JPH05508546A - エルウイニア―ｌ―アスパラギナーゼの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エルウィニア−し−アスパラギナーゼの精製技術分野 本発明は、アスパラギナーゼの精製方法に間する。

背景技術 Ｌ−アスパラギナーゼは、一連の細菌、かび、植物及び哺乳動物で生ずることが 報告されており、グラム陰性の細菌におけるその存在は、充分に発表されている （Ｗｒｉｓｔｏｎ及びＹｅｌｌ　ｉｎ、１９７３、Ｗｒｉｓｔｏｎ、１９８５） 、Ｌ−アスパラギナーゼは、これらの酵素の成るもの特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ　ｃｏｌｉ（アスパラギナーゼＩ■）及びＥＲｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔ ｈ、ｅｍｉが急性のリンパ芽球性白血病に対して有効であるので、かなり工業的 に重要である（Ｗｒｉ　ｓ　ｔｏｎ、＋９８５）、Ｅｒｗｉｎｉａ及びＥ、ｃｏ ｌｆからの酵素は、免疫学的交差反応性を示さず、そのためこれらの酵素の一つ に対して過敏になった患者に対して交代治療法を提供できる（（ｇｍｍａｃｋら 、１９８２）、Ｅｒｗｉｎｉａからの酵素は、４個の同じサブユニットを有する １４００００の相対的分子量の四量体であり、そしてｐＨ８゜６の異常に高い等 電点を有する。

従来、Ｌ−アスパラギナーゼは、パッチ及びカラムイオン交換クロマトグラフィ の組み合せにより大きなスケールで製造されている。多数の工程が、必要な純度 を達成するために要求され、ハツチイオン交換クロマトグラフィは、特に人手を 要する。最近の工業上の実施は、細胞培養の成長を含み、次にアルカリ破壊及び 酸沈澱を用いる粗蛋白抽出を含む。

得られる抽出物は１次いで吸着、ＣＭ−セルロースからの溶離にかけられる９次 いで、さらに酸沈澱工程及びＣＭ及びＤＥＡＥ−セルロース媒体を用いるクロマ トグラフィ工程を行う、系の主な問題の一つは、その？ｊ［雑さであり、従って それは容易に自動化されず、連続操作に容易に適合できない。

発明の開示 本発明者は、簡単な方法により罵くべき品質の生ｊｉｉ物を生じ、そして増大し た自動化を行わしめる利点を有するし一アスパラギナーゼ精製の新しい方法を開 発した。

本発明によれば、　（ａ）支持体にＬ−アスパラギナーゼを吸着するようにカチ オン交換基を有する固体媒体と、Ｌ−アスパラギナーゼの粗抽出物とを接触させ 、そして（ｂ）支持体から吸着されたし一アスパラギナーゼを溶離することを含 む、精製されたし一アスパラギナーゼを生成する方法において、カチオン交換基 はスルホネート基を含み、溶離工程（ｂ）は、工程（ａ）で使用されるｐＨより 高く、好ましくは８．０より低いｐＨで行われることを特徴とする方法が提供さ れる。

カチオンスルホネー）（−５ｏ）基は１例えば式−（ＣＨ２）ｎ５０３−（式中 、ｎは１−３に等しい）の基により提供できる。

固体媒体のマトリックスの性質は、それほど厳密をようしないが、しかし連続的 方法における高度の多孔性を達成するために、高度の多孔性を有する支持体が好 まれる。他の望ましい特徴は、こわさ、ｉ＆白の低い非特異性結合及び一般的な 化学的安定性を含む、これらの性質は、アガロース又はアガロース誘導体により もたらさられることか分った。

本発明の方法を行うに当って、Ｌ−アスパラギナーゼの粗希釈抽出物は、好まし くは４．０−５．５のｐＨで固体媒体に適用され１次にｐＨ６゜０の洗浄工程を 行う、吸着されたし一アスパラギナーゼの溶離は、次に６．０−７．５の範囲の ｐＨの好適なｌｌｌｌｌ液溶液り行われる。この範囲は、好ましくは６．５−７ ．０の間である。

本発明の方法は、Ｅ、ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼの精製 に有利に適用できる。上述したように、Ｌ−アスパラギナーゼは、原核生物及び 真核生物において同様に至るところにあるが、Ｅｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのそ れは、その治療的な有用性のため、この方法に好ましく使用される。それ故、本 発明の方法は、Ｅ、ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの培養物から抽出されたし一アス パラギナーゼを精製するために使用するか、又はそれは、他の源からのし一アス パラギナーゼを精製するために使用できる０例は、Ｅｒｗｉｎｉａ酵素のそれに 間するアミノ酸配列を有するし一アスパラギナーゼを含む、かなり高い特異的活 性を保持するために、野性型と密接な配列の同一性（例えば、〉９０％、最も好 ましくは〉９５％）を保持することが望ましい、野生型蛋白のアミノ酸配列は１ 図１に示される。

この方法は、また形質転換又は他のクローニング技術にかけられ、それによりＥ 、ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ　Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子がスーパー発現を促 進する系に結合する生物から得られるし一アスパラギナーゼの精製に使用できる 。

実施例 本発明の方法の利点は、以下の実施例から明かである。

実施例　ｌ−粗抽出物の製造 ■、細菌細胞の培養 はとんどＥ　Ｉ　ｓｗｏ　ｒ　ｔ　ｈら（１９６９）に記載された通りに、Ｅ。

ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの１２時間培養物を３７°Ｃで成長させ１合計４００ Ｌの容積になるように酵母抽出物及びグルタミン酸ナトリウムを含む培地中の撹 拌深部培養容器に加える。培養物は、遠心分離により採取される。

２、細胞からの蛋白の抽出 ２５培養物からの細胞ペーストを、合わせそして１．５ｇ乾燥重量／６ｍＭ　Ｅ ＤＴＡｌｏｏｍＬの濃度で懸濁する。３００−４０ＯＬの懸濁物を１６℃で撹拌 し、ｐＨを０．５Ｍ　ＮａＯＨにより１１．３−１１５に調節する。混合物を３ ０分間撹拌し、ｐＨを１２．５％ｖ／ｖ酢酸により６．３−６．７に調節する。

沈澱を遠心分離により除き、上澄流体を２５％ｖ　／　ｖ酢酸によりｐＨ４，８ にｍｎし、次に遠心分離して沈着物を除く。

実施例　２−スルホネート基を有するマトリックスを用いる精製実施例１に記載 されているやり方によりＥ、ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉから抽出された蛋白は、 以下の通り精製される。

酢酸ナトリウム緩衝液は、ｐＨ４，８に４０ｍＭ酢酸ナトリウムに２５％ｖ　／ 　ｙ酢酸を加えることにより製造される。ｔＲＷｌナトリウム緩衝液。

ｐＨ６，０は、ＮａＨ２ＰＯ４に２Ｍ　ＮａＯＨを加えることにより製造される 。蛋白の吸収は、２８０ｎｍでモニターされ、チトクロームｂ５６２は、さらに ４０５ｎｍでモニターされる。ｐＨ４，８における希釈抽出物は、３００ｃｍ／ 時の直線流速で、４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液により平衡されたＳ−セファロ ースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗのカラムに適用される。未結合蛋白は、同じ直ｍ流速で 、平衡緩衝液によりカラムから洗浄される。アスパラギナーゼを含まないが、チ トクロームｂ５６２を含む結合蛋白は、３００　ｃｍ／時の直線流速で、４０ｍ Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ６，０−６，２の約２０カラム容積によりカラムから溶 層される。

この充分な洗浄は、全てのチトクロームｂ　を溶離するために要求される。Ｌ− アスパラギナーゼは、１００ｃｍ／時の直線流速で、４０ｍＭ燐酸ナトリウム、 ｐＨ６，５−７，０によりカラムから溶離される。

連続するフラクシジンをＬ−アスパラギナーゼについて分析し、結果を添付した 図２に示す、Ｌ−アスパラギナーゼを含むフラクシジンは、２０ｍＭ＃Ｉｌ酸ナ トリウム、ｐＨａ、ｏに透析濾過し、導電度を１．５ｍｓ／Ｃｍ以下に低下させ 、溶液を濃縮し、滅菌濃過する。

別の（そして好ましい）プロトコールでは、ｐＨは５段階的に上昇し。

酵素は、ｐＨ６，８罎衝液の導入後直ちに狭いピークとして溶層することが分っ た（図３参照）。

結果を次の表１に示す。

表１ 段階　全酵素（メガＵ）　比活性（Ｕ／ｍｇ蛋白）収率（％）１１１１（６０Ｋ ｇｌ　１７８　１７．４　１００アルカリ抽出　１７５　１９．７　９１１１沈 Ｊｌ　１３９　８８　７６ Ｂ　−、、＋：フテロースＦＦ　１２５　６０９　７０超瀘通／ｉ＃ＩＩＩ　Ｉ 　Ｏｆｉ　６１５　５　Ｑ実施Ｍ３（比較） 実施例１に記載されたやり方によりＥ、ｅｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉがら抽出され た蛋白を、従来の技術のプロトコールに従って、以下のように精製する。

１、ＣＭ−セルロースへの吸着 上澄流体（伝導度＜６．５ｍＳ／ｃｍ）を脱ミネラル水により約２５ｍ　Ｓ　／ 　ｃ　ｍの伝導度に希釈し、予め４０ｍＭ酢酸ナトリウムｉｌ衝液。

ｐＨ４，８により平衡された１　５ｋｇのＣＭ−セルロースに吸着される。

流体を連続流遠心分離により懸濁物から取り出す、ＣＭ−セルロースを脱ミネラ ル水により達心分Ｎ器で洗い、そして過剰の水を遠心分離に誹り取り除く、セル ロースをプラスチック容器に移し、酵素を、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ１Ｏ，３を含 む４０ｍＭ　ＮａＯＨ１８ＬによりＣＭ−セルロースから溶離させた。ＣＭ−セ ルローススラリーを、小さい連続流遠心分Ｎ器に入れ、溶層液を集め、そのまま に保持する。ＣＭ−セルロースを回収し、１８Ｌの溶離緩衝液に加え、ｐＨを２ Ｍ　ＮａＯＨによ１７１０．３に再調節する。スラリーを遠心分ＩＷ器に置き、 ｍｓ液を集め、初めの溶離液と一緒にする。

２、酸沈澱及び濃縮 一緒にした溶離液のｐＨを、２０％ｖ　／　ｖオルト燐酸により６　ｏに調節し 、ｐＨを４５分後にチェックする。

溶液を連ａｍ遠心分離器を通し、８０Ｌに希釈し、次に３ＯＬに濃縮する。４５ −８５Ｌの脱ミネラル水を加えて、導電度を１　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍ以下に減じ 、そして溶液を３Ｌに濃縮する。濃縮系を７Ｌの脱ミネラル水によりフラッシュ １゛る、ａ縮物を０．５μｍ濾過膜を通し、濃過系を２Ｌの漉遇した脱ミネラル 水によりフラッシュする。溶液を、小さい系で２Ｌに濃縮する。もし導電度が１ 　、３　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍより大きいならば、脱ミネラル水を加え、溶液を再 び２Ｌにａｉｌする。濃ｍ器系は、１．５Ｌ以下の脱ミネラル水によりフラッシ ュされる。溶液のｐＨは、２０％Ｖ／Ｖオルｌ−燐酸により６０に調節され、そ してもｌ−必要ならば希釈されて伝導度を１．３ｍｓ以下に減じる。沈積物を遠 心分離により溶液から取り出す、溶液を滅菌濾過し、トルエンを１ｍＬ／Ｌで加 える。

方法の上部を繰り返して、滅菌条件で行われる方法の残りに充分な酵素（約６０ ０メガ単位）を得る。全ての残りの工程は、他に示されていない限り、３−６℃ で行われる。

３、ＣＭ−セルロース上のクロマトグラフィー未使用のＣＭ５２−セルロースを ６０％ｖ　／　ｖ水性エタノールにより処理し、濾過した脱ミネラル水により充 分に洗い、燐酸ナトリウム緩衝液、ｐ　Ｈ６、０について平衡させる。セルロー スを２５．２Ｘ６０ｃｍカラムに充填し、少なくともｌベッド容積の冷却した平 衡緩衝液により洗い、１８Ｌの抽出物を７約４Ｌ／時の流速でカラムに適用する 。カラムを少なくともｌベッド容積の緩衝液により洗浄する。酵素を６０ｍＭ燐 酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，０によりカラムから溶離し、活性フラクションを 集め、０２μｍ濾過膜で漉遇し、そして合わせる９合わせた蛋白溶液を中空糸系 を使用して４０−６０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、次に１Ｍ水酸化ナトリウムによりｐ Ｈ８，５に調節する。

結果を、以下の表２に示す。

表２ 段階　全酵素（メガＵ）　比活性（Ｕ／ｍｇ蛋白）　収ｇＬ（％）１１１１［６ ０にｔｌ　２６５　１６．４　ｔｏ。

アルカリ抽出　２２２　＋９．８　８４１１ｉｔＪｌ　１９７　１０４　７４ ＣＭ−ｔルロース吸１１　１４６　１６６　５５ＭｒχＪ１　１４１　１７４　 ５３ 趨１！ｉａ／ｌｊｌ！１　１１９　２０８　４５古わせた抽出物　６９８　２４ ０　４４ＣＭ−セルロース　６３５　８２０　４０寞施例　４−最終工程 実Ｍ例２及び３の何れかで記載されたやり方で精製された１１票を、以下の最終 工程にかける。

１、硫酸アンモニウムによる沈澱 硫酸アンモニウムを、蛋白溶液に加えて４０％Ｗ　／　Ｖの最終濃度にし２懸濁 物を１８−２５℃で１−３時間撹拌する。沈澱物を遠心分離（５９８６ｇ、３０ 分間）により回収し、滅菌蒸留水に溶解し、溶液の伝導度が０　、９−１　、１ ５　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍの範囲にあるまで、中空糸系を用いて滅菌蒸留水につい て透析濾過する。溶液は、酵素の活性が６５０００−８５０００Ｕ／ｍＬの範囲 にあるように濃縮される。ｐＨＪｆｉ：１Ｍ水酸化ナトリウムにより８．７に調 節し、伝導度を０．２５Ｍ＠＠ナトリウムａｍ液。

ｐＨ８，７により１　、２−１　、６　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍに調節する。

２、ＣＭ−セルロースを通る通過 ＣＭ５２−セルロースを、６０％Ｖ／Ｖ水性エタノールにより処理し。

次に２０ｍＭ硼酸ナトリウムａ衝液、ｐＨ８，７により平衡させ、そして ２５．２Ｘ４５ｃｍのカラム中に充填する。酵素を約５Ｌ／時の流速でカラムに 適用する。＃素は、結合しないが、カラムを通過する。活性フラクションを濾過 し、合わせる。

３、ＤＥＡＥ−セルロースを通る通過 ＤＥＡＥ　５２セルロースを硼酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１３，７により平衡化 し、２５．２Ｘ６０ｃｍのカラム中に充填する。ＷＩ素浴溶液約６Ｌ／時の流速 でカラムに適用し、フラクションを集め、濾過し、合わせる。

４、結晶化 酵素溶液の濃度を、２０ｍＭ硼酸ナトリウムＵ衝液、ｐＨ８，７による希釈によ り２５０００−３５０００Ｕ／ｍＬに調節し、０６６容積のエタノールを加える 。溶液を１Ｍ酢酸によりｐＨ８，５に調節し、懸濁物をさらに１時間１８−２５ °Ｃで撹拌した。沈′Ｒ物を遠心分離（５９６８ｇ、４５分間）により除き、０ ．０９容積のエタノールを加える。

溶液を、結晶が再懸濁される前に２４時間−２°Ｃで貯蔵し、さらにＯ１容積の エタノールを加え、溶液を少なくとも４８時間−２°Ｃに戻す。

上澄流体を結晶からデカンテーシゴンし、結晶を遠心分離（５９８６ｇ。

２０分間）遠心分離する。沈降した結晶を最低容積の滅菌蒸留水に溶解し、２− ４°Ｃで滅菌蒸留水について充分に透析する０合わせた透析した酵素溶液を１次 に塩化ナトリウムに対して１０ｍＭとし、さらに得られたバルク溶液を一２０℃ で凍結して、最後の処理を待つ。

５、バイアルの製造 充分量のバルク酵素溶液を解凍し１合わせて、１ｍＬを満たしたバイアルｔｏｏ ｏｏ個分のバッチのための材料を得る。蛋白濃度を滅菌蒸留水により３０−５０ 　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌに調節し、都合の良いサイズのパッチに分離し、１．０Ｍ 酢酸によりｐＨ６，０に調節し、そして０．５容積のＡＩｈｙｄｒｏｇｅｌによ り１８−２５℃で処理する。３０分間撹拌後、溶液を遠心分離（５９８６ｇ、４ ５分間）して、酸化アルミニウムを除き、上澄流体を合わせる。溶液を１．０Ｍ 水酸化ナトリウムにより、Ｈ７，４にｆｌｉＢシ、滅菌蒸留水により１４０００ Ｕ／ｍＬに希釈する。滅菌塩化ナトリウム及びグルコース−水和物を加えて、そ れぞれｌｏｍＭ及び０．５％ｗ／ｖの最終濃度にする。溶液は、最後に滅菌蒸留 水により希釈されて１０５００Ｕ／ｍＬの酵素活性を与え、０．２μｍの正に帯 電した膜フィルターを通して濾過し減菌収集容器に入れる。＆＆薗バルク生成物 を３ｍＬガラスバイアルに入れ、凍結乾燥し、そして閉じ、０５気圧の窒素の下 で締める。

結果を以下の表４に示す。

硫１１ｉ７ンモニウムン尤Ｊｌ　５５８　６６０　ＦｔｏｏｌＣＭ−セルロース 通過　６３０　７００　９５．７ＤＥ−セルロース通４　５２４　７２３　９４ ．２結晶化　４６８　７００　８４゜２ バルク酵１　４３３　７００　７７．１脱パイロノエノ化　４１１　７００　７ ２．８本発明の方法は、僅か３段階の精製工程（アルカリ抽出、酸沈澱、吸着／ 溶離）の７１で、６０−７０％の収率で＞　６００　Ｕ　／　ｍ　ｇの比活性を もたらす精製度を達成したことが１表１　（実施例２）から分る。一方（表２、 比較例３参照）、同程度の精製（比活性＞６００Ｕ／ｍｇ）は、６段階の精製工 程（アルカリ抽出、酸沈澱、ＣＭ−セルロース吸着、酸沈澱、超濾過／濃縮、Ｃ Ｍ−セルロース吸着）によってのみ達成される。

又、従来技術のやり方で、前記の比活性に達するのに２収率は、４０％に低下し た。

図１　配列表 配列番号・１ 配列の型６アミノ酸 配列の長さ、３１５ 配列の５１１１．タンパク質 １１イボセテイカル配殉：なし 生物名・エルウィニア　クリサ／テミ （Ｅｒｗｌｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎＬｈｅｍｉ）配列の特徴　エルウィニア　ク リサンテミ配列 Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ｏｌｙ　Ａｓｐ　Ｖｄ　＝”　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　Ｓｓ ｒ　＝＾ｒｇ　Ｖａｌ＾ｓｎ　Ｇｌｕ　＊ｕＬ＠ｕ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ａｓ、ｉ＾ ｓｐ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖｄ　ｕｓ　Ｔｈｒ　ＨＬｓ　Ｇｌｙ 　Ｔｈｒ＾８ｐ図１（続き） ２１ｊＤｎｍにおＣする較収 ２８０ｎｍにおける吸収 要約 （ａ）支持体にＬ−アスパラギナーゼを吸着するようにカチオン交換基を有する 固体媒体と、Ｌ−アスパラギナーゼの粗抽出物とを接触させ。

そして（ｂ）支持体から吸着されたし一アスパラギナーゼを溶離することを含む 、精製されたし一アスハラギナーゼを生成する方法において。

カチオン交換基はスルホネート基を含み、溶離工程（ｂ）は、工程（ａ）で使用 されるｐＨより高いｐＨで行われることを特徴とする方法に関する。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）支持体にＬ−アスパラギナーゼを吸着するようにカチオン交換基を有 する固体媒体と、Ｌ−アスパラギナーゼの粗抽出物とを接触させ，そして（ｂ） 支持体から吸着されたＬ−アスパラギナーゼを溶離することを含む、精製された Ｌ−アスパラギナーゼを生成する方法において、カチオン交換基はスルホネート 基を含み、溶離工程（ｂ）は、工程（ａ）で使用されるｐＨより高いｐＨで行わ れることを特徴とする方法。
2. ２．工程（ｂ）は、８．０より低いｐＨで行われる請求項１の方法。
3. ３．スルホネート基は、式−（ＣＨ２）ｎＳＯ３−（式中、ｎは１−３である） の基の一部を形成する請求項２の方法。
4. ４．支持体は、アガロースから誘導される請求項１−３の何れか一つの項の方法 。
5. ５．工程（ａ）における粗抽出物と固体媒体との接触は、４．０−５．５のｐＨ で行われる請求項１−４の何れか一つの項の方法。
6. ６．工程（ｂ）における吸着されたＬ−アスパラキナーゼの溶離は、６．０−７ ．５のｐＨで行われる請求項１−５の何れか一つの項の方法。
7. ７．工程（ｂ）におけるｐＨは．６．６−７．０の範囲内である請求項６の方法 。
8. ８．（ｉ）１１．３−１１．５のｐＨで、破壊された細胞からＬ−アスパラギナ ーゼを抽出する工程、 （ｉｉ）６．３−６．７の範囲内にｐＨを調節する工程、（ｉｉｉ）沈澱した不 純物から上澄を分離する工程、（ｉｖ）工程（ｃ）からの上澄を、陽イオン交換 基を有する該固体媒体上の吸着にかける工程、及び （ｖ）吸着されたＬ−アスパラギナーゼを溶離する工程を含む請求項１−７の何 れか一つの項の方法。
9. ９．精製にかけられたＬ−アスパラギナーゼは、実質的にＥ．ｃｈｒｙｓａｎｔ ｈｅｍｉ　Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列を有する請求項１−８の何れか 一つの項の方法。
10. １０．精製にかけられたＬ−アスパラギナーゼは、図１に記載されたアミノ酸配 列と少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１−９の何れか一つの項の方 法。
11. １１．精製にかけられたＬ−アスパラギナーゼは、図１に記載されたアミノ酸配 列と少なくとも９５％の配列同一性を有する請求項１０の方法。
12. １２．精製にかけられたＬ−アスパラギナーゼは、図１に記載されたアミノ酸配 列と少なくとも９９％の配列同一性を有する請求項１１の方法。
13. １３．粗抽出物は、該Ｌ−アスパラギナーゼについてコードするＤＮＡ挿入物を 有する組換えプラスミドを含む形質転換された微生物を培養することにより生成 される請求項１−１２の何れか一つの項の方法。
14. １４．粗抽出物は、Ｅ．ｏｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉを培養することにより得られ る請求項１−９の何れか一つの項の方法。