JPS63500636A - 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３０、請求の範囲第１５項又は第２６項記載のＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿 主細胞における発現のポリペプチド産物。

３１、　表■に示されたアミノ酸配列の一部もしくは全部を有し、かつ天然多分 化能性顆粒球コロニー刺激因子のイン・ビトロ生物学的活性の１以上（ｏｎｅ　 ｏｒ　ｍｏｒｅ　）を有する合成ポリペプチド。

３２、表■に示されたアミノ酸配列の一部もしくは全部の二次構造の一部もしく は全部ををし、かつ天然ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の生物学的活性 を有する合成ポリペプチド。

３３、天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の一部もし くは全部及び生物学的性質の１以上（ｏｎｅ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　）ををするポリ ペプチドの産生方法であって、適切な栄養条件下、請求の範囲第２８項記載のＤ ＮＡベクターで形質転換又は感染転換された原核もしくは真核宿主細胞を増殖さ せ、上記ベクター中のＤＮＡ配列の発現の所望のポリペプチド産物を単離するこ とからなる方法。

３４、グリコジル又は非グリコジル型の、いかなるヒトタンパク質とも会合して いない精製単離ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子。

３５、請求の範囲第１項又は第３４項記載の有効量のポリペプチド及び薬学上許 容される希釈剤、アジュバント又は担体からなる医薬組成物。

３６、請求の範囲第１項又は第３４項記載のポリペプチドの有効量を投与するこ とからなる哺乳動物への造血治療提供方法。

３７、請求の範囲第１項又は第３４項記載のポリペプチドの有効量を投与するこ とからなる白血病細胞増殖抑制方法。

３８、　［Ｓｅｒ’］ｈｐＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列。

３９、　請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主細胞にお ける発現のポリペプチド産物。

４０、請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ配列を含有する生物学的機能プラスミド 又はウィルスＤＮＡベクタ４１、請求の範囲第４０項記載のＤＮＡベクターで安 定的に形質転換又は感染転換された原核もしくは真核宿主細胞。

４２、（Ａｌａ’〕ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ； （Ｓｅｒ”６）ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ　； （Ｓｅｒ４２）ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ　； ［Ｓｅｒ’）ｈｐＧ−ＣＳＦ　； （Ｓｅｒ’）ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ； （Ｍｅｔ　、、Ｓｅｔ’）ｈｐＧ−ＣＳＦ；（Ｍｅｔ’、５ｅｒ３６）ｈｐＧ− Ｃ３Ｆ；（Ｍｅｔ　、Ｓｅｔ”’）ｈｐＧ−ＣＳＦ；（Ｍｅｔ　、Ｓｅｔ”）ｈ ｐＧ−ＣＳＦ；及びＣＭｅｔ−’、５ｅｒ７４］　ｈｐＧ−ＣＳＦ；からなる群 より選択されるｈｐＧ−ＣＳＦ類縁体をコードするＤＮＡ配列。

４３、請求の範囲第４２項記載のＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主細胞におけ る発現のポリペプチド産物。

４４、　純度が９５％より大であって、ｈｐｃ−ＣＳＦ　Ｏ，５ｍｇにつき発熱 性物質を０．５ｎｇ以下で明　細　書 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の産生本出願は、１９８５年８月２３日に出 願された同時係属米国特許出願筒７６８，９５９号の一部継続出願である。

背景技術 本発明は、一般に、造血促進因子及びががる因子をコードするポリヌクレオチド に関する。本出願は、詳しくは、補乳動物の多分化能性コロニー刺激因子、特に ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈ　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ）、その断片 及びポリペプチド類縁体、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドに関する 。

ヒト血液生成（造血）系は、様々な白血球（好中球、マクロファージ及び好塩基 球／肥満細胞を含む）、赤血球（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨核球／ 血小板）を補充する。平均的ヒト男性の造血系は毎年４，５×１０１１のオーダ ーの顆粒球及び赤血球を産生ずると推測されていたが、これは１年間で全体重に 相当する。デキスターら、バイオエッセイズ、第２巻、第１５４−１５８頁、１ ９８５年（Ｄｃｘｔｃｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、　２　。

１５４−１５８　（１，９８５））。

少量の特定の造血促進因子は、少数の前駆体“幹細胞。

の各種血液細胞系への分化、これらの系の著しい増殖及びこれらの系からの成熟 血液細胞の最終的分化の原因をなすと考えられている。造血促進因子は極端に少 量で存在しているため、これら因子の検出及び同定は分析の仕方にかかっていた が、今までは人為的条件下での培養細胞に対する刺激効果に基づき様々な因子の 中から区別できるにすぎ゛なかった。その結果、多数の名称が極めて少数の因子 を表示するために考え出されてきた。かかる混同が生じた例として、ＩＬ−３、 ＢＰＡ、マルチ−ＣＳＲ，ＨＣＧＦ、ＭＣＧＦ及びＰＳＦという語は、すべて現 在では同一のマウス造血促進因子に該当すると考えられている頭字語である。メ トカーフ、サイエンス、第２２９巻、第１６−２２頁、１９８５年［Ｍｅｔｃａ ｌｆ’、　５ｃｉｅｎｃｅ、２２９．１６−２２（１９８５）　）　、更に、各 種マウスの成長調節糖タンパク質に関する、バージニスら、ジャーナル・オブ・ バイオロジカル・ケミストリー、第２５２巻、第１９８８頁、１９７７年（Ｂｕ ｒｇｅｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ。

Ｃｈｅ「、、　２５２　、１９８８（１９７７）　）　、ダスら、ブラッド、第 ５８巻、第６００頁、１９８０年（Ｄａｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ。

５８、８００　（１９８０））　；イーレら、ジャーナル・オブ・イムノロジー 、第１２９巻、第２４３１頁、１９８２年（Ｉｈｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２９．２４３１（１９８２））　、ニコラら、ジャー ナル・オブやバイオロジカル・ケミストリー、第２５８巻、第９０１７頁、１９ ８３年［ＮＩｃｏｌａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｔ、Ｃｈｅｗ、、２５８．９ ０１７（１９８３））　、メトカーフら、インターナショナル・ジャーナル・オ ブ・キャンサー、第３０巻、第７７３頁、１９８２年（Ｍｅｔｃａｌｆ’、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、３０゜７７３　（１９ｇ２＞） 　ｉ及び、バージニスら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー 、第２６巻、第６４７頁、１９８０年（Ｂｕｒｇｅｓｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉ ｎｔ、Ｊ。

組換え遺伝子技術の利用はこの混乱の中から一定の秩序をもたらした。例えば、 赤血球産生を促進するヒトエリスロボエチンのアミノ酸及びＤＮＡ配列が得られ た［１９８５年６月２０日に公開されたリン（Ｌ　ｉ　ｎ）のＰＣＴ公開出願第 ８５１０２６１０号明細書参照。〕。

組換え方法は、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子のｃＤＮＡの単離 に関しても利用された。ジーら、プロシーディングズーオブ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンス（Ｕ　Ｓ　Ａ）第８２巻、第４３６０−４３６４頁、 １９８５年［Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８２．４３８０−４３６４（ＵＳＡ）　）及 びウオンら、サイエンス、第２２８巻、第８１０−８１４頁、１９８５年［Ｗｏ ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｌｅｎｃｅ、　２２８．８１０−８１４（１９８５ ））。更に、マウス遺伝子のクローニングに関する、ヨコタら、ブロシーデイン ダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ◆サイエンス（ＵＳＡ）、第８１巻 、第１０７０頁、１９８４年［Ｙｏｋｏｔａ、ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　８１．１０７０（１，９８４）］　、フ ァングら、ネーチャー、第３０７巻、第２３３頁、１９８４年［Ｐｕｎｇ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　３０７　、２３３　（１９８４）］　、及び、ゴーフら、ネーチ ャー、第３０９巻、第７６３頁、１９８４年［Ｇｏｕｇｈ、　ｅｔ　ａｔ、、　 Ｎａｔｕｒｅ、　３０９．７［ｉ３　（１９８４）］　、並びにヒトＭ−Ｃ３Ｆ に関するカワザキら、サイエンス、第２３０巻、第２９１頁、１９８５年［Ｋａ ｖａｓａｋｌ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０．２９１　（１９８５））参照。

ヒト多分化能性コロニー刺激因子（ｈ　ｐ　ＣＳ　Ｆ）又はプルリボエチンと称 されるヒト造血促進因子は、ヒト膀胱癌細胞系の培養液中に存在していることが 示された。

この細胞系は５６３７と呼ばれて、米国菌寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　、Ｏ−／クビル、メリーランド において制限条件句でＡＴＣＣ寄託番号第ＨＴＢ−９号として寄託されている。

この細胞系から精製されたｈｐＣＳＦは、ヒト骨髄前駆体細胞を用いた分析にお いて、すべての主な血液細胞系の産生につながるような多分化能性前駆細胞の増 殖及び分化を促進することが報告された。ウェルトら、プロシーディンゲス争オ ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、第１． ５２６−１５３０頁、１９８５年１５２６−１５３０　（１９８５）］。ｈｐＣ ８Ｆの精製には、（ＮＨ４）２Ｓ０４沈降、陰イオン交換クロマトグラフィー（ ＤＥＡＥセルロース、Ｄ　Ｅ　５２　）　、ゲルトン濾過（ＡｃＡ５４カラム） 、及びＣ１８逆相高性能液体クロマトグラフィーを利用していた。Ｃ１８逆相Ｈ Ｐ　Ｌ　Ｃ画分において２つの活性ピークの２番目に溶出するｈｐＣＳＦとして 確認されたタンパク質は、銀染色を用いるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　 −ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）での測定によれば、分子量（ＭＷ） １８，０００を有すると報告された。

ｈｐＣＳＦは、等電点５．５を有し〔ウェルトら、ジャーナル・オブ・セル・バ イオケミストリー、増刊第９Ａ号、第１１６頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ、　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、　ＣｅｌｌＢｌｏｃｈｅｍ、、　５ｕｐｐ　９Ａ、　１１Ｂ　 （１９８５））］　、マウス骨髄単球性白血病細胞系ＷＥＨＩ−３８Ｄ＋に対し て高分化能を有する〔ウェルトら、分子及び細胞生物学のＵＣＬＡ討論会、ゲー ルら編集、ニューシリーズ、第２８巻、１９８５年（Ｗｅｌｔｓ、　ｅｔ　ａｌ 、、　ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｇａ１ｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

ｅｄｓ、、　Ｎｅｗ　５ｅｒ１ｅｓ、　２ｇ　（１９８５）））ことが早期に報 告された。予備研究では、ｈｐＣＳＦと確認された因子はヒトＣＦＵ−ＧＭ分析 において最初の７日間に顕著な顆粒球コロニー刺激活性を有することを示してて いる。

ヒトＣ３Ｆ−βと称されるもう１つの因子も、ヒト膀胱癌細胞系５６３７から単 離されたが、未標識マウスＧ−Ｃ３Ｆの場合と同一の用量応答関係においてＷＥ ＨＩ−３８Ｄ　細胞との結合性に関しマウス１２５ニ一標識顆粒球コロニー刺激 因子（Ｇ−Ｃ５Ｆ）の競合体として記載されていた〔ニコラら、ネーチャー、第 ３１４巻、第６２５−６２８頁、１９８５年（Ｎｉｃｏｌａ、　ｅｔ　ａｔ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　３１４．６２５−８２８　（１９８５）））　。この用量応答 関係は・以前、未標識マウスＧ−Ｃ５Ｆに独特であって、Ｍ−Ｃ８Ｆ％ＧＭ−Ｃ ３Ｆ又はマルチ−ＣＳＦのような因子には見られないと報告されていた〔ニコラ ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ ＵＳＡ）、第８１巻、第３７６５−３７６９頁、１９８４年（Ｎ１ｃｏｌａ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８１．３７１３５−３７８９　（１９８４））　］　、　 ＣＳ　Ｆ−β及びＧ−ＣＳＦはともに、それらがＷＥＨＩ−３８Ｄ＋細胞の分化 を誘導する高い能力を有している点ににおいて、Ｃ３Ｆ類の中では独特である。

ニコラら、イムノロジー・トウデー、第５巻、第７６−８０頁、１９８４年［Ｎ １ｃｏｌａ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　５．７ ８−８０（１９８４））。高濃度でＧ−ＣＳＦは混合顆粒球／マクロファージコ ロニー形成細胞を刺激するがにコラら、１９８４年、同上）、このとことは、ヒ ト骨髄培養物及びｈｐＣＳＦの１４日間のインキュベート後に顆粒球性、単球性 、混合顆粒球／単球性及び好酸球性のコロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の出現を示 す予備実験結果と一致する。Ｃ５Ｆ−βもマウス骨髄細胞使用分析において好中 球性、顆粒球性のコロニー形成を促進すると記載されていたが、この性質は因子 をＧ−ＣＳＦとして同定するための基準とされた。これらの類似性から、ヒトＣ ５Ｆ−βはＧ−ＣＳＦ　（顆粒球コロニー刺激因子）と同一視された。ニコラら 、ネーチャー、第３１４巻、第６２５−６２８頁、１９８５年［Ｎ１ｃｏｌａ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

３１４．６２５−６２８　（１９８５）　）。

これらの共通の性質に基づけば、ニコラら、同上のヒｔ−Ｃ３Ｆ−β及びウェル トら、同上のｈｐＣＳＦは、適切にはヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ ｈｐｃ−ＣＳＦ）と称される同一の因子であると思われる。

ｈｐＧ−Ｃ３Ｉ’の特徴づけ及び組換え産生は、イン・ビトロＷＥＨＩ−３Ｂ　 Ｄ＋白血病細胞数を゛全く正常な濃度”で完全に抑制するマウスＧ−ＣＳＦの報 告されている能力、並びに、マウスで確立された移植骨髄白血病を抑制する粗製 マウスＧ−Ｃ５Ｆ注射製剤の報告されている能力からみて、特に望ましいであろ う。メトカーフ、サイエンス、第２２９巻、第１６−２２頁、１９８５年［Ｍｅ ｔｃａｌｔ’、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９　、１６−２２　（１９８５）］　 、更に、シックス、サイエンティフィック・アメリカン、第２８４巻、第１号、 第４０−４７頁、１９８６年（５ａｃｈｓ　。

５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　２８４．８（１）　、４０−４７ 　（１９８６）　）参照。

ｈｐＧ−ＣＳＦが治療上重要であるとわかり、したがって市販規模量の入手が必 要となる限り、細胞培養物からの単離では、十分な物質源を提供することは困難 である。たとえば、ウェルトら（１９８５年、同上）により天然ｈｐＣＳＦ単離 物源として報告されたヒト膀胱癌細胞系５６３７　（ＡＴＣＣＨＴＢ９）等のヒ ト腫瘍バンク細胞の商業的使用に対して制約が存在していることは、注目される 。

発明の要旨 本発明によれば、ｈｐＧ−ＣＳＦの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列が提供 される。このような配列は、選択された非唾乳動物宿主による発現に″好ましい ”コドンの組込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部位の供与、及び、 簡易的発現ベクターの組立てを容易にする前端、後端又は中間部へのＤＮＡ配列 の付加的供与を含むことができる。本発明は更に、１以上（ｏｎｅ　ｏｒｗｏｒ ｅ　）のアミノ酸残基の同−性又は位置に関して天然型と異なり、しかも天然型 の性質の一部又は全部を保をしている、ｈｐＧ−ＣＳＦのポリペプチド類縁体又 は誘導体（即ち、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆに特異的な残基のすべてまでは含有していない 削除類縁体、１以上（ｏｎｅ　ｏｒ　＠ｏｒｅ　）の特異的残基が他の残基で置 換されている（Ｓｅｒ’）ｈｐＧ−Ｃ５Ｆのような置換類縁体、及び、１以上（ ｏｎｅ　ｏｒ　ｔｔｈｏｒｅ　）のアミノ酸残基がポリペプチドの末端又は中間 部分に付加している付加類縁体）の微生物発現をコードするＤＮＡ配列を提供す る。

本発明の新規ＤＮＡ配列は、天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一 次構造配列の少なくとも一部及び生物学的性質の］以上（ｏｎｅ　ｏｒ　ｍｏｒ ｅ　）を有ｒるポリペプチド産物の原核もしくは真核宿主細胞での発現を確実化 するために使用される配列を含有している。本発明のＤＮＡ配列は、特に、（ａ ）表■及び表■に示されノコＤＮＡ配列又はそれらの相補鎖、（ｂ）表■のＤＮ Ａ配列又はその断片と（本明細書記載のようなハイブリッド形成条件下又はより 厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ配列、又は（Ｃ）遺伝コードの縮 重がなければ表■のＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列をも含むも のである。特に（ｂ）に包含されるものとしは、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆの対立変異型及 び／又は他の哺乳動物種の多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするゲノ ムＤＮＡ配列がある。特に（Ｃ）に包含されるものとしては、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ％ ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの断片及びｈｐｃ−Ｃ８Ｆ類縁体をコードする人よりＮＡ配列が あるが、このＤＮＡ配列には微生物宿主でのメツセフジャーＲＮＡ翻訳を促進す るコドンを組込むことができる。このような人工配列は、アルドン（Ａｌｔｏｎ 　）らのＰＣＴ公開出願第ＷＯ３３１０４０５３号の方法により容易に組立てる ことができきる。

更に本発明に包含されるものとしては、本明細書の表■又は表■の上部鎖ヒトｃ ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列に相補的なりＮＡの一部によりコードされたポリペ プチド類、即ちトラモンタノら、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、第１２巻 、第５０４９−５０５９頁、１９８４年［ＴｒａＩＩＩｏｎｔａｎｏ、　ｅｔ　 ａｌ−＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　１２．５０４９−５０５９ 　（１９８４）：ｌに記載された″相補的転化タンパク質”がある。

本発明は、対立変異体を含む天然ｈｐＧ−Ｃ８Ｆにおける一次構造配列（即ち、 アミノ酸残基の連続配列）の一部もしくは全部、生物学的性質（例えば、免疫学 的性質及びイン・ビトロ生物学的活性）の１以上（ｏｎｅ　ｏｒＩＩｌｏｒｅ） 、及び物性（例えば、分子量）を有する精製単離ポリペプチド産物を提供する。

これらのポリペプチドは、化学合成操作又はゲノムもしくはｃＤＮＡのクローニ ングもしくは遺伝子合成により得られる外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿 主発現（例えば、細菌、酵母菌、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞の培養による ）の産物である、ということによっても特徴づけられる。典型的な酵母菌〔例え ばサツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｓｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ　）　）又は原核生物〔例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ　ｃｏｌｌ）　］宿主細胞の産物は、いずれの哺乳動物タンパク質とも 会合していない。を椎動物（例えば、非ヒト唾乳動物及び鳥類）細胞における微 生物発現産物は、いずれのヒトタンパク質とも会合していない。用いられた宿主 に応じて、本発明のポリペプチドは、哺乳動物その他の真核生物の炭水化物でグ リコジル化していてもよいし、非グリコジル化のままでもよい。本発明のポリペ プチドは、（−１位に）最初のメチオニンアミノ酸残基を有することもできる。

更に本発明に包含されるものとしては、有効量の本発明のポリペプチド産物と一 緒に適切な希釈剤、アジュバント及び／又は担体を含有する、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ療 法に使用される医薬組成物がある。

本発明のポリペプチド産物は、固体組織及び血液もしくは尿等の液体試料中にお けるヒトｈｐＧ−Ｃ５Ｆの検出及び定量に使用される試薬を提供するために、検 出可能なマーカー物質と結合させることににより“標識“する（例えば、Ｉで放 射線標識する）ことができる。

本発明のＤＮＡ産物は、検出可能なマーカー（例えば、放射線標識及びビオチン のような非アイソトープ標識）で標識することもでき、しかも染色体地図上のヒ トｈｐＧ−Ｃ５Ｆ遺伝子の位置及び／又はその関連遺伝子群の位置をつきとめる ためのＤＮＡハイブリッド形成操作（ご用いることができる。それらはＤＮＡレ ベルでのヒトｈｐＧ−ＣＳＦ遺伝子の異常を確認するためにも使用され、隣接遺 伝子及びそれらの異常を確認するための遺伝子マーカーとして使用することもで きるる。

本発明のポリペプチド産物は、再生不良性貧血のような造血障害の治療のために 、単独で又は他の造血因子もしくは薬物と一緒に使用される。それらは化学療法 又は放射線療法による造血障害の治療にも使用される。骨髄移植の成功率は、例 えばｈｐＧ−、ＣＳＦの使用により高められるであろう。創傷治飾熱傷治療及び 細菌性炎症治療にもｈｐＧ−Ｃ５Ｆが有効である。更に、ｈｐｃｙ−ＣＳＦは、 白血病細胞を分化させると報告されている能力に基づき、白血病の治療にも使用 される。ウェルトら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、第１５２６−１５３０頁、１９８５年（ Ｖｅｌｔｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　ＳＣ１，（ｔｌｓＡ）、　８２．１５２６−１５３０　（１９８５ ）　）及びサックス（Ｓａｃｈｓ　＞　、同」二。

本発明の多数の側面及び長所は、現在の好ま１．い態様たる本発明の実例につい て説明した以下の詳細な説明を勘酌することにより、当業者であれば明らかにな るであろう。

図面の簡単な説明 図は、ゲノム配列を得るために利用された配列決定方法を示す矢印を含む、ｈｐ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の部分的な制限エンドヌクレアーゼ地図である。

詳細な説明 本発明によって、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆのポリペプチド配列の一部又は全部をコードす るＤＮＡ配列が単離されかつ特徴づけられた。

って、特に、ｈｐＧ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡ及びゲノムクローンの同定に先立ち行な われる操作、かかる同定方法、並びに、配列決定、ｃＤＮＡ、ゲノム及び人工遺 伝子に基づく発現系の開発、及びかかる系での発現ｈｐｃ−ＣＳＦ及び類縁体産 物の同定に関する。

更に詳しくは、例１はｈｐＧ−Ｃ５Ｆのアミノ酸配列決定に関する。例２はコロ ニーハイブリッド形成スクリーニング用ｃＤＮＡライブラリーの製造に関する。

例３はハイブリッド形成プローブの組立てに関する。例４は、ハイブリッド形成 スクリーニング、陽性クローンの同定、陽性ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定 及びポリペプチド−次構造配列（アミノ酸配列）情報の作成に関する。

例５はｈｐＧ−Ｃ３Ｆをコードするゲノムクローンの同定及び配列決定に関する 。例６は、大腸菌優先（ｐｒｅｔ’ｅｒｅｎｃｅ）コドンが用いられたｈｐＧ− ＣＳＦをコードする人工遺伝子の組立てに関する。

例７は、ｈｐＧ−Ｃ５ＦをコードするＤＮＡを組込んだ大腸菌形質転換ベクター の組立て方法、ｈｐｃｒ−ＣＳＦの原核生物発現におけるベクターの使用、及び 本発明の組換え産物の特性分析に関する。例８は、システィン残基がｈｐＧ−Ｃ ５ＦをコードするＤＮＡでの変異誘発により別の適切なアミノ酸残基で置換され たｈｐＧ−Ｃ８Ｆ類縁体の産生方法に関する。例９は、陽性ｃＤＮＡクローンか ら得たｈｐＧ−ＣＳＦ類縁体をフードするＤＮＡを組込んだベクターの組立て方 法、Ｃ０８−１細胞形質転換のためのベクターの使用、及び形質転換細胞の培養 増殖に関する。例１ｏは、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的及び生物学 的性質に関する。

ｈｐＣｙ−ｃｓｐ試料（３〜４ｕｒｒ、ＳＤＳ銀染色−ＰＡＧＥ純度８５〜９０ ％）は、ウェルトら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナルｅアカデミーφオ ブ壷サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、第１５２６−１５３０゜１９８５年〔警 ｅｌｔｅ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

（ＵＳＡ）　、旦１５２Ｂ−１５３０（１９８５）　’］に従い単離精製したも のと同様であって、スローン・ケタリング・インスティテユート（Ｓｌｏａｎ　 Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、ニューヨーク、ニューヨーク州か ら入手した。

この）１　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ試料のＮ末端アミノ酸配列を、ＡＢ４０７Ａ気相 分析装置〔アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｊｏｓｙｓｔｅ ａｓ）　、フォスター市、カリフォルニア〕を用いたミクロ配列分析により１号 操作（１？ｕｎ＃Ｉ）で決定し、下記表Ｉに掲示された配列情報を得た。

表１−ＩＶでは、単一文字コードが用いられており、“Ｘ。

は明確に決定されなかった残基を示し、括弧内の残基は単に択−的又は推定的に 示されたものである。

Ｋ二Ｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｓ−に−Ｌ−に−Ｑ−（Ｇ、Ｖ、５）−Ｇ−Ｌ−Ｘ− Ｘ−Ｘ高いバックグランドが操作サイクル毎に存在したが、その結果は表１に報 告されており、このことは試料がおそらく精製時の化学的残留物たる多くの汚染 成分を有することを示していた。配列を単に参照用として保存した。

２号操作（Ｒｕｎ　８２）では、第２試料（５〜６μｇ、純度９５％以下）は１ 号操作と同様にスローン・ケタリングから入手し、配列決定操作は１号操作と同 様にして実施した。この試料は、ウェルトら、プロシーディンゲス・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−、オブ拳サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、第１５２６−１ ５１３０頁、１９８５年の図４を作成するために用いられた物質の同一ロットか ら得たものである。結果は、表Ｈに示されている。

Ｘ− 更に多くの残基が同定されたが、２号操作では、適当数のプローブをｈｐＧ−Ｃ ＳＦ　ＤＮＡ調査用に組立て得るほど十分に長い明確な配列は得られなかった。

表■の配列に基づきｃＤＮＡの単離を行なうためには、少なくとも１５３６個の プローブが必要であろうと計算された。再度、試料の汚染が問題視された。

このため、第３試料（３〜５μｇ１純度４０％以下）を上記のようにスローン・ ケタリングがら入手した。この調製物は、更に精製するために、５ＤＳ−’ＰＡ ＧＥによる分離後、電気プロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ、　）に付した。

この試料の配列分析ではデータが得られなかった。

（Ｂ）修正方法により得られた物質の配列決定十分量の純粋物質を得て適切な最 終的アミノ酸配列分析を実施するため、スローン・ケタリングで産生されるもの 同様の膀胱癌細胞系５６３７の細胞（サブクローンＩＡ６）をイー・ブラッツア ー博士（Ｄｒ、Ｅ、　Ｐｌａｔｚｅｒ　）から入手した。細胞を最初にフラスコ 中のアイコブ（１ｓｃｏｖｅ’ｓ）培地〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）　、グランドア イランド、ニューヨーク〕で培養し、集密化させた。集密化時、培養物をトリプ シン処理し、ローラーボトル中に播種したが（１，５フラスコ／ボトル）、各ボ トルは５％ＣＯ２下で予め条件が整えられたアイコブ培地２５ｍ１を含有してい た。細胞を３７℃　０．３ｒｐｍで一夜増殖させた。

サイトデックス−１（Ｃｙｔｏｄｅｘ−１）ビーズ〔ファルマシアＣＰｈａｒω ａｃｉａ　）　、ウプサラ、スウェーデフ〕を洗浄し、下記操作により滅菌した 。ビーズ８ｇをボトルに加え、ＰＢＳ４００ｍｌを加えた。ビーズを３時間静か に攪拌して懸濁させた。ビーズを静置させた後、ＰＢＳを排出し、ビーズをＰＢ Ｓで洗浄し、新鮮ＰＢＳを加えた。

ビーズを１５分間オートクレーブで処理した。使用前に、ビーズを、新鮮培地＋ １０％牛脂児血清（Ｆ　ＣＳ）添加前にアイコブ培地→−１０９６ＦＣ３中で洗 浄し、処理ビーズを得た。

各ローラーボトルから３０ｍ１を除くすべての培地を除去した後、新鮮培地＋１ ０％ＦＣ５３０ｍｌ及び処理ビーズ４０ｍ１をボトルに加えた。ボトルを５９６ 　ＣＯ２処理し、すべての泡を吸引除去した。ボトルを、速度０．３ｒｐｍに低 下させる前、ローラー台に３ｒｐｍで０．　５時間載置した。３時間後、別のフ ラスコ内容物をトリプシン処理し、ビーズ含有の各ローラーボトルに加えた。

集密度４０〜５０９６の時点でローラーボトル培養物をＰＢ８５０ｍｌで洗浄し 、ＰＢＳ除去前１０分間回転させた。細胞を培地Ａ　（０，２％ＦＣ３，１０− ８Ｍヒドロコルチゾン、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン及び１ ００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有アイコブ培地〕中で４８時間培養した。

次いで、培養上澄を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して集め、−７０℃で貯 蔵した。培養物に１０％ＦＣ５含有培地Ａを再度加え、４８時間培養した。培地 を捨てた後、細胞を上記のようにＰＢＳで洗浄し、培地Ａ中で４８時間培養した 。

上澄を再度集め、上記のように処理した。

ＩＡ６細胞の培養培地約３０リツトルを、１０．０００Ｍ、Ｗ、遮断装置をもつ ２個のカセットを備えたミリボア・ベリコン（Ｍｆｌ目ｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｆｅ ｏｎ）　：ｘ、＝ットにより、ン濾過速度約２００ｍ１／ｍｉｎ及び保持速度的 １０００ｍｌ／ｍｉｎで約２リットルまで濃縮した。濃縮物を同−装置及び同一 流速により５０ｍ、Ｍ）リス（ｐＨ７，８）約１０リツトルで透析ン濾過した。

透析か過濃縮物を５０ｍＭトリス（ｐＨ７，８）で平衡化された１リツトル　Ｄ Ｅセルロースカラムに４０ｍ１／ａｉ、ｎで添加した。添加後、カラムを５０ｍ Ｍ）リス（ｐＨ７，８）１リツトル、次いで５０ｍＭ　ＮａＣ１含有５０ｍＭト リス（ｐＨ７，８）２リツトルにより同一速度で洗浄した。

カラムを次いでＮａＣ１濃度が７５ｍＭ、１００ｍＭ。

１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ及び３００ｍＭの６種の５０ｍＭ）リス（ ｐＨ７，５）１リツトルで連続的に溶出させた。両分（５０ｍｌ）を集め、活性 画分をプールし、ＹＭ５膜装備アミコン（Ａｍｌｃｏｎ）限外か過攪拌セルユニ ットで６５ｍ１に濃縮した。この濃縮物をＰＢＳで平衡化された２リツトルのＡ ｃＡ３４ゲル濾過カラムに添加した。カラムを８０ｍ１／ｈｒで操作し、１０ｎ ＋Ｊ画分を集めた。活性画分をプールし、ｃ４高性能液体クロマトグラフィー（ ＨＰ　Ｌ　Ｃ）カラムに直接添加した。

容量１２５〜８５０ｍ１で、タンパク質１〜８ｆｆ１ｇを含有し、その約１０％ がｈｐＧ−Ｃ５Ｆである試料を、流速１〜４ｍｌ／ｍｉｎでカラムに添加した。

添加後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで８０％２−プロパツール中の０．１Ｍ酢酸アンモ ニウム（ｐＨ５，Ｏ〜７．０）により洗浄した。１ｍ１画分を集め、タンパク質 について２２０ｎｍ、２６０ｎＩ１１及び２８０　ｎｍでモニターした。

精製した結果、ｈｐＧ−ＣＳＦ含有画分を他のタンパク質含有画分から（８０の 両分中７２及び７３番目の両分として）明確に分離した。ｈｐｃ−ｃｓｒ’は純 度約８０±５％及び収率的５０％で単離された（１５０〜３００　μｇ　）　ｏ この精製物質９１１ｇを４号操作（Ｒｕｎ　Ｈ）アミノ酸配列分析に使用し、タ ンパク質試料を非ポリブレンＴＦＡ活性ガラス繊維板に付着させた。配列分析は 、ヘライックら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５６ 巻、第７９９０−７９９７頁、１９８１年［ＩＩｅｗｉｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、＋ 　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅ口、、　２５６゜７９９０−７９９７　（１９８１ ）］及びライ、アナリティ力・キミカφアクタ、第１６３巻、第２４３−２４８ 頁、１９８４年（Ｌａｉ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｉｎ、　Ａｃｔａ、　１６３　、 ２４３−２４８　（１９８４））の方法に従い、Ａ　８４．７０　Ａ分析装置で 実施した。４号操作の結果は表■に示されている。

匡一旦 τｈｒ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｓ ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ　−Ｓｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ 　−Ｌｙｓ　−（Ｌｙｓ）−Ｌｅｕ　−（Ｇｌｕ）　−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　−Ａｒ ｇ　−Ｌｙｓ−工１ｅ　−（Ｇｌｎ）−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−Ａｌａ 　−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｘ− ４号操作では、（表■の残基３１に相当する）第３１サイクルより先において、 更に重要な配列情報は得られなかった。長い明確な配列を得るために、５号操作 （Ｒｕｎ　１ｉ５）においては、条件調整培地から精製されたｈｐＧ−ＣＳＦ１ ４μｇを４５℃で１時間β−メルカプトエタノール１０ｍ１で還元し、次いで減 圧下で完全に乾繊維板に付着させる前に５％ギ酸に再溶解した。配列分析は上記 ４号操作と同様にして実施した。５号操作の結表■ Ｔｈｒ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｓ ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　７　工１ｅ　−Ｇ ｉｎ　−、Ｇｌｙ　−Ａｓｐ　−（Ｊｙ　−八］−ａ　−Ａｌａ　−Ｖａｌ　− Ｐｈｅ　−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−（Ａｒｇ）　−（Ｐｈｅ）　−（Ｍｅ七）　− Ｘ−表■のアミノ酸配列は、下記ｈｐＧ−Ｃ３ＦｃＤＮＡを得るためのプローブ を組立てる上で、十分に長く（４４残基）かつ明確であった。

例２ 目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的操作の中には、標的遺伝子の発現に 基づき選択されたドナー細胞中に豊富に存在するｍ　ＲＮ　Ａの逆転写から得ら れるプラスミド担持ｃＤＮＡ“ライブラリー“の調製が含まれる。

ポリペプチドのアミノ酸配列の実質的部分が公知である場合には、“標的ｃＤＮ Ａ中での存在が推定される配列を複製した標識−重鎖ＤＮＡプローブ配列が、− 重鎮型に変性されたｃＤＮＡのクローンコピーに対して実施されるＤ　Ｎ　Ａ／ Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッド形成操作において使用され得る。ワイスマン（Ｖｅｌｓ ｓｍａｎ）ら、米国特許第４゜３９４．４４３号明細書、ウオレスら、ヌクレイ ツク・アシッズ・リサーチ、第６巻、第３５４３−３５５７頁、１９７９年〔ν ａｌｌａｃｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７９巻、 第３２７０−３２７４頁、１９８２年（Ｒｅｙｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、７９．３２７０−３２７４（１９８２）　）　、及びジエイ（Ｊａ ｙｅ）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーサ、第１１巻、第２３２５−２３３ ５．１９８３年。更に、診断実施時におけるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操 作に関するファルコ−（Ｐａｌｋｏｖ）らの米国特許第４，３５８，５３５号明 細書、及びコロニー及びプラーク／１イブリツド形成技術に関するデービスら、 “遺伝子工学、高等細菌遺伝学のマニュアル”、コールド・スプリング・ノ＼− ，（−・ラボラトリ−［Ｄａｖｌｓ、ｅｔ　ａｌ、、”Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏ ｒ　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒ ｊａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ〕・コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、１９８０年 、第５５−５８頁及び第１７４−１７６頁参照。

完全ＲＮＡの定量的単離のためのグアニジニウムチオシアネート操作〔チャーブ ウィンら、バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４−５２９９頁、１９７９ 年（１９７ｇ））　）により、全ＲＮＡを膀胱癌細胞系５６３７（ＩＡ６）細胞 的１ｇから抽出した。

無菌ＲＮＡ水溶液はＩＡ６細胞由来の全ＲＮＡを含有していた。全ＲＮＡ溶液か らメツセンジャーＲＮＡのみを得るため、溶液をオリゴデオキシチミジレ−１・ 〔オリゴ（ｄＴ））［コラボレーティブ・ジーサ社（Ｃｏｌｌａｂｏ−ｒａｔｌ ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃ、ｈ、　Ｉｎｃ、　）　、ウオルサム、マサチューセッツ 〕含有カラムに通した。メツセンジャーＲＮＡに特有のポリアデニル化（ポリＡ ”）尾部はカラムに付着するが、リポソームＲＮＡは溶出する。かかる操作の結 果、ポリアデニル化メツセンジャーＲＮＡ　（ポリＡ＋ｍＲＮＡ）約９０μｇを 単離した。単離されたポリＡ＋メツセンジャーＲＮＡを、ｃＤＮＡ反応で使用す る前に、最終濃度４ｒｎＭで５分間室温で水酸化メチル水銀〔アルファ６ベント ロン（Ａｌｐｈａ　Ｖｅｎｔｒｏｎ　）　、デフバーズ、マサチューセッツ〕に より前処理した。水酸化メチル水銀処理は、翻訳を阻害するメツセンジャーＲＮ Ａ自体の相互反応及びそれと汚染分子との相互反応を抑制させた。

ベイバーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル−ケミストリー、第２５８巻、 第７６３６−７６４２頁、オカヤマ操作法〔オカヤマら、モレキュラー・アンド ・セルラー・バイオロジー、第２巻、第１６１−１７０頁、１９８２年（Ｏｋａ ｙａｍａ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏ１ｃｕｌａｒ　＆　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏ ｌｏｇｙ、　２，１６１．−１７０　（１９８２））　）に従い、ｃＤＮＡバン クをＩＡ６細胞から得たｍ　ＲＮ　Ａにより調製した。

ｃＤＮＡを次いでインキュベートして増幅用宿主微生物大腸菌に一１２株ＨＢＩ ＯＩに組込んだ。

例３ 表■のｈｐＧ−ＣＳＦアミノ末端配列に基づき考え出されたハイブリッド形成プ ローブは、各々が長さ２３塩基で３個のイノシン残基を有する２４組のオリゴヌ クレオチドから構成されていた。プローブオリゴヌクレオチドをカルザースら、 ジエネティック・エンジニアリング、第４巻、第１−１８頁、１９８２年［（Ｃ ａｒｕｔｈｅｒｓ、　ｅｔａｔ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 、　４　、１−１８　（１９８２）　］の操作に従い製造し、ポリヌクレオチド キナーゼでリン酸化（Ｋｌｎａｓｌｎｇ）することによりｒ−”２Ｐ　ＡＴＰで 標識した。表■の配列中残基２３−３０のメツセンジャーＲＮＡに対応するプロ ーブオリゴヌクレオチドは、表■に示ｈｐＧ−ＣＳＦプローブ 中立性をｌに付与したのは、タカハシら、ブロシーデインダス・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、第１９３１−１９３ ５頁、１９８５年（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ！、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８２．１９３１−１９３５　（１９８５））及びオーツカ ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第２６０ ５−２６０８頁、１９８５年（Ｏｈｔｓｕｋａ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０　、２６０５−２６０８（１９８５））の公表研 究に基づいていた。しかしながら、イノシンはＧ又はＴと塩基対形成した場合に は脱安走化効果を有する。タカハシらの場合では、イノシンは、それらが一群と して平均化してほぼ中立化するに到ることがら、中立効果を有するようである（ 例えば、３個はＣと好ましく対形成したが、２個はＴと対形成し好ましくなかっ た）。

ＧとのＩ塩基対形成効果を試験するため、コントロール実験をＮ−ｍｙｃ遺伝子 配列及びクローンを用いて計画した。Ｎ−ｍｙｃ遺伝子から得た配列は、ｈｐｃ 　−Ｃ８Ｆプローブで規定されたものと同一の全体的Ｇ及びＣ含有率を、各コド ンの最初の２つの位置で有していた。

したがって、Ｎ−ｍｙｃ試験プローブは、ｈｐｃ　−Ｃ８Ｆプローブと比較し、 同一の長さであり、同一の相対的位置に■を含有し、しかも潜在的に同一の平均 Ｔｍ（６２〜６６℃、３又は４個のイノシン残基を含有しているためではない） を有していた。

２組のＮ−ｍｙｃ試験プローブを前記カルザースらの操作に従い組立てた。表■ に示された第１組は、以下のものを含んでいた；１．完全対合体の２３量体：２ ．３個の３位置が、■を加えた場合に最悪のケースを生じるようにｌで置換され ている；３゜４個の３位が■で置換されている。第２組の試験プローブは、全体 的な中立的塩基対形成効果を与え得るイノシン塩基対のよりランダムな配置を表 わすために考え出された。表■に示された第２組は以下のものを含んでいた；４ ．Ｃと塩基対形成する２個のＩ及びＧ塩基対形成する１個の工を有する；５．１ ：Ｇ塩基対たるもう１個のＩを存する４と同一である。

表■ Ｎ−ｍｙｃ試験プローブ １、”ＣＡＣＭＣＴＡＴ　ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣ”２、”ＣＡＣＡＡＣ ＴＡＴ　Ｇ（Ｊ　ＧＣＣＣｆＪ　ＴＣＩ　ＣＣ”３、”ＣＡ工ＡＡＣＴＡＴ　Ｇ ＣＩ　ＧＣＣＣ（Ｊ　ＴＣＩ　ＣＣ”４、”ＡＡＣＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＧＩ　Ｇ ＧＣＡＧＸ　Ｃ（Ｊ　ＧＣ”５、”ＡＡＩ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＧＩ　ＧＧＣＡ （、Ｉ　ＣＣＩ　ＧＣ”Ｎ−ｍｙｃＤＮＡ配列及びニワトリ成長ホルモンＤＮＡ 配列（陰性コントロール）を含有する５個のレプリカフィルターを、ハイブリッ ド形成前に、減圧オーブン中８０℃で２時間焼いた。すべてのフィルターは、ハ イブリッド形成時間が６時間のみであること以外、ｈｐｃ−ＣＳＦプローブに関 して例４で記載されたように、ハイブリッド形成した。フィルターを室温で３回 しかる後４５℃で１回各々１０分間洗浄した。フィルターをガイガーカウンター でモニターした。

Ｎ−ｍｙｃプローブ３のフィルターは他の４個のプローブフィルターと比較して 非常に弱いシグナルを発したため、それ以上洗浄しなかった。５０℃で１０分間 洗浄後、ガイガーカウンターは、プローブ１を１００％標準として、下記％シグ ナルを表示したニブローブ２．２０％；プローブ３（４５℃）、２％；プローブ ４．９２％；及びプローブ５．７５％。５５℃での洗浄後は、％がニブローブ２ ．１６％；プローブ４．１００％；及びプローブ５．８０％であった。６０℃で の最終洗浄では下記９６を表示したニブローブ２．１．６％；プローブ４．９０ ％；及びプローブ５．７０％。

このように、プローブ２及び４のように３個の■が存在する場合では、シグナル において６０倍までの差違が、理論的Ｔｍ（Ｉは計算に含まれていない）は〔最 悪の■塩基対形成例（プローブ２）及び比較的中立なＩ塩基対形成例（プローブ ４）に関して〕近いにもかかわらず観察される。

Ｎ−ｍｙｃ試験ハイブリッド形成により得られた標準化情報は、より厳格でない 洗浄による結果が許容され得る信頼度を測定するために、下記のように洗浄及び ｈｐＧ−Ｃ３Ｆハイブリツド形成のモニターに際して利用された。

匹−Ａ ハナハンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１６６巻、第 ５５７−５８０頁、１９８３年（Ｈａｎａｈａｎ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、　Ｈ ｏｔ、　Ｂｉｏｌ、、　１６６．５５７−５８０（１９１１ｔ３））の操作に従 い、例２で産生されたｃＤＮＡインサート（ｉｎｓｅｒｔ）との組換え体を含む 細菌を、寒天プレート上に載置された２４個のニトロセルロースフィルター〔ミ リポア（Ｍｉｌｌｌｐｏｒｅ　）　、ベッドフォード、マサチューセッツ〕に拡 散した。プレートを次いでインキュベートして約１５０，０００個のコロニーを 得たが、これを２４個の他のニトロセルロースフィルターに移してレプリカ培養 した。レプリカを明瞭なコロニーが出現するまでインキュベートした。フィルタ ー上の細菌を、１゜分間水酸化ナトリウム（０，５Ｍ）でわずかに飽和され、し かる後２分間トリス（ＩＭ）でプロットされ、次いで１０分間Ｎａ’ＣＩ　（１ ，５Ｍ）含有トリス（０，５Ｍ）でプロットされたワットマン３ＭＭ紙上で溶菌 させた。

フィルターがほぼ乾燥した後、それらを核酸ハイブリッド形成前に減圧オーブン 中８０℃で２時間焼いた。ウアールら、プロシーディンゲス・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７６巻、第３６８３−３６８７頁、１ ９７９年（Ｗａｈｌ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔ　Ｉ　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、７６、３６８３−３８８７　 （１９７９））　、及びマニアティスら、セル、第８１巻、第１６３−１８２頁 、フィルターを１０Ｘデンハード（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）　０．２％ＳＤＳ及び６ ＸＳＳＣ７５０ｍ１中６５℃で２時間、前ハイブリッド形成させた。フィルター を６ＸＳＳＣで洗浄し・次いで４つをノくラグに入れ、６ＸＳＳＣ及び１０Ｘデ ンハード中で１４時間ハイブリッド形成させた０５０Ｘ１０　ｃｐｍの３２Ｐ− 標識プローブ（オリゴヌクレオチド）を有するバッグ当たり、溶液的１５ｍ１が 入っていた。

ハイブリッド形成後、フィルターを６ＸＳＳＣ（１リツトル／洗浄）中で３回室 温で各々１０分間洗浄した。

フィルターを次いで６ＸＳ　Ｓ　Ｃ１リツトルにより、４５”Ｃ１５分間で１回 洗浄した。フィルターを増強スクリーン及びコダックＸＡＲ−２フィルムにより 一７０℃で２時間オートラジオグラフィーに付した。このオートラジオグラフで は、５個の非常に強いシグナルを含む４０〜５０個の陽性シグナルが検出された 。

最強の５個のシグナル及び別の５個の陽性シグナルを含む領域をマスタープレー トからこすり落とし、同一条件下同一プローブ混合物を用いて二次スクリーニン グに移した。洗浄操作は、高温洗浄が５５℃１５分間で各々２回、及びしかる後 の６０℃１５分間で１回からなる点で異なっていた。例３のＮ−ｍｙｃプローブ 研究に基づき、二次スクリーニングでの最終洗浄温度を上げたが、２４個の２３ 量体に関する凝集融解温度がＮ−ｍｙｃプローブの温度に近似した６０〜６８℃ であったためである。２回目の５５℃での洗浄後、フィルターを湿潤させたまま にし、オートラジオグラフィーに付した。このオートラジオグラフィーと、６０ ℃での最終洗浄後同じ時間をかけた２回目のオートラジオグラフィーとの比較で は、１０個の彼試クローンのうち２個だけが５５℃〜６０℃以上に昇温させた場 合にシグナルの実質的損失をうけないことを明らかにした。これら２個のクロー ンは、はぼ同一の長さ及び制限エンドヌクレアーゼパターンであることが後に示 された。Ｐｐｏ２と称される１個のクローンを配列決定のため選択した。

上記操作で得られた組換えｈｐＧ−ＣＳＦｃＤＮＡクローンのＰｐｏ２の配列決 定は、サンガーら、プロシーディンゲス・オブΦナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７４巻、第５４６３−５４６７頁、１９７７年（Ｓ ａｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

ＳＣｔ、（ＵＳＡ）、７４．５４６３−５４６７　（１９７７））のジデオキシ 法により達成された。−重鎖ＤＮＡファージＭ−１３は、二重鎖ｃＤＮＡクロー ンの一重鎖ＤＮＡ鋳型を供給するためのクローニングベクターとして使用した。

サンガーらの方法により、表■に示されているようなアミノ酸翻訳を伴う配列及 びポリペプチドコード領域の相補鎖が明らかとなった。

ＯＢ−＜　ｅｌｊ○　コロＣＪ　Ｏ（Ｊロ　−ｔＪｃ：）　Ｑ＜Ｅｓ−ｃＪ（ｊ 　ｖ−４＜Ｅｓ　、−＋（＋−１ｋ（Ｊリ　＞＜ｈ　Ｊ：ｕ。

山ｕｔｐ　じＱロ　じｏｕ　ｃｂｃ、＋じ　？？（Ｅ−＋＜Ｅ’ＷＣＪＣｊ　Ｑ ＋？＜　：ｊ（ｊｃＪ　ｅｃ：ｌ（Ｊ　＞ＱＣＪのＯｃＪ　φくト　Φ−く　− く８　−○Ｑψく８　く口ＣＪ　ＩＣＪ（！ｌ　ロＱＱ　Ｑ口Ｑｚａｖ　ｏｕｏ 　ｕｏｃ＋　？　＜　。　ＣＪ（ＪＣＪ計ご　起談δ間　旧　已　舐　冨　足　 ？＞ｏｕ　ｔａｏｏ　＝ｒｏｕ　ｕ　＜　。　ｏＨＨＵＥ−＜　ＨＣＪＱ　のト く　。　ａｕ＜　。　くｘ＜ｔｓ　＜ｏｏ　ｔｐｕｃ：＋　Ｅ−１ａ　ａ　ｈ　 ＜　Ｅ−ｏｃａｖｃｒｍｔｙａｃｙａｒｏｏ　＜　ｃｚ　（Ｊ　＜　ＣＪ　ｃｐ 北５Ｃ二士乏二酵ゴ　８　６　肛　冒　８ｇｅｏｕ　ｍｏｏ　＊ｕｏ　ＣＪ　＜ 　＜　ｈ　ａ　＜、−＋　＜　Ｅ−＋−Ｉ　ＣＪ　ｕｌ 。ｕｏ　＜ｃｚａ　茂壮　ビ　冒　ビ　８　ミ　？ｎツＯ（りｃｌ：（プｕｍｃ ノ（り！デＯＬ＋（り（っ（ｊＵ（ＪＣＪ＋Ｕリ　−＜Ｅ−＋　−＋ＣＪ（ｊ ＜○（Ｊ　ＣｊＣＪ（Ｊ　（Ｑ（Ｊ　ロと３３　３　；　ｕ　冒　８ル乏　翻８ １乏　正ａ”、５’　と 山−＜　Ｅ−１（Ｅ−１＞ｕｏ　ｏｕｏ　Ｅ−Ｉ　Ｅ−１。　００ＱＩＯリ　ｏ ｕｏ　コロＵ　閃’ｒｕａ　＜　シ　０　０　ロａ’ｈ＜ｈ　−ｕｏ　ｅＪｈ＜ 　＋ｕｏ　Ｅ−１。　ｈＨ，）＜ｏｕ　ｏ、Ｑｏ　ｑｏ＊　ｒａｕ　（Ｊ　（Ｊ 　（Ｊ　ＣＪ　＜ｍｕａ　ｃｏｏ　、−＜ｕｃ　’：ｓｈ＜　ｈ　？　ＣＪ　ｏ 　。

篇ｇｇｇ５ｃ　兆ご　３発　ビ　２　＄　８８ＣＩＦ−１ｃＪ’＋５　０：００ 　０＞ＣｊＣＪ　０ＦＣＪ（ｊ　＜　。　？４Ｕ−弓トく　會のＥ−＋＜　ＬＩ ′Ｉｘす０　さ−＜Ｅ＠　Ｅ−Ｉ　Ｅ−Ｉ　ＣＪ　リ　ト８＞ｏｃ、＋　、−＋ 、ｓｕｏ　、＜ｏｃｐｕ　、−＋＝ｕｏ　Ｅ−Ｉ　ＣＪ　ＣＪ　？　ａ１買　二 ８８°　ど８８　芯３”　ゴ　ご　淀（ｊｃＪＬｌ　（Ｃ）（Ｊ　＜Ｃｕｔ：ｌ 　〉ＱＣＪ　＜　（Ｊ　ＬＩ　Ｅ−＋　ｌｊ表■の下記特徴は顕著である。配列 の５′末端には、ポリＧｃＤＮＡリンカー配列に相当する塩基が示されている。

次いで約５個の塩基（“Ｎ′と表示されている）が存在するが、その配列は前に ある多数のＧのためにサンガーらの方法によっては容易に明確に決定することが できなかった。その後の配列は、ポリペプチドのリーダー配列と推定される部分 をコードする１２個のコドンを表わす。例１に記載されたｈｐＧ−Ｃ３Ｆ天然単 離物のアミノ末端配列との対応により、ｈｐｃ−ｃｓｉ；’の推定的“成熟２型 における最初のスレオニン残基は＋１で示されている。成熟ｈｐＧ−Ｃ３Ｆは、 示された如＜１７４個の残基を有することがその後爪された。“停止”コドン（ ＯＰコドン、ＴＧＡ）の後に、約８５６塩基の非翻訳３′配列及びポリＡ“尾部 ″の多数のＡが続く。唯一のＨｇｔＡＩ及びＡｐａｌルミｌ制限エンドヌクレア ーゼ位、並びに２つの５ｔｕ１部位（原核及び真核細胞発現系の組立てに関して 以下で説明されている）も表■に示されている。ポリペプチド中におけるアスパ ラギン残基の欠損のため、Ｎ−グリコジル化のための明確な部位は存在しない。

３′非翻訳配列末端近くで下線が引かれた６個の塩基は、潜在的ポリアデニル化 部位を表わす。

合計４５０，０００個のクローンの中から」１記ハイブリッド形成操作により同 定された２つの他のｃＤＮＡクローンの各々が、転写開始部位以降の全リーダー 配列をコードするＤＮＡを含有してぃなかったことは、注目に値する。なるほど 、３つすべてのｈｐｃ−ｃｓＦクローンは正確に同一部位の５′領域で集結して おり、このことは転写されたｍＲＮＡの二次構造がこの部位より先のｃＤＮＡ形 成を著しく阻害することを示唆している。実際には、したがって、オカヤマら、 モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第３巻、第２８０−２８９頁 、１９８３年（Ｏｋａｙｍａ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１．　ａｎｄＣｅｌｌ、 Ｂｆｏｌ、、　３　、２８０−２８９　（１９８３））に記載され、しがもウォ ンら、サイエンス、第２２８巻、第８１０−８１４頁、１９８５年〔−“ｏｎｇ 、　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２ｇ・８１０−８１４　（１９８５ ））においてＧＭ−Ｃ３Ｆを単離するために現実に利用されたｃＤＮＡ発現スク リーニングは、ｈｐＧ−Ｃ５ＦＤＮＡの単離に簡単に利用することができなかっ たが、その理由は、かかる単離系が通常被験クローン中における全長のｃＤＮＡ 転写体の存否に依存しているからである。

上記配列は、微生物宿主におけるｈｐＧ−Ｃ５Ｆの直接的発現を確実化するには 、困難である。ががる発現を確実にするためｈｐＧ−ＣＳＦコード領域には開始 ＡＴＧコドンを加えるべきであり、しかもその配列は適切なプロモーター／レギ ュレーターＤＮＡ配列の制御下にある部位で形質転換ベクター中に挿入されるべ きである。

例５ この例では、前記例で単離されるようなｈｐｃｙ−Ｃ５ＦコードｃＤＮＡを用い てゲノムクローンをスクリーニングした。λファージヒト胎児肝ゲノムライブラ リー〔ローンら、セル、第１５巻、第１１５７−１１７４頁、１９７８年（Ｌａ ｗｎ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　１５．１１５ｌｌ５７−１１７４（１９ ７の操作に従い製造され、ティー・マニアテイス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　） から入手した〕を、Ｈｇ１ＡＩ及び５ｔｕＩで切断単離された２つのｈｐＧ−Ｃ ３ＦｃＤＮＡ断片（ＨｇｉＡＩ−５ｔｕＩ、６４９塩基対；５ｔｕＩ−ＳｔｕＩ 、６３９塩基対）からなるニック（ｎｉｃｋ）翻訳プローブを用いてスクリーニ ングした。合計的５００．０００個のファージを１２個のベトリ皿（１５ｃｍ） で培養し、プラークを取出し、ベントン／デビソン（Ｂｅｎｔｏｎ／　Ｄａｖｉ ｓｏｎ　）操作法〔ベントンら、サイエンス、第１９６巻、第１８０頁、１９７ ７年（Ｂｅｎｔｏｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６．１８０　（１９７７））　）によ りプローブとハイブリッド形成させた。合計１２個の陽性クローンが観察された 。二次スクリーニングにおけるオートラジオグラフィーで最強シグナルを生じた ３個のクローン（１〜３）を、１リツトル培地中で増殖させ、放射線標識２４量 体オリゴヌクレオチド（γ−３２Ｆ　ＡＴＰでキナーゼ処理されている）５’　 ＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧ３’を用いて制限酵素切断 及びザザーンプロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）により遺伝 子地図を作成した。地図作成結果は、単離体１及び３が同一であって、単離体２ がｈ　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子の５′に付加した２０００個の塩基を含有する ことを示していた。したがって、クローン２を更に特徴づけるために使用した。

クローン２のＤＮＡをＲ１で切断して８５００塩基対のｈｐＧ−ＣＳＦ含有断片 を得、これを次いでｐＢＲ３２２に組込んでサブクローニングし、更に制限エン ドヌクレアーゼ切断、サザーンプロット法、Ｍ１Ｂサブクローニング及び配列決 定により遺伝子地図を作成した。得られた配列は■に示されたとおりである。

ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ地図（ 約３．４キロ塩基対）は図１で詳細に記されている。図１で示された制限エンド ヌクレアーゼは、ＮｃｏｌｓＮ；Ｐｓｔｌ、Ｐ；ＢａｍＨＩＢ；ＡｐａＩ、Ａ； ＸｈｏｌＳＸ；及びＫｐｎ、にである。図の下方の矢印は、ゲノム配列を得るた めに利用される配列決定方法を示す。ボックス領域はｃＤＮＡクローン中の領域 であり、点線の端部ボックスはｃＤＮＡクローン中に存在しないもののｍＲＮＡ プロット法により同定された配列を表わす。エキソン配列たるコード配列の同定 をノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）プロット法により実施した。エキソン１及び２ における推定的スプライス部位にまたがる２４量体オリゴヌクレオチドプローブ 、５′ＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＴ３′を、ノーサンプ ロット法でｈｐＧ−Ｃ８ＦｍＲＮＡとハイブリッド形成させた。得たプロットは 、エキソン２のオリゴヌクレオチドプローブの場合と同様のサイズ（１６５０塩 基対以下）のｍＲＮＡを示す。このデータは、表■で示されるＭｅｔ開始コドン を用いたｐＳＶＧＭ　−Ｐ　ｐ　ｏ　ｌベクター（例９）によるｈｐＧ−ＣＳＦ の直接的発現能と一緒に考え合わされた場合に、エキソン］に含有されるコード 配列を規定する。エキソン２〜５は、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ遺伝子（表■）のＣＤ　Ｎ 　Ａクローン（Ｐ　ｐ　ｏ　２）において得られるコード配列により規定される 。

例に の例は、ｈ　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有する人 工遺伝子の製造に関する。

簡潔に述べると、用いられたプロトコールは、全般的に、参考のため本明細書に 包含される共有権者アルドン（Ａｌｔｏｎ　）らのＰＣＴ公開第ＷＯ３３１０４ ０５３号明細書の開示に示されているとおりであった。遺伝子は、成分オリゴヌ クレオチドが多数の二重鎖にまず集合するように考えられ、二重鎖は次いで３つ の別個のセクションにまとめられた。これらセクションは簡易な増幅用として考 えられ、増幅系から除去された後に、適切な発現ベクター中に連続的に又は多数 の断片結合を介してまとめることができた。

セクション１１■及び■の構造は表■〜ＸＩＶに示されている。表■及びＸに示 されたセクションＩの構造において、オリゴヌクレオチド１〜１４は７本の二重 鎖（１及び８；２及び９：３及び１０；４及び１１；５及び１２；６及び１３； ７及び１４）にまとめられた。７本の二重鎖を次いで結合し、表Ｘに示されるセ クションＩを形成した。表Ｘにおいて、セクションエは増幅・発現ベクターとの 結合及びセクション■との結合のために用いられる上流Ｘｂａｌ付着端及び下流 ＢａｍＨＩ付着端を含有することにも着目されるであろう。

表■ ＥＣｈｐＧ−ＣＳＦＤＮＡセクションＩＧＡＴＣＣＣＭＧＡＧ、！１．ＡＴＧＡ ＣＣＣＡＧＣＡＧＴ　１４表ＸＩ及びＸ■に示されるセクション■の構造におい て、オリゴヌクレオチド１５〜３０は８本の二重鎖（］５及び２３　；　１６及 び２４；１７及び２５　；　１８及び２６；１９及び２７．２０及び２８；２１ 及び２９；２２及び３０）にまとめられた。これら８本の二重鎖を次いで結合し 、表Ｘ■に示されるセクション■を形成した。表Ｘ■で更に示されるように、セ クション■は増幅ベクターとの結合及びセクションＩとの結合のために用いられ る上流ＢａｍＨＩ付着端及び下流Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　（”ｆ置端を有する。その 下流端部近くでは、セクション■は最後の結合セクション■及び■に用いられる 下流５ｓｔＩ部位も有している。

表ＸＩ ＧＡＴＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＴＧＴＣＴＴＣＴ　１５ＴＧＴＣＣＡ、Ｔ ＣＴＣＡＡ、ＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＣ１６ＴＧＧＴＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣ ＭＣＴＧＣＡＴＴＣＴＧＧＴ　１７ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＴＣＴ ＴＣＴＧ　１８ＣＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡ、Ｊ’１．ＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＧＧ Ａ　１９ＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＧ、１．ＣＡＣＴＣＴＧＣＡ　２０ ＧＣＴＡＧＡＴＧＴＡＧＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＡＣＴＡＣＴ　２１ＡＴＴＴＧ ＧＣＡＡ、ＣＡＧＡＴＧＧＭＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧ　２２ＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡ ＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧ　２３ＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣ ＴＴＧＡＧＡＴＧ　２４ＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＡ’ｒＧＣＡＧＴＴＧ八ＧＡＣＡ ＧＡＣＡ　２５ＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡ　２６ＣＡ ＧＴＴＣＣＧＧＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＧ　２７ＭＴＴＣＴＴＴＧＡ ＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣ３０取■に、でノンヨ／、ｕＬは衣λ１ ｕ双υλｌ■（こボされ蒐いるように組立てられた。この組立てのために、オリ ゴヌクレオチド３１〜４２は６本の二重鎖（３１及び３７；３２及び３８．３３ 及び３９．３４及び４０；３５及びセクションＩで形成されたＸｂａｌ−Ｂａｍ 、ＨＩ断片を、Ｘｂａｌ及びＢａｍＨＩで開環されたＭ１３ｍｐ］１ファージベ クターに結合する。ベクターを次いでＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断すること により再開環し、次いでセクション■で形成されたＢ　ａ　ｍ　ＨＩ〜ＥｃｏＲ Ｉ断片と結合する。この段階で、セクションＩ及び■は適切な方向で結合された 。次いで別のＭ１３ｍｐＨベクターをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断で開環し、し かる後セクション■で形成されたＢａｍＨＩ〜ＥｃｏＲＩ断片と結合した。

セクションエ及び■含有ベクターをＸｂａＩ及び５ｓｔｌで切断する。同様に、 セクション■含有ベクターをＳｓｔ！及びＥｃｏＲＩで切断する。各々の切断で 得る２つの断片のうち小断片の両方を、事前にＸｂａｌ及びＥｃｏＲＩで開環さ れたプラスミドｐ　ＣＦ　Ｍ１１５６に結合する。この反応の生成物は表Ｘｖに 示される連続ＤＮＡ配列含有の発現プラスミドであって、そのＤＮＡ配列は大腸 菌翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（Ａ、　Ｔ　Ｇ　）をもつ完全ｈｐ Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドをコードしている。

コＱ　Ｅ−Ｉｌ）　コＯコト　コＱ　ロト　−ト　≧。

ａＪｈ　（ＪＦ−１０ＪＥ＠ａ＋ｔ−ＣＩＥ−Ｉ　Ｅｌｌ＜　、４（Ｊ　＋ｃｑ ＪＣＪ　Ｃ：Ｉ＜　＋ｊＣＪ　＋−２（Ｊ　ＪＣＪ　＜Ｏ＜Ｃ：Ｉ　に＋ｒ＝北 　暮シ　；ご　二〇　社　肝　８ご　：こ（／ＩＥ−＋　１ｊｌｊ　＞Ｃ：Ｉ　 ＜ＣＤ　ＩＣＪ　＋ｊＣＪ　Ｑ、（Ｊ　（ｑｌ、１ｌ−４ｃＪα　：ＩＣ：＋　 Ｃｄ、　＞ｌ−ｔ　ｅＬ）　ｍ＜　ｌ：Ｍａｈａ　＜ｖ＋　ａｓｌ−１Ｐ−１（ ：　＋ｔ）　、−１（、−１（Ｊ　ｗｃｕｈｈ　Ｃ：）＜　ＱＣＪ　Ｃ）（Ｊ　 ＯＱ　ＱＬＩ　＜Ｃ：２　＜ｔ−閃Ｅ−１１−１＞　コＬ）　１−Ｅ−ロロ　り ０　υリ　ひ〔−ＣＪ　Ｌｌ！−１−＜　ＪＣＪ　、−１＜　ωＥ−１のトー（ ＜ａ　リ０　０ロ　のト　ロリ　−〇　工＜＜（ＯＥ４（ｊｃ　：Ｉ＜　Ｏ＜　 Ｌ−Ｅ−１１−Ｅ−１＞ｈ　ｃｃ。

しくＪ　（Ｐ−１−＜　Ｉ−Ｉ（Ｊ　為く　二〇　−ロ　−ｃ山（Ｊ　ｕｏ　ｏ ｃｐ　粂Ｑ　トド　トく　ｃロ　○（＞ｈ　ＣＪ（Ｌｌ　ｏａ　ａ’＋＋−ｔ　 ：ｘａ　ｃ、ｕ　コｕ　ａｔｒ−？＜５　１＋Ｆ−４ｙＣＪ＞ｏ　Φ−ψく　Φ ト　二〔ＱＣｊ　＜ＨＱ、ＣＪ　（ＪＥ−１ＩＣＪ　＜ロ　−Ｑ　ら〔コく　く φ　φシ　−９のり　＝０　コ○　弓Ｃ６３Ｅ４　＜　＞　−（ＧＪ　（Ｊ　、 １：　Ｅ＠　ＯＪ　Ｅ−＊　−（−ＣＪ　ｈ　（Ｊ　＝ＣＪ　ψ−−ト　−Ｑ　 ロ０　＜【二０＜　Ｅ−１０１ＣＩＩＣＪ　１１−４　ＯＣｊ　ＷＦ４　：ｌ＜ 　１ａＣＩ−ＩＣＪ　Ｑ　ｌｊ　＞ロ　ａｔ（Ｊ　ａ＋？　ｘ：ＣＪ　、−１（ ＋！ＪＣＣ，ＣＪ　ＣＪ（ｃ、＋ｈ　ｃｎｈ　−ｕ　Ｅ−（００ｃｎ＋−＜　＜ ｚ　ｋｃＪ　Ｉ′ａＥ−Ｉｍｈ　コ（ｊ　ｅ　＜　ｍ　！ｈ　＜ｌ−１＞＜　− １ｃＪ　・−＜Ｕ　ｈ　？　＜　＋　Ｃ（Ｃ：ｌ　Ｑ　ｈ　Ｅ’　ｍ　ｌｌｊ　 工ＣＪ　：　ＣＪ　Ｑ　（Ｊ　＜　Ｉ−（０：Ｉ　叶　リ　コ○　コく　卿　０ 【−＜　Ｅ−１６Ｊ二ＣＪ　ｌｉＱ　ｃ＋ｈ　−＜　ｕｏ　１ｉ（Ｅ−Ｉ　ＣＪ −ｈ（？ｌ−＜　、−１（Ｊ　Ｏロートへ（＜　Ｅ４ｔｎ　ｍ？　Ｏ（ｊ　Ｃ＜ 　ＯＣｊ　ａｌＥ−＋　ｗｐ＝　？ご　＝８　と８６西　と８　＝聾　肛Ｃ５０ コ　：＝＋０　飄ロ　りＯＪＣＪ　ｌ−？　飄［詫　Ｃｔ：　ｉｃｅ　Ｆ８３ｅ 　：ギ　起足　計已　ｇ”　′！＞乏　テ釦　′！＞Ｓ　陰陽　二８　工：ＣＪ 　ＣＪ＋Ｊ　ｂ−３＜　−（Ｊ　ＣＪＥ−１（ｊじ　＜ａ　ｇｔ−龜　闘　啄　 ムＩ　タ騎　占ｇ　本　氾ゴ　８＝　５瓢　、＝謳　２８　記？　鼾藁　８２＜ 　＜ＣＩＩ　Ｌｌ（Ｊ　ＥＣＪ　＜ｕ　ｔｊｃＪ　＜ＯＱｌ（リ　くｅ　コＱ　 為−コＱ　閲ト　句シ　仁口＜　＜−〇ＩＥ−Ｉ　Ｐ４ｏ　Φ９　−〇　−ＣＪ 　Ｉ−＋１ＱＥ−１（ＪＣ）　ｔＪｃＪ　Ｃ：Ｉ（ｊ　−ＣＪ　＜Ｕ　＜○　Ｑ （いずれの適切なベクターもこのＤＮＡ発現のために使用することができるが、 発現プラスミドｐｃｉ：’ｒν１１１５６はプラスミドｐｃＦＮ１Ｂ３６から容 易に組立てることができ、その構造は公開欧州特許出願第１３６．４９０号明細 書に記載され°ＣいるｐＣＦＭ８３６をまずＮｄｅｌで切断し、次いで両方に存 在するＮｄｅＩ部位が破壊されるようにＰｏ１Ｉでプラント末端化する。次いで 、ベクターをＣＩａＩ及び５ａｃｌＩで切断して、存在するポリリンカーを除去 し、しかる後人ＸＶＩに示される代替ポリリンカーに結合する。この代替ポリリ ンカーは、前記アルドンらの操作に従い組立てることができる。発現ｐｃＦＭ１ １５６ブラスミドにおける発現制御はλＰＬプロモーターによるが、これ自体が （大腸菌株に１２ΔＨｔ　ｒｐから得られるような）ＣＩ８５７リプレツサー遺 伝子の制御下にある。

この例は、［Ｍｅ　ｔ−１）ｈｐＣ５Ｆ：＋−ドＤＮＡ配列によるｈ　ｐ　Ｇ、 −ＣＳ　Ｆポリペプチドの大腸菌発現に関する。使用された配列は、部分的に合 成で、部分的にｃＤＮＡ由来であった。使用された合成配列は大腸菌優先コドン であった。

表■に示されたｈｐＧ−Ｃ３Ｆ遺伝子含有プラスミドＰｐｏ２をＨｇ１ＡＩ及び ５ｓｕｌで切断して、約６４５塩基対の断片を得たが、この断片は５′末端の７ 個のリーダー配列残基コドン及び３′非コード領域の約１００塩基対をもつ（表 ■に示されるような）成熟ｈｐＣ３Ｆ遺伝子を含有していた。Ｈｇ１ＡＩ切断で はＰｓｔＩ切断の場合と同一の５′の４塩基付着端を残し、５ｔｕｌではプラン ト末端を残す。これにより、Ｐｓｔｌ及びプラント末端形成制限酵素ＨｉｎｄＩ Ｉで切断されたＭ１３ｍｐ８　（Ｒｆ）に断片を容易に挿入することができる。

Ｍ１３中で増幅させた後、ｈｐＧ−ＣＳＦＤＮＡをＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで切 断することにより摘出したが、これはそれぞれｈｐＣ３Ｆにおける＋３〜＋５残 基のコドン間にまたがるＡｐａＩ部位、及びの“下流“のＢａｍＨ１部位におい て切断されたものである。ｈｐＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの大腸菌発現を可能にす るため、合成断片を下記表Ｘ■に示されるように製ミドＩ）５３６ＰＩ）０２を 形成した。

プラスミドＩ）５３６Ｐｐｏ２を、Ｃｌ８５７遺伝子含有プラスミドｐＭＷ１　 （ＡＴＣＣＮｏ、３９９３３）で予め形質転換された大腸菌Ａ　Ｍ　７株のファ ージ耐性変異体に刊込んだ。形質転換は、ｐｃＦＭ５３６前駆体プラスミドに担 持された抗生物質（ａｍｐ）耐性マーカー遺伝子に基づき確認した。ＬＢブロス （アンピシリン５０μｇ／ｍ１）中での細胞培養物を２８℃に維持し、Ａｅｏｏ 　−０，５の培養細胞増殖時において培養物を温度４２℃に３時間上げて、ｈｐ ＣＳＦ発現を誘導した。培養物の最終ＯＤはＡ　ｅｏｏ　＝　１　、　２であっ た。

形質転換細胞によるｈｐＧ−Ｃ５Ｆ発現レベルは、クマシーブルー色素で染色さ れたＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより、総細胞タンパク質３〜５％と評価さ れた。

細胞をＪＳ−４，２０一ター中３５００ｘｇで１０分間遠心分離して回収した。

水中２５％（ｗ／ｖ）の細胞をフレンチ・プレッシャー中セル（Ｆｒｅｎｃｈ　 ＰｒｅｓｓｕｒｅＣｅｌｌ）に１０，０ＯＯｐｓ　ｉ　（７００ｋｇ／ｃＪ）で ３回通して破壊した。破壊細胞懸濁液をＪＡ−２０ローター中］帆　０００ｘｇ で１５分間遠心分離した。ベレットを水に再懸濁し、ｐ）（ｓ、７の１％ラウリ ン酸５０ｍＭトリス中に総タンパク質濃度約５ｍｇ／ｍ＋で溶解させた。溶解ベ レット物質を１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄にＣｕ　Ｓ　０４を ２０ｍＭまで加えた。１時間後、この試料を、例１（Ｂ）の操作に従い精製する ため、容量及び濃度を調整して、Ｃ４ＨＰＬＣカラムに充填した。

非有機物含有緩衝液中で調製された更に多量のｈｐｃ−Ｃ３Ｆを得るために第二 の精製法が開発された。この物質はイン・ビボ研究に適する。細胞ペースト１５ ０ｇを１ｍＭＤＴＴ約６００ｍ１に再懸濁し、約７０００ｐ　ｓ　ｉ　（４９０ ｋｇ／ｃｊ）でマントン・グアリン（ＭａｎｔｏｎＧｕａｌ　ｉｎ）ホモジナイ ザーに４回通した。破壊細胞懸濁液を１０．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離し、 ベレットを１％デオキシコール酸、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ及び５０ｍ ＭトリスのｐＨ’９の４００ｍ１に再懸濁した。この懸濁液を室温で３０分間混 合し、１０、ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離した。ペレットを本釣４００ｍ１に 再懸濁し、１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。ペレットを２％ザルコシ ル及び５０ｍＭトリスｐＨ８の１．０　Ｏｍｌに溶解した。Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４を２ ０μＭまで加え、混合物を室温で１６時間攪拌し、しかる後、２０．ＯＯＯｘｇ で３０分間遠心分離した。上澄にアセトン３００ｍ１を加えた。この混合物を氷 上に２０分間おき、しかる後５０００ｘｇで３０分間遠心分離した。

ペレットをｐＨ４の６Ｍグアニジン及び４ＱｍＭ酢酸ナトリウムの２５０−ｍｔ に溶解し、平衡化された１、２００ｍ１のＧ−２５カラムに充填し、ｐＨ５，４ の２０ｍＭ酢酸ナトリウムで操作した。ｈｐＧ−Ｃ８Ｆビーク（約４００ｍ１） をプールし、ｐＨ５，４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化された１５ｍ１のＣ Ｍセルロースカラムに加えた。充填後、カラムを６０ｍ１のｐＨ５，４の２０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム６０ｍ１及び２５ｍＭ塩化ナトリウム洗浄し、しかる後カラム を２００ｍ１のｐＨ５，４の２０ｍ〜１酢酸ナトリウム及び３７ｍＭ塩化ナトリ ウムで溶出させた。この溶出液１５０ｍ１を１０ｍ１に濃縮し、平衡化された３ ００ｍ１のＧ−７５カラムに充填し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム及びｐＨ５，４の １００ｍＭ塩化ナトリウムで操作した。ピーク画分３５ｍ１をプールし、フィル ター滅菌した。ｈｐｃ−ｃｓｔ：’の最終濃度は１．、　、　５　ｍｇ／　ｍｌ であったが、ゲル分析で測定した場合純度９５％以上であり、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ０ ．５ｍｇにつき発熱性物質を０’、５ｎｇ以下で含有していた。発熱性物質レベ ルは、カブトガニ遁走細胞溶離物（ＬＡＬ）試験キット〔エム・ニーやバイオプ ロダクツ（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　、ウォーカースピル、メリー ランド〕により測定した。

匹一旦 この例は、１７．３６．４２．６４及び７４位に存在するシスティン残基が各々 適切なアミノ酸残基で置換されたｈｐＧ−Ｃ８Ｆ類縁体を産生ずる組換え方法の 利用に関する。

１９８５年２月２８日に公開されたスープ（Ｓｏｕｚａ　）らの公開ＰＣＴ出願 第ＷＯ３５１００８１７号明細書の特定部位突然変異誘発は、下記表Ｘ■に示さ れた大きさが２０〜２３塩基の合成オリゴヌクレオチドを用いて、下記プラスミ ドｐ５３６Ｐｐｏ２のＣＭ　ｅ　ｔ−’）コードＤＮＡ上で行なわれた。オリゴ ヌクレオチド１は［Ｓｅｒ’）ｈｐＧ−Ｃ５ＦＤ−ド遺伝子の形成が可能で、オ リゴヌクレオチド２は［Ｓｅ　ｒ３”）ｈｐＧ−ＣＳＦの形成が可能であった。

１、　５　’　−ＣＴＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＴＣＣＴＴＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＧＴ −３’２、　３　’−ＧＡＧ閤Ｇ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＧＣＣＪ！１．ＣＣＴＡＣ Ａ−３’３　、　５　’−ＴＡＣμＡＧ　ＣＴＣＴＣＣＣ，１，ＣＣＣＣＧＡＧ −３’４、　５’−ＴＧＡ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＣＣＣＣＣＡ　ＧＣＣＡＧ−３’ ５、　Ｓ’−ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＣτＣＣＴＴＧ　ＡＧＣＣ品−３１Ｃｙｓか らＳｅｒへの限定的突然変異誘発は、鋳型としてり５３６Ｐｐｏ２から単離され たＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ　ｈｐＧ−Ｃ９Ｆ断片含有のＭ１３ｍｐｌＯを用いて実 施した。Ｃｙｓ−５ｅｒ置換体含をの各に１１３ｍｐ１３由来のＤＮＡをＸｂａ Ｉ及びＢａｍＨＩで処理した。得た断片を発現ベクターｐ　ＣＦ　Ｍ　７４６に 組込んでクローニングし、発現産物を例７のように単離した。

プラスミドｐＣＦＭ７４６は、Ｃ１ａＩ及びＢａｍＨＩでプラスミドｐＣＦＭ７ ３６　（寄託されがっ公的に入手可能な物質であるその構造は、１９８５年２月 ２８日に公開されたモリス（Ｍｏｒｒｉｓ）の公開ＰＣＴ出願第ｗ。

８５１００８２９号明細書に記載されている）を切断し、存在するポリリンカー を除去し、下記ポリリンカーで置換することにより組立てることができる。

３１ＴＡＡＡＣＴＡＡＧＡＴＣＴＴ靜ＧＣＡＡＴ”ＧＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴ 本発明のＣｙｓ−５ｅｔ　（Ｃｙｓがらｓｅｒへの）類縁体の精製操作において 、細胞ペースト約１０〜１５ｇを１ｍＭ　ＤＴＴ４０ｍｌに差違懸濁し、フレン チ・プレッシャー・セルに１０，０００ｐｓ　ｉ　（７００ｋｇ／ｃｄ）で３回 通した。破壊細胞懸濁液を１０００ｘｓｒで３０分間遠心分離した。ベレットを ｐＨ９の１％ＤＯＣ。

５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、５０ｍｋｌトリスに再懸濁し、室温で３０ 分間混合した。混合物をｍｌに再懸濁し、１０．０００ｘｇで３０分間再遠心分 離した。ベレットをｐＨ８の２％ザルコシル、５０’ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭ）リ スの１０ｍ１に溶解した。１時間混合後、混合物を２０，０００ｘｇで３０分間 遠心分離して清澄化し、しかる後平衡化された３００ｍ１のＧ−７５カラムに充 填し、ｐＨ８の１％ザルコシル、５０ｍＭトリスで操作した。類縁体含有画分を プールし、少なくとも１日間空気にさらして空気酸化させた。最終濃度は０．５ 〜５■／　ｍｌの範囲であった。

例９ この例において、哺乳動物細胞発現系は、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ　ＤＮＡの活性ポリペ プチド産物が哺乳動物細胞（ＣＯＳ　−１、ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）中で発 現されかつそこから分泌されるか否がを確認するために、工夫された。この系は 、ウォンら、サイエンス、第２２８巻、第８１０−８１５頁、１９８５年（Ｗｏ ｎｇ、　ｅｔａｌ、＋　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８　、８１０−８１５　（１９ ８５））及びり−ら、プロシーディンゲス・オフφナショナル書アカデミ−、オ フ・サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、第４３６０−４３６４頁、１９８５年［ Ｌｅｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＬＩＳＡ）、　８２．４３６０−４３６４（１９８５） 　）におけるヒトＧＭ−ＣＳＦに属する残基配列を有したリーダーポリペブチｔ ’（７）後１．：位置して（Ａ　ｌ　ａ’　）ｈｐＧ　−ＣＳＦを）−ドする、 部分的合成部分的ｃＤＮＡ由来構造体の発現分泌プロセッシングを介して、ｈｐ Ｇ−Ｃ５Ｆポリペプチド類縁体を分泌させるように考え出された。

本発明のポリペプチド産物の予備的発現研究のために使用される発現ベクターは 、ウィルス性プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列の制御下で挿入外来性Ｄ ＮＡを哺乳動物細胞発現すると共に哺乳動物細胞及び大腸菌の双方において自律 複製するように考え出されたｐＢＲ３２２及び５Ｖ４０ＤＮＡの双方を組込んで いる″シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ　）”ベクターであった。大腸菌ＨＢＩＯ１に 担持されたこのベクターｐＳＶＤＭ−１９は１９８５年８月２３日にアメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１バークローン・ドライブ、ロ ックビル、メリーランドに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ第５３２４１号が付され た。

発現ベクター組立てに必要な具体的操作は下記のとおりであった。リーダーフー ドＤＮＡ配列を下記表ＸＸに示したように合成した。

表ＸＸ ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍｅ辷Ｔｒｐ ５’　−Ａ　ＧＣＴ　ＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧ　ＴＧＧ３’　−ＡＧＧ　ＴＴ Ｇ　ＴＧＧ　ＴＡＣＡＣＣ−１０。

Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ、　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　ＶａｎＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＧＧＣＡＣＴ 　ＧＴＧＧＡＣＧＴＣＴＣＧ　ＧＡＣＧＡＣＧＡＧ　ＡＡＣＣＣＧ　ＴＧＡ　Ｃ ＡＣ−１＋１ Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ工１ｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＬｅｕＧＣＣＴＧＣ ＡＧＣＡＴＣＴＣＴ　ＧＣＡ　ＣＣＣＣＴＧ　ＧＧＣＧ　−３’ＣＧＧ　ＡＣＧ 　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＣＧＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣ−５’んど工 表ＸＸに示されているように、配列は、ＨｉｎｄｌＩＩ及びＡｐａｌ付着端、及 びヒトｈｐＧ−Ｃ３Ｆの”リーダー°に属する１７個のアミノ酸残基のコドンを 有している。アラニン残基、プロリン残基及びロイシン残基を特定するコドンが 続いている。プロリン及びロイシン残基はｈｐＧ−Ｃ３Ｆの＋２及び＋３位に存 在するアミノ酸の複製で、一方アラニン残基はｈｐｃ−ｃｓｐ以外のＧＭ−Ｃ８ Ｆの開始アミノ末端（＋１）残基の複製である。スレオニンのアラニンによる置 換は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ分泌プロセッシングに通常伴う細胞メカニズムによるＧＭ− ＣＳＦリージーの適切な宿主細胞゛プロセッシング・オフ（ｐｒｏｃｅｓｓｌｎ ｇ　ｏｒｆ’）″を促進させるために考え出された。

プラスミドｐＳＶＤＮ−１９をＫｐｎＩで切断し、その部位をフレノウ酵素でプ ラント末端化した。次いでＤＮＡをＨｉｎｄＩＩｒで切断した。得られる大断片 を表■に示されるＨ　ｉ　ｎ　ｄＩＩＩ／　Ｐ　Ｖ　ＩＪＩＩＩ断片（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片及びＰｖｕＩＩでの部分的切断から得る２番目に大きな断片としてプ ラスミドＰｐｏ２から単離された）と混合して結合し、プラスミドｐＳＶ−Ｐｐ ｏｌを形成した。表ＸＸの人工ＧＭ−Ｃ３Ｆリーダー配列断片を次いで（Ｈｉｎ ｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断後の）ｐＳＶ−Ｐｐ。

１に結合し、プラスミドｐＳＶＧＭ−Ｐｐｏｌを得た。

プラスミドｐＳＶＧＭ−ＰｐｏｌＤＮＡの！Ｊン酸シカルシウム沈降物１〜５μ ｇ）を、ウィグラーら、セル、第１４巻、第７２５−７３’　１頁、１９７８年 〔警ｊｇｌｅｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　ｃｅｌｌ、、　１４．７２５−７３１　（１９７８））に実質 的に記載されているようなＣＯＳ　−１細胞の２個の６０市プレートに組込んだ 。コントロールとして、プラスミドｐＳＶＤＭ−１９もＣＯ３−１細胞に組込ん だ。組織培養上澄を形質転換後５日目に回収し、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ活性について試 験した。培養上澄からの［Ａ１ａ’）ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ収量は、１〜２．　５μｇ ／ｒｎｌであった。

ＣＯ３−１細胞における（Ａｌａ’）ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ産物コ一ドプラスミドｐＳ ＶＧＭ−Ｐｐｏｌの上首尾な発現の後、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆリーダー配列を含む一 方で、スレオニン残基（ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの１位に元来存在する）のコドンをその 位置のアラニンのコドンに代わって有する他のベクターを組立てた。簡単に言え ば、オリゴヌクレオチドが特定部位の突然変異誘発（ＳＤＭ）用に合成された（ ５’　ＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧ）、ｐＳＶＧＭ−Ｐｐｏｌ におけるＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ　ｈｐＧ−ＣＳＦ断片をＳＤＭ用に Ｍ１３ｍｐｌＯと結合した。１位にＴｈｒコドンを有する新規合成ｈｐＧ−Ｃ３ Ｆ遺伝子をＨｉｎｄｍ及びＥｃｏＲＩで切断して単離した。断片を次いで、同一 の２つの制限エンドヌクレアーゼによる切断から得られたｐＳＶＤＭ−１９に組 込んで複製した。得られるベクターｐｓｖｃＭ−Ｐｐｏ（Ｔｈｒ）をＣＯＳ細胞 に組込んで形質転換したが、培養上澄中で測定されるｈｐＧ−ＣＳＦの収量は１ 〜５μｇ　／　ｍｌの範囲であった。

最後に、単離法が例５に記載されているゲノム配列を用いて、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆの 咽乳動物細胞発現用の発現ベクターを形成した。更に詳しくは、ｐＳＶＤＭ−１ ９をＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩ［で切断し、大断片を表ＸＸＩに示されるＨｉｎ ｄｍ及びＮｃｏＩ粘着端粘着金含有合成リンカ囲者結合に使用した。エキラン１ 含有ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片はｐＢＲ３２２（８５００ｈｐＧ−ＣＳＦゲノム サブク゛ローン）から単離し、エキラン２〜５含有ＢａｍＨＩ　−Ｋｐｎ　Ｉ断 片はプラスミドｐＢＲ３２２（８５００ｈｐＧ−ＣＳＦゲノムサブクローン）か ら単離した。得られる哺乳動物発現ベクターｐＳＶ／ｇｈＧ−Ｃ５Ｆは形質転換 ＣＯＳ細胞から１〜２．５μｇ／ｍｌのｈｐＧ−Ｃ３Ｆを産生した。

ＡＧＧＴＴＧＴＧＧＴＡＣ５゜ この例は、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的及び生物学的性質に関する 。

１、分子量 例７における大腸菌発現の組換えｈｐＧ−Ｃ３Ｆ産物は（表■の演鐸的アミノ酸 分析から予測されるように）還元５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の見掛分子量 が１８．８＋ロダルトンであったが、一方何１で記載したようにして精製された 天然単離体は見掛の分子量が１９．６キロダルトンであった。天然単離体と会合 したＮ−グリカン類の存在は、表■のｈｐＧ−Ｃ３Ｆ−次配列中にアスパラギン 残基が欠損していることから、実際上無視することができ、したがって、操作は Ｏ−グリカン類が天然単離体及び非グリコシド組換え産物間の分子量差の原因で あるか否かを調べられるように工夫した。

天然単離物質的５μｇをノイラミニダーゼ〔カルビオケム（Ｃａｌｂｌｏｃｈｅ ｍ）　、ラホラ、カリフォルニア〕で処理し、試料０．５μｇを取出し、残留物 質をＯ−グリカナーゼ〔エンド−ｘ−ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ、 ジエンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）　、ボストン、マサチューセッツ〕４ｍＵと３ ７℃でインキュベートした。一部をインキュベートの０．５．２及び４時間後に 取出した。これら試料を大腸菌由来組換え物質と並べて５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し た。ノイラミニダーゼ処理後、単離体の見掛分子量は１９．６キロダルトンから １．９．２キロダルトンに変わったが、このことはシアル酸残基の離脱を示唆す る。

Ｏ−グリカナーゼ処理の２時間後、分子量は１８．８キロダルトンに変わったが 、これは大腸菌由来物質の見掛分子量と一致する。ノイラミニダーゼ及び○−グ リカナーゼに対する炭水化物構造体の感受性から判断すると炭水化物成分として 下記構造体が示唆される二Ｎ−アセチルノイラミン酸−α（２−６）ガラクトー スβ（１−３）Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｒ（Ｒはセリン又はスレオニンで ある）。

２、３Ｈ−チミジン取込み 加に基づき分析した。健康ドナー者のヒト骨髄をフィコール−ハイバック（Ｐｌ ｃｏｌ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ）　（１、０７７ｇ　／ｍ１、ファルマシア）によ る密度分離に付し、低密度細胞を１０％牛脂児血清及びグルタミンペニシリン・ ストレプトマイシン含有のイスコブ培地［Ｇｉｂｃｏ　（ギブコ）〕に懸濁した 。次いで、ヒト骨髄細胞２Ｘ１０’個を９６個の平底ウェルプレート中コントロ ール培地又は例７の日間インキュベートした。試料を重複して分析したが、濃度 は１０，０００倍以上異なっていた。培養物に次いで３Ｈ−チミジン〔二ニー・ イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）　、ボ スマン、マサチューセッツ〕０．５μＣｉ／ウェルを加えた。３Ｈ−チミジン取 込み量をベンチュアら、ブラッド、第６１巻、第７８１頁、１９８３年（Ｖｅｎ ｔｕａ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＢＩｏｏｄＪｌ、　７８１（１９８３）］に記載さ れているように測定した。この分析において、ヒトｈｐＧ−Ｃ５Ｆ単離体は、コ ントロール上澄よりも約４〜１０倍高いレベルで、ヒト骨髄細胞中に３Ｈ−チミ ジンを取込ませることができる。例６の大腸菌由来のｈｐＧ−Ｃ８Ｆ物質も同様 の性質を存していた。

２回目のヒト骨髄細胞増殖研究は、例９で製造された形質転換ＣＯ５−１細胞の 培養培地を用いて実施され、同様の結果を与えたが、このことはコ゛−ドされた ポリペプチド産物が活性物質として培地中に実際に分泌されることを意味する。

。 ３、　ＷＥＨＩ−３８Ｄ　分化誘導 マウス骨髄単球性白血病細胞ＷＥＨＩ−３Ｂ　Ｄ＋の分化を誘導する組換え大腸 菌由来物質の能力を、メトカーフ、インターナショナル・ジャーナル・オフ・キ ャンサー、第２５巻、第２２５巻、１９８０年［ＭｅｔｃａＨ。

Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２５．２２５　（１９８０）］に記載さレテ イルヨうに、半固体寒天培地中で分析した。組換えｈｐｃ　−ＣＳＦ産物及び培 地コントロールを３０℃空気中５％／ウェルと一緒にインキュベートした。試料 を２４個の平底ウェルプレート中でインキュベートしたが、濃度□は２０００倍 以上異なっていた。コロニーを未分化、部分的分化又は全部分化のコロニーに分 類し、コロニー数を顕微鏡で計測した。大腸菌組換え物質は分化を誘導すること が判明した。

多分化能性ヒトＧ−ＣＳＦ　（ｈｐＧ−ＣＳＦ）の天然単離体及び組換え多分化 能性ヒトＧ−ＣＳＦ　（ｈｐＧ−ＣＳＦ）は、ヒト骨髄細胞を増殖かつ分化させ ることが判明した。これらの活性は、ＣＦＵ−ＧＭ　［ブロックスマイヤーら、 エクスペリメンタル・ヘマトロジー、第５Ｅｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、、　５． ８７　（１９７１）　）　）　、Ｂ　Ｆ　Ｕ　−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ試験法 〔ルーら、ブラッド、第６１巻、第２５０頁、１９８３年（Ｌｕ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｂｌｏｏｄ、６１．２５０（１９８３））　）により、健康ヒトボランテ ィアの低密度非付着性骨髄細胞を用いて測定した。各々５００単位のｈｐＧ−Ｃ ５Ｆ又はｒｈｐＧ−ＣＳＦを用いたＣＦＵ−ＧＭ。

ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ生物学的活性の比較は、下記表ＸＸ■に示され ている。

すべてのコロニー分析は、低密度付着性骨髄細胞を用いて実施した。ヒト骨髄細 胞をフィコールハイパツク（密度１．　０７７ｇ／ｃｔｄ、ファルマシア）によ る密度分離に付した。低密度細胞を次いで牛胎児血清含有のイスコブ修正ダルベ ツコ（Ｄｕ　Ｉ　ｂｅｃｃｏ）培地に再懸濁し、ファルコン組織培養皿〔Ｎα３ ００３、ベクトン・ディケンマン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｋｅｎｓｏｎ）：Ｉ　ッ キーズビル、メリーランド〕上に付着させるために３７℃で１．５時間入れてお いた。

培地　０±０　２６±１　０±０ 天然 ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ　８３±５．４　８３±６．７４±０ｒｈｐＧ−Ｃ８Ｐ　８７± ５８１±０．１６±２培地コントロールは、１０％Ｆ’Ｃ８，０，２ｍＭヘミン 及び組換えエリスロポエチン１単位含有イスコブ修正ダルベツコ培地であった。

ＣＦＵ−ＧＭ分析の場合では、標的細胞は、補充マツコイ（ＭｃＣｏｙ　）　５ 　Ａ培地及び１０％熱不活化牛脂児血清を含有する０、３％寒天培地１ｍｌ中Ｉ ×１０５個で培養した。培養７日目、培養物のコロニー（凝集物力たり細胞数４ ０以上）について計数し、形態を観察した。コロニー数は、４個の同一プレート から測定される平均子ＳＥＭとして示されている。

ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ分析の場合では、細胞（１×１０５）をイスコ ブ修正ダルベツコ培地〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ　）　）　、０．８％メチルセルロ ース、３０％牛脂児血清、０．０５ｎＭ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ ヘミン及び組換えエリスロポエチン１単位の混合物１ｍｌに加えた。皿を５％Ｃ Ｏ及び５％０２湿気雰囲気中でインキュベートした。レミング・バイオインスツ ルメンツ（Ｒｅｍｌｎｇ　Ｂ４ｏ１ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）　（シラキュース （Ｓｙｒａｃｃｕｓｅ　）　、ニューヨーク〕の酸素減少器により低酸素圧にし た。コロニーをインキュベート１４日後に計測した。コロニー数は、２個の同一 プレートから測定される平均±ＳＥＭとして示されている。

ＣＦＵ−ＧＭ分析で形成されたコロニーは、すべて、クロロアセテートエステラ ーゼ陽性でかつ非特異的エステラーゼ（α−ナラチルアセテートエステラーゼ） 陰性であることが判明し、顆粒球型のコロニーと一致した。

天然ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ及びｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆは双方とも、ＣＦＵ−ＧＭ分析におけ る連続希釈により分析した場合、約１．、　Ｘ　１０８Ｕ／ｍｇ純粋タンパク質 の特異的活性を有することが判明した。表ＸＸ■のＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥ ＭＭデータは、３つの別個の実験を表示しており、天然ｈｐＧ−Ｃ５Ｆに関し過 去に報告されたデータと類似する。ｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆが大腸菌中で産生されてい ることから、極めて純粋でありかつ他の潜在的哺乳動物成長因子を含有しないこ とに注目することは重要である。

このように、ｒｈｐＧ−Ｃ５Ｆは、組換えエリスロポエチンの存在下で加えられ た場合に、混合コロニー形成（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ及びＢＦＵ−Ｅ）を補助するこ とがＷＥＨＩ　−３８（Ｄ”　）細胞及び新たに診断された白血病患者のヒト白 血球は１．２５ｉ−標識マウスＧ−Ｃ５Ｆに結合するが、この結合は未標識Ｇ− Ｃ３Ｆ又はヒトＣ３Ｆ−βの添加により競合させることができる、と過去に報告 された。ヒト及びマウスの白血球に対して１２５１−ｈｐＧ−ＣＳＦの結合に競 合する天然ｈｐｃ　−Ｃ３Ｆ及びｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆの能力に関し試験した。

高度に精製された天、然ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ　（純度９５％以上、１μｇ）がヨウ素 化〔デジニド−ら、アナリティカル・バイオケミストリー、第１２７巻、第１４ ３頁、１９８２年（Ｔｅｊｅｄｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃ ｈｅｍ、、　１２７゜１４３　（１９８２））　］　され、ゲル）濾過及びイオ ン交換クロマトグラフィーにより反応物から分離された。天然１２５゜ｈｐＧ− ＣＳＦの特異的活性は約１００μＣｉ／μｇタンパク質であった。マウスＷＥＨ Ｉ−３８（Ｄ”）及び２種のヒト末梢血骨髄白血病細胞（ＡＮＬＬ、１つはＭ４ 、他はＭ５Ｂとして分類される）を１２５１−ｈｐＧ〜Ｃ３Ｆとの結合能につい て試験した。

マウス及び新しく得たヒトの末梢血骨髄白血病細胞をＰ　Ｂ　Ｓ／１％ＢＳＡで ３回洗浄した。ＷＥＨＩ−３８（Ｄ＋）細胞（５Ｘ　１０６個）又は新鮮白血病 細胞（３ｘ１０Ｂ個）を、各種濃度（容量：１０μｇ）の未標ａｈｐｃ−ｃｓｐ 、ｒｈｐＣ；−Ｃ５Ｆ又はＧＭ−Ｃ８Ｆの存在又は非存在下、及び１２５　Ｉ　 −ｈ　ｐｃ　−Ｃ５Ｆ　（約１００．ＯＯＯｃｐｍ又は１．ｎｇ）の存在下、Ｐ ＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｇ）中θ℃９０分間２連でインキュベートシた（総 容ｉｔ　：　１２０μｇ）。細胞を次いで３５０μｇプラスチック製遠心管中の 水冷ＦＣ３２００μｇに再懸濁して積層し、遠心分離（１０００ｘｇ；１分間） した。ペレットを管端部切断により集め、ペレット及び上澄を別々にガンマカウ ンター〔バラカード（Ｐａｃｋａｒｄ）］で、計測した。

特異的結合ｆｆｌ　（Ｃｐ　ｍ）は、競合物の非存在下における総語合量（２連 の平均）−１００倍過剰の未標識ｈｐＧ−Ｃ８Ｆの存在下における結合量（非特 異結合量）（ｃｐｍ）として計算した。非特異的結合量は、最大で、ＷＥＨＩ− ３８（Ｄ”　）細胞の場合が２５０３ｃｐｍ。

ＡＮＬＬ　（Ｍ４）の細胞の場合が１１０７２ｃｐ。

ＡＮＬＬ　（Ｍ５Ｂ）細胞の場合が１１２５ｃｐｍであった。実験１及び２は同 一の１２５１−ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ調製物を用いて異なる日に実施したが、ｈ　ｐ　 Ｇ　−Ｃ，５Ｆ２０００単位の場合の阻害率においては内部的一貫性を示す。得 られたデータは下記表ＸＸ■に示されている。

表ＸＸ■で示されているように、　Ｉ−ｈｐＧ−Ｃ３ＦはＷＥＨＩ−３８（Ｄ” 　）白血病細胞との結合性を示した。結合は、ＧＭ−Ｃ８Ｆではなく未標識天然 ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ又はｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆにより用量依存的に回置された。しかも、 ヒト骨髄単球性白血病細胞（ＡＮＬＬ、Ｍ４）に対する天然ｈｐＧ−ＣＳＦの結 合も観察された。これら細胞への結合性は、液体培養物中の天然ｈｐｃ−ｃｓｒ ’に応じて、形態学的に判断されるマクロファージへの分化と比較される。別の 患者の単球性白血病細胞（ＡＮＬＬ、Ｍ５Ｂ）との天然１２５゜ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ の結合性の欠如は、特定の白血病が特異的に発現したか、又はｈｐＧ−Ｃ８Ｆに 対するレセプターを欠くことを示唆する。天然ｈｌ）Ｇ−Ｃ５Ｆと同様に天然１ ２５Ｉ−標識−ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの結合に対して競合するｒｈｐＧ−Ｃ５Ｆの能力 は、レセプターが十分等しく両型を認識することを示唆する。

白血病細胞との天然１２５Ｉ−標識ｈ　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆの結合性を証明する これらの研究は、培養物中で急性前骨髄性白血病（Ｍ３）の第１患者及び急性骨 髄芽球性白血病（Ｍ２）の第２患者から得た低密度骨髄法の顆粒球及び単球への 分化を誘導する天然ｈｐＧ−ＣＳＦの能力と対比される。各患者からの細胞を、 培地単独で又はｈｐｃ−Ｃ５ＦＩＸＩＯ”単位存在下で、４日間培養した。培地 単独でインキュベートされたＭ３コントロール培養物からの細胞は前骨髄球のま まであったが、一方ｒｈｐＧ−ＣＳＦの存在下で培養された細胞は、後骨髄球、 巨大杆状核型−分葉核型好中球及び単球からなる骨髄型成熟細胞を示した。この 患者での現実の分化は、１００個の細胞について、コントロールの場合が１００ ％前骨髄球であり、ｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆ処理細胞の場合が２２％芽球十前骨髄球、 ７％骨髄球、３５％後骨髄球、２０２６杆状核型十分葉核型好中球、１４％単球 及び２９６マクロフアージであった。注目されるのは、多形核顆粒球の１つが顕 著なアラニル小体をまだ有していたという事実であ゛るが、このことは少なくと もこの細胞が白血病系のクローンに属する分化細胞であることを示唆する。骨髄 芽球性白血病（Ｍ２）の第２患者からの細胞もｒｈｐＧ−Ｃ６Ｆの存在又は非存 在下で４日間培養した。

培地単独で培養されたＭ２細胞の視覚分析では、大きな“芽球様”細胞を示した が、そのうちのいくつかは核小体を有していた。Ｍ２細胞のいくつかは、ｒｈｐ Ｇ−Ｃ５Ｆで処理した場合に、好中球の中心にアラニル小体が残った成熟分葉核 型好中球に分化したが、このことは白血病系のクローンに属する細胞で生じる分 化を示唆した。形態学的に評価された細胞１００個の実際の分化では、コントロ ール細胞は１００％芽球からなることが示された。ｒｈｐＧ−Ｃ５Ｆ処理細胞は 、４３％芽球、１％骨髄球、１５％後骨髄球、２８％杆状核型十分葉核型好中球 、２％前骨髄球及び１１％単球からなっていた。

白血病細胞が、また４つの異なる濃度（５×１０３、ｌＸｌ０　．２．５Ｘ１０ ４及び５　Ｘ　１０４Ｕ／ｍ＋、デ−タ示さず）のｒｈｐＧ−Ｃ５Ｆ存在下で分 化に関して試験された。試験されたｒｈｐＧ−Ｃ５Ｆの最低濃度（５Ｘ　１０３ Ｕ／ｍｌ）の場合であっても、Ｍ３（５０％）及びＭ２（３７９６）白血病細胞 の著しい分化が生じた（細胞は骨髄法以上に分化した）。

６、　免疫試験 免疫試験用のポリクローナル抗体を産生ずるために使用された抗原は、例１（Ｂ ）で調製されたようにしてヒト膀胱癌細胞系５６３７　（ＩＡ６）から精製され た多分化能性Ｇ−Ｃ５Ｆであった。この物質は、ポリアクリルアミドゲルの硝酸 銀染色に基づき、純度８５％と判定された。６退会Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを抗原の 多部位注射により免疫した。抗原をＰＢＳに再懸濁し、等量のフロイント（Ｆｒ ｅｕｎｄ）完全アジュバントで乳化させた。投与量は抗原５〜７μｇ／マウス／ 注射であった。追加免疫注射は、等量のフロイント不完全アジュバントで乳化さ れた同量の抗原で１８日後に投与した。４日後、マウス血清を採取し、ヒ゛ト多 分化能性Ｇ−Ｃ５Ｆに特異的な抗体について試験した。

ホルダー中のダイナチック・イムロン■・リムーバウェル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　 Ｉｍｍｕｌｏｎ　ＩＩ　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ）ストリップ〔ダイナチック・ラ ボラトリ−社（Ｄｙｎａｔｅｃｋ　Ｌａｂ、。

Ｉｎｃ＝）　、アレクサンドリア、バージニア〕をｐＨ９，２の５０ｍＭ炭酸− 重炭酸緩衝液中のｈｐＧ−ＣＳＦ５μｇ　／　ｍｌで被覆した。ウェルを容量５ ０μΩ中の０．２５μｇで被覆した。抗原被覆プレートを室温で２時間及び４℃ で一夜インキユベートした。溶液を捨て、プレートを５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で ３０分間インキュベートして、反応表面を保護した。この溶液を捨て、希釈され た免疫前血清又は試験血清をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。

血清は１％ＢＳＡ含有のｐＨ７，０のＰＢＳで希釈した。血清溶液を捨て、プレ ートをワラシュ・ツルージョン（Ｗａｓｈ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　（ＫＰＬ、 ゲイザースブルグ、メリーランド）で３回洗浄した。　ｐ）（７，０の１％ＢＳ Ａ含有ＰＢＳ５０μρ中のヨウ素化ウサギ抗マウスＩ　ｇＧ　（ＮＥＮ、ボスト ン、マサチューセッツ）約２００．０００ｃｐｍを各々のウェルに加えた。室温 で１．５時間インキュベートした後、溶液を捨て、プレートをワラシュ・ツルー ジョンで５回洗浄した。ウェルをホルダーから取外し、ベックマン５５００ガン マンカウンターで計測した。高力価マウス血清は、１：１００希釈時において、 相当する免疫前血清よりも１２倍以上高い反応性を示した。

大腸菌由来ｈｐＧ−Ｃ５Ｆの免疫学的性質は、哨乳動物細胞由来ｈｐＧ−ＣＳＦ に特異的な高力価マウス血清に対する反応性により測定した。純度９０％の大腸 菌由来タンパク質０．２５μｇを容量５０μｐのイムロン■リムーバウェルに被 覆し、マウス血清を上記のように分析した。

高力価マウス血清は、１　：　１００希釈時において、相当する免疫前血清より も２４倍高い反応性を大腸菌由来物質に対して示した。

７、　セリン類縁体生物学的試験 例９で製造された（Ｓｅ　ｒ１７〕ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ、（Ｓｅｒ””：ｌ　ｈｐＧ −ＣＳＦ、［５ｅｒ４２）ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ、［Ｓｅｒ’）ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ及び（ Ｓｅｒ’）ｈｐＧ−Ｃ５Ｆ産物を、３Ｈ−チミジン取込み、ＣＦＵ−ＧＭ及びＷ ＥＨＩ−３Ｂ　Ｄ＋分析によりｈｐＧ−Ｃ５Ｆ活性に関し分析した。各分析にお いて、（Ｓｅｒ１７］類縁体は天然構造組換え分子の活性に匹敵する活性を有し ていた。他の類縁体は、３Ｈ−チミジン取込み分析では１／１００の活性、ＣＦ Ｕ−ＧＭ分析では１／２５０の活性、及びＷＥＨＩ−３８Ｄ＋分析では１１５０ ０の活性を有していた。このデータは、３６．４２．６４及び７４位のシスティ ンが十分な生物学的活性のために必要であるという考え方を支持する。

８、　イン・ビボ生物学的試験 アルゼット（Ａｌｚｅｔ　”　）浸透圧ポンプ〔アルゼット社（Ａｌｚｅｔ　Ｃ ｏｒｐ、　）バロ・アルド（Ｐａｌｃ＋　ＡＩｔｏ　）　、カリフォルニア；モ デル２００１）を内在型右頚静脈血管カテーテルに連結し、７匹の雄性シリアン ゴールデフハムスターの皮下に植込んだ。４つのポンプは緩衝液〔２０ｍＮ１酢 酸ナトリウム（ｐＨ５，４）及び３７ｍＭ塩化ナトリウム〕及び大腸菌由来ｈｐ Ｇ−ｃｓＦ’　１．５　ｍｇ　／　ｍｌを含をし、３つは緩衝液のみを含有して いた。浸透圧ポンプに必要な吸入排出速度は、７日目まで１μ、１１１　／　ｈ 　ｒであった。ポンプ植込み後３日目において、４匹の処理ハムスターの平均顆 粒球数は３匹の（緩衝液）コントローラル場合より６倍高く、顆粒球数増加は総 リンパ球が４倍増加したことに反映されていた。赤血球数は処理により変化しな かった。これらの結果は、組換え物質が哺乳動物において顆粒球の産生及び／又 は放出を特異的に高めることを示している。

ｈｐｃｙ−ｃｓｒ’の天然対立型に加え、本発明ではｈｐＧ−Ｃ５Ｆのポリペプ チド類縁体及びｈｐｃ−Ｃ５Ｆ断片のような他のり、　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ産物 も包含する。

上記アルドンらの公開出願（ＷＯ／８３１０４０５’３）の操作に従い、１以上 （ｏｎｅ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　）の残基の同−性又は位置に関し本明細書で記載さ れたものとは異なる（例えば、置換、端部及び中間部付加、並びに削除）−次構 造をもつポリペプチドの微生物での発現をコードする遺伝子を用意に考えかつ製 造することができる。一方、ｃＤＮＡ及びゲノム遺伝子の修正は、周知の特定部 位突然変異誘発法によって容易に実施することができ、しかもそれらの類縁体及 び誘導体を産生ずるために利用することができる。このような産物はｈｐＧ−Ｃ ＳＦの生物学的性質のうち少なくとも１つを有するが、他の点では異なる可能性 がある。例えば、考えらる本発明の産物としては、例えば削除により短縮された 産物、加水分解に対しより安定な産物（したがって、天然体よりも顕著な又は持 続性の効果を有する可能性がある）、１以上（ｏｎｅ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　）の潜 在的Ｏグリコジル化部位を削除して修正された産物（酵母菌産生産物に関しより 高い活性を有するようになる）、１以上（ｏｎｅ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　）のシステ ィン残基が削除され又はアラニンもしくはセリン残基等で置換され、しかも微生 物系から活性型でより容易に単離され得る産物、又は、１以上（ｏｎｅ　ｏｒ　 ｍｏｒｅ　）のチロシン残基がフェニルアラニンで置換され、しかも標的細胞上 のｈｐＧ−Ｃ３Ｆレセプターにいくぶん容易に結合し得る産物がある。更には、 ｈｐＧ−ＣＳＦの連続アミノ酸配列又は二次構造の一部のみを複製したポリペプ チド断片も包含されるが、この断片は１つの活性（例えば、レセプター結合性） を有するが、他の活性（例えば、コロニー増殖刺激活性）を何しない可能性があ る。

本発明のいずれの１以上（ｏｎｅ　ｏｒ　１Ｉｌｏｒｅ　）の産物が、治療的効 用〔ウアイラントら、ブルート、第４４巻、第１７３−１７５頁、１９８２年（ Ｗｅｉｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｌｕｔ、　４４．１７３−１７５　（１９８５））参照〕又はｈｐＧ−Ｃ５Ｆ 拮抗作用分析のような他の関連における効用をもつ活性が必ずしも必要されない ことは注目に値する。競合的拮抗剤は、例えばｈｐＧ−ＣＳＦの過剰産生時に非 常に有用である可能性がある。

本発明の他の側面によれば、ｈｐＧ−Ｃ５Ｆポリペプチドをコードする本明細書 に記載されたＤＮＡ配列は、天然産物単離体の分析的プロセッシングにもかかわ らず今まで得られていなかったこの噴孔動物タンパク質のアミノ酸配列に関して 、それが情報を提供することから、価値がある。ＤＮＡ配列は、様々な組換え技 術によるｈｐＧ−ＣＳＦＯ大規模な微生物での合成を実施するために使用される 産物としても著しい価値がある。その他に、本発明により提供されるＤＮＡ配列 は、新規かつを用なウィルス性または環状プラスミドＤＮＡベクター、新規かつ 有用な形質転換及び感染転換された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　）微生物原核及 び真核及び真核宿主細胞（細菌、酵母菌細胞及び哨乳動物の培養細胞を含む）、 ｈｐＧ−ＣＳＦ及びその関連産物の発現が可能なかかる微生物宿主細胞の新規か つ有用な培養増殖方法を開発するために使用される。本発明のＤＮＡ配列は、ｈ ｐＧ−ＣＳＦ及び関連タンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡ並びに他の哺乳 動物種のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列を単離するための標識プローブとして使 用される、極めて適切な物質でもある。ＤＮＡ配列は、（例えば、昆虫細胞中で の）タンパク質合成の様々な代替的方法又はヒト及び他の哩乳動物における遺伝 子療法にも使用することができる。本発明のＤＮＡ配列は、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ及び ｈｐｃ−ｃｓＦ産物の大規模産生用の真核細胞“宿主”として機能し得る遺伝子 転換吐乳動物種を開発するためにも使用し得る、と期待されれている。一般的に は、バルミターら、サイエンス、第２２２巻、第４６２５号、第８０９＝８１４ 頁、１９８３年［Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２２（４６２５）、　’８０９−８ｉ４　（１９８３＞）参照。

本発明のｈｐＧ−Ｃ３Ｆ断片及びポリペプチド類縁体の応用例の中には、天然タ ンパク質、糖タンパク質及び核タンパク質中に存在するアミノ酸配列を実質的に 複製した合成ペプチドの免疫学的活性に関する報告がある。

更に詳しくは、比較的低分子量のポリペプチドは、ウィルス抗原、ポリペプチド ホルモンその他のような生理学的に重要なタンパク質の免疫反応と時間及び程度 が類似した免疫反応に関係することが示された。このようなポリペプチドの免疫 反応の中には、免疫学的に活性な動物における特異的抗体産生の賦活化が含まれ る。例えば、レーナーら、セル、第・２３巻、第３０９−３１０頁、１９８１年 ［Ｌｅｒｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　２３．　＆０９−３１０（１ ９８１））　、ロスら、ネーチャー、第２９４巻、第６５４−６５６頁、１９８ １年［Ｒｏｓｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９４　。

８５４−８５８　（１９８１））　、ワルターら、プロシーディンゲス・オフ・ ナショナル・アカデミ−、オフ。サイエンス（ＵＳＡ）、第７７巻、第５１９７ −５２００頁、１９８０年　（ＷａｌＬｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ４゜（ＵＳＡ）　、旦５１９７−５２０ｆｌ　（１９８０） 　ｌ］　、ラーナーら、プロシーディンゲス中オブ・ナショナル中アカデミーψ オブーサイエンス（ＵＳＡ）、第７８巻、第３４０３−３４０７頁、１９８１年 、ワルタターら、プロシーディンゲス・オフφナショナル中アカデミ−・オフ拳 サイエンス（ＵＳＡ）、第７８巻、第４８８２−４８８６頁、１９８１年；ウォ ン（Ｗｏｎｇ）ら、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミー−オフ ・サイエンス（ＵＳＡ）　、第７８巻、第７４１２−７４１６頁、１９８１年； グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、セル、第２８巻、第４７７−４８７頁、１９８２年 ；ニック（Ｎ！ｇｇ）ら、プロシーディンゲス・オフ争ナショナル・アカデミ− ゆオフ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７９巻、第５３２２−５３２６頁、１９８２ 年；バロン（Ｂａｒｏｎ　）ら、セル、第２８巻、第３９５−４０４頁、１９８ ２年；ドジーズマン（Ｄｒｅｅｓｍａｎ）ら、ネーチャー、第２９５巻、第１８ ５−１．６０頁、１９８２年；及びラーナー、サイエンティフィック・アメリカ ン、第２４８巻、第２号、第６６−７４頁、１９８３年（Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｓｃ ｉｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ、　２４ｇ　、　Ｎｏ、２．　Ｂ［ｆ−７４（ １９８３）］参照。更に、ペプチドホルモンの二次構造をほぼ有するもののそれ らの一次構造配列を有していない合成ペプチドの生物学的及び免疫学的活性に関 する、カイザーら、サイエンス、第２２３巻、第２４９−２５５頁、１９８４年 ［Ｘａｉｓｅｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２３．２４９−２５５　（！９８４）） 参照。

本発明は好ましい態様に関して記載されてきたが、変更及び修正は当業者であれ ばなし得ると解される。したがって、添付された請求の範囲は、請求の範囲に記 載された発明の範囲に属するこのようなすべての均等な変形例を包含するものと する。

国際調査報告 ””””””　””””’ｂｉ！’ｒ／ｕｓｅ６１０ｎｏ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の一部もしく は全部及び生物学的性質の１以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）を有し、しかも外来性 ＤＮＡ配列の原核細胞もしくは真核細胞発現産物であることを特徴とする精製単 離ポリペプチド。 ２．いかなる哺乳動物タンパク質とも会合していない、請求の範囲第１項記載の ポリペプチド。 ３．外来性ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である、請求の範囲第１項記載のポリペプ チド。 ４．外来性ＤＮＡ配列が人工ＤＮＡ配列である、請求の範囲第１項記載のポリペ プチド。 ５．外来性ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ配列である、請求の範囲第１項記載のポリ ペプチド。 ６．外来性ＤＮＡ配列が自律複製ＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターに担持 されている、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ７．表ＶＩＩに示されるヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子又はそのいずれ かの天然対立変異体における一次構造配列の一部もしくは全部を有する、請求の 範囲第１項記載のポリペプチド。 ８．天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の免疫学的性質を有する、請求の範 囲第１項記載のポリペプチド。 ９．天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子のイン・ビトロ生物学的活性を有す る、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 １０．検出可能標識物質と共有結合せしめられた、請求の範囲第１項記載のポリ ペプチド。 １１．検出可能標識が放射線標識である、請求の範囲第１項記載のポリペプチド 。 １２．天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の少なくと も一部及び生物学的性質の１以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）を有するポリペプチド 産物の原核もしくは真核宿主細胞中での発現を確実化するために使用されるＤＮ Ａ配列であって、 （ａ）表ＶＩＩ及びＶＩＩＩに示されたＤＮＡ配列又はそれらの相補鎖、 （ｂ）（ａ）で規定されたＤＮＡ配列又はそれらの断片とハイブリッド形成する ＤＮＡ配列、及び（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ（ａ）及び（ｂ）で規定さ れたＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列、 の中から選択されることを特徴とするＤＮＡ配列。 １３．宿主細胞にポリペプチド産物を発現させるように請求の範囲第１２項記載 のＤＮＡ配列で形質転換又は感染転換された原核もしくは真核宿主細胞。 １４．原核もしくは真核細胞宿主における請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ配列 の発現のポリペプチド産物。 １５．多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の一部もしくは 全部及び生物学的性質の１以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）を有するポリペプチドの 原核もしくは真核細胞宿主発現をコードする精製単離ＤＮＡ配列。１６．請求 の範囲第１５項記載のＤＮＡ配列。 １７．請求の範囲第１６項記載のゲノムＤＮＡ配列。 １８．請求の範囲第１５項記載の人工ＤＮＡ配列。 １９．大腸菌細胞中での発現に好ましい１以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）のコドン を含有する、請求の範囲第１８項記載の人工ＤＮＡ配列。 ２０．ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の発現をコードする、請求の範囲 第１８項記載の人工ＤＮＡ配列。 ２１．酵母菌細胞中での発現に好ましい１以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）のコドン を含有する、請求の範囲第２０項記載の人工ＤＮＡ配列。 ２２．請求の範囲第１６、１７又は１８項記載のヒト多分化能性顆粒球コロニー 刺激因子をコードするＤＮＡ配列。 ２３．検出可能標識物質と共有結合せしめられた、請求の範囲第１５項記載のＤ ＮＡ配列。 ２４．検出可能標識が放射線標識である、請求の範囲第２３項記載のＤＮＡ配列 。 ２５．請求の範囲第２３項記載の一重鎖ＤＮＡ配列。 ２６．天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子のポリペプチド断片又はポリペプ チド類縁体をコードするＤＮＡ配列。 ２７．【配列があります】をコードするＤＮＡ配列。 ２８．請求の範囲第１２、１５又は２６項記載のＤＮＡ配列を有する生物学的機 能プラスミド又はウィルスＤＮＡベクター。 ２９．請求の範囲第２８項記載のＤＮＡベクターで安定的に形質転換又は感染転 換された原核もしくは真核宿主細胞。 ３０．請求の範囲第１５項又は第２６項記載のＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿 主細胞における発現のポリペプチド産物。 ３１．表ＶＩＩに示されたアミノ酸配列の一部もしくは全部を有し、かつ天然多 分化能性顆粒球コロニー刺激因子のイン・ビトロ生物学的活性の１以上（ｏｎｅ ｏｒｍｏｒｅ）を有する合成ポリペプチド。 ３２．表ＶＩＩに示されたアミノ酸配列の一部もしくは全部の二次構造の一部も しくは全部を有し、かつ天然ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の生物学的 活性を有する合成ポリペプチド。 ３３．天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の一部もし くは全部及び生物学的性質の１以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）を有するポリペプチ ドの産生方法であって、適切な栄養条件下、請求の範囲第２８項記載のＤＮＡベ クターで形質転換又は感染転換された原核もしくは真核宿主細胞を増殖させ、上 記ベクター中のＤＮＡ配列の発現の所望のポリペプチド産物を単離することから なる方法。 ３４．グリコシル又は非グリコシル型の、いかなるヒトタンパク質とも会合して いない精製単離ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子。 ３５．請求の範囲第１項又は第３４項記載の有効量のポリペプチド及び薬学上許 容される希釈剤、アジュバント又は担体からなる医薬組成物。 ３６．請求の範囲第１項又は第３４項記載のポリペプチドの有効量を投与するこ とからなる哺乳動物への造血治療提供方法。 ３７．請求の範囲第１項又は第３４項記載のポリペプチドの有効量を投与するこ とからなる白血病細胞増殖抑制方法。 ３８．【配列があります】をコードするＤＮＡ配列。 ３９．請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主細胞におけ る発現のポリペプチド産物。 ４０．請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ配列を含有する生物学的機能プラスミド 又はウィルスＤＮＡベクター。 ４１．請求の範囲第４０項記載のＤＮＡベクターで安定的に形質転換又は感染転 換された原核もしくは真核宿主細胞。 ４２．【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】；及び 【配列があります】； からなる群より選択される【配列があります】類縁体をコードするＤＮＡ配列。 ４３．請求の範囲第４２項記載のＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主細胞におけ る発現のポリペプチド産物。 ４４．純度が９５％より大であって、【配列があります】０．５ｍｇにつき発熱 性物質を０．５ｎｇ以下で含有する、【配列があります】；製剤。