ cと称する（図１）。XhoIリンカーを、KSII+HBpc/c中のプレコア／コアのStuI部 位へ（ヌクレオチド配列1704で）付加し、次いでHincIIで（ヌクレオチド配列25 92で)切断する。得られた877塩基対のXhoI-HincIIプレコア／コアフラグメント を、SKII+のXhoI/HincII部位へクローン化する。このプラスミドを、SK+HBeと称 する（図１）。 実施例２ PCRを用いた配列の調製 Ａ．PCR を用いたHBV e/コア配列の部位特異的変異誘発 プラスミドKSII+HBpc/c中のプレコア／コア遺伝子を配列決定して、プレコア ／コアコード領域が正しいか否かを決定する。この配列は、コドン84および85で ２つの連続的なインフレームでのTAG終止コドンを生じるコドン79でのフレーム シフトを生じる単一の塩基対欠失を有することが見出された（図２）。この欠失 は、プラスミドSK+HBe中のプレコア／コアコーディング領域のPCRオーバーラッ プ伸長によって補正される(Hoら，Gene 77:51-59，1989)。４つのオリゴヌクレ オチドプライマーを、正確な欠失を行う３つのPCR反応のために使用する。 最初の反応はテンプレートとしておよび２つのプライマーとしてプラスミドKS II+HB pc/cを利用する。センスプライマー配列は、adw株のヌクレオチド配列185 5〜1827に対応し、そして5'末端で２つのXhoI制限部位を含む。ヌクレオチド配 列のナンバリングは、Genbank(Intelligenics，Inc.，Mountain View，Californ ia)から入手した。 第２のプライマー配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのadw株のアンチセンスヌクレオ チド配列2158〜2130に対応し、そしてコドン79、84、および85を含む。 第２の反応はまた、テンプレートとしてプラスミドKS II+HBpc/cおよび２つの プライマーを利用する。センスプライマーは、adw株のヌクレオチド配列2130〜2 158に対応し、そしてコドン79、84、および85を含む。 第２のプライマーはSK+プラスミドポリリンカー由来のアンチセンスヌクレオ チド配列に対応し、HBVプレコア／コアコーディング領域の終止コドンの135bp下 流のClaI部位を含む。 第３の反応はまた、第１および第２のPCR反応の２つのプライマーおよび産物 を利用する。センスプライマーはadw株のヌクレオチド配列５〜27に対応し、そ して5'末端に２つのXhoI制限部位を含む。 第２のプライマー配列は、SK+プラスミドポリリンカーのアンチセンスヌクレ オチド配列に対応し、HBVプレコア／コアコーディング領域の終止コドンの135bp 下流のClaI部位を含む。 第１のPCR反応は、アンチセンス鎖における欠失を補正し、そして第２の反応 は、センス鎖における欠失を補正する。PCR反応１および２は、コドン79におい て生じるCCからCCAへの変異、およびコドン81におけるTCAからTCTへの塩基対置 換を補正する（図２を参照のこと）。プライマー１は、HBV eコーディング領域 のATGコドンの10bp上流の２つの連続するXhoI部位を含み、そしてプライマー４ はHBVプレコア／コアコーディング領域の終止コドンの135bp下流のClaI部位を含 む。第１および第２のPCR反応の産物を第３のPCR反応において伸長して、正しい 配列を有する完全なHBVプレコア／コアコーディング領域を作製する（図３）。 PCR反応を、以下のサイクル条件を用いて行う：サンプルをまず94℃で2分間加 熱する。融解工程といわれるこの工程は、合成のために二本鎖DNAを一本鎖に分 離する。次いで、サンプルを56℃で30秒間加熱する。アニーリング工程といわれ るこの工程は、プライマーが第１の工程において作製された一本鎖DNAへのアニ ールするのを可能にする。次いで、サンプルを72℃で30秒加熱する。伸長工程と いわれるこの工程は、第１の工程で作製された一本鎖DNAの相補鎖を合成する。 第二の融解工程を、94℃30秒で行い、続いて56℃で30秒アニーリング工程を行い 、続いて72℃30秒で伸長工程を行う。次いでこの手順を35サイクル繰り返し、所 望のDNA産物の増幅を生じる。 PCR反応産物をゲル電気泳動で精製し、そしてNA45濾紙(Schleicher and Schue ll，Keene，New Hampshier)上へ移す。所望の787bp DNAフラグメントを、400μ ｌの高塩濃度緩衝液(1.5M NaCl、20mM Tris，pH8.0、および0.1mM EDTA)におい て65℃で30分間インキュベートすることによってNA45濾紙から溶出する。溶出の 後、500μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1)を溶 液へ添加する。混合物をボルテックスし、次いでBrinkmann Eppendorf遠心機(54 15L)において14,000rpmで5分間遠心分離する。所望のDNAフラグメントを含む水 相を、1.5mlの微量遠心管に移し、1.0mlの100％EtOHを添加する。溶液を、ドラ イアイス上で５分間インキュベートし、次いで10,000rpmで20分間遠心分離する 。上清をデカントし、そして沈殿を500μｌの70％EtOHで洗浄する。沈殿を、Sav ant Speed-Vacコンセントレーターにおいて真空下の10,000rpmでの遠心分離によ っ て乾燥し、次いで10μｌの脱イオンH2Oに再懸濁する。１μｌのPCR産物を、1.5 ％アガロースゲル電気泳動によって分析する。787 XhoI-ClaIプレコア／コアPCR 増幅フラグメントをSK+プラスミドのXhoI-ClaI部位へクローン化する。このプラ スミドを、SK+HBe-cと称する。E.coli(DH5α、Bethesda Research Labs，Gaithe rs burg，Maryland)をSK+HBe-cプラスミドで形質転換し、増殖してプラスミドDN Aを作製する。次いで、本質的にBirnboimら(Nuc．Acid Res．7:1513，1979;Mole cular Cloning:A Laboratory Manual，Sambrookら（編），Cold Spring Harbor Press，1989)もまた参照のこと）に記載のように、プラスミドを単離し、そして 精製する。SK+HBe-cプラスミドを分析して、プレコア／コア遺伝子の配列を確認 する（図４）。 Ｂ．HBV コア配列の単離 プラスミドSK+HBeにおける１塩基対欠失を、実施例2Aに記載のように、PCRオ ーバーラップ伸長法によって補正する。４つのオリゴヌクレオチドプライマーを PCR反応実施のために用いて、変異を補正する。 第１の反応は、テンプレートとしてのプラスミドKSII+HBpc/cおよび２つのプ ライマーを利用する。センスプライマーは、SK+HBeプラスミドのT-7プロモータ ーについてのヌクレオチド配列に対応する。 第２のプライマーは、adw株のアンチセンス配列2158〜2130に対応し、そして コドン79、84、および85を含む。 第２の反応は、テンプレートとしてのプラスミドKSII+HBpc/cおよび２つのプ ライマーを利用する。アンチセンスプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在する T-3プロモーターについてのヌクレオチド配列に対応する。 第２のプライマーは、adw株のセンスヌクレオチド配列2130〜2158に対応し、 そしてコドン79、84、および85を含む。 第３の反応は、２つのプライマーならびに第１および第２のPCR反応の産物を 利用する。アンチセンスプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在するT-3プロモ ーターについてのヌクレオチド配列に対応する。 第２のプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在するT-7プロモーターのセンス 配列に対応する。 第３の反応からのPCR産物は、HBVプレコア／コアコーディング領域について正 しい配列を生じる。 HBVコアコーディング領域を単離するために、プライマーを、コアコーディン グ領域のATG開始コドンの上流にXhoI部位を導入し、そしてHBVプレコア／コア領 域の29アミノ酸リーダー配列を除去するように設計する。第４の反応において、 HBVコアコーディング領域を、第３の反応からのPCR産物および以下の２つのプロ ーブを用いて作製する。 センスプライマーは、adw株のヌクレオチド配列1885〜1905に対応し、そして5 '末端で２つのXhoI部位を含む。 第２のプライマーは、SK+HBeプラスミドに存在するT-3プロモーターについて のアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。第４のPCR反応からの約600bp PCR 産物は、HBVコアコーディング領域、ならびに5'末端に新規のXhoI制限部位、お よび3'末端にSK+HBeプラスミドのマルチクローニング部位に存在するClaI制限部 位を含む。 第４のPCR反応の後、溶液を新しい1.5ml微量遠心管に移す。15μｌの３M酢酸 ナトリウムをこの溶液へ添加し、次いで500μｌのクロロホルム：イソアミルア ルコール(24:1)を添加する。混合物をボルテックスし、次いで14,000rpmで５分 間遠心分離する。水相を新しい微量遠心管に移し、そして1.0ml 100％EtOHを添 加する。この溶液を、-20℃で4.5時間インキュベートし、次いで10,000rpmで20 分間遠心分離する。上清をデカントし、そして沈殿を500μｌの70％EtOHで洗浄 する。ペレットを真空下の10,000rpmでの遠心分離によって乾燥し、次いで10μ ｌの脱イオンH2Oに再懸濁する。１μｌのPCR産物を、1.5％アガロースゲルにお ける電気泳動によって分析する。 Ｃ．HCV コア配列の単離 血清の200μｌサンプルを、慢性非Ａ非Ｂ肝炎を有する患者から入手し、ウイ ルスRNAをCristianoら，Hepatology 14:51-55，1991の手順によって調製する。2 00μｌの血清を、4.2Mイソチオシアン酸グアニジン(Fluka Chemical Corp.，St. Louis，Missouri)、0.5％ラウリルサルコシン酸(sarkosate)ナトリウム、および 25mM Tris HCL，pH8.0を含む550μｌの抽出緩衝液と混合し、そしてフェノール ：クロロホルム(1:1)で１度、およびクロロホルムで１度抽出する。水相を、等 量のイソプロピルアルコールおよび14,000rpmで５分間の遠心分離で沈殿させる 。ウイルスRNAを含む得られた沈殿を70％エタノールで洗浄し、そして200μｌの RNaseを含まない脱イオンH2Oに再懸濁する。４μｌのRNasin(40,000U/ml)(Prome ga Corp.，Madison，Wisconsin)を混合物に添加する。この混合物はHCV RNAを含 み、そして以下の逆転写反応のテンプレートである。cDNA CYCLEキット(Invitro gen，San Diego，California)を用いて、全長第１鎖cDNAを、単離されたウイル スmRNAから作製する。７μｌの上記の逆転写反応物(100ngの全長第１鎖cDNA)を 、10μｌの10×PCR緩衝液(バイアルC16)、２μｌの25mM dNTP(バイアルC11)、5 ％のDMSO、4UのTaq DNAポリメラーゼ(Cetus，Los Angeles，California)、およ び２lMの各２つのプライマーを含む全量100μｌの反応混合物中でPCRによって増 幅する。 センスプライマーは、ヌクレオチド配列316〜335に対応し、そしてC型肝炎ウ イルスコアオープンリーディングフレームの5'領域のヌクレオチド配列であり、 そしてATG開始コドンを含む。 第２のプライマーは、C型肝炎ウイルスエンベロープオープンリーディングフ レームに存在するアンチセンスヌクレオチド配列1172〜1153に対応する。 反応混合物を、PCR Gene AMP System 9600（Perkin-Elmer，Cetus，Los An geles，California）に配置する。PCRプログラムは、反応容器の温度を、最初95 ℃で１分間、次いで60℃で２分間、そして最後は72℃にて２分間で、調節する。 このサイクルを、40回くり返す。40回目のサイクルの後、最終サイクルを、反応 容器を95℃で１分間、次いで67℃で２分間、そして最後は72℃にて７分間で、調 節する。 第１のPCR反応において、ATG開始コドンから上流の、5'領域からHCV E1オープ ンリーディングフレームの始まりまでのHCVコアオープンリーディングフレーム を、増幅する。ヌクレオチドナンバリング配列は、HCV-J株に従う（Katoら、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 87：9524-9528，1990）。 第１のPCR反応からの産物を、第２のPCR反応で増幅する。第２のPCR増幅を、 ヌクレオチド配列329〜367に対応する（およびC型肝炎ウイルスコアオープンリ ーディングフレームの5'末端のヌクレオチド配列である）センスプライマーを用 いて行う。センスプライマーの5'末端は、２つの連続したXho I制限部位を含む 。このプライマーはまた、翻訳開始の適切な規則を確実にするために、イニシエ ーターATG開始コドンの領域に導入される多数のヌクレオチド変化を含む（Kozak ，Mol．Biol．196：947-950，1987）。 アンチセンスプライマーを、HCVコア遺伝子とインフレームで２つの連続した 終止コドンを含むように設計する。プライマーの5'末端は、２つの連続したHind III制限部位を含む。このプライマーは、ヌクレオチド配列902〜860に対応し、 そしてC型肝炎ウイルスコアとE1オープンリーディングフレームとの間の結合点 である。 次いで、TA Cloning Kit（Invitrogen，San Diago，Calfornia）を用いて、第 ２の反応からの570bpのPCR増幅産物をpCR IIベクター（Invitrogen，San Diego ，California）に連結し、そして凍結したコンピテントE．coli細胞に形質転換 する。DNA配列決定による確認の後、この構築物を、pCR II Xh-H HCVコアと称す 。 第１のPCR反応からの産物をまた、三次PCR反応において増幅する。センスプラ イマーの5'末端は、２つの連続したHind III制限部位を含む。このプライマーは また、翻訳開始のKozak規則を確認するために、ヌクレオチド変化を含み、そし てHCV-J配列のヌクレオチド配列329〜367に対応する（およびC型肝炎ウイルスコ アオープンリーディングフレームの5'末端のヌクレオチド配列である）。 アンチセンスプライマーを、HCVコア遺伝子とインフレームで２つの終止コド ン、およびプライマーの5'末端に２つの連続したXho I制限部位を含むように設 計する。このプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列902〜860に対応し、 そしてC型肝炎ウイルスコアとE1リーディングフレームとの間の結合点である。 上記のように、第３の反応からの570bp PCR増幅産物を、pCR IIベクターに連 結する。DNA配列決定による確認の後、この構築物を、pCR II H-Xh HCVコアと称 する。 D．HCV NS3/NS4 配列の単離 C型肝炎ウイルスNS3/NS4配列を、慢性非Ａ、非Ｂ型肝炎に罹患した患者から得 た200μｌの血清から、実施例2Cに記載されるように単離する。ウイルスRNAを、 CDNA CYCLE Kit（Invitrogen，San Diego，California）により逆転写し、そし てPCRにより増幅する。第１のPCR反応において、HCV NS3/NS4オープンリーディ ングフレームを増幅する。 第１のPCR増幅を、２つのプライマーで行う。センスプライマーは、C型肝炎ウ イルスNS2オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列3088〜3106に対応 する。 第２のプライマーは、C型肝炎ウイルスNS5オープンリーディングフレームのア ンチセンスヌクレオチド配列6530-6511に対応する。 第１のPCR反応からの産物を、第２のPCR反応において増幅する。センスプライ マーの5'末端は、２つの連続したXho I制限部位を含む。このプライマーはまた 、翻訳開始のためのKozak規則を確認するために、ヌクレオチド変化を含み、そ してHCV-J配列のNS3オープンリーディングフレームの5'領域のヌクレオチド配列 3348〜3385に対応する。 このプライマーは、HCV-J配列のNS4オープンリーディングフレームの3'領域の ヌクレオチド配列6368〜6328に対応する。このプライマーは、HCV NS4 NS4遺伝 子をインフレームでの２つの連続した終止コドン、ならびにその5'末端に２つの 連続したHind III部位を含む。 第２のPCR反応からの3020bp PCR産物を、pCR IIプラスミドに連結し、DNA配列 決定によって確認し、そしてpCR II Xh-H HCV NS3/NS4と称する。 E．免疫調節補因子IL-2の増幅 Jurkat細胞を、T75フラスコ中で、158mlの最終容量まで、１×106細胞/mlで再 懸濁した。植物性凝集素（PHA；Sigma，St．Louis，MO）を、１％の全容量まで 添加し（1.58ml全量）、37℃、5％CO2で、一晩インキュベートする。次の日に、 細胞を３つの50mlの遠心チューブ（Corning，Corning，NY）に採取する。３つの ペレットを、50mlのPBS中で合わせ、3,000rpmで5分間遠心分離し、そして上清を デカントする。この手順をくり返す。Poly A+mRNAを、Micro-Fast Track mRNA I solation Kit，バージョン1.2（Invitrogen，San Diego，California）を用いて 単離する。この単離したインタクトなmRNAを、テンプレートとして使用し、以下 のプライマーを用いてcDNA CYCLEキットによって全長の一次鎖cDNAを生成する。 このオリゴヌクレオチドは、IL-2 mRNAの終止コドンの25塩基対下流のアンチ センスヌクレオチド配列に対応する。 逆転写反応からの産物を、２つの別々の反応で増幅する。第１のPCR増幅を、A TG開始コドンの３bp上流に対応するセンスプライマーを用いて行う。このプライ マーは、その5'末端にHind III部位を含み、およびATG開始コドンを含むIL-2オ ープンリーディングフレームの5'領域を含む。 アンチセンスプライマーは、IL-2オープンリーディングフレームの3'領域に相 補的であり、TGA終止コドンの３bp下流から始まる。このプライマーは、プライ マーの5'末端にXho I部位を含む。 第１のPCR反応からの467bpのPCR産物を、pCR IIプラスミドに連結し、DNA配列 決定により確認し、そしてpCR II H-Xh IL-2と称する。 逆転写反応からの産物を、第２のPCR反応で増幅する。第２のPCR増幅を、ATG 開始コドンの３bp上流に対応するセンスプライマーを用いて行う。このプライマ ーは、5'末端にXho I部位、およびATG開始コドンを含むIL-2オープンリーディン グフレームの5'領域を含む。 アンチセンスプライマーは、IL-2オープンリーディングフレームの3'領域に相 補的であり、そしてTGA終止コドンの３bp下流から始まる。このプライマーは、 プライマーの5'末端にApa I部位を含む。 第２のPCR反応からの467bpのPCR産物を、pCR IIプラスミドに連結し、DNA配列 決定により確認し、そして凍結したコンピテントE．coli細胞に形質転換する。 このベクター構築物を、pCR II Xh-A IL-2と称する。 F．免疫調節補因子B7の増幅 Raji細胞を、５つのT75フラスコ中で、全容量158mlまで、１×106細胞/mlで再 懸濁し、そして37℃、５％CO2で一晩インキュベートする。次の日に、細胞を３ つの50ml遠心チューブに採取する。細胞ペレットを、50mlのPBS中で合わせ、2,0 00rpmで10分間遠心分離し、そして上清をデカントする。この手順をくり返す。P oly A+mRNAを、実施例E2に記載されるように単離する。単離したインタクトなmR NAをテンプレートとして使用し、cDNA CYCLEキットを用いて全長の一次鎖cDNAを 生成し、続いて２つの別々のPCR増幅反応を、プライマーとして１μｇのオリゴd T（バイアルC5）を用いることを除いて、本質的に実施例2Eに記載されるように 行う。ヌクレオチドナンバリングシステムは、Freemanら（J．Immunol．143：27 14-2722，1989）から得られる。 第１のPCR増幅を、２つのプライマーを用いて行う。センスプライマーは、B7 のヌクレオチド配列315〜353に対応する。このプライマーは、ATG開始コドンを 含むB7オープンリーディングフレームの5'領域を含み、および5'末端に２つのHi nd III制限部位を有する。 第２のプライマーは、B7のアンチセンスヌクレオチド配列1187〜1149に対応す る。このプライマーは、TAA終止コドンで終結するB7オープンリーディングフレ ームの3'領域に相補的であり、そして5'末端に２つのXho I制限部位を含む。 第１のPCR反応からの868bp PCR産物を、pCR IIプラスミドに連結し、DNA配列 決定により確認し、そして凍結したコンピテントE．coli細胞に形質転換する。 このベクター構築物を、PCR II H-Xh-B7と称し、そしてDNA配列決定により確認 する。 第２のPCR増幅を、２つのプライマーを用いて行う。センスプライマーは、B7 のヌクレオチド配列315〜353に対応する。このプライマーは、ATG開始コドンを 含むB7オープンリーディングフレームの5'領域を含み、そしてその5'末端に２つ のXho I部位を有する。 第２のプライマーは、B7のアンチセンスヌクレオチド配列1187〜1149に対応す る。このプライマーは、TAA終止コドンで終結するB7オープンリーディングフレ ームの3'領域に相補的であり、そして5'末端に２つのApa I制限部位を含む。 第２のPCR反応からの868bpのPCR産物を、pCR IIプラスミドに連結し、DNA配列 決定により確認し、そして凍結したコンピテントE．coli細胞に形質転換する。 このベクター構築物をpCR II Xh-A-B7と称し、そしてDNA配列決定により確認す る。 G．免疫調節補因子GM-CSFの合成 GM-CSFの合成を、FoguetおよびLubbert（Biotechniques 13：674-675，1992） のプロトコルに従って行う。簡単には、10の重なったオリゴヌクレオチド、53〜 106のヌクレオチド長を合成する。第１のオリゴヌクレオチドは、5'末端に２つ のHind III部位を含むヌクレオチド配列番号29〜86の、ヒトGM-CSFのセンス配列 である。 第２のオリゴヌクレオチド配列は、5'末端に２つのXho I部位を含むヌクレオ チド配列番号29〜86の、ヒトGM-CSFのセンス配列である。 第３のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列番号145〜70の、ヒトGM-CSF のアンチセンス配列である。 第４のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号131〜191の、ヒトGM-CSFのセ ンス配列である。 第５のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号282〜176の、ヒトGM-CSFのア ンチセンス配列である。 第６のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号265〜346の、ヒトGM-CSFのセ ンス配列である。 第７のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号389〜331の、ヒトGM-CSFのア ンチセンス配列である。 第８のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号372〜431の、ヒトGM-CSFのセ ンス配列である。 第９のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号520〜416の、ヒトGM-CSFのア ンチセンス配列であり、そして5'末端に２つのXho I制限部位を含む。 第10のオリゴヌクレオチドは、5'末端にXho I制限部位の代わりに２つのXba I 制限部位を含むことを除いて、オリゴヌクレオチド番号９と同一である。 配列番号29、36、37、および47のオリゴヌクレオチドを除く全てのオリゴヌク レオチドを、リン酸化する。連結を、８pmolの各オリゴヌクレオチドと7.5μｌ の10×Sequenase Buffer（US Biochemical，Cleveland，Ohio）とを、滅菌蒸留 脱イオンH2Oで75μｌの最終容量まで混和することによって行う。反応を70℃で ５分間、続いて48℃で５分間加熱する。２μｌのdNTPミックス（2.5mMの各dNTP ）および10U Sequenaseを添加し、そして37℃で30分間インキユベートする。Seq uenaseを不活性化するために、連結反応物を70℃で10分間加熱する（Current Pr otocols in Molecular Biology，F.M．Asubelら、8.2.8-8.2.13，1988）。 １μｌの連結混合物を、Ventポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly， Massachusetts）、およびプライマーとして２つのオリゴヌクレオチド配列番号2 9および36とともに、PCR反応で使用する。PCR産物をpCR IIベクター中に連結し 、そして凍結したコンピテントE．coli細胞中に形質転換する。この構築物をpCR II H-Xh GM-CSFと称し、そしてDNA配列決定により確認する。 １μｌの連結混合物を、Ventポリメラーゼとともに、プライマーとして２つの オリゴヌクレオチド配列番号47および37を用いて、第２のPCR反応で使用した。P CR産物をpCR IIベクター中に連結し、そして凍結したコンピテントE．coli細胞 中に形質転換する。この構築物をpCR II Xh-Xb GM-CSFと称し、そしてDNA配列決 定により確認する。 H．HBV Pre-S2 オープンリーディングフレームの単離 Pre-S2オープンリーディングフレーム（Ｓを含む）を、２つのプライマー、お よびテンプレートとしてpAM 6プラスミド（ATCC番号45020）を用いて、PCR増幅 する。センスプライマーは、B型肝炎ウイルスのadw株のヌクレオチド3178〜31に 対応し、そしてPre-S2オープンリーディングフレームの5'領域およびATG開始コ ドンを含む。このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho I制限部位を含む 。 第２のプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列907〜859に対応し、そし てPre-S2オープンリーディングフレームの3'領域に相補的である。このプライマ ーの5'末端は、２つのCla I部位を含む。 957bpのPCR産物をpCR IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そ してpCR II HB-Pre-S2と称する。 Ｉ．HBV ポリメラーゼオープンリーディングフレームの単離 PCR増幅を、２つのプライマー、およびテンプレートとしてpAM 6プラスミド（ ATCC 40202）を用いて行う。センスプライマーはB型肝炎ウイルスのadw株のヌク レオチド2309〜2370に対応し、そして翻訳のためにKozak規則を確認するための ヌクレオチド変化を有するポリメラーゼオープンリーディングフレームの5'領域 を含む。このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho I制限部位を含む。 第２のプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列1645〜1594に対応し、そ してポリメラーゼオープンリーディングフレームの3'領域に相補的であり、そし てTGA終止コドンを含む。このプライマーの5'末端は、２つのCla I部位を含む。 2564bpのPCR産物を、pCR IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、 そしてpCR II HB-polと称する。 Ｊ．HBV ORF5 オープンリーディングフレームの単離 PCR増幅を、２っのプラィマー、およびテンプレートとしてpAM 6プラスミド（ ATCC 45020）を用いて行う。センスプライマーはB型肝炎ウイルスのadw株のヌク レオチド1432〜1482に対応し、そして翻訳のためにKozak規則を確認するための ヌクレオチド変化を有するORF5オープンリーディングフレームの5'領域を含む。 このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho I制限部位を含む。 第２のプライマーは、アンチセンスヌクレオチド配列1697〜1648に対応し、そ して5'末端に２つのCla I部位を含む。このプライマーは、ORF5オープンリーデ ィングフレームの3'領域に相補的であり、そしてTAA終止コドンを含む。 293bpのPCR産物をpCR IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そ してpCR II HB-ORF5と称する。 Ｋ．HBV ORF 6 オープンリーディングフレームの単離 PCR増幅を、２つのプライマー、およびテンプレートとしてpAM6プラスミド（A TCC 45020）を用いて行う。センスプライマーはB型肝炎ウイルスのadw株のヌク レオチド1844〜1788に対応し、そして翻訳のためにKozak規則を確認するための ヌクレオチドの変化を有するORF 6オープンリーディングフレームの5'領域を含 む。このプライマーの5'末端は、２つの連続したXho I制限部位を含む。 第２のプライマーはアンチセンスヌクレオチド配列1188〜1240に対応し、そし て5'末端に２つのCla I部位を含む。このプライマーは、ORF6オープンリーディ ングフレームの3'領域に相補的であり、そしてTAA終止コドンを含む。 687bpのPCR産物をpCR IIプラスミドに連結し、DNA配列決定により確認し、そ してpCR II HB-ORF 6と称する。 Ｌ．EMC IRES の単離 脳心筋炎ウイルス由来のIRESを、pCITE-2a(+)プラスミド（Novagen，Madison ，WI)から、２つのプライマーを用いて、PCRによって増幅する。Acc I制限エン ドヌクレアーゼ部位を含むセンスプライマーのヌクレオチド配列は以下である： Cla I制限エンドヌクレアーゼ部位を含むアンチセンスプライマーのヌクレオチ ド配列は以下である： この500塩基対のPCR生成物を、1.5％アガロースゲルを通す電気泳動によって 精製し、そして実施例5Bに記載のようにGene Clean II(Bio 101，Vista，CA)に よって精製する。 Ｍ．IL-12 p40 サブユニットの単離 正常な非感染ヒト末梢血単核球(PBMC)を、Staphylococcal aureasを用いて活 性化する。刺激したPBMC由来のRNAを抽出し、そしてIL-12 p40サブユニットヌク レオチド配列を、実施例2Cに記載のようにPCRによって増幅する。 センスプライマーは、IL-12のオープンリーディングフレームのp40サブユニッ トの5'領域におけるヌクレオチドに対応し、そしてさらに5'末端にBgl II制限エ ンドヌクレアーゼ部位を含む。このプライマーのヌクレオチド配列は以下である ： 第２のセンスプライマーは、IL-12のオープンリーディングフレームのp40サブ ユニットのアンチセンス配列3'領域に対応し、そしてさらに5'末端にHpa I制限 エンドヌクレアーゼ部位を含む。このプライマーのヌクレオチド配列は以下であ る： このPCR反応の生成物は、IL-12のp40サブユニットをコードするBgl II-Hpa I1 140bpのフラグメントである。 Ｎ．IL-12 p35 サブユニットの単離 正常な非感染PBMCを、Staphylococcal aureasを用いて活性化する。刺激したP BMC由来のRNAを抽出し、そしてIL-12 p35サブユニットヌクレオチド配列を、実 施例2Cに記載のようにPCRによって増幅する。センスプライマーは、IL-12のオー プンリーディングフレームのp35サブユニットの5'領域におけるヌクレオチドに 対応する。このプライマーのヌクレオチド配列は以下である： 第２のセンスプライマーは、IL-12のオープンリーディングフレームのp35サブ ユニットのアンチセンス配列3'領域に対応する。このプライマーのヌクレオチド 配列は以下である： 次いで、TAクローニングキット(Invitrogen，San Diego，CA)を用いて、PCR増 幅生成物を、PCR IIベクター(Invitrogen，San Diego，CA)中に連結し、そして 凍結したコンピテントE．coli細胞中に形質転換する。DNA配列決定による検証後 、この構築物をPCR II p35と命名する。 Ｏ．F HB コア/neoRを産生するための部位特異的変異誘発 HBVコアとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子との間に融合を有す る構築物を生成するために、PCRオーバーラップ伸長を用いた。ここでHBコアの 終止コドンを欠失させ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのオープンリー ディングフレームの11番目のアミノ酸と、フレーム中で融合させている。KT-HBc プラスミドを鋳型として使用し、加えて４つのオリゴヌクレオチドプライマーを 、誘導HBコア-neoR構築物を生成するように実施する３つのPCR反応のために使用 する。 第１の反応は２つのプライマーを利用する。センスプライマー配列は、HBコア 遺伝子の5'末端でのXho I制限部位に対応する。 第２のプライマー配列は、アンチセンスヌクレオチド配列2457〜2441、および コドン11〜17をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の23塩 基対に対応する。 第２の反応はまた、鋳型としてのKT-HBcプラスミドおよび２つのプライマーを 利用する。センスプライマーは、ヌクレオチド配列2440〜2457、およびコドン11 〜17をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の23塩基対に対 応する。 第２のプライマーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のアンチ センスヌクレオチド配列に対応する。 第１および第２のPCR反応の生成物を、第３の反応において伸長し、F HBコア- neoR構築物を生成する。２つのプライマーをまた、第３の反応において利用する 。センスプライマーは、HBコア遺伝子の5'末端でのXho I制限部位に対応する。 第２のプライマー配列は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のア ンチセンスヌクレオチド配列に対応する。 第３の反応からのPCR生成物は、融合HBコア/neoR構築物を生成する。PCR反応 後、溶液を新しい1.5mlの微量遠沈管に移す。50マイクロリットルの３Ｍ酢酸ナ トリウム、続いて500μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）を 、 この溶液に添加する。混合物をボルテックスし、次いで14,000rpmにて５分間遠 心分離する。水相を新しい微量遠心管に移し、1.0ml 100％ EtOHを添加する。こ の溶液を-20℃にて4.5時間インキュベートし、次いで10,000rpmにて20分間遠心 分離する。上清をデカントし、そしてペレットを500μｌの70％ EtOHでリンスす る。ペレットを、減圧下10,000rpmでの遠心分離によって乾燥させ、次いで10μ ｌの脱イオン化H2O中に再懸濁する。１マイクロリットルのPCR生成物を、1.0％ アガロースゲル中での電気泳動によって分析する。 このPCR生成物（約1.05kb長）を、Xho IおよびPst I制限エンドヌクレアーゼ で消化し、1.0％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてDNAをGeneclean II (Bio 101，Vista，California)によってゲル切片から精製する。このXho I-Pst I PCR生成物を、pBluescript KS+II(Stratgene，La Jolla，Califormia)のそれ ぞれの部位中に挿入する。この構築物を、KSII+Xh-Pst HB Fコア-neoRと命名し 、そしてDNA配列決定によって検証する。 実施例３ Ａ．HBV X 抗原の単離 Ｂ型肝炎ウイルスＸオープンリーディングフレームを含む642bpのNco I-Taq I フラグメントを、pAM6プラスミド(adw)(ATCC 45020)から得、クレノウフラグメ ントによって平滑末端化し、そしてSK+(Stratagene，La Jolla，California)のH inc II部位中に連結する。 E．coli(DH5α、Bethesda Research Labs，Gaithersburg，Maryland)を、連結 反応で形質転換し、そして増殖させる。次いで、ミニプレップDNAを、Birnboim ら（Nuc.Acid Res.7:1513，1979;Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Sam brookら（編）、Cold Spring Harbor Press，1989）によって本質的に記載され るように単離し、そして精製する。 このフラグメントは、いずれの方向でも挿入され得るので、SK+マルチクロー ニング部位において、Xho IおよびCla I部位に関してセンス方向を有するクロー ンを選択する。より詳細には、ミニプレップDNAを診断用制限酵素Bam HIで消化 する。正しい方向の挿入物は、3.0Kbおよび0.6Kbのサイズの２つのフラグメント を生成する。不正確な方向の挿入物は、3.6KBおよび0.74Kbの２つのフラグメン トを生成する。正確な方向のクローンを選択し、そしてSK-X Agと命名する。 Ｂ．HBV X 抗原の短縮化 短縮型Ｘ抗原を生成するために、TAGを、Nhe I（ナンセンスコドン）リンカー （NEB#1060，New England BioLabs，Beverly，Massachusetts）を介して挿入す る。このリンカーは、３つすべてのリーディングフレームにおけるナンセンスコ ドンを提供する。 SK-XAgを、プラスミドを線状化するStu Iで切断する(ヌクレオチド1704)。第 １に、Nhe I（ナンセンスコドン）リンカーを、最初に以下の反応においてリン 酸化する。OD260 1.0のリンカーを、100μｌ（10mM Tris-HCl(pH7.6)、１mM EDT A）中に溶解する。１マイクロリットルのリンカー(1.0〜2.0)を、１μｌの１0× 緩衝液（0.66M Tris-HCl(pH7.6)，10mM ATP，10mMスペルミジン、0.1M MgCl2、1 50mM DTT，２mg/ml BSA）、６μｌのH2O、および２ＵのT4 DNAキナーゼと混合し 、そして37℃にて１時間インキュベートする。次いで、この反応混合物を、10単 位のT4 DNAリガーゼを有する10μｌの上記の緩衝液中で、0.4μｇの線状化SK XA gプラスミド(実施例3A)に添加する。反応を22℃にて６時間インキュベートし、 そして１μｌの0.5M EDTAを用いて停止する。次いで、反応物をフェノール：ク ロロホルム（１：１の比）で抽出し、そしてDNAをエタノールで沈殿させる。DNA を、室温にて５分間、14,000rpmでの遠心分離によって回収する。次いで、ペレ ットを乾燥させ、そして90μｌのTE（10mM Tris-HCl(pH7.6)，１mM EDTA)中に溶 解する。10マイクロリットルの10×NeB2緩衝液(New England Biolabs，Beverly ，Massachusetts)をDNAに添加し、次いで20ＵのNhe Iで消化する。プラスミドを 、1.0％アガロースゲルによって過剰のリンカーから精製し、そしてGeneclean I I(Bio 101，Vista，California)によって単離する。 DNAを自己連結し、そしてコンピテントE．coli上に形質転換する。次いで、診 断用制限部位Nhe Iの存在についてスクリーニングし；これらのクローンは短縮 型Ｘ遺伝子を含む。クローンを選択し、そしてSK-TXAgと命名する。実施例４ ベクター構築物バックボーンの調製 Ａ．レトロウイルスバックボーンKT-3の調製 N2ベクター由来のgag配列を含むモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)5'長末 端反復(LTR)EcoR I-EcoR Iフラグメント(Armentanoら、J．Vir．61:1647-1650， 1987;Eglitasら、Science 230:1395-1398，1985)を、プラスミドSK+（Stratagen e，La Jolla，Califormia）中に連結する。得られる構築物をN2R5と命名する。N 2R5構築物を、部位特異的インビトロ変異原性によって変異させ、ATG開始コドン を、gag発現を妨げるATTに変換する。この変異誘発したフラグメントは、200bp 長であり、そしてPst I制限部位に隣接する。Pst I-Pst I変異フラグメントを、 SK+プラスミドから精製し、そしてプラスミドpCU31中のN2 MoMLV 5’LTRのPst I 部位中に挿入し、非変異の200bpのフラグメントと置換する。プラスミドpCU31を 、pUC19(Stratagene，La Jolla，California)から誘導し、ここでさらなる制限 部位Xho I、Bgl II、BssH II、およびNco Iを、ポリリンカーのEcoR Ｉ部位とSa c I部位との間に挿入する。この構築物を、pCU31/N2R5gMと命名する。 N2由来の1.0KbのMoMLV 3'LTR EcoR I-EcoR Iフラグメントを、N2R3-と命名し た構築物を生じるプラスミドSK+中にクローン化する。1.0KbのCla I-Hind IIIフ ラグメントを、この構築物から精製する。 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40初期プロ モーターを含む、pAFVXMレトロウイルスベクター（Krieglerら、Cell 38:483，1 984;St．Louisら、PNAS 85:3150-3154，1988）由来のCla I-Cla I優性選択マー カー遺伝子フラグメントを、SK+プラスミド中にクローン化する。この構築物を 、SK+SV2-neoと命名する。1.3KbのCla I-BstB I遺伝子フラグメントを、SK+SV2- neoプラスミドから精製する。 KT-3レトロウイルスベクターを、３つの部分の連結によって構築する。ここで 、目的の遺伝子を含むXho I-Cla Iフラグメント、および1.0KbのMoMLV3’LTR Cl a I-Hind IIIフラグメントを、pUC31/N2R5gMプラスミドのXho I-Hind III部位中 に挿入する。次いで、pAFVXMレトロウイルスベクター由来の1.3KbのCla I-BstB Ineo遺伝子フラグメントを、このプラスミドのCla I部位中にセンス方向で挿入 す る。 Ｂ．レトロウイルスバックボーンKT-1の調製 KT-1レトロウイルスバックボーンベクターを、優性選択マーカー遺伝子neoを 発現ベクター中に挿入しないことを除いて、本質的に実施例4AのKT-3について記 載されるように構築する。詳細には、３つの部分の連結において、目的の遺伝子 を含むXho I-Cla Iフラグメンドおよび1.0KbのMoMLV 3'LTR Cla I-Hind IIIフラ グメントを、pUC31/N2R5gMプラスミドのXho I-Hind III部位中に挿入する。 Ｃ．レトロウイルスバックボーンJMR-2の調製 JMR-2ベクターは、脳心筋炎ウイルスIRES（Novagen，Madison，WI）の5'末端 に隣接するKT-3のXho I部位にてXho I、Bam HI、Srf I、およびNot I制限エンド ヌクレアーゼを含むポリリンカー、ならびに脳心筋炎IRESの3'末端に隣接するCl a I、Bgl II、Age I、Hpa I、Mlu I、およびSal I制限エンドヌクレアーゼを含 むポリリンカーを有するKT-3レトロベクターを含む。 手短には、LMR-2ベクターを、実施例3Bにおいて記載されるように、KT-3バッ クボーンのXho I制限エンドヌクレアーゼ部位にてXho I、Bam HI、Srf I、Not I 、Cla I、およびSal I制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカーを挿入するこ とによって調製する。この構築物を、KT3-L1と命名し、そしてDNA配列決定によ って検証する。センス鎖およびアンチセンス鎖を、DNA合成の標準的な方法によ って合成する。センス鎖配列は以下である： アンチセンス鎖配列は以下である： これらのオリゴヌクレオチドを37℃にてアニールし、5'突出部を生成する。次 いで、これらの二本鎖リンカーを、37℃でアニールし、そして連結することによ り、Xho I消化KT-3バックボーンの互換突出部にハイブリダイズする。 脳心筋ウイルス由来のIRESを、PCR増幅生成物(実施例2C)のAcc IおよびCla I 制限エンドヌクレアーゼでの消化によって切断し、そしてKT3-L1のCla I部位中 に連結し、そしてKT3-L1-IRESと命名する。IRESの正しい方向を、AvrIIエンドヌ クレアーゼ消化を用いる分析後に決定する。次いで、Cla I、Bgl II、Age I、Hp a I、Mlu IおよびSal I制限エンドヌクレアーゼを含むマルチクローニング部位 を、KT3-L1-IRESのCla I-Sal I部位中に挿入する。得られたベクターをIMR-2と 命名する。センス鎖およびアンチセンス鎖を、DNA合成の標準的な方法によって 合成する。センス鎖配列は以下である： アンチセンス鎖配列は以下である： これらのオリゴヌクレオチドを37℃にてアニールし、5'突出を生成する。次い で、これらの二本鎖リンカーを、37℃でのアニーリング、続く連結によって、Cl a I-Sal I消化KT3-L1-IRESバックボーンの互換突出にハイブリダイズさせる。 Ｄ．CMV 発現ベクターの調製 プラスミドpSCV6（米国特許番号第07/800,921号において記載）を利用して、p CMV-HBcを生成する。手短には、pSCV6プラスミドは、CMV IEプロモーター、続い て、目的の遺伝子の挿入を可能にし、そしてSV40ポリＡシグナルで終わるポリリ ンカー部位を有するpBluescript SK-バックボーン（Stratagene，La Jolla，Cal ifornia）から誘導される。 Ｅ．アデノウイルスバックボーンの調製 アデノウイルスバックボーンpAdM1プラスミドを、Quantum Biotechnologies(M ontreal，Canada)から誘導する。Ad5ΔE1ΔE3プラスミド（Gluzmanら、Eucaryot ic Viral Vectors，187-192頁、Cold Spring Harbor，1982）もまた、Quantum B iotechnologiesから誘導する。 実施例５ ウイルスベクターおよび発現ベクターの構築 Ａ．Ｂ型肝炎ウイルスレトロウイルスベクターの構築 次いで、SK+HBe-c(実施例2A)由来の787bpのXho I-Cla Iフラグメントを、KT-3 レトロウイルスベクターバックボーンのXho IおよびCla I部位中に連結する。 この構築物をKT-HBe-cと命名する。 Ｂ．Ｂ型肝炎ウイルスコアレトロウイルスベクターの構築 実施例2B由来のPCR生成物（約600bp長）を、Xho IおよびCla I制限エンドヌク レアーゼで消化し、1.5％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてDNAを、Ge neclean II(Bio 101，Vista，California)によってゲル切片から精製する。この Xho I-Cla I HBVコアPCR生成物を、KT-3レトロウイルスベクターバックボーンの Xho IおよびCla I部位中に挿入する。構築物を、KT-HBcと命名する。 KT-HBc由来のHBVコアフラグメント(Xho I-Cla I)を、pBluescript KS+II(Stra tagene，La Jolla，California)のそれぞれの部位中に挿入する。この構築物を 、KS+II HBcと命名し、そしてDNA配列決定によって検証する。 Ｃ．Ｃ型肝炎ウイルスコアレトロウイルスベクターの構築 実施例2C由来のpCR II Xh-H HCVコア由来のXho I-Hind IIIフラグメントを、p SP72のそれぞれの部位に挿入する。この構築物を、pSP72 Xh-H HCcと命名する。 次いで、pSP72 Xh-H HCc由来のXho I-Cla Iフラグメントを切り出し、そしてKT- 3バックボーン中に挿入する。この構築物をKT-HCcと命名する。 Ｄ．Ｃ型肝炎ウイルスNS3/NS4レトロウイルスベクターの構築 実施例2DからのpCR II Xh-H HCV NS3/NS4由来のXho I-Hind IIIフラグメント を、pSP72のそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をpSP72 Xh-H HCV NS3/NS 4と命名する。次いで、pSP72 Xh-H HCV NS3/NS4由来のXho I-Cla Iフラグメント を切り出し、そしてKT-3バックボーン中に挿入する。この構築物をKT-HCV NS3/N S4と命名する。 Ｅ．Ｂ型肝炎ウイルスＸレトロウイルスベクターの構築 SK-X Ag由来のXho I-Cla Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボー ンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT-HB-Xと命名する。 Ｆ．Ｂ型肝炎ウイルス短縮型Ｘレトロウイルスベクターの構築 SK-TX Ag由来のXho I-Cla Iフラグメントを切り出し、そしてKT-3バックボー ンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT HB-TXと命名する。 Ｇ．Ｂ型肝炎ウイルスPre-S2レトロウイルスベクターの構築 実施例2HからのpCR II HB-Pre-S2由来のXho I-Cla Iフラグメントを切り出し 、そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT HB- Pre-S2と命名する。 Ｈ．Ｂ型肝炎ウイルスポリメラーゼレトロウイルスベクターの構築 実施例2IからのpCR II HB-pol由来のXho I-Cla Iフラグメントを切り出し、そ してKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT HB-pol と命名する。 Ｉ．Ｂ型肝炎ウイルスORF 5レトロウイルスベクターの構築 実施例2JからのpCR II HB-ORF5由来のXho I-Cla Iフラグメントを切り出し、 そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT HB-OR F 5と命名する。 Ｊ．Ｂ型肝炎ウイルスORF 6レトロウイルスベクターの構築 実施例2KからのpCR II HB-ORF6由来のXho I-Cla Iフラグメントを切り出し、 そしてKT-3バックボーンのそれぞれの部位中に挿入する。この構築物をKT HB-OR F 6と命名する。 Ｋ．Ｂ型肝炎ウイルスe/チミジンキナーゼレトロウイルスベクターの構築 KT-HBe-c(実施例5A)由来のXho I〜Cla I HBVeを、KT-1/HBe-cと命名されたベ クターを生じるKT-1レトロウイルスベクターバックボーン(実施例4B)のXho I/Cl a I部位中に連結する。チミジンキナーゼプロモーターによって駆動されるHSV-1 チミジンキナーゼ遺伝子を含む2.0Kb Kb Cla I/Cla Iフラグメントを、pSP72-TK /Claから誘導し、そしてセンス方向でKT-1/HBe-cのCla I/Cla I部位中に連結す る。方向を、Sma I消化によって決定する。この構築物をKT-HBe-TKと命名する。 pSP72-TK/Claを以下のように誘導する。HSV-1チミジンキナーゼプロモーター および遺伝子を含むフラグメントを、PrTKΔAから、Xho IおよびBam HI消化によ って切り出す（PrTKΔAは、PCT WO 91/02805の実施例４に記載されている）。こ のフラグメントを、実施例2Aに記載されるようにNA45紙を用いて１％アガロース ゲルから単離し、そしてpSP7プラスミドのXho IおよびBam HI部位中に挿入する 。このプラスミドをpSP72-TKと命名する。pSP72TKを、実施例3Bに記載されるよ うに、Xho Iを用いて線状化し、クレノウを用いて平滑末端化し、そしてCla Iリ ンカー（New England BioLabs，Beverly，Massachusetts）を用いて連結する。 このプラスミドを、自己連結し、そしてコンピテントE．coli上に形質転換する 。クローンを選択し、そしてpSP72-TK/Claと命名する。 Ｌ． Ｂ型肝炎ウイルスコア／チミジンキナーゼレトロウイルスベクターの構築 KT-HBc（実施例5B）由来のXhoI〜ClaI HBVコアフラグメントをKT-1レトロウイ ルスベクター骨格（実施例4B）のXhoI/ClaI部位へ連結して、KT-1/HBcと命名さ れるベクターを生じる。チミジンキナーゼプロモーターにより駆動されるHSV-1 チミジンキナーゼ遺伝子を含む2.0kb ClaI/ClaIフラグメントを、pSP72-TK/Cla から得、そしてKT-1/HBcのClaI/ClaI部位へセンス方向に連結した。この構築物 をKT-HBc/TKと命名する。 Ｍ．Ｂ型肝炎ウイルスコアCMV発現ベクターの構築 HBVコアフラグメントを、構築物KT-HBc（実施例5B）からこのプラスミドのXho IおよびClaI制限酵素での消化、および実施例2Aに記載されるようにNA45ペーパ ーを用いた１％アガロースゲルからの単離により得た。フラグメントをクレノウ で平滑末端化し、そしてプラスミドpSC6のSmaI部位に連結する。HBコア遺伝子の 方向を、EcoRI/SSpIの二重消化により決定する。このプラスミドをpCMV-HBcと命 名する。E.coli（DH5α、Bethesta Research Labs，Gaitheriburg，Maryland） をpCMV-HBcプラスミドで形質転換し、そして増殖させてプラスミドDNAを生成す る。次いで、このプラスミドDNAを、本質的にBrimboimら（Nuc.Acid Res．7:151 3、1979；「Molecular Cloning：A Laboratory Manual、」Sambrookら（編）、C old Spring Harbor Press,1989もまた参照のこと）に記載される塩化セシウムバ ンド化およびエタノール沈澱により精製する。DNAを0.9％滅菌リン酸緩衝化生理 食塩水中に、2mg/mlの最終濃度で再懸濁する。 Ｎ．Ｂ型肝炎ウイルスeアデノウイルスウイルスベクターの構築 XhoI〜ClaI HBVeフラグメントを、実施例2Aに記載されるようにXhoIおよびCla I制限酵素によるプラスミドの消化ならびに１％アガロースゲルおよびNA45ペー パー上での単離により、KT-HBe-cから得る（実施例5A）。フラグメントをクレノ ウフラグメントで平滑末端化する。アデノウイルスベクターバックボーンである pAdM1プラスミドを、BamHIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化 する。平滑末端化HBVeフラグメントをpAdM1プラスミドの平滑末端化BamHI部位に 連結する。HBVe遺伝子の方向は、EcoRI/SspO二重消化により決定する。このプラ スミドをpAdM1-HBeと命名する。 Ｏ．HB F コア/neoRレトロウイルスベクターの構築 ３つのフラグメントをHB Fコア/neoRレトロウイルスの構築のために精製する 。第一に、KT-HBc（実施例５に由来する）をClaI、PstI、およびHindIIIで消化 し、 そしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および３’LTRを含む1.6kb Pst-HindIIIフラグメントを単離する。第二に、KSII+Xh-Pst HB Fコア/neoR（実 施例２）、1.05kbのXhoI-PstIフラグメントを単離する。第三に、KT-HBcから、 ベクターバックボーンを含む4.3kb XhoI-HindIIIフラグメントを単離する。３つ の部分の連結において、HB Fコア/neoRフラグメントを含むXhoI-PstIフラグメン トおよびPstI-HindIII neo/3'LTRフラグメントを、KT-HBcのXhoI-HindIII部位に 挿入する。このベクター構築物を、KT-HB Fcore/neoRと命名する。 実施例６ 多価レトロウイルスベクターの構築 Ａ．Ｂ型肝炎e/GM-CSFレトロウイルスベクターの構築 ｉ．BIP IRESを伴う多価レトロウイルスベクター pGEM 5Z+BIP 5’（Peter Sarnow,University of Colorado，Health Sciences Center，Denver，ヒトイムノグロブリン重鎖結合タンパク質）をSacIおよびSphI で消化する。250bpのBIPフラグメントを1.5％のアガロースゲル電気泳動で単離 し、そしてpSO72のそれぞれの部位にサブクローニングする。ベクター構築物をp SP72 BIPと命名する。 HindIII-XhoI GM-CSFフラグメントを、実施例２ＧのpCR II H-XhGMOCSFから切 り出し、pSP72 BIPのHindIII-XhoI部位にサブクローニングする。この構築物を 、pSP72 BIP-GM-CSFと命名する。 構築物pSP72 BIP GM-CSFを、XhoI部位で切断して、そしてクレノウフラグメン トで平滑末端化し、続いてClaIで切断する。KT-1バックボーンを、ClaIで切断し 、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoI制限エンドヌクレア ーゼで切断する。これらの３つの部分の連結において、SK+HBe-c、実施例２由来 のXhoI-ClaIフラグメント、およびClaI平滑末端化XhoI BIP-GM-CSFフラグメント を、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI平滑末端化ClaI部位に連結する。こ の構築物を、KT-HBe-c/BIP-GM-CSFと命名する。 ii．CMVプロモーターを伴う多価レトロウイルスベクター 4.7kb CMV EnvRPst-RIフラグメントをpAF/CMV/EnvR（米国特許出願第07/395,9 32号）から単離し、そしてpUC18のPstIおよびEcoRI部位に挿入する。この構築物 をpUC18 CMV EnvRと命名する。 HIV-I IIIB CARを、pAF/CMV/EnvRからのSau3AフラグメントとしてpBluesriptI I KS+（Stratagene，La Jolla，California）のBamHI部位にサブクローニングし て、pBluescriptII KS+/CARを生成する。CARフラグメントをpBluescript II KS+ /CARからXbaI-ClaIフラグメントとして切り出す。XhoI-XbaI HIV-I IIIBgag/pol フラグメントをSK+gag/pol SDΔ（米国特許出願第07/395,932号）から切り出す 。CMVプロモーターを含むプラスミドバックボーンを、pUC18 CMV/EnvRから、Xho IおよびClaIで切り出す。３つの部分の連結において、XhoI-XbaI HIV IIIB gag- polフラグメントおよびXbaI-ClaI CARフラグメントを、pUC18 CMV/EnvRバックポ ーンのXhoI-ClaI部位に挿入しpUC18 CMVgag/pol/CARを生成する。 pUC18 CMV-gag/pol/CAR由来のCMV IEプロモーターを含むHindIII-XhoIフラグ メントをpCDNAIIIのそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物を、pC DNA II CMVと命名する。 XhoI-XbaI GM-CSF PCR産物を、実施例2GのpCRII Xh-Xb FM-CSFからサブクロー ニングし、そしてpCDNA II-CMVのそれぞれの部位に挿入する。この構築物をpCDN A II CMV-GM-CSFと命名する。 PCDNA II CMV GM-CSF構築物を、Xba I部位で切断し、クレノウフラグメントで 平滑末端化し、続いてHindIIIで切断する。KT-1バックボーンをClaIで切断し、 そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部 分の連結において、SK+HBe-c（実施例2A）からのXhoI-HindIIIフラグメントおよ びHindIII平滑末端化XbaI CMV-GM-CSFフラグメントを、KT-1レトロウイルスバッ クボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HB e-c/CMV/GM/CSFと命名する。 Ｂ．Ｃ型肝炎コア/IL-2レトロウイルスベクターの構築 i．IRESをともなう多価レトロウイルスベクター HindIII-XhoI IL-2配列を、実施例2EのpCR II H-Xh IL-2から切り出し、そし てpSP72 BIPのHindIII-XhoI部位にサブクローニングする。この構築物をpSP72 B IP IL-2と命名する。XhoI-HindIIIＣ型肝炎ウイルスコア配列（実施例2C）をpCR II Xh-H HCV C coreから切り出し、そしてpSP72のそれぞれの部位にサブクロー ニングする。この構築物を、pSP72 Xh-H HCV coreと命名する。 構築物pSP72 BIP-IL2を、XhoI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末 端化し、続いてEcoRIで切断する。XhoI-EcoRI HCV coreフラグメントをpSP72 Xh -H HCV coreから単離する。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウ フラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結におい て、XhoI-EcoRI HCVcoreフラグメントおよびEcoRI平滑末端化XhoI BIP-IL2フラ グメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連 結する。このベクター構築物を、KT-HCV core/BIP-IL2と命名する。 ii．CMVプロモーターをともなう多価レトロウイルスベクター XhoI-Apa I IL-2フラグメントを、実施例2EのpCR II Xh-A IL-2から切り出し 、そしてpCDNA II-CMVプロモーターのそれぞれの部位にサブクローニングする。 この構築物をpCDNA II CMV-IL-2と命名する。 KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化 し、続いてXhoIで切断する。構築物pCDNA II CMV-IL-2を、ApaI部位で切断し、 クレノウフラグメントで平滑末端化し、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼ で切断する。３つの部分の連結において、実施例2CからのpCRII Xh-H HCV core 由来のXhoI-HindIII HCV coreフラグメントおよびHindIII平滑末端化ApaI CMV-I L2フラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部 位に連結する。このベクター構築物を、KT-HCV core/CMV IL-2と命名する。 Ｃ．Ｂ型肝炎コア/B7レトロウイルスベクターの構築 i．IRESをともなう多価レトロウイルスベクター HindIII-XhoI B7配列を、実施例2FのpCR II H-Xh B7から切り出し、そしてpSP 72 BIPのHindIII-XhoI部位にサブクローニングした。この構築物をpSP72 H-Xh B IP-B7と命名する。 構築物pSP72 H-Xh BIP-B7をXhoI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑 末端化し、続いてClaIで切断する。XhoI-ClaI HB VcoreフラグメントをKX+IIHBc （実施例5B）から単離する。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウ フラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結におい て、XhoI-ClaI HB VcoreフラグメントおよびClaI平滑末端化XhoI BIP-B7フラグ メントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結 する。このベクター構築物を、KT-HB Vcore/BIP-B7と命名する（実施例７を参照 のこと）。 ii． CMVプロモーターをともなう多価レトロウイルスベクター XhoI-ApaI B7配列を、実施例2FのpCR II Xh-A B7から切り出し、そしてpCDNA II-CMVプロモーターのそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物をpC DNA II CMV-B7と命名する。 KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化 し、続いてXhoIで切断する。構築物pCDNA II CMV-B7を、ApaI部位で切断し、ク レノウフラグメントで平滑末端化し、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼで 切断する。３つの部分の連結において、KSII+HBc由来のXhoI-HindIII HBV core フラグメントおよびHindIII平滑末端化ApaI CMV-IL2フラグメントを、KT-1レト ロウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター 構築物を、KT-HBc/CMV B7と命名する。 Ｄ．Ｂ型肝炎e/Ｃ型肝炎コアレトロウイルスベクターの構築 i． BIP IRESをともなう多価レトロウイルスベクター HindIII-XhoI HCV core PCR産物を、pCR II H-Xh HCV core（実施例2C）にサ ブクローニングし、そしてpSP72 BIPのそれぞれの部位に挿入する。この構築物 をpSP72 H-Xh BIP-HCV coreと命名する。 構築物pSP72 BIP-HCVをXhoI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑末端 化し、続いてClaIで切断した。KT-1バックボーンをClaIで切断し、そしてクレノ ウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで切断する。３つの部分の連結にお いて、SK+HBe-c（実施例2A）由来のXhoI-ClaI HBVeフラグメントおよびClaI平滑 末端化XhoI BIP HCVコアフラグメントを、KT-1レトロウイルスバックボーンのXh oI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構築物を、KT-HBV/BIP-HCVと 命名する。 ii. CMVプロモーターをともなう多価レトロウイルスベクター pSP72 Xh-H HCV core(実施例6Bi)由来のXhoI-XbaI HCV coreフラグメントを、 pCDNA II-CMVプラスミドのそれぞれの部位に挿入する。この構築物をpCDNA II C MV HCV coreと命名する。 構築物pCDNA II CMV HCVを、XbaI部位で切断し、クレノウフラグメントで平滑 末端化し、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼで切断する。KT-1バックボー ンをClaIで切断し、そしてクレノウフラグメントで平滑末端化し、続いてXhoIで 切断する。３つの部分の連結において、SK+HBe-c(実施例2A)由来のXhoI-HindIII HBV e配列、HindIII平滑末端化XbaI CMV HCV coreフラグメントを、KT-1レトロ ウイルスバックボーンのXhoI-平滑末端化ClaI部位に連結する。このベクター構 築物を、KT-HBVe/CMV HCVコアと命名する。 Ｅ．Ｂ型肝炎ウイルスコア/IL-12レトロウイルスベクターの構築 XhoI-NotI HBV coreフラグメントをKS II+PHBc（実施例5B）から単離し、そし てJMR-2のXhoI-NotI部位にサブクローニングする。この構築物をJMR-2 HBcと命 名する。 次いで、BglII-HpaI p40PCRフラグメントをJMR-2HBcのそれぞれの部位にサブ クローニングする。この構築物をJMR-2 HBc/p40と命名する。 次いで、XhoI-NsiI p35フラグメントをpCRII p35から切り出し、そしてpCDA I I-CMV（実施例6Al）のそれぞれの部位にサブクローニングする。この構築物をpC DNA II CMV-p35と命名する。 pCDNA II CMV-p35をNsiIで切り出し、T4DNAポリメラーゼ（New England Biola bs，Beverly，MA）で平滑末端化する。NsiI平滑末端化CMV p35フラグメントを、 JMR-2 HBc/p40のSalI-平滑末端化部位に連結する。制限消化物を使用して、一つ のフラグメントのみが正しい方向に挿入されていることを確認する。このレトロ ベクター構築物をJMR-2 HBc/p40/CMV-p35と命名する。 実施例７ 組換えレトロウイルスベクターの生成 Ａ．２個のパッケージング細胞株を介するプロデューサー細胞株の生成 HX細胞（WO92/05266）を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュ で、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および10％仔ウシ血清（FBS）ととも に播種する。２日目に、培地をトランスフェクションの４時間前に、５mlの新鮮 な培地と置換する。標準的なリン酸カルシウム−DNA共沈澱を、400llの総容積中 に40.0μｌ 2.5 M CaCl2、10μｇのプラスミドDNA、および脱イオンH2Oを混合し て実施する。400マイクロリットルのDNA-CaCl2溶液を、400μｌの沈澱緩衝液（5 0mM HEPES-NaOH、pH7.1、0.25M NaClおよび1.5mM Na2HPO4-NaH2PO4）に定常的に 振盪させながら滴下する。この混合液を室温で10分間インキュベートする。得ら れた細かい沈澱を、細胞の培養培地に添加する。細胞をDNA沈殿物とともに一晩3 7℃でインキュベートする。３日目に、培地を吸い出し、そして新鮮な培地を添 加する。４日目にウイルスを含む上清を取り出し、0.45μフィルターを通して通 過させ、そしてこれを使用してDAパッケージング細胞株、マウス線維芽細胞に感 染させるか、または−80℃で保存する。 DA(WO92/05266)細胞を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュで 、10ml DMEMおよび10％ FBS、４μｇ/mlポリブレン（Sigma,St.Louis，Missouri ）中に播種する。２日目に、3.0ml、1.0,ml、および0.2mlの新鮮に回収したDX培 地を含むウイルスを細胞に添加する。細胞を、ウイルスとともに一晩37℃でイン キュベートする。３日目に、培地を除去し、そして800μｇ/ml G418を含む1.0ml DMEM、10%FBSをプレートに添加する。ベクターで形質導入され、そしてneo選択 可能マーカーを含む細胞のみが生存する。G418耐性プールを１週間かけて生成す る。このプールを記載されるように（実施例12A）発現について試験する。細胞 のプールを、プレートからの細胞を除去することおよび細胞懸濁液を計数するこ と、細胞懸濁液を10細胞/mlにまで希釈すること、および96ウェルプレート（Cor ning，Corning，NY）の各ウェルに0.1ml（１細胞/ウェル）を添加することによ り希釈クローン化する。細胞を37度で14日間、10％CO2でインキュベートする。2 4クローンを選択し、そして24ウェルプレート、６ウェルプレート、次いで10cm プレートにまで増殖し、この時点でクローンを発現についてアッセイし、そして 上清を回収し、そしてウイルス力価についてアッセイする。 パッケージング細胞株HX(WO92/05266)を、HX上清からのDA細胞の形質導入につ いて記載されるのと同様の様式で、DAベクタープロデューサ細胞株から生成され るベクターで形質導入する。 DA(WO 92/05266)細胞の多価ベクター（neo選択マーカーを欠いている）での形 質導入のために、上記の感染手順を使用する。しかし、G418を３日目に細胞に添 加することに代えて、細胞を上記で説明した限界希釈によりクローニングする。 50クローンを発現のために上記のように増殖させ、そして力価を実施例８に記載 のようにアッセイする。 Ｂ．１個のパッケージング細胞株を介するプロデューサー細胞株の生成 DA(WO 92/05266)細胞を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュで 、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および10％の放射線照射（最低2.5メガ ラド）仔ウシ血清（FBS）とともに播種する。２日目に、培地をトランスフェク ションの４時間前に、5.0mlの新鮮な培地と置換する。標準的なリン酸カルシウ ム−DNA共沈澱を、400llの総容積中に60.0μｌ 2.0M CaCl2、10μｇのMLP-Gプラ スミドDNA、10μｇのKT-HBe-cまたはKT-HBcレトロウイルスベクタープラスミド および脱イオン水を混合して実施する。400マイクロリットルのDNA-CaCl2溶液を 、400μｌの２×沈澱緩衝液（50mM HEPES-NaOH、pH7.1、0.25M NaClおよび1.5mM Na2HPO4-NaH2PO4）に定常的に振盪させながら滴下する。この混合液を室温で10 分間インキュベートする。得られた細かい沈澱を、前日にプレートしたDA細胞の 培養培地に添加する。細胞をDNA沈殿物とともに一晩37℃でインキュベートする 。３日目に、培地を吸い出し、そして新鮮な培地を添加する。４日目にＧ偽型ウ イルスを含む上清を取り出し、0.45μフィルターを通して通過させ、そしてこれ を使用してDAパッケージング細胞株感染させる。 DA(WO 92/05266)細胞を、１日目に、５×105細胞／10cm組織培養ディッシュで 、10ml DMEMおよび10％ FBS、４μｇ/mlポリブレン（Sigma,St.Louis，Missouri ）中に播種する。２日目に、2.0ml、1.0ml、および0.5mlの新鮮に回収した上清 を含むＧ偽型ウイルスを細胞に添加する。細胞を、ウイルスとともに一晩37℃で インキュベートする。３日目に、培地を除去し、そして800μｇ/ml G418を含む1 .0ml DMEM、10% 放射線照射FBSをプレートに添加する。ベクターで形質導入され 、そしてneo選択可能マーカーを含む細胞のみが生存する。G418耐性プールを１ 〜２週間の期間をかけて生成する。このプールを、実施例12Aに記載されるよう に、発現について試験する。細胞のプールを、プレートからの細胞を取り出すこ と、細胞懸濁液を計数すること、細胞懸濁液を10細胞/mlにまで希釈すること、 および96ウェルプレート（Corning，Corning，NY）の各ウェルに0.1ml（１細胞/ ウェル）を添加することにより希釈クローン化する。細胞を37℃で２週間、10％ CO2でインキュベートする。24クローンを選択し、そして24ウェルプレート、次 いで６ウェルプレート、最後に10cmプレートにまで増殖し、この時点でクローン を発現についてアッセイし、そして上清を回収し、そしてウイルス力価について アッセイする。 実施例８ レトロウイルスベクターの力価測定 Ａ．選択マーカーとともなうベクターの力価測定 個々のクローンの力価をHT1080細胞（ATCC CCL 121）の感染により決定する。 １日目に、５×105HT1080細胞を、６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェ ルに、3.0ml DMEM、10％ FBSおよび４μｇ/mlポリブレン中に播種する。２日目 に、各クローンからの上清を10倍で連続希釈し、そしてこれを使用して1.0mlア リコート中のHT1080細胞に感染させる。培地を新鮮なDMEM,10% FBS培地と置換し 、そして細胞をベクターとともに一晩、37℃、10％CO2でインキュベートする。 ３日目に、形質導入された細胞の選択は、新鮮な800μｇ/mlのG418を含むDMEM、 10％FBS培地で置換することにより実施する。細胞を37℃、10％ CO2で14日間イ ンキュベートし、この時点で、G418耐性コロニーを各希釈で計数して各クローン の ウイルス力価をコロニー形成単位/ml(cfu/ml)として決定する。 これらの手順を用いて、HBV coreおよびHBV eプロデューサー細胞株の力価が 以下であることが示され得る： DAcore-6A3 3×106cfu/ml DAcore-10 1×106cfu/ml DAHBe 4-7 3×106cfu/ml Ｂ．多価ベクターの力価測定 i．終末点希釈 多価ベクターは、ネオマイシン遺伝子のような選択マーカーを含んでいないの で、別のベクター滴定方法を以下に詳細に記載する。手短には、1.0mlのベクタ ー上清を５倍に希釈して10-9mlの最終希釈度にする。次いで、１ミリリットルの 各希釈物を使用して、５×105HT1080細胞(ATCC No．CCL121)を、本質的に、実施 例7Bで記載されるように、形質導入する。しかし、G418を添加することに代えて 、DNAを各ディッシュから７日後に、Willis（J.Biol.Chem.259:7842-7859、1984 ）に記載されるように、抽出する。HBV e/coreをPCRにより、Genset（Paris，Fr ance）から得られる以下のプライマを用いて増幅する。 HBV e/coreについてのPCR増幅を、adwクローンのヌクレオチド配列1865〜1889 に対応するセンスプライマーを用いて実施する。 このプライマーは、adwクローンのアンチセンスヌクレオチド配列2430〜2409 に対応する。 これは、所望のPCR産物の存在を確認するために使用されるプローブ配列であ り、そしてＢ型肝炎ウイルスのadw株のヌクレオチド配列1926〜1907に対応する 。 Ｃ型肝炎コアのPCR増幅は、HCV-Jクローンのヌクレオチド配列328〜342に対応 するセンスプライマーを用いて行われる。 このプライマーは、HCV-Jクローンのアンチセンスヌクレオチド配列907〜892 に対応する。 これは、所望の564bp PCR産物の存在を確認するために使用されるプローブ配 列であり、そしてHCV-Jクローンのヌクレオチド配列674〜693に対応する。 Ｃ型肝炎NS3/NS4のPCR増幅は、HCV-Jクローンのヌクレオチド配列4876〜4896 に対応するセンスプライマーを用いて行われる。 このプライマーは、HCV-Jクローンのアンチセンスヌクレオチド配列6321〜630 2に対応する。 これは、所望の1426bp PCR産物の存在を確認するために使用されるプローブ配 列であり、そしてHCV-Jクローンのヌクレオチド配列5618〜5637に対応する。 PCR産物は、適切な32P標識プローブを用いてサザンブロット分析によって分析 される（Sambrookら、Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989）。シグナルは、 低希釈物の全てにおいて予想され、そして高希釈物で徐々に減少する。シグナル が目に見える最後の希釈物は、ベクターの感染性U/mlを産生する。 ii.PCRによるレトロベクターの力価測定 PCRはまた、選択マーカーを含まないベクターの力価を測定するために利用さ れ得る。手短には、1.0mlのベクター上清を用いて、６ウェルプレート中の5×105 のHT1080細胞を形質導入する。形質導入された細胞をコンフルエンシーまで増 殖させ、そして細胞を計数する。細胞の濃度は、5×105細胞/mlに調整される。 細胞を、3000rpmで５分間、室温で遠心分離する。上清を廃棄し、そして細胞を1 mlのRIPA緩衝液（10mM Tris，pH7.4，1％ NP40，0.1％ SDS，150mM NaCl）で溶 解させる。細胞を再懸濁し、そしてエッペンドルフチューブに移す。細胞を、微 量遠心管において最大速度で、室温で10秒間遠心分離する。上清を廃棄し、そし て10μｌのプロテイナーゼＫ(10mg/ml Stratagene，La Jolla，CA)を細胞に添加 する。この混合物を60分間37℃でインキュベートする。TE（101mM Tris，pH7.6 ，1mM EDTA）をインキュベートした細胞に、1×107の核/mlの最終濃度で添加す る。この溶液を100℃で10分間煮沸する。 標準曲線を、１プロウイルスコピーのベクターを含むHT1080細胞のクローンを 用いて作製する。このポジティブコントロールのDNAを、以下のポジティブ:ネガ ティブコントロール比：100:1、3:1、1:1、1:3、および1:100でネガティブコン トロールDNA（HT1080）と混合する。約2.5μｌのサンプルDNAを反応容器に配置 する。約30μｌのH2O、５μｌの10×PCR緩衝液、４μｌ MgCl2（各々25mM）、プ ライマーDNA（100ng/μｌに分注）を含む５μｌプライマー混合物、および0.25 μｌ Amplitaq（Cetus，Los Angeles，CA）を、サンプルDNAを含有する各々の反 応容器に添加する。この混合物に1.0μｌ α 32P dCTPを添加する。この混合物 を混合し、そして47.5μｌをPCR反応のために分注する。PCRプログラムを、94℃ ２分間で開始し、 続いて26サイクルの94℃30秒間、続いて１サイクルの64℃30秒間、および最終サ イクルの72℃30秒間で行う。次いで、PCR混合物を４℃に冷却する。 約10μｌのPCR混合物を、25％グリセロール、75％ TEおよびブロモフェノール ブルーを含有する10μｌのゲルローディング緩衝液と混合し、そして１％アガロ ースゲルにロードする。電気泳動を、130ボルト30分間で１×TBE（0.045M Tris ホウ酸、0.001M EDTA，pH8.0）泳動緩衝液において行う。電気泳動の後、記載さ れるように（Sambrookら、(編)、Cold Spring Harbor Press，1989）、DNAをDur alon-UV（Stratagene，San Diego，CA）に移した。Duralon-UV膜を、トランスフ ァー装置から取り出し、Saran Wrapに包み、そしてシグナルをAmbis phosphorim ager（Ambis，San Diego，CA）を用いて定量する。各サンプルの力価値を、上記 の標準曲線と比較して決定し、そしてポジティブコントロールの％として示す。実施例９ 複製コンピテントレトロウイルスの検出 伸展したS+L-アッセイは、複製コンピテント、感染性ウイルスが、目的の細胞 株の上清に存在するかどうかを決定する。アッセイは、感染性レトロウイルスが 指示細胞株MiCl1（ATCC CCL 64.1）に病巣を産生するという経験的観察に基づく 。MiCl1細胞株は、マウス肉腫ウイルス（MSV）での形質導入によりMvILuミンク 細胞株（ATCC CCL 64）に由来する。これは、MSVゲノムの存在を示す肉腫を形成 するが（S+）、複製コンピテントウイルスの非存在を示す白血病を引き起こさな い（L-）、マウス肉腫プロウイルスを含有する非プロデューサー、非形質転換、 復帰変異体クローンである。MiCl1細胞の複製コンピテントレトロウイルスでの 感染は、MSVゲノムを「活性化」して、病巣形成を生じる「形質転換」を引き起 こす。 複製コンピテントレトロウイルスの存在を試験するために上清を細胞株から取 り出し、そしていかなる細胞をも除去するために0.45μフィルターを通過させる 。１日目に、MvILu細胞を、2mL DMEM，10％ FBSおよび８μｇ/mlポリブレン中に ６ウェルプレートのウェルあたり1×105細胞（１試験サンプルあたり１ウェル） で播種する。MvILu細胞を、別の６ウェルプレートに、同じ様式でポジティブお よ びネガティブコントロールについてプレーティングする。細胞を37℃、10％CO2 で一晩インキュベートする。２日目に、1.0mlの試験上清をMv1Lu細胞に添加する 。ネガティブコントロールプレートを、1.0mlの培地とともにインキュベートす る。ポジティブコントロールは、MAウイルス(Millerら、Molec．and Cell．Biol ．5:431-437，1985)の３つの希釈物（1.0ml培地中に各々200病巣形成ユニット、 (ffu)、20ffuおよび２ffu）からなる。これを、ポジティブコントロールウェル 中の細胞に添加する。細胞を一晩インキュベートする。３日目に、培地を吸引し 、3.0mlの新鮮なDMEMおよび10％ FBSを細胞に添加する。細胞をコンフルエント になるまで増殖させ、そして６日目と10日目に1:10に分け、任意の複製コンピテ ントレトロウイルスを増幅する。13日目に、Mv1Lu細胞における培地を吸引し、 そして2.0ml DMEMおよび10％ FBSを細胞に添加する。さらに、MiCl1細胞を、2.0 mlのDMEM、10％ FBSおよび８μｇ/mlポリブレン中にウェルあたり1×105細胞で 播種する。14日目に、MvlLu細胞からの上清をMiCl1細胞の対応するウェルに移し 、そして37℃、10％ CO2で一晩インキュベートする。15日目、培地を吸引し、そ して3.0mlの新鮮なDMEMおよび10％ FBSを細胞に添加する。21日目に、細胞を、 細胞の単層上の病巣形成（単層一面にはびこり、接着したままである、クラスタ ー形成した、屈折性細胞）について10×羃乗で顕微鏡下で検査する。MiCl1細胞 上に病巣が現れた場合、試験物を複製コンピテントレトロウイルスで汚染してい ると決定する。 これらの手順を用いて、HBVコアプロデューサー細胞株DA core-1、DA core-10 、およびHBVeプロデューサー細胞株DA HBe 4-7が、複製コンピテントレトロウイ ルスで汚染していないことが示され得る。 実施例10 組換えアデノウイルスベクターの産生 ClaIで直線化した１μｇのpAdMI-HBeを１μｇのClaI切断Ad5del ta el delta E3（Gluzmanら、Eucaryotic Viral Vectors，pp．187-192，Cold Spring Harbor ，1982）ウイルスDNAと混合する。このDNA混合物を、0.8mlのOpti-MEM I Reduce d Serum Medium(BRL，Gaithersburg，Maryland)中の７μｌのLipofectamine(BRL ， Gaithersburg，Maryland)を用いて、60mm直径の皿に5〜6×105の293細胞（ATCC CRL 1573）にトランスフェクトする。20％ FBSを有する１mlのDMEM培地を５時間 後に添加し、そして10％ FBSを有するDMEM培地を翌日にび満たす。c.p.e.の出現 （8〜10日）の後、培養物を回収し、ウイルス溶解物を２回のプラーク精製に曝 す。個々のウイルスプラークを拾い上げ、そして６ウェルプレート中の293細胞 （ウェルあたり1×105細胞の細胞密度で）に感染させることにより増幅する。組 換え体を、Hirt手順（Hirt，1967）によって感染細胞から抽出したウイルスDNA のサザン分析により同定する。ポジティブ同定の後に、組換えウイルスを２回の さらなるプラーク精製に曝す。力価を、Grahamら、J.Gen.Virol．36:59-72，197 7に記載されるプラークアッセイによって測定する。ウイルスストックを、20pfu /細胞の多重度で60mm直径皿中のコンフルエント293細胞（2×106細胞）に感染さ せることによって調製する。全てのウイルス調製物を、CsCl密度遠心分離（Grah amおよびVan der Elb，Virol．52:456-457，1973）により精製し、透析し、そし てすぐに使用する場合には４℃で、10mM Tris-HCl（pH7.4）、1mM MgCl2中に保 存し、そうでなければ10％グリセロールの添加を用いて−70℃で保存する。 実施例11 ベクター構築物の細胞への導入 A．組換えレトロウイルスベクター i．マウス細胞の形質導入 マウス線維芽細胞細胞株BC10ME（ATCC番号TIB85）B16およびL-M(TK-)(ATCC番 号CCL 1.3)を、4500mg/Lグルコース、584mg/L L-グルタミン（Irvine Scientifi c，Santa Ana，California）および10％ FBS（Gemine，Calabasas，California ）を含有するDMEM上で増殖させる。 BC10ME，Bl6、およびL-M(TK-)線維芽細胞細胞株を10cm皿にDMEM、10％FBSおよ び４μｇ/mlポリブレン中に各々1×105でプレーティングする。各々を、約105cf u/mlのベクター力価を有する1.0mlのレトロウイルスベクターで形質導入する。 クローンを、実施例7Bに記載のようにDMEM、10％ FBSおよび800μｇ/ml G418中 で選択する。 EL4（ATCC番号TIB 39）細胞およびEL4/A2/Kb細胞（L．Sherman，Scripps Inst itute，San Diego，California）をDAプロデューサー細胞とともに同時培養する ことによって形質導入する。詳細には、1.0×106のEL4細胞または1.0×106EL4/A 2/Kbを、１日目にRPMI 1640（Irvine Scientific，Santa Ana，California）、1 0％ FBS、および４μｇ/ml ポリブレン(Sigma，St.Louis，Missouri)中の1×106 の放射線照射した(10,000rad)DA（約105〜106のベクター力価）プロデューサー 細胞に添加する。２日目に、1.0×106の放射線照射した(10,000rad)DAプロデュ ーサー細胞を同時培養に添加する。５日目に、形質導入したEL4またはEL4/A2/KB 細胞の選択を800μｇ/ml G418で開始する。このプールは、実施例7Aに記載され るようにクローン化された希釈物である。 多価ベクターによって形質導入したBC10ME、B16、L-M(TK-)、EL-4細胞は、G41 8において選択されない；それらは実施例7Aに記載のような限界希釈によってク ローン化され、そして実施例12Aに記載されるように発現についてアッセイされ る。 ii．マカク細胞の形質導入 末梢血単核細胞（PBMC）を、2000rpmで30分間室温でFicoll-hypaqueカラムに よってスピンさせる。リンパ芽球腫細胞株（LCL）を、それぞれのＢ細胞をHerpe s papioウイルスに1:1000の細胞上清の希釈度で感染（形質転換）させることに よって、各マカクについて確立する（594-S、Southwest Institute for Biomedi cal Research）。 Herpes papio形質転換の３〜５週後に、活発に増殖する細胞を、HBVコアまた はe抗原を発現するレトロウイルスベクターで２回形質導入する。LCLの形質導入 を、4.0mlの培地および4.0μｇ/mlポリブレンを含有する６cmプレート中で1×106 のLCL細胞と1×106の放射線照射（10,000rad）したDA/BeまたはDA/HBコアプロ デューサー細胞とを同時培養することによって達成する。培養培地は、RPMI 164 0、20％熱不活化胎児ウシ血清（Hyclone，Logan，Utah）、5.0mMピルビン酸ナト リウム、5.0mM非必須アミノ酸および2mM L-グルタミンからなる。37℃および５ ％ CO2での一晩の培養の後、LCL懸濁細胞を取り出し、そして最初の形質導入 のように1×106の放射線照射(10,000rad)したDA/HBeまたはDA/HBコアプロデュー サー細胞とともに同時培養する。形質転換したLCL細胞を、800μｇｍ/ml G418を 添加することによって選択し、そして限界希釈によってクローン化する。 iii．チンパンジーおよびヒト細胞の形質導入 リンパ芽球腫細胞株（LCL）を、B95-8、EBV形質転換マモセット白血球（ATCC CRL 1612）の３週齢培養物の上清から得られた新鮮なEpstein-Barrウイルス（EB V）でそれらのＢ細胞を感染させることによって、各患者について確立する。EBV 形質転換の３週間後に、LCLをHBVコアまたはe抗原を発現するレトロウイルスベ クターで形質導入する。LCLの形質導入を、4.0mlの培地および4.0μｇ/mlのポリ ブレンを含有する６cmプレート中で1.0×106LCL細胞と1.0×106の放射線照射し た(10,000rad)HXプロデューサー細胞とを同時培養することによって達成する。 培養培地は、RPMI 1640、20％熱不活化胎児ウシ血清（Hyclone，Logan，Utah） 、5.0mMピルビン酸ナトリウムおよび5.0mM非必須アミノ酸からなる。37℃および ５％ CO2での一晩の同時培養の後、LCL懸濁細胞を取り出し、そして1×106の細 胞を、1×106の放射線照射（10,000rad）したHXプロデューサー細胞を含有する 新鮮なプレートにさらに６〜18時間、再び同時培養する。形質導入LCL細胞を、8 00μｇ/mlのG418を添加することによって選択し、そして高発現クローンを得る ためにクローン化する。Jurkat A2/Kb細胞（L.Sherman，Scripps Institute，Sa n Diego，California）を、本質的にLCL細胞の形質導入に記載されたように形質 導入する。多価ベクターによって形質導入されたLCL、Jurkat A2/KbおよびEL4 A 2/Kb細胞は、G418においては選択されない；それらは、実施例7Aに記載されるよ うに限界希釈によってクローン化され、そして実施例12Aに記載のように発現に ついてアッセイされる。 Ｂ．Ｂ型肝炎ウイルスコアCMV発現ベクターでのトランスフェクション L-M(TK-)細胞を、１日目に、5×105細胞で、DulbeccoのModified Eagle Mediu m（DMEM）および10胎児ウシ血清（FBS）を有する10cm組織培養皿において播種す る。２日目に、培地を、トランスフェクションの４時間前に5.0mlの新鮮な培地 で交換する。標準的なリン酸カルシウム-DNA同時沈殿を、60μｌの2.0M CaCl2、 10μｇのCMV-HBcプラスミド、および脱イオン水を混合して、400llの容積にする することによって行う。400μｌのDNA-CaCl2溶液を、等速で撹拌しながら液滴で 400μｌの2×沈殿緩衝液（50mM HEPES-NaOH，pH7.1、0.25M NaClおよび1.5mM Na2 HPO4-NaH2PO4）に添加する。この混合物を、室温で10分間インキュベートする 。得られる良好な沈殿物を、前日にプレーティングしたL-M(TK-)細胞の培養皿に 添加する。細胞をDNA沈殿物とともに37℃で一晩インキュベートする。３日目に 、培地を取り出し、新鮮な培地を添加する。４日目に、細胞抽出物を回収し、そ して実施例12Aに記載されるように発現についてアッセイする。 Ｃ．組換えアデノウイルスベクターでの感染 35mm（直径）皿で増殖するL-M(TK-)細胞（約106細胞）の半コンフルエントな 単層を、100pfu/細胞の多重度で組換えHBeアデノウイルスベクターに感染させる 。37℃での吸着の１時間後、ウイルス接種材料を取り出し、そして2% FBSを補充 したDMEMを添加する。感染の30〜40時間後、明白なc.p.e.が観察される場合には 、細胞抽出物を回収し、そして実施例12Aに記載されるように発現についてアッ セイする。 実施例12 形質導入遺伝子の発現 Ａ．ELISA KT-HBe-cまたはKT-HBcによって形質導入した細胞からの細胞溶解物を、1.0×1 07の培養細胞をPBSで洗浄し、総量600μｌに細胞をPBSで再懸濁し、そしてBrans onソニケーター、Model 350（Fisher，Pittsburgh，Pennysylvania）で30の設定 で５秒間で２回超音波処理するか、または３回凍結解凍させたことによって作製 する。溶解物を、10,000rpmで５分間遠心分離することによって明澄化する。 細胞溶解物中のコア抗原およびプレコア抗原および培養上清の分泌されたe抗 原を、Abbott HBe，rDNA EIAキット（Abbott Laboratories Diagnostic Divisio n，Chicago，Illinois）を用いてアッセイする。細胞溶解物中のプレコア抗原お よび細胞上清中の分泌されたe抗原についての別の高感度なEIAアッセイをIncsta r ETI-EBキット（Incstar Corporation，Stillwater，Minnesota）を用いて行う 。標準曲線を、Biogen（Geneva，Switzerland）から入手した組換えＢ型肝炎コ アおよびe抗原の希釈物から産生する。 これらの手順を用いて、約20〜40ng/mlのHBV e抗原を、形質転換細胞株におい て発現させ、そして38〜750ng/mlのHBVコア抗原を形質導入細胞株において発現 させる（図５）。 Ｂ．ウエスタンブロット分析による形質転換遺伝子の発現 タンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、それらの分子 量（MW）に従って分離する。次いで、タンパク質を、ゲルからIPVH Immobilon-P 膜（Millipore Corp.，Bedford，Massachusetts）に移す。Hoefer HSI TTEトラ ンスファー装置（Hoefer Scientific Instruments，California）を用いて、ゲ ルから膜にタンパク質を移す。次いで、膜を、発現されたタンパク質と特異的に 反応する患者血清からのポリクローナル抗体でプロービングする。結合抗体を、125 I標識プロテインAを用いて検出する。これは、オートラジオグラフィーによ って形質導入タンパク質を可視化する。 Ｃ．免疫沈降/ウエスタンブロット 形質導入細胞によって発現されるプレコア/コアおよびe抗原の特徴付けを、免 疫沈降および続いてウエスタンブロット分析によって行う。詳細には、PD3また は培養上清中の0.3〜1.0mlの細胞溶解物をG-Sepharose（Pharmacia LKB，Uppsal a，Sweden）に結合したポリクローナルウサギ抗Ｂ型肝炎コア抗原（DAKO Corpor ation，Carpinteria，California）と混合し、そして一晩４℃でインキュベート する。サンプルを、20mM Tris-HCl、pH8.0、100mM NaCl、10mM EDTA中で２回洗 浄し、そして0.5％β-2-メルカプトエタノールとともにサンプルローディング緩 衝液中で煮沸する。タンパク質を最初に、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 によって分解し、次いでImmobilon（Millipore Corp.，Bedford，Maine）に移し 、そしてDAKOポリクローナルウサギ抗肝炎コア抗原、および続いて125I-プロテ イン Aでプロービングする。 これらの手順を用いて、図６から、17Kd HB eタンパク質が、形質導入マウス 細胞によって培養上清中に分泌され、そしてp22、p23中間体Ｂ型肝炎e産物が、 形質導入マウス細胞の溶解物中に主として存在することが示され得る。この図は また、レトロウイルスで形質導入されたBC10ME細胞に由来する細胞溶解物におけ るp21 HBVコアタンパク質の発現を示す。 実施例13 腫瘍形成性および形質転換 Ａ．腫瘍形成性アッセイ ヌードマウスにおける腫瘍形成は、腫瘍形成性を決定するために特に敏感な方 法である。ヌードマウスは、成熟Ｔ細胞を有さず、それゆえ機能的細胞免疫系を 欠き、細胞の腫瘍形成可能性を試験するのに有用なインビボモデルを提供する。 正常な非腫瘍形成性細胞は、ヌードマウスに注射された場合に、制御されない増 殖特性を提示しない。しかし、腫瘍形成性細胞は、増殖し、そしてヌードマウス 中に腫瘍を生成する。手短には、ベクター構築物を、筋肉内および腹腔内注射に よりヌードマウス中に投与する。マウスを、注射後４〜16週間の期間、腫瘍増殖 を決定するために視覚的に検査する。マウスをまた、腫瘍が存在するか否かを決 定するために屠殺および剖検し得る（Giovanellaら，J．Natl．Cancer Inst．48 :1531-1533，1972;Fureszら，「Tumorigenicity testing of cell lines consid ered for production of biological drugs」，Abnormal Cells，New Products and Risk，HoppsおよびPetricciani(編)，Tissue Culture Association，1985:L evenbookら，J．Biol．Std．13:135-141，1985）。この試験を、Quality Biotec h Inc.,(Camden，New Jersey)により行う。 Ｂ．形質転換アッセイ 腫瘍形成性は、形質転換の特性と密接に関連することが示されている。形質転 換を決定するために利用され得る１つのアッセイは、軟寒天中にプレートされた 細胞のコロニー形成である（MacPhersonら，Vir．23:291-294，1964）。手短に は、正常な非形質転換細胞の１つの特性は、足場依存性増殖である。正常な非形 質転換細胞は、これらが半固体寒天支持培地中にある場合は増殖を停止し、一方 、形質転換細胞は、増殖を続けて軟寒天中にコロニーを形成する。 ヒト線維肉腫に由来し、100％のヌードマウス中で腫瘍を生じることが知られ る腫瘍性細胞株であるHT1080（ATCC CCL 121）を、アッセイのポジティブコント ロールとして用いる。ヌードマウスに腫瘍形成しない二倍体胚性ヒト肺細胞株で あるWI-38（ATCC CCL 75）を、アッセイのネガティブコントロールとして用いる 。 WI-38細胞株に、実施例11Aに記載される通りにベクター構築物を用いて形質導 入する。形質導入細胞株HT1080およびWI-38の各々の２連のサンプルを、寒天中 で培養する。手短には、5.0mlのDMEM 17％ FBS中10.8％Bactoagar（Difco，Detr oit，Michigan）の下層を、60mm組織培養プレート上にセットする。これに、５ ×105細胞／mlの濃度で懸濁した細胞を有する同じ培地中0.3％Bactoagarの2.0ml を重層する。バックグラウンドの凝集を減らすために、各細胞株を、701mナイロ ンメッシュを通して濾過した後で、寒天溶液に懸濁する。プレートを、５％ CO2 の加湿雰囲気において37℃にて14日間インキュベートする。プレーティングの24 時間以内に、各細胞株の代表的なプレートを、プレーティングの時点で存在する 細胞凝集について調べる。13日目に、プレートを、1.0ml INT生体染色（Sigma， St．Louis，Missouri）で染色し、そして14日目にそれらを、直径150 lmのコロ ニーについて1mm接眼レンズ網線を用いてスキャンする。 いずれかの方向で150 lm以上にわたるコロニーのみをスコアする。なぜなら、 このサイズのコロニーは、全ての平面において顕微鏡下で容易に観察され得、そ して非形質転換細胞は、まれにしかこのサイズのコロニーを形成しないからであ る。このアッセイの終わりに、各細胞株のプレーティング効率を、ｂ／ａ×100 として計算した。ここで、ｂは、全てのプレートのコロニーの合計に等しく、そ してａは、プレートする細胞の総数に等しい。非形質転換細胞株は、0.001％以 下のプレーティング効率を有する株である。それゆえ、形質転換した細胞株は、 0.001％よりも大きなプレーティング効率を有する（Risserら，Virol．59:477-4 89，1974）。 実施例14 投与プロトコル Ａ．マウス ｉ．組換えタンパク質の投与 モノマーで非粒状形態のＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質（D．Milich，Scrip ps Institute，San Diego，California）は、CTLのためにＴ-helpをプライミン グするのに有用であり得る。６〜８週齢の雌性C3H/He CR，HLA A2.1，HLA A2.1/ Kbマウスを、完全フロイントアジュバント中に乳濁した10μｇのモノマーHBVコ アでプライミングする。２〜３週間後、マウスに、処方されたHB VeまたはHBVコ アレトロウイルスベクターのいずれかを注射する（実施例14A iv a）。 ii．Adjuvaxとの組換えタンパク質の投与 BALB/c，C57BL/6、およびC3H/Heマウスに、組換えHB Veまたは組換えHBVコア ／Adjuvaxの懸濁液を注射する。抗原-Adjuvax懸濁液を、乾燥Adjuvax粉末（Alph a-Beta Technology，Inc.，Worchester，Massachusetts）１mgあたりPBS中の抗 原溶液1.0mlを添加することにより調製する。抗原Adjuvax混合物を、18ゲージの 針を付けたシリンジ中に取り、そして懸濁液を針およびシリンジを通して複数（ ８〜10回）通過させることにより水和させる。マウスに、0.2mlの抗原-AdJuvax 調製物を２回以上注射する。注射を、１〜２週間の間隔をあけて、腹腔内または 筋肉内で与える。最後の注射の１〜２週間後、マウスから採血し、そして血清を 、HB Ve抗原およびHBVコア抗原に特異的な抗体について試験する。同時に、脾臓 を取り出し、そして脾細胞を、HBV eまたはHBVコア抗原を発現する照射（10,000 ラド）した同系細胞でインビトロで再刺激する。エフェクターを、HBV e/コア特 異的CTL活性について、標準的な51Cr放出アッセイ（実施例15Aiを参照のこと） において試験する。 iii．レトロウイルス形質導入細胞の投与 ６〜８週齢の雌性BALB/c、C57BL/6、C3H/Heマウス（Charles River Laborator ies，Charles River，MA）に、抗原を発現する１×107個の照射（室温にて10,00 0ラド）同系細胞を腹腔内（i.p.）注射する。４回の注射を、１週間の間隔で与 える。各注射の後、血清を、実施例15Bに記載されるように、抗体誘導の検出の ために後眼窩出血により取り出す。最後の注射の７日後、動物を屠殺し、そして 脾細胞を、実施例15Aiに記載されるようにクロム放出CTLアッセイのために取り 出す。 iv．ベクター構築物の投与 ａ．組換えレトロウイルスベクター ６〜８週齢の雌性BALB/c、C57BL/6、C3H/He（Charles River Laboratories，C harles River，MA）、HLA A2.1（V．Engelhard，Charlottesville，Virginia） 、またはHLA A2.1/Kb（L．Sherman，Scripps Institute，San Diego，Californi a）マウスに、0.1mlの処方HBVコア、HBV e、またはHB Fコア/neoRレトロウイル スベクターを２部位に筋肉内（i.m.）注射するか、または尾の基部で皮内注射す る。２回、４回、または６回の注射を、１週間の間隔で与える。各注射の後、実 施例15Bに記載される通りに、抗体誘導の検出のために、血清を後眼窩出血によ り取り出す。最後の注射の14日後、動物を屠殺する。次いで、クロム放出CTLア ッセイを、本質的に実施例15Aiに記載される通りに行う。 ｂ．サイトカインを有する組換えレトロウイルスベクター ６〜８週齢の雌性C3H/He Charles River、HLA A2.1、またはHLA A2.1/Kbにま た、0.05mlの処方HBVコアレトロウイルスベクターおよび0.05mlの25,000単位の マウスγ-インターフェロン（mγ-IFN）またはマウスIL-2のいずれかを筋肉内注 射する。２〜３回の注射を、１週間の間隔で与える。最後の注射の14日後、動物 を屠殺する。次いで、クロム放出CTLアッセイを、本質的に実施例15A.1に記載さ れる通りに行う。 ｃ．直接DNA投与 ５〜６週齢の雌性C3H、HLAA 2.1、またはHLA A2.1/Kbマウスを、両方の脚の前 脛骨筋中に注射する。各脚は、100μｇのDNAを含有する50μｌの滅菌0.9％滅菌 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.3）を、27ゲージの針およびTBシリンジで受 ける。３回の注射を、３週間の間隔で与える。最後の注射の４週間後に動物を屠 殺し、そして脾臓を採取する。 ｄ．組換えアデノウイルスベクター ６〜８週齢の雌性C3H/He、HLA A2.1、またはHLA A2.1/Kbマウスに、５×107pf uの組換えHBeアデノウイルスを静脈内または腹腔内注射する。注射の７日後、動 物を、実施例15Aiに記載される通りにクロム放出CTLアッセイのために屠殺する 。 Ｂ．マカク 種々の齢の雄性および雌性のマカク（Primate Research Institute，White Sa nds，New Mexico）に、0.5mlの処方HB Fコア/neoRベクター、HBVコア、またはHB V eレトロウイルスベクターを筋肉内（４部位）注射または首のうなじに皮内注 射する。４回の注射を、14日間の間隔で与える。各注射の14日後に、血液サンプ ルを、実施例15Aiiiに記載される通りにクロム放出CTLアッセイのために収集す る。 Ｃ．チンパンジー マウスおよびマカク系で生じたデータを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスに慢性感染 したチンパンジーにおけるベクターの投与のプロトコルを決定する。マウスおよ びマカクにおけるHBV特異的CTLの誘導に基づいて、チンパンジー試験における被 験体（White Sands Research Center，Alamorgordo，NM，Southwest Foundation for Biomedical Research，San Antonio，Texas）は、４用量の処方HB Fコア/n eoRベクターを14日間の間隔で受ける。投薬量は、各注射日に４回の0.5mlのi.m. 注射で与えられる109cfu/mlの処方HB Fコア/neoRベクターである。血液サンプル を、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベル、Ｂ型肝炎ｅ抗原に 対する抗体の存在、HBV DNAレベルを測定するため、ならびに処置の安全性およ び許容度を評価するために処置の間に採取する。Ｂ型肝炎ｅ抗原およびHB e抗原 に対する抗体を、実施例12Aに記載される通りにAbbott HB e rDNA EIAキットに より検出する。Ｂ型肝炎コアまたはｅ抗原に対するCTLの誘導の効力は、実施例1 5Aivに記載される通りに決定され得る。 チンパンジーでの試験からの安全性および効力の結果に基づいて、投薬量およ び接種スケジュールが、ヒトでの試験における被験体へのベクターの投与のため に決定される。これらの被験体を、血清ALTレベル、Ｂ型肝炎ｅ抗原の存在、Ｂ 型肝炎ｅ抗原に対する抗体の存在、およびHBV DNAレベルについて本質的に上記 のようにモニターする。Ｂ型肝炎コアまたはｅ抗原に対するヒトCTLの誘導は、 実施例15A ivに記載される通りに決定される。実施例15 Ａ．細胞傷害性アッセイ ｉ．近交系マウス ６〜８週齢の雌性Balb/C、C57Bl/6、およびC3Hマウス（Harlan Sprague-Dawle y，Indianapolis，Indiana）に、それぞれ、１×107個の照射（室温にて10,000 ラド）ベクター形質導入BC10ME，Bl6、およびL-M(TK-)細胞を１週間の間隔で２ 回、腹腔内（i.p.）注射する。動物を、ベクターまたは形質導入同系細胞の投与 後に屠殺する。脾細胞（３×106/ml）を採取し、そしてそれらのそれぞれの照射 形質導入細胞（６×104/ml）とともにT-25フラスコ（Corning，Corning，New Yo rk）中でインビトロ培養する。培養培地は、RPMI 1640、５％熱不活化ウシ胎児 血清、１mMピルビン酸ナトリウム、50μｇ/mlゲンタマイシン、および10-5M b 2 -メルカプトエタノール（Sigma，St．Louis，Missouri）からなる。エフェクタ ー細胞を、４〜７日後に採取し、そして種々のエフェクター：標的細胞比を用い て96ウェルマイクロタイタープレート（Corning，Corning，New York）中で標準 的なクロム放出アッセイにおいて試験する。標的は、HBコアまたはHBC形質導入L -M(TK-)細胞であり、一方非形質導入L-M(TK-)細胞株は、バックグラウンド溶解 のコントロールとして用いる。詳細には、Na2 51CrO4標識（Amersham，Arlington Heights，Illinois）（100μＣｉ，37℃にて１時間）標的細胞（１×104細胞／ ウェル）を、エフェクター細胞と、種々のエフェクター対標的細胞比で、200ll の最終容量で混合する。インキュベーションに続いて、100μｌの培養培地を取 り出し、そしてBeckmanガンマ分光器（Beckman，Dallas，Texas）において分析 する。自然放出（SR）を、標的＋培地からのCPMとして決定し、そして最大放出 （MR）を、標的＋１Ｍ HClからのCPMとして決定する。標的細胞溶解の％を、以 下の通りに計算する：［（エフェクター細胞＋標的CPM）−（SR）/（MR）−（SR ）]×100。標的の自然放出値は、代表的にはMRの10％〜20％である。 確実なCTLアッセイのために、エフェクターは、インビトロで複数回、例えば 、一次インビトロ刺激の８〜12日後に刺激され得る。より詳細には、107個のエ フェクター細胞を、６×105個の照射（10,000ラド）刺激細胞、および２×107個 の照射（3,000ラド）の「フィラー」細胞（以下に記載の通りに調製される）と1 0mlの「完全」RPMI培地中で混合する。（PRMIは、以下を含む：５％熱不活化ウ シ胎児血清、２mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ 酸、および５×105M β-メルカプトエタノール）。「フィラー」細胞を、RPMI中 に再懸濁し、室温にて3,000ラドで照射したナイーブ同系マウス脾細胞から調製 する。脾細胞をPRMIで洗浄し、3,000rpmで室温にて５分間遠心分離し、そしてペ レットをRPMI中に再懸濁する。再懸濁した細胞を、1.0ml Tris-塩化アンモニウ ム（100mlの0.17M Trisベース（pH7.65）＋900mlの0.155M NH4Cl；最終溶液は、 7.2のpHに調整される）で、37℃にて３〜５分間処理する。次いで、二次インビ トロ再刺激物を、CTLアッセイにおいて試験する５〜７日前に培養する。任意の 続いての再刺激物を、上記の通りに、２〜10Ｕの組換えヒトIL-2（200Ｕ/m1、カ タログ番号799068、Boehringer Mannheim，W．Germany）を添加して培養する。 特定の場合には、非標識非形質導入またはβ-gal/neo形質導入標的を、所定の 比で標識された標的に添加することが必要であり得る。このことは、ネガティブ コントロール細胞のバックグラウンド溶解を減少させる。 β-gal/neo形質導入標的を、以下の通りに生成する。細菌のβ-gal遺伝子を含 むプラスミドpSP65を得、そして3.1Kbのβ-gal遺伝子をXbaI-SmaIフラグメント として単離し、そしてXbaI-SmaIで消化したpC15CAT（Anyaら，Science 229:69-7 3，1985）中に挿入する。β-gal遺伝子を、3.1KbのSalI-SmaIフラグメントとし て切断し、そしてN2 IIIB gag/protレトロウイルスベクターバックボーン中にXh oIおよび平滑化ClaI部位で挿入する。このプラスミドを、CB-β galと称する。 Ｎ2 III B gag/protの構築を、以下に記載する。HIV-1 gag遺伝子の主要なス プライスドナー（SD）部位を、pSLCATdelBglII（HXB2と呼ばれる、HIV-1 IIIBの クローンに由来する、gag/pol，tat．およびrevを発現するベクター）のPCRによ りGTをACに変更することにより除去する。PCR変異誘発手順の間、780bpのSacI-S peI SD delta gagフラグメントを精製し得るように、SacI部位をまた、SD delta 部位の上流に作製する。1.5KbのSpeI-EcoRV gag-prot-RTフラグメントおよび780 bpのSacI-SpeI SD delta gagフラグメントを、pUC18 SacI-SmaI部位に挿入する 。得られる2.3KbのSacI平滑末端BamHI SD delta gag-prot-RTフラグメントを、 このpUC18ベクターから単離する。SK+gag-prot-RT発現ベクターを、３部連結に よ り生成する。３部連結では、239bpのXhoI-SspI 5’rev DNAフラグメントおよび2 .3KbのSacI平滑末端BamHI SD delta gag-prot-RTフラグメントを、SK+ベクター フラグメント中のXhoI-BylII 4.2Kb rre/3’rev中に挿入する。得られる構築物 を、SK+gag-prot-RT/rre/revと称する。N2ベースgag-prot-RT発現ベクターを、 ２部連結により生成する。２部連結では、SK+gag-prot-RT/rre/rev由来の3.8Kb のXhoI-ClaI gag-prot-RT/rre/revフラグメントを、LTRを含むN2 IIIB envのフ ラグメントのXhoI-ClaI部位に挿入する。N2 IIIB envは、N2組換えレトロウイル ス（Armentanoら，J.Virol．61:1647-1650，1987;Eglitasら，Science 230:1395 -1398，1985）に基づく改変された5’末端を有する、pAF/Envr/SV2neoの誘導体 である。 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40初期プロ モーターから構成されるpAFVXMレトロウイルスベクター（Krieglerら，Cell 38: 483，1984;St．Louisら，PNAS（USA）85:3150-3154，1988）由来のClaI-ClaI優 性選択マーカー遺伝子フラグメントを、プラスミドSK+にクローニングする。こ れから、1.3KbのClaI-BstBI neo遺伝子フラグメントを、感染およびトランスフ ェクトされる細胞株の単離を容易にするためにN2ベースgag/prot/RT発現ベクタ ー中にClaI部位で挿入する。このベクターを、N2 IIIB gag/protと呼んだ。 感染性レトロウイルス粒子を、実施例7Aに記載される通りに、CB-β galプラ スミドのトランスフェクションにより安定なプロデューサー細胞株の生成を通し て生成する。これらの研究で利用される安定なプロデューサー細胞株は、DA細胞 株（WO 92/05266）由来であり、そしてDA-b galと称する。次いで、DA-b galを 用いて、b gal/neoを発現するレトロウイルスベクターを生成する。C3H（H-2k） 細胞株LMTK−を、実施例IIAiに記載される通りにb gal/neoベクターで形質導入 する。クローンを、b gal発現についてスクリーニングし、そして最大に発現す るクローンを、CTLアッセイにおけるネガティブ「neo」コントロールとして使用 するために選択する。 これらの手順を用いて、HBVコア処方ベクターのi.m.投与が、C3H/He CRマウス においてHBVコアおよびHBV e抗原に対するCTL応答を誘導することを示し得る（ 図９を参照のこと）。 HBVコア処方ベクターのi.m.投与によりプライミングしたC3H/He CRマウス（H2k ）から得たエフェクター細胞を、HB cAgレトロベクター形質導入LMTK細胞（H-2k ）、HBcAgレトロベクター形質導入BL/6細胞（H-2b）、またはHBcAgレトロベク ター形質導入BC10ME細胞（H-2d）をクロム放出アッセイにおいて標的として用い てそれらの細胞溶解活性について試験する。図10の結果は、HBcAgレトロベクタ ーでの免疫により誘導されたエフェクターは、H-2kMHCクラスＩに拘束されるこ とを示す。なぜなら、エフェクターは、H-2kの状況でHBcAgを提示する標的を殺 傷するが、H-2bまたはH-2dの状況でHBcAgを提示する標的は殺傷しないからであ る。 上記の手順から、処方されたHBコアベクターを投与することにより刺激された エフェクター細胞から、磁性ビーズに結合された抗CD4または抗CD8抗体のいずれ かでの処理により、CD4細胞またはCD8細胞を枯渇させた。 CD4細胞が枯渇した刺激されたエフェクター細胞を、Dynabeads（Dynal Inc.， Skoyen，NO）を用いる免疫磁性分離により、以下の通りに単離する：a)再刺激さ れた脾細胞（spenocyte）を、４℃にて30分間、モノクローナルラット抗L3T4（C ollaborative Biomedical Products，Becton Dickinson Labware，Bedford，ME ）とともにインキュベートし、b)細胞を、10％ FCSを含有するDMEMで２回洗浄し 、そして培地中に１×107細胞/mlに再懸濁し、c)ヒツジ抗ラットIgGでコートし た予備洗浄したDynabeads（Dynal Inc.,カタログ番号M-450）約75μｌ/l×107細 胞/mlを、細胞に添加し、そしてCD4+細胞を、磁気的に回収する。次いで、残り のCD4枯渇細胞を、それらの細胞溶解活性について、LMコア/neorおよびB-gal/ne orをクロム放出アッセイにおいて標的として用いて試験する。 CD8細胞が枯渇された刺激されたエフェクター細胞を、Dynabeads（Dynal Inc. ，Skoyen，NO）を用いる免疫磁性分離により、以下の通りに単離する：a)再刺激 された脾細胞（spenocyte）を、４℃にて30分間、モノクローナルラット抗Lyt-2 (Collaborative Biomedical Products，Becton Dickinson Labware，Bedford，M E）とともにインキュベートし、b)細胞を、10％ FCSを含有するDMEMで２回洗浄 し、そして培地中に１×107細胞/mlに再懸濁し、c)ヒツジ抗ラットIgGでコート した予備洗浄したDynabeads（Dynal Inc.,カタログ番号M-450）約75μｌ/l×107 細胞/mlを、細胞に添加し、そしてCD8+細胞を、磁気的に回収する。次いで、残 りのCD8枯渇細胞を、それらの細胞溶解活性について、i.m.コア/neorおよびB-ga l/neorをクロム放出アッセイにおいて標的として用いて試験する。図11に示す結 果は、CTLエフェクターが、CD8＋、CD4−であることを示す。 ii．HLA A2.1およびHLA A2.1/Kbトランスジェニックマウス 動物を屠殺し、脾臓細胞（３×106/ml）を、フラスコ（T-25、Corning、Corni ng、NewYork）中で照射（10,000ラド）形質導入Jurkat A2/Kb細胞またはペプチ ドコーティングJurkat A2/Kb細胞（６×104ml）と共にインビトロで培養した。 クロミウム放出アッセイの残りを、実施例15Aiに記載のように実施する。ここで は標的は、形質導入したおよび形質導入していないEL4 A2/Kb細胞およびJurkat A2/Kb細胞である。非形質導入細胞株をネガティブコントロールとして使用する 。標的はまた、実施例16に記載のようなペプチドコーティングEL4 A2/Kb細胞で あり得る。 iii．マカクCTLアッセイ 血液サンプルを、各注射の14日後にヘパリン化チューブ中に収集する。次いで 、末梢血液単核細胞（PBMC）を、Ficoll-hypaqueカラムによって、室温で30分間 、2000rpmで回転させる。PBMCを、それらの自己形質導入LCLを用いて、刺激因子 ：エフェクター比10:1で７〜10日間インビトロで刺激する。培養培地は、５％熱 不活性化ウシ胎児血清（Hyclone、Logan、Utah）、１mMピルビン酸ナトリウム、 10mM HEPES、２mM L-グルタミン、および50μｇ/mlゲンタマイシンを有するRPMI 1640からなる。得られた刺激CTLエフェクターを、標準的なクロミウム放出アッ セイにおいて、形質導入および非形質導入自己LCLに対するCTL活性について試験 する。 iv．チンパンジーおよびヒトCTLアッセイ ヒトPBMCをFicoll（Sigma、St．Louis、Missouri）勾配遠心分離により分離す る。詳細には、細胞を3,000rpmで室温で５分間遠心分離する。PBMCを、それらの 自己形質導入LCL（実施例10B）を用いて刺激因子：エフェクター比10:1で10日間 インビトロで再刺激する。培養培地は、予めスクリーニングしたロットの５％熱 不活性化ウシ胎児血清、１mMピルビン酸ナトリウム、および50μｇ/mlゲンタマ イシンを有するRPMI1640からなる。得られた刺激CTLエフェクターを、標準的な クロミウム放出アッセイにおいて、標的として形質導入自己LCLまたはHLA適合細 胞を用いてCTL活性について試験する（実施例12Ai）。ほとんどの患者は、EBVに 対する免疫性を有するので、非形質導入EBV形質転換Ｂ細胞（LCL）（ネガティブ コントロールとして用いた）もまた、形質導入LCLと共にEBV特異的CTLにより、 標的として認識される。EBV特異的CTLによる標識化標的細胞の殺傷に起因する高 いバックグラウンドを低減させるために、未標識非形質導入LCLを標識化標的細 胞に50:1の比で添加することが必要である。 Ｂ．体液性免疫応答の検出 HBVコアおよびe抗原に特異的なマウスにおける体液性免疫応答を、ELISAによ って検出する。ELISAプロトコルは、100μｇ/ウェルの組換えHBVコアおよび組換 えHBV e抗原(Biogen、Geneva、Switzerland)を96ウェルプレートをコーティング するために使用する。次いで、HBVコアまたはHBV e抗原を発現する細胞または直 接的なベクターで免疫したマウス由来の血清を抗原コーティングウェル中に系列 希釈し、そして室温で１〜２時間インキュベートする。インキュベーション後、 等価な力価のウサギ抗マウスIgG1，IgG2a，IgG2b、およびIgG3の混合物をウェル に添加する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（「HRP」）結合ヤギ抗ウサギ抗血清 を各ウェルに添加し、そしてサンプルを室温で１〜２時間インキュベートする。 インキュベーション後、反応性を適切な基質を添加することにより可視化する。 HBVコアおよびHBV e抗原に特異的なIgG抗体を含有するウェルにおいて、発色す る。 これらの手順を用いて、HBVコア抗原およびHBV e抗原に対するIgG抗体がマウ スにおいて誘発され得ることが示され得る（図７）。（抗体力価を免疫前血清の CD読みとりの３倍を得るのに必要な希釈逆数として表す。） HBVコアまたはeレトロベクターで免疫したマウスにおける体液性応答のイソ型 を、以下の改変を伴って、上記のELISAアッセイによって検出する：マウス由来 の血清を、ウェルを以前に記載のように組換えコアタンパク質または組換えeタ ンパク質のいずれかでコーティングした96ウェル力価プレートのウェルに系列希 釈する。特定のイソ型を、以下のウサギ抗マウス抗血清の１つとのインキュベー ションにより決定する：IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3。このアッセイは、以 前に記載のように開発される。この手順を用いて、IgG2a抗体は、処方HBVコアベ クター（6A3）で免疫したC3H/He（CR）マウスにおいて優先的に誘発され、そし てIgG1抗体は、処方HBV3ベクター（5A2）で免疫したC3H/He CRマウスにおいて優 先的に誘発されることが示され得る（図１２を参照のこと）。 Ｃ．Ｔ細胞増殖 HBVコアまたはe抗原を発現する直接ベクター調製物の２つまたは３つの注射か ら得られる抗原誘導Ｔヘルパー活性を、インビトロで測定する。詳細には、免疫 マウス由来の脾臓細胞を、HBVコアまたはe抗原を発現する細胞あるいはHBVコア またはe抗原を発現しない細胞（ネガティブコントロールとして）と所定の比で 、インビトロで再刺激する。５％FBS、1.0mMピルビン酸ナトリウム、および10-5 β2-メルカプトエタノールを含有するRPMI 1640培養培地中で37℃および５％CO2 で５日後、上清をIL-2活性について試験する。IL-2は、HBVコアまたはe抗原によ り刺激されたＴヘルパー細胞により特異的に分泌され、その活性を、CTLクロー ン、CTLL-2（ATCC TIB 214）を用いて測定する。簡潔には、CTLL-2クローンは、 増殖についてIL-2に依存性であり、そしてIL-2の不在下では増殖しない。CTLL-2 細胞を、96ウェルプレート中で上清試験サンプルの系列希釈液に添加し、そして 37℃および５％CO2で３日間インキュベートする。続いて、0.5ICi3Ｈチミジンを CTLL-2に添加する。3Ｈチミジンは、CTLL-2細胞が増殖する場合にのみ取り込ま れる。一晩インキュベートした後、細胞をPHD細胞採取機（Cambridge Technolog y Inc.，Watertown，Massachusetts）を用いて採取し、そしてBeckmanベータカ ウンターにおいて計数する。サンプル中のII-2の量を、Boehringer Mannheim（I ndianapolis，Indiana）から得られた組換えIL-2標準物から作成した標準曲線か ら決定する。 Ｄ．Ｔ細胞由来のサイトカインの測定 上述のように、主として、ＴH1およびＴH2と称される２つのタイプのＴリンパ 球ヘルパー細胞（ＴH）がある。誘発されたＴHのタイプを測定する１つの方法は 、体液性免疫応答の優勢なイソ型を決定し（実施例15Bを参照のこと）、それに より生成されたＴH応答のタイプを間接的に決定することである。あるいは、マ ウス脾臓細胞由来のTH細胞集団のサイトカイン分泌パターンは、上記のようにイ ンビトロで再刺激した。培養５〜７日後、上清を、各サイトカイン（Pharmagen 、San Diego，CA）に特異的なELISAアッセイを用いてIL-2、IFN-γ、IL-4、およ びIL-10について試験する。 TH誘発のタイプを定義するためのさらに別の直接的な方法は、逆転写酵素−ポ リメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、インビトロで再刺激された脾臓細胞のCD 4+選択集団由来のサイトカイン分泌パターンを直接測定することである。簡単に は、CD4+Ｔ細胞集団を、以下のようにDynabeads（Dynal Inc.，Skoyen，NO）を 用いて免疫磁気分離により単離する：(a)再刺激された脾臓細胞を４℃で30分間 、モノクローナルラット抗L3T4（Collaborative Biomedical Products，Becton Dickinson Labware，Bedford，ME）と共にインキュベートし、(b)細胞を、10％F CSを含むDMEMで２回洗浄し、そして培地中１×107細胞/mlに再懸濁し、(c)ヒツ ジ抗ラットIgGでコーティングした予備洗浄したDynabeads（Dynal Inc.，カタロ グ番号M-450）の約75ml/１×107細胞/mlを細胞に添加し、そしてCD4+細胞を磁気 により回収する。フローサイトメトリーを用いてCD4+Ｔ細胞の濃度を決定する。 選択されたCD4+集団由来のRNAをChomczynskiおよびSacchiの方法（Anal．Bioche m．162:156，1987）により単離する。CD4+選択細胞を４Ｍグアニジウム緩衝液に 添加し、そしてサンプルをDNasel（Promega．Madison、WI）で37℃で30分間処理 する。cDNAをCD4+選択細胞から単離した1mgのRNAから合成する。簡潔には、13ml DEPC処理H2O中の1mgのRNAを、1ml（0.5mg/ml）オリゴdTプライマー、1mlの鳥類 骨髄芽球ウイルス（AMV）逆転写酵素、および0.5mM dNTPをRNAに添加し、そして 42℃で１時間インキュベートすることによりプライムする。約20mlのプライムRN Aを、50mM Tris-HCl(pH9.0)、50mM KCl、2.5mM MgCl2、0.1％(w/v)ゼラチン、0. 2mM dNTP、25pM 5'および3'オリゴヌクレオチドプライマー、および2.5U Taqポ リメラーゼ（Promega、Madison、WI）を含有する30mlのPCR反応混合物と混合す る。アリコートを、DNA Thermocycler（Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT）中 で増幅する。40サイクルプログラムを使用する。このプログラムでは、各サイク ルは、94℃で１分間の変性工程、および55℃（IL-2およびg-IFNについて）また は65℃（IL-4およびIL-10）で２分間のアニーリング／伸長工程からなる。次い で、PCR産物のアリコートを２％アガロースゲル上に電気泳動する。サイトカイ ン特異的プライマー対（5'および3'）の配列は以下の通りである： IL-2； IL-4； IL-10； IFN-γ； PCR結果（IL-2がIL-2であり、IL-4がIL-4であり、IL-10がIL-10であり、そし てIFN-γがIFN-γであること）を確証するために、PCR産物を電気泳動し、そし てHybond-Nナイロン膜（Amersham Corp.、Arlington Heights，IL）に移す。あ るいは、PCR産物をスロットブロッティングによりナイロン膜に直接適用する。P CR増幅プライマーに隣接された領域内の配列に相補的なオリゴヌクレオチドを、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boeringer Mannheim Biochemicals，Indianapoli s，IN）および32Ｐ-γATP（7000Ci/mM、ICN、Costa Mesa，CA）（放射性プロー ブとして使用）により5'末端で標識する。次いで、ブロットを、Sambrookらによ り記載のように本質的に、室温で、プローブと４時間ハイブリダイズし、５分間 、２×SSCおよび0.1％SDSで、次いで0.2×SSCおよび0.5％SDSで洗浄する。次い で、ブロットをＸ線フィルムに露出し、-80℃で一晩、増感スクリーンを行う。 オリゴヌクレオチドプローブ（5'および3'）の配列は以下の通りである： IL-2； IL-4； IL-10； γ−IFN； 膜を放射性プローブとハイブリダイズし、そしてAMBIS放射分析画像化システ ム（Automated Microbiology Systems Inc.，San Diego，CA）を用いて走査する 。 実施例１６ 組換えHBVポリペプチドを用いたインビボプライミングによる、発現されたHBV 抗原コードベクターに対する始原ヘルパーＴ細胞応答の増強 HBVコアおよびe抗原(HBc/eAg)を発現し、哺乳類宿主においてヘルパーＴ細胞 をプライムする組換えレトロウイルスベクターの能力を評価した。HBcAg(「HBc( 3A4)」と称する)、HBeAg(「HBe(5A2)」と称する)、およびネオマイシンホスホリ ルトランスフェラーゼ短縮型欠失変異体にインフレームで融合したHBcAgを含む 融合タンパク質(「HBc/neo(6A3)」と称する)をコードするヌクレオチチド配列を 発現するレトロウイルスベクターを、実施例５に記載のようにKT-3レトロウイル ス骨格を用いて構築した。簡単に述べれば、HBc(3A4)構築物は、HBVカプシドア センブリ中に見出される183アミノ酸HBVコアタンパク質を発現する。HBe(5A2)レ トロウイルスは、天然に存在するプレタンパク質中に見出されるＮおよびＣ末端 アミノ酸配列を欠いているが、９アミノ酸の分泌シグナル配列を所有するHBV ｅ 抗原の成熟分泌形態を発現する。HBc/neo(6A3)レトロウイルスは、ネオマイシン ホスホリルトランスフェラーゼに融合した183アミノ酸のHBVカプシド抗原の発現 を行う。 一般に、以下で特に他であるように注記されなければ、ベクターの力価は、１ ×103〜１×109cfu/mlであった。すべての筋肉内レトロウイルスベクター免疫化 は100μｌ/筋肉であり、そしてすべての皮下またはフットパッド免疫化は50μｌ (フットパッドあたり)であった。これは、筋肉内投与について200μｌの、そし てフットパッド投与について100μｌの総容量であった。 Ａ．インビボでHBVコアおよびｅ抗原でプライムされる弱い抗原特異的ヘルパー Ｔ細胞応答を発現するレトロウイルスベクター。 １．HBc/eAg 特異的抗体応答 ３つのレトロウイルスベクター、3A4、5A2、および6A3によるマウスヘルパー Ｔ細胞応答のインビボプライミングを、B10の遺伝的背景を共有していた４〜８ 週齢のH-2類遺伝子性マウスを用いて調査した。簡単に述べれば、ベクター(１〜 ８×107cfu)を、ゼロ、２、および４週で、マウスに直接筋肉内注射し、そして 試験出血を、８週間の間、２週間毎に、後方眼窩叢から集めた。ヘルパーＴ細胞 機能を、固相への抗原の吸着を0.5μｇ/mlのrHBcAg(Schodelら、J．Biol．Chem ． 268:1332、1993)および0.1μｇ/mlのHBeAg-9.6(Milichら、1988)を用いて行った ことを除いて、先に記載のように(Milichら、J．Immunol．141:3617、1988; Mil ichら、J．Immunol．139:1223，1987)、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を用 いて、免疫血清中で抗原特異的抗体力価を測定することにより分析した。マウス H-2ハプロタイプ(Milichら、J．Virol．69:2776、1995)および免疫グロブリンイ ソ型(Stevensら、Nature 334a;255、1988)の、HBc/eAg応答との先に同定された 相関関係は、体液性免疫に対するヘルパー細胞機能の重要性を示した。 結果は以下の表１に報告される。H-2bマウスは、レトロウイルスベクター3A4 および5A2を用いて接種後４〜６週で低いが検出可能なHBc/eAg抗体力価を生成し たが、6A3は生成しなかった。逆にH-2kマウスは、ベクター3A4または5A2に応答 して測定可能な力価を生成しなかったが、6A3を用いた接種に応答した。すべて の場合で、一次抗体応答は貧弱で(力価＜１：1000)、そして二次応答は、力価は 、＜１：10,000希釈以上であった。さらにインビトロレトロウイルス感染DA生産 体細胞株中の発現されたHBc/eAgポリペプチドの細胞下免疫局在化は、3A4および 6A3にコードされたHBV抗原が、細胞内位置に優先的に残存し、その一方HBeAgが5 A2感染細胞により分泌されたことを示した。 表１ HBc[3A4]、HBE[5A2]、およびHBc/neo[6A3]レトロウイルスベクターを用いた遺 伝子免疫化後のB10(H-2b)およびB10.BR(H-2k)マウスにおける体液性免疫応答。 力価は、非免疫化血清の平均の３倍を超える492nmでのODを与える血清の最終希 釈として規定された終点力価として与えられる。各値は２〜４匹のマウスの平均 終点力価を表す。 抗HBc(3A4)または抗HBe(5A2および6A3)終点力価 ２．HBc/eAg 特異的Ｔ細胞増殖およびサイトカイン表現型 H-2kマウスに、rHBcAg(Schodelら、J．Biol．Chem．268:1332、1993)または上 記で論議されたレトロウイルスベクター3A4およば6A3の１つのいずれかをインビ ボ注射し、そしてHBV抗原に対する２次インビトロＴ細胞応答を評価した。より 詳細には、フロイントの完全アジュバント中で乳化したrHBcAg(１〜7.6×108cfu /ml)を３〜４のC3H/Heマウスの後足フットパッド中に皮下注射した；他の群のマ ウスには、２×107〜1.5×108cfuレトロウイルスベクター3A4(HBcAgを発現する) または6A3(HBcAg/neo融合タンパク質を発現する)を筋肉内投与した。レトロウイ ルスベクターを受けた群は、５日後に同じベクターで追加免疫された。最初の免 疫化の９〜11日後、排出したリンパ節細胞を動物から集め、そして単細胞懸濁液 (増殖アッセイにはウェルあたり６×105細胞、サイトカインアッセイにはウェル あたり８×105細胞)をClick培地(Clickら、Cell．Immunol．3:264、1972)を用い て96ウェルプレート中で培養した。培養は、96時間の間、以下のHBV抗原の存在 下または非存在下で維持した：rHBAg(Schodelら、J．Biol．Chem．268:11332-7 、1993）;HBeAg-7.2と呼ばれる短縮型HBcAg(Milichら、J．Immunol．141:3617-3 624、1988）；またはp111-130、ヘルパーＴ細胞エピトープを規定するHBc/eAgア ミノ酸111-130を含む合成ペプチド。 Ｔ細胞増殖は、マイクロウェルに１μＣｉ/ウェル TdRの添加の後、培養の最 終の16時間に、細胞DNA中に取り込まれた3Hチミジン(TdR;Amersham．UK)により 測定された。サイトカイン測定には、培養上清を、IL-2アッセイについては24時 間後、そしてIL-4およびIFN-γアッセイについては48時間後に取り出した。IL-2 は、IL-2感受性細胞株NK'Aの増殖を測定することにより定量し、そしてIL-4は、 IL-4感受性細胞株CT4.Sの増殖を測定することにより定量した(Milichら、J．Vir ol.69:2776、1995;Milichら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:6847、1995)。IF N-γは、Pharmagen(San Diego、CA)からのサンドイッチ酵素連結イムノアッセイ を用いて測定した(Milichら、J．Virol．69:2776、1995;Milichら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 92:6847、1995)。 結果は図１５に提供される。簡単に述べれば、rHBcAgを用いたＴ細胞のインビ ポプライミングは、すべての３つのHBV抗原に対する２次インビトロＴ細胞増殖 応答の能力により評価したとき、いずれのレトロウイルスベクターを用いたプラ イミングより効果的であった。Ｔ細胞増殖は、アッセイ培養に対して、モノクロ ーナル抗CD4抗体(GK1.5、ATCC TIB207)の添加によりブロックされたが、モノク ローナル抗CD8抗体(2.43、ATCC TIB210)の添加によりプロックされず、増殖する T細胞は、CD4＋/CD8-であったことを示す。 rHBcAgを用いた２次インビトロ刺激後の、5A2でプライムされたB10(H-2b)マウ スからの脾臓Ｔ細胞中のサイトカイン遺伝子発現のプロフィールを、RT-PCRによ り調べた。簡単に述べれば、5A2でプライムされたB10マウスからの２×106脾臓 細胞を、Click培地中、５μｇ/ml rHBcAgの非存在下または存在下で36時間培養 した。総RNAを、細胞から、TRIzol Reagent(GibcoBRL、Gaitherburg、MD)を用い て抽出し、そしてM-MLV逆転写酵素(GibcoBRL)およびオリゴ(dT)12-18プライマー を製造業者の指示に従って用いてcDNAに逆転写した。このcDNAを、サイトカイン 特異的プライマーを用いて、製造業者の指示(Stratagene，La Jolla、CA)に従っ てTaqポリメラーゼ(Promega、Madison、WI)で増幅し、そして増幅された生成物 を、PCR反応産物の電気泳動の後エチジウムブロマイド染色ゲル中で検出した。 結果を図16に示す。簡単に述べれば、RT-PCRは、B10脾臓Ｔ細胞がレトロウイ ルスベクター5A2でインビボプライムされ、そしてrHBcAgでインビトロ再刺激さ れたB10脾臓細胞はサイトカインIL-2およびIL-4をコードする遺伝子を発現した ことを示した。従って、5A2ベクターでプライムされたTh2細胞は、5A2が、体液 性免疫についてヘルパーＴ細胞機能を誘導したという観察と一致する。(実施例 １６Ａ、前述)。さらに、この結果は、5A2のrHBcAgとHBeAg生成物との間のＴ細 胞レベルでの交差反応性を示す。 Ｂ．5A2 レトロベクターから発現された次に遭遇するHBeAgに応答するためのHB c/eAgペプチド129-140でプライムされるＴヘルパー細胞 ２〜３のB10(H-2b)マウスの群を、HBV抗原をコードするレトロウイルスベクタ ー(3A4、5A2、または6A3)を用いる免疫化９日前に、フロイントの不完全アジュ バント中に乳化した100μｇのペプチド129-140でプライムした。ペプチドでプラ イムされないベクター免疫化B10マウスをコントロールとして用いた。後方眼窩 叢から隔週に採取された試験血液サンプルから免疫血清を分離した。免疫化のた めに用いたベクターによりコードされるHBV抗原に特異的な抗体を、市販のアッ セイ(Sorin Biomedica、Saluggia、Italy)を用いてELISAにより検出した。 結果を図１７に示す。簡単の述べれば、３つのレトロウイルスベクターの任意 を単独で用いて一回のみ免疫化したB10マウスは、抗原特異的抗体をほとんどま たは全く産生しなかった。[図6]。ベクターのみの動物とは全く対照的に、最初1 29-140でプライムされ、次いで3A4または5A2 HBVのいずれかの抗原をコードする レトロウイルスベクターで免疫化されたマウスは、容易に検出可能でかつ安定に 維持された抗体力価を産生した。[図6]。ベクター5A2で129-140プライムされた マウスの免疫化は、最も顕著な抗体力価を促進した。これは3A4 HBV抗原の細胞 内局在化に対してこのベクターの分泌HBV抗原産物の増加した生体利用性の反映 である。経時的なHBeAg特異的体液性応答の安定性は、ペプチド129-140により一 度マウス宿主のＴヘルパー細胞がプライムされたならば、5A2ベクターが、抗体 力価を維持するに十分なレベルのHBeAgを発現したことを示す。ペプチド129-140 は、それ自身、抗HBeAg抗体を惹起しなかったことが強調されるべきである。 先行する記載から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的で本明細書に記載 されたが、本発明の思想および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得 ることが認識される。従って、本発明は、添付の請求項を除いては制限されない 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/245 Ａ６１Ｋ 39/245 39/29 39/29 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ １７１ 31/18 31/18 Ｃ０７Ｋ 14/005 Ｃ０７Ｋ 14/005 (72)発明者 ミリッチ，デイビット アール. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92065, ラモナ，オアカナ ロード 25048 (72)発明者 リー，ウィリアム ティー．エル. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92009, カールスバッド，カール ポサダ 7961

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．温血動物内の細胞内感染を処置するための方法であって、該方法は以下の工 程： （ａ）細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向 するベクター構築物を温血動物に投与する工程；および （ｂ）該抗原の該免疫原性部分を含むタンパク質を該温血動物に投与し、その 結果免疫応答が生成される工程、 を包含する、方法。 ２．免疫調節補因子を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 ３．前記タンパク質が、前記ベクター構築物の投与の前に投与される、請求項１ に記載の方法。 ４．前記細胞内病原体が、ウイルスであり、そして前記抗原がウイルス抗原であ る、請求項１に記載の方法。 ５．前記ウイルス抗原が、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる群 より選択されるウイルスから得られる、請求項３に記載の方法。 ６．前記抗原が、Ｂ型肝炎抗原である、請求項５に記載の方法。 ７．前記Ｂ型肝炎抗原が、HBeAg、HBcAg、およびHBsAgからなる群より選択され る、請求項６に記載の方法。 ８．前記抗原がＣ型肝炎抗原である、請求項５に記載の方法。 ９．前記Ｃ型抗原が、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、およびNS5から なる群より選択される、請求項８に記載の方法。 １０．前記細胞内病原体が、寄生生物である、請求項１に記載の方法。 １１．前記ベクター構築物が、組換えレトロウイルスによって運ばれる、請求項 １に記載の方法。 １２．前記ベクター構築物が、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、および 、パルボウイルスからなる群より選択される組換えウイルスによって運ばれる、 請求項１に記載の方法。 １３．前記ベクター構築物が、核酸発現ベクター、または真核生物層化ベクター 開始系である、請求項１に記載の方法。 １４．細胞内病原体由来の抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を指向す るベクター構築物、該抗原の該免疫原性部分を含むタンパク質、および薬学的受 容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、組成物。 １５．免疫調節補因子をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。 １６．前記細胞内病原体がウイルスであり、そして前記抗原がウイルス抗原であ る、請求項１４に記載の組成物。 １７．前記ウイルス抗原が、肝炎、ネコ免疫不全ウイルス、およびHIVからなる 群より選択されるウイルスから得られる、請求項１６に記載の組成物。 １８．前記抗原が、Ｂ型肝炎抗原である、請求項１６に記載の組成物。 １９．前記Ｂ型肝炎抗原が、HBeAg、HBcAg、およびHBsAgからなる群より選択さ れる請求項１８に記載の組成物。 ２０．前記抗原がＣ型肝炎抗原である、請求項１６に記載の組成物。 ２１．前記Ｃ型抗原は、コア抗原Ｃ、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、およびNS5か らなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。 ２２．前記細胞内病原体が寄生性物である、請求項１４に記載の組成物。 ２３．前記ベクター構築物が、組換えレトロウイルスによって運ばれる、請求項 １に記載の組成物。
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