JPS61227526A - 新規なコロニー刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は骨髄細胞の分化増殖を促進する因子（Ｃｏｌｏ
ｎｙ　８ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　）　（
以下ｒ０８ＦＪとする）に関し、特にヒト好中球への分
化増殖促進作用を有する新規な０８Ｆおよびその取得方
法に関する。

〔産業上の利用分野〕

本発明の０８Ｆは白血球減少症等の治療薬としてその効
果が期待される他、臨床検査用試薬や研究用試薬として
、更鴛宝１壜浄北孝求壜涜浦−レ「Ｌ℃＝Ｓ二Ｐ−の円
幻４１呑ミ産彬確位＃め實ケ汝ト適９１才１粍妻七＝使
用しつる。

〔従来の技術〕

０８Ｆは動物の骨髄細胞に作用してマクロファージまた
は顆粒球への分化増殖を促進する物質であり、今までに
数種のものが報告されている。例えば８ｔａｎｌｅｙ　
Ｂ＊　Ｒｏ等は、健常人尿より分子量４５゜０００の糖
蛋白質でマウスの骨髄細胞に対してはコロニー形成促進
活性を示すが、ヒト骨髄細胞に対してはコロニー形成促
進活性が認められないＣＳＶを純化したと報告している
（　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、３５巻。

２２７２〜２２７８頁、１９７５年）。またＢｕｒｇｅ
ｓｓ人、Ｗ。

等はヒト胎盤から（Ｂｌｏｏｄ　４９巻５７３〜５８３
．１９７７年）　（Ｂｌｏｏｄ　５４巻６１４〜６２７
頁、１９７９年）、８ｈａｈ　Ｒ，Ｇ。等はヒト末梢血
単球、ＰＨＡ刺激リンパ球から（Ｂｌｏｏｄ　５０巻８
１１頁、１９７７年）、Ｆｏｉｏ　８゜Ｓｏ等はヒト肺
の培養上清から（Ｂｉｏｃｈｃ！ｎ１ｓｔｒ７１７巻３
１０９〜３１１６頁、１９７８年）それぞれヒトに有効
な０８Ｆを部分精製したことを報告している。これらの
０８Ｆは、いずれも分子、［１２５，０００〜４１、０
００の範囲の糖蛋白質であり、ヒト骨髄非付着性細胞に
直接作用して好中球、マク四７アージ。

好酸球のコｏニーを形成する。しかしいずれの場ヒト正
常組織由来のＣ８Ｆであるが、近年ある種のヒト庸瘍細
胞において、Ｃ！８Ｆを産生ずるものが報告されている
。例えばＡａａｎｏ　Ｓ。等はヌードマウス移植肺癌細
胞から（Ｂｌｏｏｄ　４９巻８４５〜８５２頁。

１９７７年）、０ｋａｂｅ　Ｔ。等は下相部扁平上皮癌
株化細胞、甲状腺癌株化細胞から（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓ。３８巻３９１０〜３９１７頁、１９７８年）（ＪＮ
ＯＩ６９巻１２３５〜１２４３頁、１９８２年）　（Ｊ
、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。１１０巻４３〜４９頁
、１９８２年）、Ｗｕ　Ｍ、　Ｃ９等はすい臓癌株化細
胞から（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　２５４巻６２
２６〜６２２８頁、１９７９年）　（Ｊ、　０１ｉｎ　
Ｉｎｖｅｓｔ、　６５巻７７２〜７７５頁、１９８０年
）、Ｄｉｐｅｒｓｉｏ　Ｊ、　Ｆ、等は、Ｍａｌｉｇｎ
ａｎｔ　Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｍａ患者から樹立したＧ
　ＯＴ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅから（引ｏｏｄ　５１巻１
０６８頁、１９７８年）　（Ｂｌｏｏｄ　５６巻７１７
〜７２７頁。

１９８０年）、またＧｏｌｄｅ　Ｄ、Ｗｍ等はＨａｉｒ
ｙ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｅｕｋｅ　−ｍｉａ患者から樹立した
ＭＯ０ｅｌｌＬｉｎｅから（Ｂｌｏｏｄ　５２巻１０６
８〜１０７２頁、１９７８年）　（Ｂｌｏｏｄ　５７巻
１３〜２１頁、１９８１年）、それぞれａｓｐを得たこ
とを報告している。いずれの場合もヒトに有効なＣ８Ｆ
は分子量が２７．０００〜３４．０００の範囲に含まれ
る糖蛋白質であり、等電点はｐＩ＝−４，５〜５．７の
間の値を有するものである。これらのうちＧ。

Ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅの培養上清から得られるＣ８Ｆ
は比活性１．１２Ｘ１０’Ｕ／ｌｌ’ＪＰ、ＭＯＣｅ１
ｌ　Ｌｉｎｅの培養上清からの０８Ｆは３．５Ｘ１０’
Ｕ／Ｗの純度までそれぞれ精製が進められているが、こ
の他の上記Ｏ８Ｆも至 含めいずれも完全純化には掬っていないのが現状である
。

〔発明の開示〕

本発明者等は口腔底癌患者の腫瘍細胞から、Ｃ８Ｆの極
めて高い産生能を有し、かつ良好な増殖能を示す細胞株
の樹立に成功した。この細胞株はｒＯＨＵ−ＩＪと命名
され、フランス国のバスツー／ｋ　ａ　インスチチェー
ト　コレクシ賃ン　ナシ１ナレデ　力ルツレス　デ　ミ
クロオルガニズムス（ＯＯＬＬＥＯＴＩＯＮ　ＮＡＴＩ
ＯＮＡＩＪ　　ＤＢ　　０ＵＬＴＵＲＥ８　ＤＢ　ＭＩ
ＯＲＯＯＲＧＡＮＩ　８ＭＥ８　）　（０，Ｎ、Ｏ，Ｍ
　）に１９８４年７月１１日付受託番号ｒＩ−３１５Ｊ
として寄託されている。

本発明者等はこの０ＨＵ−１をインービトｐで培養し、
その培養上清から、ヒト好中球のコロニー形成促進活性
を示し、分子量約１８，０００（ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による定ｆｆ１
）、比活性が３．９４Ｘ１０’Ｕ／■≦の極めて純度の
高いＣ８Ｆを得ることに成功した。すなわち本発明は次
の理化学的性質を有するＣ８Ｆであり、これは文献未載
の新規なものである。

イ１理化学的性質！ １）分子量ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測 定で約１８．０００゜ Ｉ）等重点：ｐＩ≠５．７３．ｐＩ−６，０３およびｐ
Ｉ−６，３７の三つの等電点のうち少なくとも１ つを有する。

１；り紫外部吸収：２８０％講に極大吸収を有し、２５
０５ｍに極小値をもつ。

ｌｖ）アミノ酸組成：明細書中の表−１に示すアミノ酸
組成を有する。

ｖ）　Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
くである。

Ｈ２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−８ｅｔ−更に本発明はヒドロ腔底癌細胞より樹立
されたヒ）Ｏｆ９Ｆ産生能を有する細胞株を血清無添加
培養液にて培養し、その培養上清を次の■〜■処理に付
し、更に必要に応じ■または■の処理を付してなる前記
理化学的性質を有するＣ８Ｆの取得方法である。

■培養上清をｓ、　ｏ　ｏ　ｏ〜７０．０００ダルトン
実効分画範囲を有するゲルを用いたゲル濾過に付し、好
中球優位のコロニー形成促進活性Ｃ以下「０８　ＡＪと
いう）を有する画分を回収する。

■■の両分を逆相系高速液体クロマトグラフィ担体に吸
着せしめ、水と有機浴媒の混液の濃度勾配により浴出し
好中球優位のＣ８人を有する両分を回収する。

■■の両分を高速分子篩り胃マドグラフィに付や し好中球優位Ｃ８Ａを有する画分を回収する。

■■の画分を等電点電気泳動に付し、好中球優位のＣＩ
Ａを有する画分を回収する。

■■の両分にシアル酸除去操作を施したのち、好中球優
位のＣ８Ａを有する両分を回収する。

上記取得方法の概要を具体的に述べると例えば次のとク
リである。

ｒｃＨＵ−ＩＪをウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０培
養液に浮遊させてガラスローラーボトル中で一定速度で
回転培養を行なう。「ｃＨＵ−ＩＪがローラーボトルの
内壁に完全に密に増殖した時点で培養液をウシ胎児血清
を含まない几ＰＭＩＩ６４０に交換し４日間培養したの
ち、培養上清を回収し、次いで再度ウシ胎児血清を含む
Ｆ−１０培養液を加えて３日間培養する。再びウシ胎児
血清を含まないＲＰＭ１１６４０培養液に液替えし４日
間培養したのち培養上清を回収する。このようなスケジ
ュールで「培養−無血清培養の上滑の回収」をくり返し
行なうことにより、ｒＯＨＵ−１」の培養上清を得る。

このようにして得た培養上清を限外濾過器にて約１００
０〜２０００倍位に濃縮したのちゲル濾過し、好中球優
位の０８Ａを有する画分を回収する。次いでこの両分を
更に高速液体りｐマドグラフィーによる精製をくり返し
行なったのち、好中球優位の０８人を有する部分を回収
し凍結乾燥する。

尚、本発明において用いたＣ８人の測定方法はｂ゛ 次のとクリである。

ｒ０８Ａの測定方法」 （ａ）ヒト骨髄細胞を用いる場合： Ｂｒａｄｌｅｙ　Ｔ、　Ｒ，、Ｍｅｔｃａｌｆ　Ｄ、等
の方法（Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　ｅｘｐ。

を藷、　８ｃｉ、　４４巻２８７〜３００頁、１９６６
年）に準じて単層軟寒天培養法により行なった。すなわ
ちウシ胎児血清０．２　ｔＪ　、被検検体０．１　ｍｊ
　、ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液０．１ｄ（１〜２　Ｘ
ＩＯ’有核細胞）、改変ＭｃＯｏｙ’ｓ　５　Ａ培養液
０゜２ｔｕｌ、寒天を０．７５％含む改変ＭｃＯｏｙ’
ｓ　５人培養液０．４−を混合して直径３５■の組織培
養プラスティックディッシェに入れて固まらせたのち、
３７℃。

５％炭酸ガス／９５％空気、１００Ｘ湿度の条件で培養
を行ない、１０日後に形成されたコロニー数（５０個以
上の細胞からなる集落を１コＵニーとする）を敵え、１
個のコロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉｔ）とし
て０８Ａを求めた。

（ｂ）マウス骨髄〆細胞を用いる場合：ウマ血清０．４
　ｄ　、被検検体０．１　ｍｌ　、　０３　Ｈ／Ｈｅ（
メス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１　ｖｌ　（０，５
〜１×１０５有核細胞）、寒天を０．７５％含む改変Ｍ
ｅＯｏｙ’ｓ　５　Ａ培養液０．４Ｉノを混合し直径３
５四の組織培養用プラスティックディッシェに入れて固
まらせたのち、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気、１
００％湿度の条件下にて５日間培養し、形成されたコｏ
ニー数（５０個以上の細胞からなる集落を１コロニーと
する）を数え、１個のコロニーを形成する活性を１単位
（Ｕｎｉｔ）として０８Ａを求めた。

尚、上記（ｉ）、（ｂ）妨法において用いた「改変Ｍｃ
Ｏｏｙ’ｓ　５人培養液および（ａ）で用いたヒト骨髄
非付着性細胞浮遊液は次の如くして作製した。

「改変ＭｃＯｏｙｓ　５　Ａ培養液」 ＭｃＣｏｙｅｓ　５　Ａ培養液（ＧＩＢＯＯ社製）１２
ｆ。

ＭＥＭアミノ酸ビタミン培地（日永製薬社製）２゜５５
９１１炭酸ナトリウム２．１８ｆ、ペニシリンＧカリウ
ム５０００単位を２回蒸溜水５００１１１１に溶解後、
０．２２−のミリポアフィルタ−にて濾過滅菌を行なっ
た。

「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭ１１６４０
培養液にて５倍に希釈し、Ｆ　１ｃｏｌ　−Ｐａｑｕｅ
液（ファルマシア社製）に重層し、４００Ｘｆ、３０分
、２５℃にて遠心を行ない、界面の細胞Ｊｆｌ　（比重
＜　１．０７７　）を回収する。この細胞を洗滌後、２
０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培養液にて５
　Ｘ　１０’　Ｃｅ１ｌ／　ｍｌの濃度に調整し、２５
ｃｔＡ（Ｄ組織培養用プラスチックフラスコに入れ、炭
酸ガス培養器にて３０分間インキエベートしたのち、上
清の非付着性細胞を回収し、再度２５　ｏＡプラスチッ
クフラスコに入れ、２時間３０分インキエペートシたの
ち、上清の非付着性細胞を集めて用いた。

本発明の０８Ｆを後述の実施例（７）の如くしてマウス
の骨髄細胞およびヒトの骨髄細胞にぞれぞれ作用させた
結果、いずれの場合も好中球コロニーの形成促進が認め
られた。このことから本発明のＯ８Ｆは骨髄細胞の好中
球への分化増殖を促進するタイプのＯ８Ｆであることが
明らがである。

次に実施例によって本発明の詳細な説明する。

〔実施例〕

実施例（１）　　ｒ　ＯＨＵ　−Ｉ　Ｊの樹立（１）腫
瘍 著明な好中球の増多が詔められた口腔底癌患者の腫瘍を
”／ｎｕマウスに移植した。この腫瘍は移植約１０日後
に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた。この
腫瘍を移植１２日後に無菌的に摘出し、１〜２−角に細
切し、これを以下の如く培養した。

（１１）初代培養 上記細切した腫瘍塊１０〜１５片を５０ｔｔｔｌのプラ
スチック遠心管に入れ、５ｒｎｌのトリプシン靜倫（ト
リプシン０．２５％、ＦｉＤＴＡｏ、０２％含む）を加
え、３７℃の温浴中で１０分間振とうしたのち上清を捨
て、再度、同トリプシン溶液５ｄを加え、３７℃で１５
分間攪拌しながらトリプシン消化を行なった。上清の細
胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を１ゴ加えてトリプシ
ンの作用を止めたのち水中に保存した。

以上の操作を再度行ない細胞浮遊液を回収し、前回の分
と合わせて１．５００　ｒａｐａｍｍ　１０分間の遠心
により細胞ペレットを得た。この細胞ペレットをウシ胎
児血清を１０％含むＦ−１０にて２回洗滌したのち、２
５−のプラスチック培養フラスコに細胞濃度５ｘｘｄ’
個／フラスコになるようにして植え込んだ。ウシ胎児血
清を１０％含有するＦ−１０培養液を用い、炭酸ガスイ
ンキエベータ−（炭酸ガス濃度５％、湿度１００％）中
にて一晩インキエベートしたのち、上清を非付着細胞と
共に除去し、新しい培養液を加えて培養を継続した。

培養開始後６日目に細胞がいっばいに増殖したので、こ
の時点で培養液を新しいものに替えた。翌日、この培養
液を捨て、ＲＰＭ１１６４０で５倍希釈した抗マウス赤
血球（０ａｐｐｅ１社製）２ｍと同じ（ＲＰＭ１１６４
０で２．５倍希釈したモルモット補体（極東製薬社製）
２ｍＪを加え３７℃、２０分間インキエベートした。イ
ンキエペーション終了後ウシ胎児血清を１０％含むＦ−
１０にて２回洗滌しｆＩＩＪ／ｎｕマウス由来のフィブ
ロブラストを除去し、引き続きウシ胎児血清を１０％含
むＦ−１０培養液を加えて培養を行なった。

（ｉｌＤ　　継代培養 初代培養において細胞が完全に密に増殖した時点で再度
ウシ胎児血清１０％を含むＦ−１０培養液にて液替えを
行ない、翌日継代を行なった。駒込ピペットにて培養液
を除去したのち、あらかじめ３７℃に加温したＰＵＴ人
を０．０２％含む生理食塩水を２ｄ加え、ホットプレー
ト上で３７℃２分間加温後、ピペッティングにて細胞を
はく離せしめた。ウシ胎児血清０．５−を添加後５１５
ｍ６！の遠心管に細胞浮遊液を移し、１．５０　Ｏｒ、
ｐ、ｍ、１０分間の遠心により細胞ペレットを得た。Ｉ
ＷＬｌ！のＦ−１０培養液に細胞を浮遊せしめ、１／１
０に分割して継代を行なった。以後、同様の操作により
４〜５日間隔にて継代を行なった。このようにして得た
細胞の増殖能を調べるため、５Ｘ１０’０ｅｌｌａ／ｄ
の細胞浮遊液を作成し、直径３５ｍのプラスティックデ
ィッシェに１ｄずつ植え込みを行ない（２０枚）炭酸ガ
スインキュベーターにて培養し、一定時間の経過毎にデ
ィツシユをとり出し、接着細胞を回収して細胞数を算定
した。こめ結果は第４図に示した。細胞植え込み後、約
２０〜２４時間後に増殖が始まり、平均倍化時間（ＰＵ
Ｔ　）は約２０時間であった。

実施例（２）　０８　Ｆの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した１
５０−の培養フラスコ２本より細胞を回収し、これをウ
シ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液５００１Ｌ
ｔに浮遊させたのち、１５８０ｄのガラス製ローラーボ
トル（Ｂｅｌｃｏ社製）に移し、０、５　ｒａｐａｍｍ
の速度で回転培養を行なった。細胞がローラーボトルの
内壁に完全に密に増殖した時点で培養液を血清を含まな
いＲＰＭ１１６４０に交換し、４日間培養したのち培養
上清を回収し、ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０
を加えて培養を続行する。３日間培養したのち再び血清
を含まないＲＰＭ１１６４Ｇに液替を行ない、４日後に
培養上清を回収した。以下同様の操作をくり返すことに
より、毎週１ボトルより５００ｄずつの血清を含まない
培養上清が得られ、しかもこの方法によりかなり長期間
にわたって細胞を維持し、培養上清を回収することが可
能であった。

得られた培養上清５ｔを１バツチとし、これに０．０１
％ツイーン２０を添加後Ｈｏｌｌｏｗ　Ｆｉｂｅｒ　Ｄ
　Ｏ−”１およびＡｍ１ｃｏｎ　Ｐ　Ｍ　−１０（アミ
コン社製）を用いた限外濾過法により約１０００倍に濃
縮したのち、これを以下の順序で精製した。

（１）直径４．６　ｃｍ　、長さ９０ｃｆＨのＵｌｔｒ
ｏｇｅｌ　ＡｃＡ　５４カラム（ＬＫＢ社製）を用い、
０．１５　Ｍ　Ｎａ０Ａおよび０．０１χツイーン２０
（牛丼化学社製）を含む０．０１　Ｍ　）　ＩＪス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて前記濃縮した培養上清５
１１Ｌｌ！を流速約５０ｒｘｌ／時間でゲル濾過した。

尚カラムはあらかじめウシ血清アルブミン（分子量６７
．０００）、オボアルプミン（分子ｉｔ　４５．０００
　）　ｓチトクロームＣ（分子つを採取し、１０倍に希
釈した後、前述した「Ｃ８Ａの測定方法（ｂ）」により
活性を示す両分を調べた。この結果、先ずＶｅ＝４００
−８７００ｄの両分がマクロファージ優位の０８Ａを示
し、Ｖ６　ａｍ８００〜１２００ｍの画分が顆粒球優位
のＣ３Ａを示すことがわかったので、後者の両分を集め
ＰＭ−１０（アミフン社製）を用いる限外ｐ過器によっ
て約５−に濃縮した。

（１）　　上記濃縮画分に襲−ブリパノール（東京化成
社製、アミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％トリ
フルオロ酢酸水浴液を添加し、水中に１５分程度放置し
たのち、１５＋　０００　ｒ６　ｐ＊１１１．１０分の
遠心により沈澱を除去した。次いで先のＳ−プロパツー
ルおよびドリフルオリ酢酸を含む水溶液で平衡化したｆ
ｉ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　０１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社
製、セミ分取用、　ｇ　ｓａ　Ｘ　３０　ｃｍ　）に吸
着後、３０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プロパツール
を含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した
。高速液体クロマト装置は日立６８５−５０型を、検出
は日立６３８−４１型検出器（いずれも日立製作新製）
を用い、２２０％慨と２８０ｎｍの吸収を同時に測定し
た。溶出後、各両分より１０μｍを分取１００倍希釈し
たのち、前述のｒ０８Ａの測＾（ｂ）」により活性を示
す両分を調べた。この結果、諮−プロバ／−ｙｖ＜ｏｘ
にて溶出されるピークに活性が認められたので、このピ
ークを集め再度同じ条件で再り四マＦを行ない上記と同
様にして０８Ａを調べたところ、やはり舊−ブリパノー
ル４０％の位置のピークに活性が認められたので、この
ピークを集め（４７ラクシヨンエ４ｔｊ）凍結乾燥した
。

（ｆｉｌ）　　上記凍結乾燥粉末を外−ブリパノールを
４０％含ｔｒＯ，１％トリフルオロ酢酸水浴液２００μ
Ｌに浴解し、Ｔ８に一０３０００８Ｗ力ｊＡ（東洋曹達
社製、乳５闘Ｘ　６０　ｏｎ　）を用いた高速液体クロ
マトグラフィにかけた。溶出は同水溶液により０゜４　
ｔｒｔｔ　／　分の流速で行ない、フラクションコレク
ターＦＲＡＯ−１００（ファルマシア社製）により０．
４ｄずつ分取した。分取した各両分についてＣ８Ａを前
記と同様にして調べた結果、保持時間が３７〜３８分の
画分（分子量約２万に相当）に活性が認められたので、
この両分を回収し、更に分析用μＢｏｎｄａｐａｋ　０
１ｇカラム（４６！ｌ１ｌＸ３０ｃＰＩｔ）による精製
を施したのち、メインピークを回収し凍結乾燥した。

実施例（３）理化学的性質 実施例（２）で得た本発明の０８Ｆの理化学的性質を調
べるため次の分析、試験を行なった。

（１）　　分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（８Ｄ８−ＰＡＧＥ）により行なった。電気泳動装
置はＧ’Ｅ−２／４Ｃ７ｙルマシア社製）、ゲルはＴツ
１５％、Ｏ−２，６％のポリアクリルアミドスラブゲル
（７０ｔｍ　Ｘ　７０　Ｗ　Ｘ　３　ｍ　）および濃縮
ゲル（Ｔ！３％、Ｏ−２０％）を用いた。

試料はあらかじめ０．６４　Ｍ　２−メルカプトエタノ
Ｍになるように添加することにより変性させておいたも
のを２μを用いた。１２０Ｖで３時間泳動したのちゲル
を取り出し、メタノール：酢酸：水（４：ｌ：５）にて
固定し、銀染色（８ｉ１ｖｅｒ　５ｔａｉｎ　：バイオ
ラッド社製）によりバンドを検出した。分子量マーカー
としてウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ。

分子ｆｆ１６７．０００）、；ｔボア＃１ミ＞（ＯＶＡ
　。

４５、０００　）、ｆ　）　りＴ２−　Ａ　Ｃ（Ｃｙｔ
、０，１２，０００）、インスリン（Ｉｎｓ、　Ａ鎖：
３，３００．Ｂ鎖：２，４００）を同様に処理して用い
た。この結果、分子量約１ｓ、　ｏ　ｏ　ｏの単一バン
ドが認められた。測定結果は第１図に示す。

（１１）等電点 フラットベッド型等電点寛気泳動装ｆｉ！ＦＢＦ！−３
０００（ファルマシア社製）を用いた。ｐＨ４〜６．５
のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ　（７フルマシア社製）を含む
ポリアクリルアミドゲル（Ｔ±５％、ｃ−３％、１１５
問×２３ｏ■）にて３０Ｗ定電力（最大電圧２゜００Ｖ
）で２時間泳動を行なったのち、３０％メタ／−ル／１
０％トリクロル酢酸／３５％スルホサリチル酸により固
定し、次いでクマーシーブリリアントプルーＲ−２５０
染色を行なった。等電点マーカーとしてＬａｗｐＩ　Ｋ
ｉｔｐｌ（２，５〜６．５　（７アルマシア社製）を用
いた。

ｐＨ４〜６．５の間で分離を検討したところｐＩ　−５
，７３，６，０３，６，３７の３本のバンドが認められ
た。このうちｐＩ−５，７３および６．０３の２本のバ
ンドが主たる成分であった。この結果は第２図に示す。

図中０８Ｆｏ、０８ＦＩ、Ｃ８Ｆ２は等電点の異なる本
発明の０８Ｆを示す。

この３本のバンドと０８人との相関をみる目的で実施例
（２）　−（Ｉｌｌ）におけるＴ８に−０３０００ＳＷ
カラムにより精製した段階のＯ８Ｆを、調製用等亀点電
気泳動装＠（ＦＢＥ−３０００、ファルマシア社製）を
用いて分離した。尚、分離条件は以下の通りである。

試　　料：凍結乾燥粉末５００μｆを４Ｍ尿素を含む０
．０５　Ｎリン酸１ｄに浴解。

支持体：１−５ｆの８ｅｐｈａｄｅｘ　−Ｉ　ｇＦ　（
ファルマシア社製）に、４Ｍ尿素、０．１％ツイーン２
０を含む２回蒸溜水２２５ｄを加えたのち、更に１２耐
の７アルマライト４−６．５　（７アルマシア社製）を
加え室温にて一晩放置して膨潤せしめた。膨潤後、吸引
びんを用いて充分脱気を行ったのち２３０５ｍＸ２３０
鵡のガラスプレート上に５■厚の均一なゲル層を作成し
た。プレート１最も均一な部位を選んで５０ｆｉＸ２３
０１１１１のゲルを残し、他の部分のゲルは除去した。

電極液＝（陽極）　０．１　Ｍリン酸、（陰極）０．１
Ｍ　ＮａＯＨを電極ストリップ（６Ｘ　１０　ｍ　。

ファルマシア社製）に含ませ、ゲルの両端に接して平行
に置く。パワーサプライ０３０Ｐ８２００Ｇ／３００．
７アルマシア社製）を用いて定電力。

前泳動：　８Ｗ４５分間泳動を行なった。

試料添加：陽極から５ｃＭの位置にて、１０巾にゲルを
かき取り、試料液と混合したのちもとの位置にもどした
。

本泳　動：前述のパワーサプライを用い、５０Ｗ定電力
４時間泳動を行なった。

泳動終了後、ゲルプレートをとり出し、分画格子を用い
て２６分画に分け、各分画の−Ｉを測定後、各分画のゲ
ルをかき取りポリプロピレン製ミニカラム（ムロマッグ
。室町化学社製）中に移し４　ｍｌの４Ｍ＠酸グアニジ
ンを含む０．１％トリフルオロ酢酸−水溶液により抽出
を行った。各抽出画分より５μＬをとり２罰の１％ウシ
血清アルブミンを含むＲＰＭ１１６４０培養液にて希釈
したのち、前述した「０８人の測定方法（ｂ）」に従っ
て０８Ａを調べた。この結果浴出全画分中に三つの活性
ピークが存在し、各活性ピークの位置は前述の等電点ｐ
Ｉ−５，７３、６，０３、６，３７とよく一致した。こ
こでみられた等電点の違いが、ベブタイド部分に起因す
るのか、あるいは糖鎖（特にシアル酸の付加数）に起因
するのかを明らかにする目的で、ノイラミニダーゼ処理
した試料と未処理の試料について等を点電気泳動を行っ
たところ、後者には３本のバンドが認められたのに対し
、前者はｐＩ＝６．３７のバンドのみが観察された。ま
たノイラミニダーゼ処理の代りに６Ｍグアニジン塩酸水
浴液に試料を浴解し、ＩＮ塩酸で−を１．５としたのち
、８０℃。

１２０分の処理を行なった試料について同様に等電点電
気泳動を行なったところ、同様なバンドの移動が認めら
れた。尚、ノイラミニダーゼ処理を行なっても０８Ａは
全く損われなかった。この結果から等電点の違いはシア
ル酸の付加数の違いによるものと推定される。

（ｉｉｉ）　　紫外部吸収 試料を５−プロパツールを４０％含ｔ？０．１％トリフ
ルオロ酢酸をレファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　）　
トシ、分光光度計を用いて紫外部吸収を調べた結果、第
３図に示した如＜２８０ａｆｉに極大吸収、２５０％惟
に極小値を示した。

（ｉＶ）　　蛋白質部分のアミノ酸組成試料を常法によ
り加水分解し、その蛋白部分のアミノ酸組成をアミノ酸
自動分析装置を用いて分析した。この結果を表−ｊに示
した。尚、加水分解条件は次の如くである。

■６ＮＨＯｊ！１１０℃　２４時間 ■４Ｎメタンスルホン酸＋０．２％３−（２−アミノエ
チル）インドール、１１０℃ ２４時間、４８時間、７２時間 ＊　Ｔｂｒ　、　８ｅｒ　、　１／２０ｙｓｔ　Ｍｅｔ
　、　Ｇａｌ　ＮＨ２は補正ａａ　Ｖａｌ　、　Ｉｌｅ
は７２時間値／′ −・　・１ 表−１ （Ｖ）　　温度安定性 試料（凍結乾燥粉末）１■を５−プロパツールを４０％
含む０．１％トリフルオロ酢酸４−にて浴解し、その１
ｄを分取し、１％ウシ血清アルブミンを含む０．０１　
Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１０−にて希釈し
て０８Ｆ濃度を２５％ｆ／ｌｄとした。

この試料を０℃、３７℃、４５℃、５６℃、６５℃およ
び１００℃にてそれぞれ４０分間処理したのち、残存す
る０３Ａを検討した。この結果、０〜４５℃で安定であ
り、５６℃で失活した。

（ｖＤ　　−安定性 試料（凍結乾燥粉末）１■を爲−プロパツールを４０％
含む０．１％トリフルオロ酢酸４ｄに浴解し、その１ｄ
を分取し、１％ウシ血清アルブミンを含む１）Ｈｌ、３
，５，７，９，１１．　ｌ　３の各緩衝液１０ゴにて希
釈し、Ｏ８Ｆ濃度を２５　ｔｓｙ／　ｍｅとしてそれぞ
れ水中で２４時間処理した。処理終了後、それぞれ２　
ｒｎｌを０．　ＯＩ　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４）にて透析してｐｉ（をもどしたのち、残存するＯ８
Ａを検討した。この結果、ｐＨｌ〜１１の広い範囲で安
定であった。

（ｖｉＤ　　酵素に対する安定性 試料（凍結乾燥粉末）を外−プロパツールを４０％含む
０．１％トリフルオｐ酢酸に浴解し、０．６７μ？を０
．０５　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐｉ１８．０　）を加
えて全量を１　ｔｔｔｌとした検体を４つ、および同じ
＜０゜６７μｔを０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０
）を加えて全社を１Ｍとした検体を１つ用意し、前者に
は各々ＲＮａｓｅ　、　）リプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ　
）　、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｉｅ　）を１μｍ添加し
、残る１つはコントレールとした。

後者にはノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓ
ｅ　）　ｌμｔを添加し、それぞれ３７℃で２時間反応
させた。反応終了後、各々０．１　ｍｌをとり１％ウシ
血清アルブミンを含むＲＰＭ１１６４０培養液１　ｔｔ
ｔｌにて希釈後、それぞれ０８Ａを検討した。この結果
、本発明の０３ＦはＲＮａａｅ　、ノイラミニダーゼで
は失活しないが、トリプシンおよびプロナーゼで失活し
た。

（ｖｉｉ）糖組成 試料１１ｎｍｏｌに内部標準としてイノシトール２５ｎ
　ｍｏｌを加え、窒素ガス置換した封管中、９０℃で４
時間反応させた。開管復炭酸銀（Ａｇｚ　００３　）を
加えて中和したのち、無水酢酸５０４を加え振とり後、
室温にて暗所に一晩放置した。上層をサンプルチューブ
にとり、窒素ガスにて乾燥した。沈澱にメタノールを加
え洗浄後軽く遠沈し、上層を同じサンプルチューブに加
え乾燥した。これに５０μＬのＴＭａ化試薬（ピリジン
：ヘキサメチルジシラザン：トリメチルクロロシラン−
５：　１　：　１に混合したもの）を加え４０℃で２０
分反応させたのち、Ｄｅｅｐ　Ｆｒｅｅｚｅｒに保存し
た。尚、スタンダードとしてガラクトース（ＧａｌＬＮ
−アセチルガラクトサミン（Ｇａｌ　ＮＡｃ　）　、シ
アル酸等、各種糖を各５０ｎｍｏ１４！及びイノシトー
ル２５　ｎ　ｍｏｌを合わせ同様の操作を行なった。

このサンプルについて以下に示す条件でガスクロマド分
析を行なった。

（分析条件） カラム：２％ＯＶ　、−１７Ｖｉｎｐｏｒｔ　ＨＰ　６
０〜８０メッシェ、３渇、ガラス 温　度：１１０℃〜２５０℃まで４℃／分の昇温キャリ
ヤーガス＝１９．初は１．２〜１．６１９／ｃｒＡ（Ｎ
素圧）終了時は２〜２．５ＡＩ’／ｃ！！１ Ｋ４ｆ：１０３ＭΩ　レンジ０．１〜０．４　Ｖ圧　：
水素ガス０．８ｋｆ／ｃｒｔｌ　、空気０．８　ｋｇ　
／　ｃｎｉサンプル坦：２．５〜３．０μＬ 分析の結果夕本発明の０８Ｆの構成糖はガラクトース、
Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびシアル酸の３種類で
あることがわかった。

（１ｘ）アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエネーター（アプライドバイオシス
テム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ　）分解し、
得られたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトクラフィー
装置（ベックマン・インストルメンツ社′ｍ）およびＵ
ｌｔｒｏｐｈｅｒｅ　−ＯＤ　Ｓカラム（ベックマン・
インストルメンツ社製）を用いて常法により分析した。

カラム（５μ犠、直径４．６　ｒｒａ　、長さ２５０　
ｖｍ　）を開始緩衝液（１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐｌＩ４．５．４０％７５１トリルを含む水餅液）にて
平衡化したのち１．検体（２０μ２の開始緩衝液にて溶
解）を注入して開始緩衝液によるイソクラティック溶出
により分離を行なった。流速は１．４ｒｔｔｌ１分、カ
ラム温度は４０℃に保持した。ＰＴＨアミノ酸の検出は
２６９％惰と３２０％洛の紫外部吸収を利用した。あら
かじめ標準ＰＴＨアミノ酸（シグマ社製）各２　Ｉｔ　
ｍｏｌを同一の系で分離して保持時間を決定し、被検検
体の保持時間から同定を行なった。この結果、Ｎ末端か
ら２１残基目までのアミノ酸配列は次の如く決定された
。

実施例（４）比活性値の測定 実施例（２）で得た本発明のＯ８Ｆのヒト骨髄細胞に対
する比活性値を前述したｒａｓ人の測定方法（ａ）」に
従って測定した結果３．９４Ｘ１０　　Ｕ／Ｆｌ≦であ
った。

実施例（５） 実施例（２）の方法で得たＯ８Ｆの凍結乾燥粉末を以下
の条件で調製用等電点電気泳動に付した。

装　　直：ＦＢＥ−３０００（ファルマシア社ｌり試　
　料：凍結乾燥粉末１０〜を４Ｍ尿素を含む０、０５　
Ｎリン酸２ｄに府解。

支持体＝１５ｆの８ｅｐｈａｄｅｘ　−Ｉ　Ｎ　Ｆ　（
７フルマシア社製）に、４Ｍ尿素、０−１％ツイーン２
０を含む２回蒸溜水２２５　＃Ｅｅを加えたのち、更に
１２ｍＡ！のファルマライト４−６．５　（７フルマシ
ア社製）を加え室温にて一晩放置して膨潤せしめた。膨
潤後、吸引びんを用いて充分脱気を行ったのち２３０譚
Ｘ２３Ｑｉｎａのガラスプレート上に５＋ｗ厚の均一な
ゲル層を作成した。

電極液＝（陽極）　０．１　Ｍリン酸、（陽極）０．１
ＭＮａＯＨを電極ストリップ（６Ｘ　１０ｍ。

ファルマシア社製）に含ませ、ゲルの両端に接して平行
に置く。パワーサプライＣＥＣＰＳ　２０００／３００
．ファルマシア社製）を用いて定電力。

前永動：　８Ｗ４５分間泳動を行なった。

試料添加：陽極から５画の位置にて、１ｃＷ１巾にゲル
をかき取り、試料液と混合したのち、もとの位置にもど
した。

本泳動：前述のパワーサプライを用い、５０Ｗ定電力、
４時間泳動を行なった。

泳動終了後、ゲルプレートをとり出し分画格子を用いて
２６分画に分け、各分画の−１を測定後、各分画のゲル
をかき取りポリプロピレン製ミニカラム（ムロマック、
室町化学社製）中に移し１０ｄの４Ｍ＃ｉ酸グアニジン
を含む０．１％トリフルオロ酢酸−水溶液により抽出を
行った。各抽出画分より５μ２をとり１６−の１％ウシ
血清アルブミンを含むＲＰＭ１１６４０の培養液にて希
釈したのち、前述したｒＯ８Ａの測定方法（ｂ）」に従
ってＣ８Ａを調べたのち三つの異なった等電点（ｐ　Ｉ
　−５，７３＋６．０３，６．３７）をもつ活性画分を
それぞれ爲−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸を含
む水浴液で平衡化したμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｏ１８カラ
ム（Ｗａｔｅｒｓ社製、セミ分取用、８■Ｘ　３０５１
　）に吸着させたのち、３０〜６０％の直線濃度勾配の
悴−プロパノールを含む０．１％トリフルオｐ酢酸水浴
液で浴出し、５−ブロバノ−＃４０％で浴出されるピー
クをそれぞれ回収し凍結乾燥した。

実施例（６） 実施例（２）で得た０８Ｆの凍結乾燥粉末１０Ｔｖを２
　ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム（
ｐＨ９，０）に浴解したのち、ＩＮ塩酸を用いて−を５
．０に調整した。これにフイラミニダーゼ１００μｍを
添加後３７℃で２時間反応させたのち、゛び゛ 反応液を爲−プロパノールおよぶトリフルオロ酢酸を含
む水浴液で平衡化したμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１ｇカラ
ム（Ｗａｔｅｒ＠社製、セミ分取用、　ｇ　ｗｒ　Ｘ　
３　Ｑ　ｅｘ　）に吸着後、３０〜６０％の直線濃度勾
配の舊−プロパノールを含む０．１％トリフルオロ酢酢
酸水液液訂出し、外−プロパノール４０％にて浴出され
るピークを回収し凍結乾燥した。この一部を採り分析用
等電点電気泳動に付した結果、等電点ｐＩ−６，３７の
単一バンドであることを確認した。

実施例（７）コロニーの分類 前述の「Ｃ８人の測定方法（ａ）」に基づいて形成され
たコロニーをＫｕｂｏｔａ　Ｂ　Ｋ　ａらの方法（Ｅｘ
ｐ、　Ｈａｎａｔ、　８巻、３３９〜３４４頁、１９８
０年）に従って、寒天層ごとスライドグラス上にとり出
し乾燥させフィルム状標本を作成した。次にこの標本を
Ｋｏｎｗａ　ｌ　１ｎｋａ、　Ｇ。

らの方法（Ｅｘｐ、　Ｈｅｍａｔ　、　８巻、４３４〜
４４０頁、１９８０年）に従ってエステラーーー染色及
びビーブリッヒスカーレット染色の三重染色を行ってコ
ロニーの分類を行った。方法の詳細については以下に示
す。

■固定液：緩衝ホルマリン・アセトン液（ｐＨ６，６）
Ｎａ２ＨＰ０４　　　　２０１ＮＪ ＫＨ２ＰＯ４１００ＭＩ Ｈ２０３０ｍｇ アセトン　　　　４５ｍ／ ホルマリン　　　２５　ｍｌ 全ｉｆ　　　　　１００扉ｌ　　　４℃にて保存■非特
異的エステラーゼ染色反応液（用時調製）ＣＡ）　　１
／１５　ｍｏｌ　／　Ａ　、リン酸緩衝液（Ｔｈ１６．
３　）　９．５　ｈｔ１７アスト、ガーネットＧＢＣ塩
　　　　　Ｉ　Ｑ　ｒｒ：ｇ（Ｂ）　α−ナフチルブチ
レート　　　　　　１０７ダエチレングリコールモノメ
チルエーテ＃　　　　　０．５　ｍｌ（Ａ）液とＣＢ）
液を混和後濾過して使用■クロロアセテートエステラー
ゼ染色反応液（用時調製） （Ａ）　１／１５　ｍｏｌ　／　Ａ　、リン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）　９．５　ｒｔｔｌファストブルーＲＲ塩
　　　　　　５　■（Ｂ）　　す７）−＃Ａｆ９−Ｄり
ｎｏアセテート１ｍ９Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド　
　　　０．５ｒｔｔｌ　　　・（Ａ）液と（Ｂ）液を混
和後濾過して使用。

■ビープリッヒスカーレット染色反応液（Ｂ）０．１Ｍ
）リス−塩酸緩衝液（ｐｉ（７，４）（λ）液２　ｍｌ
を（Ｂ）液９８ゴに混和して使用。

上述の如く調製した固定液および反応液を用いて以下の
如き順序でコロニー染色を行なった。

（＋）■の固定液（４〜１０℃）にて３０秒間固定後蒸
溜水にて３回水洗し室温にて１０〜３０分間乾燥。

（１１）■の反応液に浸し室温に２０〜３０分間放置後
蒸溜水にて３回水洗。

（ｌｉ＋）　　■の反応液に浸し室温に１５分間放置後
復温水にて３回水洗。

Ｏｖ）　　■の反応液に浸し室温に２時間放置後流水に
て水洗。

（Ｖ）乾燥後観察。青色の顆粒を含む細胞を好中球。

茶褐色の顆粒を含む細胞を単球−マクｐ７アージ、赤色
の顆粒を含む細胞を好酸球として分類した。

この結果、本発明の０８Ｆを用いて形成されたコロニー
は、培養７，１０．１４日口のいずれの時点においても
全てクロロアセテートエステラーゼ陽性の好中球コロニ
ーで、他系統のコ四ニーは全く認められなかった。

〔発明の効果〕

本発明の０８Ｆは次の■〜■の実験結果から明らかな如
くほぼ完全に純化されたものである。即ち■逆相系およ
び分子ふるいに基づく高速液体クロマトグラフィーにお
いて単一のピークを示し、活性ピークもこれと一致する
。■８ＤＳ−ＰＡＧＥにて単一のバンドを与える。■等
電点電気泳動法により３つの巣なる等電点を持った成分
に分離されるが、各成分はいずれもＯ８Ａを示す単一成
分である。また、酵素的あるいは化学的に末端シアル酸
の除去を行なうと、等電点電気泳動においても単一のバ
ンドとなる。■Ｎ末端２１残基迄のアミノ酸配列分析に
おいて、各ステップで出現するＰＴＨアミノ酸は、常に
一種類である。■従来報告されているヒトに有効な０８
Ｆの純度と比較すると、比活性において約１０倍高い値
が得られている。

このように純化された形の０８Ｆは未だ例を見材料とし
て極めて好適であるほか、臨床検査用試薬として、ある
いは研究用試薬として使用しうる。

また骨髄移植時の骨髄細胞の増殖促進、放射線被爆時の
骨髄組織の回復促進、制癌剤使用後の白血球レベル回復
促進あるいは本発明のＯ８Ｆが骨髄細胞の好中球への分
化増殖促進作用を有することから、抗生物質で治療でき
ない重症感染症等の治療薬としての効果等が期待される
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の０８Ｆの５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示
す。図中拳が本発明の０８Ｆである。 第２図は本発明のＯ８Ｆの等電点電気泳動の結果を示す
。 第３図は本発明の０８ＦのＵＶ吸収スペクトルである。 第４図はＣＨＵ−１の増殖能を示す。 特許出願人　　中外製薬株式会社 米１図 ０１　λ　３　４　　Ｓ　　（（ｘ） →勤斧鳥東 手続補正書（自発） 昭和６０年４月３日 特許庁長官　　　志　賀　　　学　　殿１、事件の表示 昭和５９年特許願第１５３２７３号 ２、発明の名称 新規なＣ８Ｆおよびその取得方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 東京都北区浮間五丁目５番１号 （３３１）中外製薬株式会社 代表者　　　上　　　野　　　公　　　夫明細書「特許
請求の範囲」、「発明の詳細な説明」の欄および「図面
の簡単な説明」６、補正の内容 （１）特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正する。 （２）明細書簡８頁１２行〜１４行目の記載を次のとお
り補正する。 ｒ　ｉｌ）等電点：以下の表−１に示す三つの等電点（
Ａ、Ｂ、Ｃ）のうち少なくとも １つを有する。 表−１ 」 （３）同、第８頁１７行目の１表−１」を「表−２と補
正する。 （４）同、第２２頁１８行目の「（ファルマシア社製）
」のあとに「及び４Ｍ尿素」を挿入する。 （５）同、第２３頁１２行目のｒ−−−Ｃ８Ｆを示す。 」のあとに次の文を挿入する。 「尚、尿素不存在下で同様に等電点電気泳動を行った結
果ｐＩ＝５．５２．５．８０および６．１３の３本のバ
ンドが認められた。 この方法による等電点測定を１０回繰り返し行った結果
、その値は表−１に示すと゛　おりであり、等電点Ａ、
Ｂ、Ｃは互いにほぼ０．３ずつの相違が常に見られた。 」（６）同、第２７頁１行目の「表−１」を「表−２」
と補正する。 （７）同、第２８頁の「表−１」を「表−２」と補正す
る。 （８）同、第３３頁最下行の「−ｍ−電気泳動に付した
。」を「−ｍ−電気泳動により等電点の違いによるＣ８
Ｆの分離を行った。」と補正する。 （９）同、第３５頁１４行目の「−一一調べたのち」を
「−一一調べた結果」と補正する。 （１０）同、゛第３５頁１５行目の「−ｍ−をもつ活性
画分をそれぞれ一一一」を「−ｍ−にほぼ一致して活性
のピークが認められた。次いでそれぞれの活性画分を一
一−」と補正する。 （１１）同、第３６頁２行目の「−ｍ−凍結乾燥した。 」のあとに次の文を挿入する。　　′「これらについて
実施例（３）の（１ｖ）および同（１ｘ）に記載の方法
に従ってアミノ酸組成並びにアミノ酸配列を調べた結果
、いずれも実施例（３）の結果と一致した。」（１２）
同、第４１頁５行目の「第２図は」のあとにｒ４Ｍ尿素
存在下における」を挿入する。 特許請求の範囲を次のとおり補正する。 「２、特許請求の範囲 （１）次の理化学的性質を有するＣ８Ｆ。 ｉ）分子量ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法 による測定で約１８．０００゜ 表−１ 目［）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５
０ｎｍに極小値をもつ。 Ｉｖ）アミノ酸組成：明細書中の表−２に示すアミノ酸
組成を宵する。 ｖ）　Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
くである。 ａｌ− （２）等電点ｐＩがＡである特許請求の範囲第１項記載
のＣ８Ｆ。 （３）等電点ｐＩがＢである特許請求の範囲第１項記載
のＣ８Ｆ。 （４）等電点１）ＩがＣである特許請求の範囲第１項記
載のＣ８Ｆ。 （５）ヒ１−Ｃ３Ｆ産生能を有する細胞株を血清無添加
培養液にて培養し、その培養上清を次の■〜■処理に付
し、更に必要に応じ■または■の処理を付してなる下記
理化学的性質を有するＣ８Ｆの取得方法。 ■培養上清を５．０００〜７０．０００　　ダルトン促
進活性（以下ｒｃｓＡＪという）を有する画分を回収す
る。 ■■の両分を逆相系高速液体クロマトグラフィ担体に吸
着せしめ、水と有機溶媒の混液の濃度勾配により溶出し
好中球優位のＣ８Ａを有する画分を回収する。 ■■の画分を高速分子篩クロマトグラフィに付し好中球
優位のＣ８Ａを有する両分を回収する。 ■■の両分を等電点電気泳動に付し、好中球優位のＣ３
Ａを有する両分を回収する。 ■■の画分にシアル酸除去操作を施したのち、好中球優
位のＣ８Ａを有する両分を回収する。 「理化学的性質」 ｉ）分、子量ニドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリル
アミドゲル電気泳動法 による測定で約１８．０００゜ つ 表−１ 目Ｉ）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５
０ｎｍに極小値をもつ。 ｊｖ）アミノ酸組成：明細書中の表−２に示すアミノ酸
組成を有する。 ｖ）　Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
くである。 ａｌ− （θ）ヒ）Ｃ３Ｆ産生能を有する細胞株がＣＨＵ−１で
ある特許請求の範囲第５項記載の方法。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の理化学的性質を有するＣＳＦ。 ｉ）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動法による測 定で約１８，０００。 ｉｉ）等電点：ｐＩ＝５．７３、ｐＩ＝６．０３および
   ｐＩ＝６．３７の三つの等電点のうち少なくとも１ つを有する。 ｉｉｉ）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２
   ５０ｎｍに極小値をもつ。 ｉｖ）アミノ酸組成：明細書中の表−１に示すアミノ酸
   組成を有する。 ｖ）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如く
   である。 【アミノ酸配列があります】
2. （２）等電点ｐＩが５．７３である特許請求の範囲第１
   項記載のＣＳＦ。
3. （３）等電点ｐＩが６．０３である特許請求の範囲第１
   項記載のＣＳＦ。
4. （４）等電点ｐＩが６．３７である特許請求の範囲第１
   項記載のＣＳＦ。
5. （５）ヒトＣＳＦ 産生能を有する細胞株を血清無添加培養液にて培養し、
   その培養上清を次の［１］〜［３］処理に付し、更に必
   要に応じ［４］または［５］の処理を付してなる下記理
   化学的性質を有するＣＳＦの取得方法。 ［１］培養上清を５，０００〜７０，０００ダルトン実
   効分画範囲を有するゲルを用いたゲルろ過に付し、好中
   球優位のコロニー形成促進活性（以下「ＣＳＡ」という
   ）を有する画分を回収する。 ［２］［１］の画分を逆相系高速液体クロマトグラフィ
   担体に吸着せしめ、水と有機溶媒の混液の濃度勾配によ
   り溶出し好中球優位のＣＳＡを有する画分を回収する。 ［３］［２］の画分を高速分子節クロマトグラフィに付
   し好中球優位のＣＳＡを有する画分を回収する。 ［４］［３］の画分を等電点電気泳動に付し、好中球優
   位のＣＳＡを有する画分を回収する。 ［５］［３］の画分にシアル酸除去操作を施したのち、
   好中球優位のＣＳＡを有する画分を回収する。 「理化学的性質」 ｉ）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動法による測 定で約１８，０００。 ｉｉ）等電点：ｐＩ＝５．７３、ｐＩ＝６．０３および
   ｐＩ＝６．３７の３つの等電点のうち少なくとも１ つを有する。 ｉｉｉ）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２
   ５０ｎｍに極小値をもつ。 ｉｖ）アミノ酸組成：明細書中の表−１に示すアミノ酸
   組成を有する。 ｖ）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如く
   である。 【アミノ酸配列があります】
6. （６）ヒトＣＳＦ 産生能を有する細胞株がＣＨＵ−１である特許請求の範
   囲第５項記載の方法。