JPS6216640B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は次の式（） （式中、DABはα，γ―ジアミノ酪酸を、Leu
はロイシンを、Thrはスレオニンを示す）で表わ
されるコリスチンヘプタペプタイドを製造する方
法に関する。 従来から、下記の式（）で表わされるコリス
チンはグラム陰性菌に対して優れた作用を有する
抗生物質として知られており、現在臨床において
広く使用されている。 （式中、MOAは６―メチルオクタノン酸を示
し、DAB、Leu、Thrは前記した意味を有する） 近年、このコリスチンの鎖状部分のペプチド結
合を種々の位置で切断し、その部分に他の基を導
入し、コリスチンにない抗菌スペクトルを得よう
とする多くの試みがなされている。 そこで、本発明者は当該ペプチド結合を切断す
る方法について鋭意研究を行つた結果、本発明者
によつて見出された、コリスチン生産菌〔バチル
ス・ポリミキサ・バリアント・コリスチヌス・コ
ヤマ（Bacillus polymyxa var.colistinus
Koyama）、微工研菌寄第1376号、ATCCNo.
21830〕を培養して得られる培養物から単離され
た酵素がコリスチンをその環状部分と鎖状部分と
の結合で切断する作用を有することを見出し、本
発明を完成した。 従つて、本発明は、コリスチンに、コリスチン
生産菌の培養物から得られたコリスチン分解酵素
を作用せしめてコリスチンヘプタペプタイド
（）を製造する方法である。 本発明方法で使用されるコリスチン分解酵素
は、コリスチン生産菌を窒素源、炭素源、無機塩
類及びビタミンを含む培地中、PH7.2、温度30℃
にて72時間振盪培養し、この培養液を硫安塩析
法、イオン交換法、クロマトグラフ処理、ゲル
過法、透析法、分子篩膜による濃縮法、沈澱法等
を任意に組合せて単離精製することによつて製造
される。この酵素の物性は次のとおりである。 至適PH 9.0 安定PH ５〜６ 熱安定性 50℃、10分間処理で30％失活 60℃、10分間処理で95％失活 分子量（ゲル過法） 20000 等電点 8.3 Ｅ値 Ｅmg^／ml_{２８０ｏｎ} 0.896 本発明方法を実施するには、コリスチン又はそ
の硫酸塩を水等の溶媒に溶解し、これに上記のコ
リスチン分解酵素を加えて酵素反応を行う。コリ
スチン分解酵素はPH９付近において最も活性であ
るので、溶媒として0.01Mホウ酸緩衝液等を使用
してPH９付近で反応を行うのが好ましい。コリス
チン分解酵素は原料コリスチン１mgに対し約0.05
mg酵素蛋白質を使用すれば充分であり、反応は37
℃の温度で約３時間行えば終了する。反応後はPH
を４付近として反応を停止させ、可及的すみやか
に次の単離精製操作を行う。 コリスチンヘプタペプタイド（）の単離精製
は、例えば次の如くして行われる。すなわち、反
応液をアンバーライトIRC―50（H⁺型）あるい
はIRC―50（Na⁺型）等に吸着させ、充分に水洗
した後塩酸―メタノール―水（５：45：50v／
ｖ）混液で溶出させる。溶出液の一部をニンヒド
リン発色させ、570nmの吸収を測定して画いた溶
出曲線は第１図の如くである。第１図にみられる
如く２個のピークが認められ、その各分画を紙
クロマトグラフイー〔東洋紙No.５、ｎ―ブタノ
ール―酢酸―水（４：１：2v／ｖ）で展開、ニ
ンヒドリン発色〕で試べたところ、前溶出分画Ａ
がコリスチンヘプタペプタイド（）、後溶出分
画Ｂがアシルトリペプタイド（MOA→DAB→
Thr→DAB）であることが確認された。 そこで、コリスチンヘプタペプタイドの分画を
単離し、PH8.5〜10に調整し、これにベンズアル
デヒドを加えてシツフ塩基として沈澱させ、この
沈澱を塩酸と処理して分解すればコリスチンヘプ
タペプタイドが収得される。 また、アシルトリペプタイドは、当該分画を酸
性条件下ｎ―ブタノールで抽出し、水洗後溶媒を
留去することにより得られる。 斯くして得られるコリスチンヘプタペプタイド
及びアシルトリペプタイドの物理化学的性質は第
１表のとおりである。

【表】

【表】 次にコリスチン分解酵素を製造するための参考
例及び本発明の実施例を挙げて説明する。 参考例 (a) 可溶性デンプン１％、硫酸アンモニウム１
％、燐酸第一カリウム0.05％、硫酸マグネシウ
ム0.05％、食塩１％、炭酸カルシウム0.2％、
ビオチン10μｇ／を含み、PH7.2に調整した
培養基５に、コリスチン生産菌（Bacillus
polymyxa var colistinus）を１％グルコース
肉汁培地で培養した種培養液50mlを接種し、30
℃で72時間振盪培養した。得られた培養液を遠
心分離し、上澄に硫酸アンモニウムを0.6飽和
となるように加え、沈澱を得た。この沈澱を水
に溶解し、水に対してセロフアン膜を用いて透
析した。透析液を再び遠心分離し、上澄に0.6
飽和の硫酸アンモニウムを加えて遠心分離し、
沈澱を得た。得られた沈澱を再び水に溶解し、
セフアデツクスＧ―50のカラムクロマトグラフ
イーに付せば二つのコリスチン分解活性区分を
得た。前溶出区分をコリスチン分解酵素、後
溶出区分をコリスチン分解酵素とした。この
蛋白質量は151.8mgであつた。コリスチン分解
酵素はコリスチン分解酵素の約３倍の活性
を有した。 (b) (a)で得られたコリスチン分解酵素区分345
mlに0.1Mトリス緩衝液（PH9.0）34mlを加えて
緩衝化し、あらかじめ10mMトリス緩衝液（PH
9.0）で緩衝化したDEAE―セフアデツクスＡ
―50に負荷した。10mMトリス緩衝液と0.5M塩
化ナトリウムを含む10mM同緩衝液との間で直
線的濃度勾配溶出をおこない、塩化ナトリウム
0.25M―0.33Mの間で溶出される区分を集め、
水に対して一夜透析をおこなつた。透析後再び
10mM燐酸緩衝液（PH6.9）で緩衝化してハイ
ドロオキシアパタイトに負荷し、吸着した酵素
を10mM燐酸緩衝液（PH6.9）と500mM燐酸緩
衝液（PH6.9）で直線的濃度勾配溶出を行なつ
た。得られた活性区分を集め、ライホゲルで濃
縮し、セフアデツクスＧ―100のゲル過をお
こない単一の活性区分（コリスチン分解酵素
）を得た。ここで得られた活性区分は培養液
中の活性に比べ254倍の比活性を有していた。 実施例 １ (i) コリスチン硫酸塩２ｇを純水200mlに溶解
し、これに参考例で得たコリスチン分解酵素
200mg酵素蛋白質相当を加え、更に0.1Mホウ酸
緩衝液を加えて最終濃度が0.01M（PH9.0）に
なるようにし、37℃で３時間反応させた。反応
終了後希塩酸でPH4.0とし、IRC―50（H⁺型）
500mlに吸着させ、充分水洗した後、塩酸：メ
タノール：水（５：45：50）で溶出して、15ml
ずつ分画した。各分画を薄層クロマトグラフイ
ーで検査し、コリスチンヘプタペプタイド及び
アシルトリペプタイドの各分画を集めた。 (ii) コリスチンヘプタペプタイド分画は減圧下メ
タノールを除去し、残留物を強塩基性樹脂（ア
ンバーライトIRA―410）でPH５付近とし、次
いで希苛性ソーダ液でPH7.2付近に調節すると
コリスチンヘプタペプタイド塩基が沈澱した。
この沈澱物を遠心分離して集め、希酸水溶液に
溶解し、再びPH7.2付近にして再沈澱させ、こ
の沈澱物を集めて、淡黄色粉末のコリスチンヘ
プタペプタイド756mgを得た。 実施例 ２ 実施例１の(i)と同様にして得たコリスチンヘプ
タペプタイドの分画から減圧下メタノールを除去
し、実施例１の(ii)と同様にしてPH５付近とし、次
いで希苛性ソーダ液でPH8.7〜8.9とし、ベンズア
ルデヒドを沈澱が完全に終了するまで撹拌下加え
た。析出した沈澱を遠心分離して集め、これを希
塩酸に溶解し、PH2.0にするとシツフ塩基は分解
して、ベンズアルデヒドが遊離した。遊離したベ
ンズアルデヒドをエチルエーテルで抽出して除去
し、水層を凍結乾燥して淡黄色のコリスチンヘプ
タペプタイド623mgを得た。 実施例 ３ 実施例１の(i)で得たアシルトリペプタイド分画
を減圧下メタノールを留去し、ｎ―ブタノールで
３回抽出し、抽出液を２回水洗した。抽出液に過
剰の水を加え、減圧下にｎ―ブタノールを除去
し、水層を凍結乾燥してアシルトリペプタイド塩
酸塩の粉末226mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はコリスチンにコリスチン分解酵素を作
用させて得られた反応液をアンバーライトIRC―
50（H⁺型）に吸着させ、塩酸―メタノール―水
（５：45：50）で溶出したときのコリスチンヘプ
タペプタイドとアシルトリペプタイドの溶出曲線
を示し、第２図はコリスチンヘプタペプタイドの
紫外線吸収スペクトル、第３図は同赤外線吸収ス
ペクトルを示し、第４図はアシルトリペプタイド
の紫外線吸収スペクトル、第５図は同赤外線吸収
スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリスチンに、バチルス・ポリミキサ・バリ
   アント・コリスチヌス・コヤマの培養物から得ら
   れた次の物性、 至適PH 9.0 安定PH ５〜６ 熱安定性 50℃、10分間処理で30％失活 60℃、10分間処理で95％失活 分子量（ゲル過法） 20000 等電点 8.3 Ｅ値 Ｅmg^／ml_{２８０ｏｎ} 0.896 を有するコリスチン分解酵素を作用せしめること
   を特徴とする次式（）、 （式中、DABはα，γ―ジアミノ酪酸を、Thr
   はスレオニンを、Leuはロイシンを示す）で表わ
   されるコリスチンヘプタペプタイドの製造法。