PT87941B

PT87941B - Processo para a preparacao de uma urease acida

Info

Publication number: PT87941B
Application number: PT87941A
Authority: PT
Inventors: Takashi Suzuki; Shigeya Kakimoto; Yasuhiro Sumino
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1987-07-09
Filing date: 1988-07-08
Publication date: 1995-03-01
Also published as: KR890002391A; EP0298641B1; US5093255A; MX173764B; AU1871688A; KR960014702B1; EP0298641A3; PT87941A; BR8803412A; EP0298641A2; CA1333889C; NZ225225A; BG48218A3; HUT47316A; DE3884295D1; HU202918B; CN1036405A; CN1037617C; MX12205A; DE3884295T2

Description

Memória descritiva

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma nova urease utilizável como uma enzi ma para melhoramento da qualidade bebidas alcoólicas ou para análise de ureia em exames de laboratório clínico ou de alimentos.

A urease (E. C. 3. 5. 1. 5) é a enzima que decompõe a ureia em amónio e dióxido de carbono e encontra-se largamente distribuída no reino natural abrangendo plantas, animai s e micro-organismos. Para além das ureases de Canavalia Adans (Jack bean) e de Bacillus pasteurii, as quais tem vindo a ser comercialmente produzidas e utilizadas, são também conhecidas: a urease contendo um peso molecular de cerca de 440 000 que é elaborada por estirpes microbianas de Corynebacterium lilium, Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter paraffineus, Proteus vulgaris, Microbacterium ammoniaphilus ou Bordetella bronchiseptica (Publicação da Patente Japonesa n2 60-55119), a urease contendo um peso molecu lar de cerca de 440 000 como elaborada por Bacillus sp. UR-155 (Publicação de Patente não examinada Japonesa (KOKAI) ____

i.

59-179987) e a urease contendo um peso molecular de cerca de 280 0000, conforme elaborada por Pseudomonas aeruginosa e Uocardia erythropolis (pedido de patente não examinada Japonesa (KOKAI) 61-257158).

Todas as ureases acima mencionadas têm valores óptimos de pH de reacção entre a região neutra e a alcali na e não só são instáveis e tendem a ser desactivadas no lado ácido mas também só reagem com dificuldade. Especialmente quando a temperatura de reacção é superior a temperatura ambiente ou num sistema de reacção contendo um solvente orgânico, como por exemplo álcool, estas ureases apresentam o incon viniente de uma inactivação considerável.

Os inventores da presente invenção fizeram uma ampla investigação de selecção para encontrar um microorganismo capaz de produzir uma urease com um pH óptimo na região ácida e que seja altamente estável e conseguiram desenvolver uma estirpe pertencente ao género lactobacillus e Streptococcus acumulou no interior das células uma urease com as propriedades pretendidas. Os inventores isolaram então e purificaram esta enzima, continuaram as investigações e chegaram a presente invenção.

Um objecto da presente invenção é, deste modo, proporcionar uma nova urease que possui as seguintes propriedades fisicoquímicas e com um pH óptimo na região ácida (em seguida referida na presente memória descritiva abreviada mente por urease ácida):

(1) Acção

Esta urease ácida produz 2 moles de amónia e 1 mole de dióxido de carbono a partir de 1 mole de ureia e 1 mole de água.

(2) Especificidade do substracto

Actua com mais potência em ureia.

(5) pH óptimo e estabilidade do pH

-2a

pH óptimo desta urease ácida é de 1,5 5,5; é estável a pH 6-8 a 57°C durante 30 minutos.

(4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

A temperatura óptima desta urease ácida no pH óptimo é de 55° a 75°C; a pH 6 continua estável durante 30 minutos até uma temperatura de 50°C.

(5) Inibidores

Esta urease ácida é inibida por cloreto de mercúrio e por ácido aceto-hidroxamico.

(6) Peso molecular peso molecular desta urease ácido determinado por filtração de gel é de 100 000 a 250 000.

(7) Actividade específica

A actividade específica desta urease ácida no pH óptimo e a 57°C não é inferior a 20 U/mg de proteína.

A presente invenção tem por objecto proporcionar um processo para a preparação de urease ácida por cultura num meio nutriente de um microorganismo que pertence ao género lactobacillus ou Streptococcus_o Como microorganismos utilizados na preparação de urease ácida de acordo com a presente invenção podem ser mencionadas as novas estirpes prç) dutoras de urease dos géneros Streptococcus ou Lactobaccilus. Especificamente podem ser mencionados como exemplos Lactobacillus fermentum JMC 5867 (IEO 14511, EERM P-8990), lactobacillus fermentum JMC 5868 (IEO 14512, EERM P-8991), lactobacillus fermentum JMC 5869 (IEO 14515, EERM P-8992), Eactobacillus reuteri UM-12 (IEO 14629, EERM P-9456), lactobacillus reuteri UM-18 (IEO 14630, EERM E-9457), Lactobacillus reuteri Rt-5 (IEO 14631, EERM P-9458), lactobacillus ruminis PG-98 (IEO 14632, EERM P-9459), Streptococcus mitior PG-154 (IEO 14635, EERM P-9460), Streptococcus bovis PG-186

(IPO 14654, PERM Ρ-9461) e Streptococcus salivarius PG-186 (IPO 14746). Os números IPO citados acima são números de depósito no Instituto de Fermentação de Osaka (IPO) 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japão e os números PERM P são números de depósito no Instituto de Investigação de Fermentação (Permentation Research Institute, PRI), Agência de Ciência e de Tecnologia Industrial, Ministério do Comércio Internacional e da Indústria, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarati-ken 505, Japão.

As estirpes de Lactobacillus fermentum JMC 5867 (IPO 14511), Lactibacillus fermentum JMC 5868 (IPO I4512) e Lactobacillus fermentum JMC 5869 (IPO 14513) são estirpes conhecidas listadas em Research Communications (n2 15, pág. 94, 1987) editada por IPO.

Estes microorganismos, que foram depositados no PRI na data referida no quadro seguinte, foram convertidas em depósito de acordo com o tratado de Budapeste e foram conservadas no PRI sob os números de acesso de PERM BP referidos no quadro seguinte.

Microorganismo	Lata de depósito no PRI	Número de acesso de acordo com 0 tratado de Budapeste
lactobacillus fermentum JCM 5867	4 de Outubro 1986	PERM BP - 1454
Lactobacillus fermentum JCM 5868	4 de Outubro 1986	FERM BP - 1445
Lactobacillus fermentum JCM 5869	4 de Outubro 1986	PERM BP - 1446
Lactobacillus reuteri UM - 12	7 de Julho 1987	PERM BP - 1904
Lactobacillus reuteri UM - 18	7 de Julho 1987	PERM BP - 1905
Lactobacillus reuteri Rt - 5	7 de Julho 1987	PERM BP - 1447
-- -₄_

Microorganismo	Lata de depósito no PRI	Numero de acesso de acordo com o tratado de Budapeste
Lactobacillus ruminis PG - 98	7 de Julho 1987	PERM BP - 1906
Streptococcus mitior PG - 154	7 de Julho 1987	PERM BP - 1448
Streptococcus bovis PG - 186	7 de Julho 1987	PERM BP - 1449

A estirpe PG-3O3W foi depositada no PRI a 14 de Abril de 1988 sob o número FERM BP - 1856 „

As características bacteriológicas do Lactobacillus reuter UM - 12, de Lactobacillus reuteri UM - 18, de Lactobacillus reuteri Rt - 5 e de Lactobacillus ruminis PG - 98 são descritas abaixo.

' -------2
, Estirpe	UM-12	UM-18	Rt-5
Origem	Eezes de rato	Eezes de rato	Fezes de rata zana
Morfologia da célula	Bastão curto (0,6-0,8 x x 1,0-15)	Bastão curto (0,6-0,8 x x 1,0-15)	Bastão curto (0,6-0,8 x x 1,0-15)
Mobilidade	-	-	1
Esporulação	-	-	—
Coloração de Gram	+	+	+ 1
Exigência de oxi génio	Microaerófilo	Microaerófilo	Anaeróbio facultativo
Teste de Oxidação -fermentação	Eermentativo	Eermentativo	Fermentativo
Tipo de fermenta çao	Heterofermenta tivo	Heterofermentativo	Heterofermen- tativo . - i
Catalase	-	-
Oxidase	-	-	-
Redução de nitra to	-	-	-
Liquefação da ge latina	-	-	-
Hidrólise do ami do	-	-	-
Decomposição da esculina	-	—	—
j Teste MR	+	+	+
-6-


Estirpe	UM-12	UM-18	Rt-5
Teste VP			1
Produção de indo le	-	-	—
Produção de sulfureto de hidro génio
Produção de NH a partir de arginina	+	+	I +
Leite de tornes sol	Produção de ácido	Produção de ácido	Produção de ácido
Produção de gás a partir de glucose	+	+	+
Temperatura ópti ma para crescimento °G	24 - 45	50 - 45	25 - 45
Crescimento a 45°C	+	+	+
Crescimento a 15°C	—		—
Crescimento a pH 4,0	+	+	+
Crescimento a - pH 9,6 ..	-	-
-7-


Estirpe	UM-12	UM-18	Rt-5
Crescimento na presença de 5 % de NaCl	+	-	+
Crescimento em presença de 6,5 % de NaCl	-	-	-
Produção de ácido
Adonitol	-	-	-
Arabinose	+	-	-
Arabitol	-	-	-
Arbutina	-	-	-
Celobiose	-	-	-
Dulcitol	-	-	-
Pructose	-	-	-
Galactose	+	+	+
Gluconato	+	+	+
Glucose	+	+	+
Glicerol	-	-	-
Inositol	-	-	-
Inulina	-	-	-
lactose	+	+	+
-8-

Estirpe	UM-12	UM-18	Rt-5
Maltose	+	+	+
Mannitol	-	-	-
Manose	-	-	-
Melezitose	-	-	-
Melibiose	+	+	+
©6“Metilglucóside	-	—
Rafinose	+	+	+
Ramnose	-	-	-
Ribose	+	-	+ (fracamen te)
Salicina	-	-	-
Sorbitol	-	-	-
Sorbitose	-	-	-
Amido	-	-	-
Sucrose	+	+	+
Trealose	-	-	-
Xilose	+	-	-
Xilitol	-	-	-

Estirpe	UM-12	UM-18	Rt-5
Auxotrofia
Niacina	+	+	+
Tiamina	+	+	+
Cloreto de Colina	-	+	-
Riboflavina	+	-
Pantotenato de Ca	+	+	+
Piridoxal	-	+	-
Ácido Eólico	-	-	-
Conteúdo ( % ) de ADN por CG	39.8	40.7	40.3
Tipo de peptidoglicano	Lys	Lys	Lys
	Asp	Asp	Asp
	Ala	Ala	Ala
... -	Glu	Glu	Glu

-10As características bacteriológicas do Dactobacillus ruminis PG-8 são as seguintes.

Origem

Morfologia da célula

Mobilidade

Esporulação

Coloração de Gram

Necessidade oxigénio

Teste de oxidação-fermentação

Tipo de fermentação

Catalase

Oxidase

Redução de nitrato

Liquefação de gelatina

Hidrólise do amido

Decomposição da esculina

Teste MR

Teste VP

Produção de indole

Produção de sulfureto de hidrogénio

Produção de NH, a partir de arginina

Leite de tornessol

Produção de gás a partir de glucose

Temperatura óptima para crescimento, °C

Crescimento a 45 °C

Crescimento a 15 °C

Crescimento a pH 4,0

Crescimento a pH 9,6

Crescimento na presença de 5 °/₀ de

NaCl

Crescimento na presença de 6,5 °/_t de NaCl

Cego de porco Bastão curto (0,6-0,8 x 1,0-15) +

Microaerífilo

Permentativa

Homo ácido L-láctico + (fracamente) + + (fracamente) não há modificação

- 37

-11ot-Hemólise £-Hemólise

Produção de ácido

Adonitol

Arabinose

Arabitol

Arbutina

Celobiose lulcitol

Pructose

Galactose

Gluconato

Glucose

Glicerol

Inositol

Inulina lactose

Maltose

Manitol

Manose

Melezitose

Melibiose <<-metilglucósido

Rafinose

Ramnose

Ribose

Salicina

Sorbitol

Sorbose

Amido

Sucrose

Trealose

Xilose

+

-12Xilitol

Conteúdo ( °/_o ) de ADN por CG Tipo de peptidoglicano

45,6 m-DAP

Ala

Glu

As caracterlsticas bacteriológicas das estir pes PG-154, PG-186 e PG-303 W são descritas abaixo.

Estirpes Propriedades	PG-154	PG-186	PG-303 W
Origem	intestino de porco jejum	cólon de porco	duodeno de intestino de porco
Forma das células	Coccus (0,8-1,0 x 0,8-1,0) p.	Coccus (0,8-1,0 x 0,8-1,0) ju	Coccus (0,8-1,0 x 0,8-1,0) μ
Mobilidade	-	-	-
Esporulação	-	-	-
Coloração de Gram	+	+	+
Necessidade de oxigénio	facultativa anaeróbioa	facultativa anaeróbica	facultativa anaeróbica
Teste de fermen tação-oxidação	fermentativa	fermentativa	fermentativa
Tipo de fermentação	homo ácido L-láctico	homo ácido L-láctico	homo ácido L-láctico

Estirpes Propriedades	PG-154	PG-186	PG-303 W
Catalase	-	-	-
Oxidase	-	-	-
Redução de azoto	-	-	-
Liquefação da ge latina	-	-	-
Hidrólise do ami do	-	+ (fracamente)	+
Decomposição da esculina	—	-	+
Teste MR	+	+	+
Teste VP	+ (fracamente)	+ (fracamente)	+
Formação de indol	-	-	ND
Formação de NH^ a partir de arginina	-	-	-
Leite de torne£ sol	produz ácido (fracamente)	produz ácido (fracamente)	ND
Formação de gás a partir de glucose	-	-	ND
Temperatura óptima para cres cimento (°C)	30-37	25-37	30-37

			*'V-. T-
		-
Estirpes Propriedades	PG-154	PG-186	PG-505 W
Crescimento a 45°C			-
Crescimento a 15°C	-	-	-
Crescimento a pH 4,0	-	-	ND
Crescimento A pH 9,6	-	-	-
Crescimento em 4 % de solução de cloreto de sódio aquosa
Crescimento em 6,5 % de so- lução de clore to de sódio aquosa
Crescimento em 40 % de agar de bílis	+ (fracamente)	+ (fracamente)	+
Crescimento mucóide (meio de sucrose)	-	-	-
<X.-h emoli se	-	+ (fracamente)	+ (fracamen te)
emolise	-	-	-
Formação de áci do
-15-

sxnc


Estirpes Propriedades	PG-154	PG-186	PG-303 W
adonitol	ΝΌ	ND	-
arabinose	-	-	-
arbutina	+ (fracamente)	+	+
celobiose	+	+	+
fructose	+	+	+
galactose	+	+	! + '
Gluconato	-	-	-
Glucose	+		+
Glicerol	-	-	-
Inositol	-	-	ND
Inulina	-	-	-
Lactose	+	+	ΐ +
Maltose	+	+	+
Manitol	-	-	-
Manose	-	+	+
Melezitose	-	-	-
Melibiose	-	-	-
Rafinose	+	-	+
Ramnose	-	-	-
Ribose	-	-	-
Salicina	+	+	+

Estirpes Propriedades	PG-154	PG-186	PG-303 W
Sorbitol	-	-	-
Sucrose		+	+
Trealose	-	-	+
Xilose	-	-	-
Xilitol	ND	ND	-
Conteúdo ( °/₀ ) de ADN por CG	40.3	40.1	ND

No quadro apresentado acima, Lys, Asp, Ala, Glu, Orn, Ser e m-Dap representam lisina, ácido aspártico, alanina, ácido glutâmico, ornitina, serina e ácido mesodiaminopimálico, respectivamente. 0 símbolo ND” significa que não foram efectuadas as experiências. Uma consulta do Manual of Systematic Bacterioloy de Bergey, Volume 2 (1986) para uma classificacação taxonomica das estirpes baseada nas características bacteriológica acima apresentadas sugere que as estirpes UM-12, UM-18 e Rt-5 podem ser adequadamente relegados para Bactobacillus reuteri, apesar de evidenciarem ligeiras diferenças das caracteristicas da literatura: as estirpes UM-18 e Rt-5 foram negativas na produção de ácido a partir de arabinose, fructose e ribose (no entanto a estirpes Rt-5 foi fracamente positiva na produção de ácido a partir de ribose). Por acidente, uma vez que as estirpes UM-12 e Rt-5 são diferentes uma da outra, só na temperatura de crescimento e na auxotrofia são consideradas como variantes mútuos. As caracteristicas da estirpe PG-98 são substancialmente idênticas às do Bactobacillus ruminis. Além disso é apropriado que a estirpe PG-154, apesar da hemólise (?C ser negativa, se

ja de Streptococcus mitior; que a estirpe PG-186, apesar de a hidrólise de esculina ser negativa, seja de Streptococcus hovis e que a estirpe PG-303 seja de Streptococcus salivarius.

A cultura destas estirpes bacteriológicas pa ra a acumulação de urease ácida pode ser conduzida pelo proc£ dimento usual de cultura estacionária, por cultura agitada, por cultura aeróbica submersa ou por cultura sólida, quer con duzida de modo contínuo quer numa base intermitentes. É espe cialmente preferida a cultura estacionária. 0 meio de cultura pode ser um meio nutriente habitual para microorganismos. Como fontes de carbono, podem ser seleccionadas uma ou várias substâncias que a estirpe possa assimilar para o crescimento de entre vários hidratos de carbono, óleos e gorduras, ácidos gordos, ácidos orgânicos, álcoois, etc,,. Como fontes de azoto podem ser empregues materiais azotados orgânicos, como por exemplo peptona, farinha de soja, farinha de semente de algodão, licor de maceração de milho, extracto de levedura, extra cto de carne, extracto de malte, soro, etc., e compostos de azoto inorgânico como, por exemplo, sulfato de amónio, cloreto de amónio, nitrato de amónio, fosfato de amónia, etc₀. Es tas fontes podem ser utilizadas isoladamente ou combinadas, conforme necessário. Para alóm destas fontes de carbono e de azoto, o meio contém, de preferência, factores essenciais e promotores, como, por exemplo, minerais, ácidos aminados, vitaminas, etc., para crescimento e inducção de enzimas. Alóm disso pode adicionar-se ureia e tioureia para inducção de ure ase ácida em alguns casos. Para regulação do pH e para comba te da espuma durante a cultura verificou-se ser vantajosa a adição de uma solução cáustica alcalina, de uma solução de carbonato de sódio ou de um sal de cálcio.

Como temperatura de incubação pode ser escolhida uma temperatura apropriada para o crescimento da estirpe utilizada. Normalmente a cultura pode ser levada a cabo com sucesso às temperaturas de 15 a 55°O e, de preferência entre 25 a 45°C. O tempo de incubação deve ser suficiente pa ra o crescimento do organismo e para a produção de urease áci

da e geralmente ronda 5 a 120 horas.

Após cultura nas as condições acima menciona das a urease ácida ocorre geralmente nas células microbianas. Por isso as células vivas recolhidas a partir do caldo por centrifugação, sedimentação, floculação ou filtração através de uma membrana porosa polimérica ou de cerâmica, são submeti das a qualquer dos tratamentos de congelamento-descongelamento, tratamento de homogenização, disrupção ultra-sónica, tratamento de pressão osmótica, lise da membrana da parede celular, tratamento com agentes tensioactivos, etc., ou a uma com binação de vários destes tratamentos. A enzima assim solubilizada é então submetida a uma combinação adequada dos procedimentos habituais de purificação de enzimas, como, por exemplo, tratamento por protemina, precipitação fraccionada, tratamento por solventes orgânicos, focagem isoelétrica, electro forese, cromatografia de troca de iões, filtração em gel, cro matografia de afinidade, cristalização, etc., para dar como resultado um produto enzimático que é homogéneo como uma proteina.

Método para analise da actividade enzimatica

Os valores de actividade da urease mencionados nesta especificação foram determinados pelo processo que se apresenta a seguir à temperatura de 37° e a pH 4,0. Incu baram-se dois mililitros de uma diluição apropriada da solução da enzima a 37°C durante exactamente durante 5 minutos. A esta diluição da enzima adicionaram-se 2 ml da solução de substrato pré-aquecida a 37°C. A mistura foi agitada e a reacção foi realizada a 37°C durante exactamente 30 minutos. Após a reacção adicionaram-se imediatamente 4 ml de ácido tri cloroacético a 10 % e centrifugou-se a mistura (98 000 rpm, min.). 0 sobrenadante (2 ml) foi retirado e preencheu-se com água até 20 ml. A uma porção de 4 ml adicionaram-se 2 ml de solução de reagente A de coloração, misturando-se em seguida suavemente. Adicionaram-se então 2 ml de solução de reagente B de coloração misturando-se em seguida outra vez

suavemente e a reacção foi levada a cabo a 37°C durante 3Q. mi nutos. Então, ã temperatura ambiente, determinou-se a absorvãncia a 640 nm utilizando água como branco.

Por outro lado, agitaram-se 2 ml da diluição de enzima acima mencionada com 2 ml de tampão de citrato 0,2 M em lugar da solução de substrato e a reacção foi levada a cabo a 37°C durante exactamente 30 minutos. A mistura reaccio nal resultante foi submetida ao mesmo procedimento como acima para um teste de branco de enzima.

Além disso, tomaram-se 2 ml de solução de sulfato de amónio padrão (50 ^g/ml), 1 ml de ácido tricloroacético a 10 % e 0,5 ml de tampão de citrato 0,2 M e diluiu-se até 2 ml com água e a solução resultante foi submetida ao mesmo procedimento de desenvolvimento de coloração como acima a fim de dar uma solução padrão. Por outro lado, tomaram-se 1 ml de ácido tricloroacético a 10 % e 0,5 ml de tampão de citra to 0,2 M e diluiu-se até 20 ml com água e a diluição foi sujei ta ao mesmo procedimento de desenvolvimento de coloração para um teste de branco padrão.

A actividade enzimatica foi calculada por meio da seguinte equação:

Actividade enzimática (U/mg) =

DO da solução de enzima - DO do branco de enzima

DO da solução padrão - DO do branco padrão factor de diluição x 0,76 x 4 x quantidade de enzima (mg)

A quantidade de enzima que produz 1 jumol de NH^ por minuto é considerada como a unidade (1 U). 0 reagente e as soluções de teste utilizadas nos processos de determinação acima mencionados foram preparados da maneira que se segue.

A solução substrato foi preparada por dissolução de 1,0 g de ureia em tampão de citrato 0,2 M para perfazer 100 ml. A solução de ácido tricloroacético a 10 % foi preparada por diss£ lução de 10 g de ácido tricloroacético em água até perfazer 100 ml. A solução de reagente A de coloração (solução de fenol-nitroprussiato de sódio) foi preparada por dissolução de 5 g de fenol e 25 mg de nitroprussiato de sódio em água até perfazer 500 ml. A solução de reagente B de coloração (solução de hipoclorito de sódio alcalina) foi preparada por diss£ lução de 5,0 g de hidroxido de sódio e 7,5 ml de solução de hipoclorito de sódio (concentração efectiva de cloro 5 %) em água até perfazer 500 ml. 0 tampão de citrato 0,2 M foi preparado por dissolução de 25,18 g de ácido cítrico (mono-hidra to) e 23»59 g de citrato de sódio (di-hidrato) em água até perfazer 1000 ml (pH 4,0). A solução de sulfato de amónio pa drão (50 jug/ml) foi preparada pesando exactamente 250,0 mg de sulfato de amónio, dissolvendo-o em água até perfazer 250 ml e diluindo 5 ml da solução com água até perfazer 100 ml.

Ao contrário da urease convencional, a nova urease, de acordo com a pesente invenção possui um pH óptimo para actividade na região ácida. Além disso é superior á ure ase convencional na estabilidade do pH, na estabilidade da temperatura e na estabilidade perante o álcool. Por isso a urease da presente invenção é uma enzima comercialmente mais útil. Particularmente esta urease possui uma actividade espe cífica superior a 20 U/mg de proteína e, por conseguinte, é suficientemente activa, em quantidade reduzida, para decompor e eliminar ureia de licores alcoolicos (Pedido de Patente Japonesa N^s. 179738/1987), sendo assim útil para fins de melhoramento da qualidade de tais produtos. Por outro lado esta urease é muito eficaz como reagente para a análise de ureia em amostras de sangue ou de urina em exames de laboratório clínico ou em licores alcoólicos (Pedido de Patente Japonesa N2. 171751/1987) e para outras aplicações. A análise de uri na em sake, por exemplo, pode ser levada a cabo com alta precisão por decomposição da ureia em amónia com esta enzima e aplicando 0 método de indofenol.

Breve descrição dos desenhos

As Figs. 1, 2, 3 e 4 mostram as relações do pH e da temperatura com a actividade enzimática da urease de acordo com o Exemplo 1.

Na Fig. 1, na qual se apresenta uma curva de pH-actividade determinada a 37°C, ·, o e x representam os resultados de determinação em tampão de citrato 0,1 M, tampão de acetato 0,1 M e tampão de veronal-ácido acético-HCl, respectivamente.

Na Fig. 2, que mostra a estabilidade da enzi ma, são indicadas as actividades residuais após 30 minutos a 37°C.

A Fig. 3 mostra a curva de temperatura-actividade em tampão de citrato 0,1 M a pH 4,0.

A Fig. 4, que mostra a estabilidade de tempe. ratura da enzima, indica as actividades residuais após 30 minutos a várias temperaturas; o representa pH 4 e representa· pH 6 em tampão de citrato 0,1 M.

As Figs. 5 a 8, Figs. 9 a 12, Figs. 13 a 16, Figs. 17 a 20, Figs. 21 a 24, Figs. 25 a 29 e Figs. 29 a 32 mostram as relações do pH e da temperatura com a actividade enzimática da urease de acordo com os Exemplos 2, 3, 4, 5, 6, e 8 respectivamente. As experiências das Figs. 5 a 32 foram levadas a cabo utilizando tampão de citrato 0,1 M excepto nos testes de estabilidade do pH.

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar a invenção mais em pormenor e de modo nenhum devem ser considerados como limitando o respectivo âmbito.

Exemplo 1

-22Inoculou-se Lactobacillus reuteri Rt-5 (IFO 14631, FERM BF-1447) cultivado em meio semi-fluido GAM comercial (Nissui Seiyaku Co. Ltd., Japan) em 10 balões de

Erlenmeyer (200 ml de capacidade) cada um contendo 50 ml de um meio de cultura de inoculação esterilizado composto por 3%

de glucose, 1,5 % de polipeptona, 1 % de extracto de carne, 0,8 % de extracto de levedura, 0.,5 % de cloreto de sódio, 0,2 °/o de acetato de sódio anidro, 0,005 % de sulfato de manganês (cerca de 4 ^0) e 0,001 % de sulfato de níquel (6 H^O) (pH 7,0, neutralizado com NaOH a 30 %). Os balões foram incubados sob condições estacionárias a 34°0 durante 24 Horas. As culturas de inoculação assim preparadas foram transferidas pa ra 10 balões de Erlenmeyer (2 1 de capacidade) cada um contendo 1 1 de meio esterilizado da mesma composição que acima e procedeu-se à incubação sob condições estacionárias a 32 °0 durante 2 dias. 0 processo deu 10 1 de um caldo de cultu ra apresentando uma actividade de 21,6 U/ml de urease ácida.

caldo de cultura acima mencionado foi centrifugado para se recuperarem as células e estas em seguida foram lavadas em tampão de fosfato (pH 7,2) por duas vezes e suspensas em 4 1 de uma solução contendo tampão de fosfato

0,05 M (pH 7,2), EDTA 1 mM e ditiotreitol 1 mM. Após adição 2 1 de esferas de vidro de cerca de 0,1 a 0,2 mm de diâmetro, a suspensão de células foi desintegrada mecanicamente a 4 500 rpm durante 20 minutos. A suspensão de células após de sintegração foi centrifugada e adicionou-se etanol ao sobrena dante até uma concentração final de 80 %. 0 sedimento foi recolhido por centrifugação e dissolvido em tampão de tris-HC1 0,05 M (pH 7,0) contendo de EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol. A solução foi aplicada a uma coluna de Sephadex G-100 (7,5 cm dia. x 90 cm comp.) para adsorção e a eluição foi levada a cabo com a mesma solução tampão. As fracções activas foram reunidas. Este eluido foi aplicado a uma coluna de Sephadex G-200 (4,5 cm dia. x 150 cm comp.) equilibrada com o mesmo tampão para adsorção e procedeu-se à eluição com o mesmo tampão. As fracções activas foram reunidas e aplicadas a uma coluna de DEAE-Sephadex CL-6B para adsorção, sendo a elui ção levada a cabo pelo método de gradiente de eluição utilizando-se a mesma solução tampão contendo cloreto de sódio des de 0 a 0,7 M. As fracções activas foram reunidas. Esta solu ção foi concentrada numa unidade de ultrafiltração com uma membrana Amicon 8 200 UK-50 (limiar de separação do peso mole

cular 50 000). 0 tampão foi alterado para tampão de fosfato

0,005 M (pH 7,O) contendo 2-mercaptoetanol 1 mM. En seguida a solução foi aplicada numa coluna de cromatografia de gel de afinidade (4 cm dia. x 50 cm comp.) preparada com Affiprep 10 (um produto da Bio-Rad) e hidroxiureia para adsorção e efectuou-se uma eluição de gradiente com tampão de fosfato 0,005 M a 0,044 M. As fracções activas foram reunidas e concentradas utilizando o mesmo unidade de ultrafiltração como mencionado acima, efectuando-se em seguida uma precipitação fracci£ nada e uma liofilização, obtendo-se 104 mg de enzima purifica do em Po. Este pó possuía uma actividade específica de 336,5 U/mg de proteína e apresentava uma única banda de proteína em electroforese de gel de poliacrilamida. 0 procedimento da pu rificação é apresentado no Quadro 1.

Quadro 1

Pases da purificação	Proteína total	Actividade total (x 10⁵U)	Actividade especifica (U/mg de proteina)	Rendimen to (%)
Extracto isento de células	14.1	185.3	13.0	100.0
Etanol	5.2	157.6	30.5	86.0
Sephadex G-100	3.0	140.1	46.7	76.4
Sephadex G-200	1.0	78.7	78.7	42.9
S ephar os e-LEAE CL-6B	0.37	60.7	164.0	33.1
Gel de afinidade	0.10	35.4	354.0	19.3
Líofolizado	0.10	35.0	336.5	19.1

-24As propriedades enzimoquímicas e fisioquímicas da enzima ácida liofilizada obtida pelo método acima des-

crito sao descritas abaixo.

Urease ácida A (1) Acção

A enzima produz 2 moles de amónia e 1 mole de dióido de carbono a partir de 1 mole de ureia e 1 mole de água.

(2) Especificidade do substracto

A enzima tem uma actividade mais intensa sobre ureia e até certo ponto sobre etilureia, biuret, metilureia, ácido alantóico e alantoina (Quadro 2).

Quadro 2

Substrato	Actividade relativa (%)
Ureia	100.0
Alantoina	1.2
Ácido alantóico	8.8
Biuret	64.1
Metilureia	4.9
Etilureia	41.1

(5) pH óptimo e estabilidade do pH

Como se mostra na Eig. 1, o pH óptimo da enzima é de 2 a 4,5. A Eig. 2 apresenta as actividades residuais após se ter deixado em repouso a enzima a 37°C a diversos níveis de pH durante 30 minutos. Como se verifica a partir da Eig. 2 a enzima é estável a pH 6 a 8 e relativamente

estável na gama de pH 2 a 10.

(4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

Como se mostra na Fig. 5, a temperatura ópti ma da enzima ó de 60 a 70°C. A Fig. 4 mostra as actividades residuais após a enzima ter sido deixada em repouso a pH 4 e a pH 6 e a diversas temperaturas durante 50 minutos. Como se verifica a partir da Fig. 4, a enzima ó estável a pH 6 ató 60 °C e relativamente estável a pH 4 ató 60°C.

(5) Inibidores

Como se mostra no Quadro 5 a enzima é inibida por cloreto mercúrico, nitrato de prata, ácido iodoacótico e ácido aceto-hidroxãmico.

Quadro 5

Inibidor	Concentração	Actividade relativa (%)

Nenhum		100.0
AgNO₃	0.05 mM	0.7
HgCl₂	0.05 mM	0.6
Ácido Iodoacótico	1 mM	15.4
Ácido aceto-hidroxãmico	10 mM	10.0

-26(6) Peso molecular

Conforme determinado por filtração em gel através de Sephadex G-200, a enzima possui um peso molecular de cerca de 220 000.

(7) Ponto isoelectrico

Conforme determinado pela focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida a enzima mostra um ponto isoeléctrico de cerca de 4,7.

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima praticamente não pode ser cristalizada.

(9) Análise elementar

Não determinada por causa da dificuldade de cristalização.

(10) Km valor de Km desta enzima é 1,7 mM (pH 4, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo 2

Uma cultura de inoculação de Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IEO 14511, EERM BP-1454) obtida do mesmo modo conforme descrito no Exemplo 1 foi inoculada em 10 balões de Erlenmeyer (2 1 de capacidade) cada um contendo 1 1 de um meio esterilizado composto de 4 % de glucose, 1,5 % de polipeptona, 1 % de extracto de carne, 0,8 % de extracto de levedura, 0,5 % de cloreto de sódio, 0,2 % de acetato de sódio anidro, 0,5 % de ureia, 0,05 % de sulfato de manganês (cerca de 4^0), 0,002 % de sulfato de níquel (éHgO), 0,002 % de sulfato de cobalto (7^0), 0,005 % de sulfato de estanho e 0,001 % de sulfato de estroncio (pH 7,0, ajustado com NaOH a 30 %) e cultivou-se em cultura estacionária a 32°C durante 2 dias. 0 procedimento deu 10 1 de um caldo de cultura que apresentava 5,6 U/ml de actividade da urease ácida.

As células foram recolhidas por centrifuga-273

_ l~t ui ι ·ι nÍTW·— ção do caldo acima descrito, lavadas com tampão de fosfato 0,05 M (pH 7,2) por duas vezes e suspensas em 4 1 de uma solução contendo tampão de fosfato 0,5 M (pH 7,2), EDTA 1 mM e ditiotreitol 1 mM. Após adição de 2 1 de esferas de vidro de cerca de 0,1 a 0,2 mm de diâmetro, a suspensão de células foi desintegrada mecanicamente a 4 500 rpm durante 20 minutos» A suspensão de células desintegradas foi centrifugada e adicionou-se etanol ao sobrenadante até uma concentração final de 80 %. 0 sedimento foi recolhido por centrifugação e dissolvido em tampão de Tris-HCl 0,05 M (pH 7,0) contendo EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol. A solução foi aplicada a uma coluna de Sephadex G-100 (7,5 cm dia. x 90 cm comp.) para adsorção e a eluição foi realizada com o mesmo tampão. As fracções acti vas foram reunidas e aplicadas a uma coluna de Sephadex G-200 (4,5 cm dia x 150 cm comp.), efectuando-se a adsorção e eluição com o mesmo tampão. As fracções activas foram reunidas e novamente aplicadas a uma coluna de DEAE-Sephadex A-50 equili brada com o mesmo tampão, sendo o gradiente de eluição levado a cabo com o mesmo tampão contendo NaCl desde 0 a 0,7 M. As fracções activas foram reunidas. A actividade específica de.s ta solução era de 35,2 U/mg de proteina e o rendimento da actividade foi de 43,7 %. As propriedades enzimoquimicas deste produto são como descritas em seguida.

Urease ácida B (1) Acção

A enzima produz 2 moles de amónia e 1 mole de dioxido de carbono a partir de 1 mole de ureia e 1 mole de água.

(2) Especificidade do substrato

A enzima actua com mais intensidade sobre ureia e, até certo ponto sobre etilureia, biuret, metilureia e ácido alantóico (Quadro 4).

-28I

Substrato

Quadro 4

Actividade relativa (%)

Ureia 100.0 Alantoína 0.0 Ácido alantóico 3.7 Biuret 72.0 Metilureia 14.0 Etilureia 46.0 (3) pH óptimo e estabilidade do pH

Como se mostra na Eig. 5, o pH óptimo foi de cerca de pH 3. A Eig. 6 mostra as actividades residuais após se ter deixado a enzima em repouso a 37°C θ a vários pHs durante 30 minutos. Como se verifica a partir da Eig· 6 a enzi ma á estável a pH de 6 a 8.

(4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

Como se mostra na fig. 7 a temperatura óptima desta enzima ó de 60 a 70°C. A Eig. 8 mostra as actividades residuais após a enzima ter sido deixada em repouso a pH 4 e 6 durante 30 minutos. Como se verifica a partir da Eig.

a enzima á estável a pH 6 até 80°C e a pH 4 até 60°C.

(5) Inibidores

Como se mostra no Quadro 5 a enzima é inibida por cloreto mercúrico, nitrato de prata, sulfato de cobre, ácido iodoacático e ácido aceto-hidroxâmico.

Quadro 5

Inibidor	Coneentração	Actividade relativa
(%)
Nenhum			100.0
AgNO^	0.05	mM	0.4
CuSO ·5Η 0 4 2	0.4	mM	47.6
HgCl₂	0.005	mM	0.8
Ácido Iodoacético	1	mM	14.9
Ácido Aceto-hidroxãmico	10	mM	l6_o0

(6) Peso molecular

Conforme determinado por filtração em gel através de Sephadex G-200, esta enzima possui um peso molecular de cerca de 210 000 a 220 000.

(7) Ponto isoeléctrico

Conforme determinado por focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida a enzima apresenta um ponto isoeléctrico de cerca de 4,8.

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima dificilmente pode ser cristaliza da.

(9) Análises elementares

Não determinadas por causa da dificuldade de cristalização.

-50(10) Km valor de Km desta enzima é de 1,0 mM (pH 2, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo 3

Inoculou-se Streptococcus bovis PG-186 (IEO 14634, EERM BE-1449) cultivado em meio comercial GAM semi-flui. do (Nissui Seiyaku) em 10 balões de Erlenmeyer (200 ml de capacidade) cada um contendo 50 ml de um meio de cultura de inoculação esterilizado composto por 4 % de glucose, 1,5 % de polipeptona, 1 % de extracto de carne, 0,8 % de extracto de leve dura, 0,5 % de cloreto de sódio, 0,2 % de acetato de sódio ani dro, 0,5 % de ureia, 0,005 % de sulfato de manganês (cerca de 4H^0), 0,001 % de sulfato de níquel (õH^O), (pH 7,0, ajustado com NaOH a 30 %). Os balões foram incubados sob condições estacionárias a 34°G durante 24 horas. As culturas de inoculação assim preparadas foram transferidas para 10 balões de Erlenmeyer (2 1 de capacidade) contendo cada um 1 1 de um meio esterilizado da mesma composição que o descrito acima e fyj f θ foi realizada a incubaçao sob condiçoes estacionarias a 32 C durante 2 dias. 0 procedimento deu 10 1 de um caldo de cultu ra apresentando 7,6 U/ml de actividade de urease ácida.

caldo de cultura acima mencionado foi centrifugado para se recuperarem as células que foram lavadas com tampão de fosfato 0,05 M (pH 7,2) por duas vezes e suspensas em 4 1 de uma solução contendo tampão de fosfato 0,05 M (pH 7,2), EDTA 1 mM e ditiotreitol 1 mM. Após adição de 2 1 de esferas de vidro de cerca de 0,1 a 0,2 mm de diâmetro, a suspensão de células foi desintegrada mecanicamente a 4 500 rpm durante 20 minutos. A suspensão de células desintegradas foi centrifugada e adicionou-se etanol ao sobrenadante a uma concentração final de 80 %. 0 sedimento foi recolhido por centri fugação e dissolvido em tampão de tris-HCl 0,05 M (pH 7,0) con tendo EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol. A solução foi aplicada a uma coluna de Sephdex G-100 (7,5 cm dia. x 90 cm comp.) para adsorção e a eluição foi levada a cabo com a mesma solução de

-51tampão. As fracções activas foram reunidas. Este eluído foi aplicado a uma coluna de Sephadex G-200 (4,5 cm dia. x 150 cm comp.) equilibrada com o mesmo tampão para a adsorção e a eluição foi levada a cabo com o mesmo tampão. As fracções aç. tivas foram reunidas e novamente aplicadas a uma coluna BEAE-Sephadex CL-6B para adsorção, sendo a eluição levada a cabo pelo método de gradiente de eluição utilizando a mesma solução de tampão contendo cloreto de sódio desde 0 até 0,7 M. As fracções activas foram reunidas. Esta solução foi concentrada numa unidade de ultrafiltração com uma membrana Amicon 8200 UK-50 (limiar de separação de peso molecular 50 000). 0 tampão foi mudado para tampão de fosfato 0,005 M (pH 7,0) con tendo 2-mercaptoetanol 1 mM. Então a solução foi aplicada a uma coluna cromatográfica de gel de afinidade (14 cm dia. x 50 cm comp.) preparado utilizando Affiprep 10 (o produto da Bio-Rad) e hidroxiureia para adsorção e levou-se a cabo a eluição por gradiente utilizando-se tampão de fosfato desde 0,005 M a 0,44 M. As fracções activas foram reunidas e concentradas com a mesma unidade de.ultrafiltração que se meneio nou acima, seguindo-se precipitação fracionada e liofilização, obtendo-se 104 mg de uma enzima em pó purificada. Este pó ti nha uma actividade específica de 124 U/mg de proteína.

As propriedades enzimoquímicas e fisicoquími cas da enzima ácida liofilizada obtida pelo método mencionado acima são apresentadas em seguida.

Urease ácida C (1) Acção

A enzima produz 2 moles de amónia e 1 mole de dióxido de carbono a partir de 1 mole de ureia e 1 mole de água.

(2) Especificidade do substrato

A enzima actua com mais intensidade sobre ureia (Quadro 6).

-52Substrato

Ureia

Ácido alantoico

Biuret

Etilureia

(3) pH óptimo e estabilidade do pH

Como se mostra na Eig. 9 o pH óptimo desta enzima é de cerca de 5. A Eig. 10 mostra as actividades resi duais após se ter deixado a enzima em repouso a 37°C e a vários níveis de pH durante 30 minutos. Como se verifica a par tir da Eig. 10 a enzima é estável a pH 6 a 10.

(4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

Como se mostra na Fig. 11 a temperatura opti , o ma desta enzima e de 60 a 70 C. A Eig. 12 mostra as activida des residuais após a enzima ter sido deixada em repouso a pH 6 a diversas temperaturas durante 30 minutos. Como se verifi ca a partir da Eig. 12 a enzima é estável a pH 6 até 50°C.

(5) Inibidores

Como se mostra no Quadro 7 a enzima é inibida por cloreto mercúrico e por ácido aceto-hidroxâmico.

Quadro 7

Inibidor Goncentragão Actividade relativa

			(%)
Nenhum			100,0
HgCl₂	1	mM	0,0
ácido Iodoacético	10	mM	89,8
Ácido aceto-hidroxâmico	10	mM	9,8

(6) Peso molecular

Conforme determinado por electroforese em gel de poliacrilamida (H. Eng et al; Can_o J. Microbial., 52, 487 (1986), a enzima possui um peso molecular de cerca de 190 000.

Conforme determinado por filtração em gel através de Sephadex G-200 a enzima possui um peso molecular de cerca de 170 000.

(7) Ponto isoeléctrico

Conforme determinado por focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida a enzima apresenta um ponto isoeléctrico de cerca de 4,7.

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima dificilmente pode ser cristalizada.

(9) Análise elementar

Não determinada por causa da dificuldade de

cristalização.

(10) Km valor de Km esta enzima é de 0,2 mM (pH 0,5, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo 4

Cultivou-se Streptococcus mitior PG-154 (IPO 14633, PERM BP-1448) do mesmo modo análogo ao descrito no Exemplo 3. 0 procedimento deu 10 1 de um caldo de cultura apresentando 5,4 U/ml.

caldo de cultura acima mencionado foi centrifugado para se recuperarem as células, as quais foram lavadas com tampão de fosfato 0,05 M (pH 7,2) por duas vezes e sus pensas em 4 1 de uma solução contendo tampão de fosfato 0,05M (pH 7,2), EDTA 1 mM e ditiotreitol 1 mM. Após adição de 2 1 de esferas de vidro de cerca de 0,1 a 0,2 mm de diâmetro, a suspensão de células foi desintegrada mecanicamente a 4 500 rpm durante 20 minutos. A suspensão de células desintegrada foi centrifugada e adicionou-se etanol ao sobrenadante a uma concentração final de 80 %. 0 sedimento foi recolhido por cen trifugação e dissolvido em tampão de tris-HCl 0,05 M (ph 7,0) contendo 1 mM de EDTA e 2-mercaptoetanol. A solução foi aplicada a uma coluna de Sephadex G-100 (7,5 cm dia. x 90 cm. comp.) para adsorção e a eluição foi levada a cabo com a mesma solução de tampão. As fracções activas foram reunidas. Este eluído foi aplicado a uma coluna de Sephadex G-200 (4,5 cm dia. x 150 cm comp.) equilibrada com o mesmo tampão usado para a adsorção e a eluição foi levada a cabo com o mesmo tampão.

As fracções activas foram reunidas. A actividade especifica des. ta solução foi de 76,3 U/mg de proteína e o rendimento da actividade foi de 38,7 %. As propriedades enzimoquímicas deste produto são como apresentadas a seguir.

Urease ácida D

-55(1) Acção

(2) Especificidade do substrato

A enzima actua com mais intensidade sobre ureia e até certo ponto sobre biuret e etilureia (Quadro 8)

Quadro 8

Substrato

Actividade relativa (%)

Ureia 100,0 Ácido alantoico 0,0 Biuret 22,0

Etilureia 18,8 (3) pH óptimo e estabilidade do pH

Como se mostra na Fig. 13 o pH óptimo desta enzima é de cerca de 4 a 5. A Eig. 14 mostra as actividades residuais após se ter deixado a enzima em repouso a 37°C e a vários níveis de pH durante 30 minutos. Gomo se verifica a partir da Eig. 14 a enzima é estável a pH 4 a 8.

(4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

Como se mostra na Eig. 15 a temperatura ópti ma desta enzima é de 60°C. A Eig. 16 mostra as actividades residuais após a enzima ter sido deixada em repouso a pH 6 du rante 30 minutos. Como se verifica a partir da Eig_o 16 a enzima é estável a pH 6 até 60°C.

(5) Inibidores

Como se mostra no Quadro 9 a enzima é inibida por cloreto mercúrico, ácido iodoacético e ácido aceto-hidroxámico.

Quadro 9

Inibidor Concentragão Actividade relativa

			(%)
Nenhum			100,0
HgCl₂	1	mM	0,0
ácido Iodoacético	10	mM	0,6
Ácido Aceto-hidroxãmico	10	mM	19,2

(6) Peso molecular

Conforme determinado por electroforese em gel de poliacrilamida a enzima possui um peso molecular de cerca de 160 000. Conforme determinado por filtração em gel através de Sephadex G-200 a enzima possui um peso molecular de cerca de 170 000.

(7) Ponto isoeléctrico

Conforme determinado por focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida a enzima apresenta um ponto isoeléctrico de cerca de 4,6.

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima dificilmente pode ser cristaliza

da.

(9) Análise elementar

Nao determinada por causa da dificuldade de cristalização.

(10) Km valor de Km desta enzima é de 0,3 mM (pH 4, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo 5

Cultivou-se Streptococcus salivarius PG~ -303 W (IEO 14746, EERM BP-1856) de modo análogo ao descrito no Exemplo 3. 0 procedimento deu 10 1 de um caldo de cultura apresentando 4,3 U/ml. 0 caldo de cultura acima mencionado foi sujeito ao mesmo processo de purificação descrito no Exemplo 4 dando origem à enzima com uma actividade específica de 68,2 U/mg de proteína. 0 rendimento da actividade foi de 41,2 %. As propriedades enzimoquímicas deste produto são as seguintes.

Urease ácida E (1) Acção

(2) Especificidade do substrato

A enzima actua com mais intensidade sobre ureia e até certo ponto sobre biuret e ácido alantóico (Quadro 10).

38Quadro 10

Substracto

Actividade relativa (%)

Ureia 100,0 Ácido alantóico 12,0 Biuret 60,0

Etilureia 50,0 (3) pH óptimo e estabilidade do pH

Como se mostra na Eig. 17 o pH óptimo desta enzima ó de cerca de 4. A Eig. 18 mostra as actividades resi duais após se ter deixado a enzima em repouso a 37 C e a vários níveis de pH durante 30 minutos. Como se verifica a par tir da Eig. 18 a enzima ó estável a pH 6 a 11« (4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

Como se mostra na Eig. 19 a temperatura ópti ma desta enzima ó de 60 a 70°C. A Eig. 20 mostra as activida des residuais após a enzima ter sido deixada em repouso a pH 6 a várias temperaturas durante 30 minutos. Como se verifica a partir da Eig. 20 a enzima ó estável a pH 6 ató 60°C_o (5) Inibidores

Como se mostra no Quadro 11 a enzima ó inibi da por cloreto mercúrico e por ácido aceto-hidroxâmico.

Quadro 11

Inibidor

Nenhum

HgCl₂

Ácido Iodoacético Ácido

Aceto-hidroxâmico

Concentração

0,05 ÉhM
10	mM
10	mM

Actividade relativa (%)

100,0

2,0

100,0

15,2 (6) Peso molecular

Conforme determinado por electroforese em gel de poliacrilamida a enzima possui um peso molecular de cerca de 110.000. Conforme determinado por filtração em gel através de Sephadex G-200 a enzima possui um peso molecular de cerca de 140 000.

(7) Ponto isoeléctrico

Conforme determinado por focagem isoeléctrica j em gel de poliacrilamida a enzima apresenta um ponto isoeléc- i trico de cerca de 4,7.

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima dificilmente pode ser cristalizada.

(g) Análise elementar

Não determinada por causa da dificuldade de cristalização.

(10) Km

-403

valor de Km desta enzima é de 0,2 mM (pH 4, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo 6

Cultivou-se Lactobacillus ruminis PG-98 (IEO 14632, EERM BE-1906) de modo análogo ao descrito no Exem pio 1. 0 procedimento deu 10 1 de um caldo de cultura apresentando 5,2 U/ml de actividade de urease ácida. 0 caldo de cultura acima mencionado foi submetido ao mesmo processo de purificação descrito no Exemplo 2, tendo-se obtido a enzima com a actividade específica de 36,7 U/mg de proteina. 0 rendimento da actividade foi de 42,8 %. As propriedades enzimoquímicas deste produto foram conforme se apresenta a seguir.

Urease ácida E (1) Acção

(2) Especificidade do substrato

A enzima actua com mais intensidade sobre ureia e até certo ponto sobre etilureia e biuret (Quadro 12).

Quadro 12

100,0

0,0

26,0

5,0

Substrato Actividade relativa (%)

Ureia

Ácido alantóico

Biuret

Etilureia

-413

(3) pH óptimo e estabilidade do pH

Conforme se mostra na Fig. 21, o pH óptimo desta enzima é de 5. A Fig_o 22 mostra as actividades residuais após se ter deixado a enzima em repouso a 37°C e a vários níveis de pH durante 50 minutos₀ Conforme se verifica a partir da Fig. 22 a enzima é estável a pH 4 a 8.

(4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

Conforme se mostra na fig. 23 a temperatura óptima desta enzima é de 55 a 60°C. A Fig. 24 mostra as acti vidades residuais após a enzima ter sido deixada em repouso a pH 6 durante 30 minutos. Conforme se verifica a partir da Fig. 24 a enzima é estável a pH 6 até 55°C e a pH 4 até a 30 °C.

(5) Inibidores

Conforme se apresenta no Quadro 3» a enzima é inibida por cloreto mercúrico, por ácido iodoacético e por ácido aceto-hidroxâmico.

	Quadro 13
Inibidor	Concentração	Actividade relativa

Nenhum		100,0
HgCl₂	0,05 mM	0,0
ácido Iodoacético	10 mM	50,0
Ácido aceto-hidroxâmico	10 mM	0,0

(6) Peso molecular

-42Conforme determinado por filtração em gel através de Sephadex G-200 a enzima possui um peso molecular de cerca de 150 000.

(7) Ponto isoeléctrico

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima dificilmente pode ser cristalizada.

(9) Análise elementar

Não determinada por causa da dificuldade de cristalização.

(10) Km valor de Km desta enzima é de 1,2 mM (pH 5, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo 7

Cultivou-se lactobacillus reuteri UM-12 (IE0 14629, FERM BP-1904) de modo análogo ao descrito no Exemplo 1. 0 procedimento deu 10 1 de um caldo de cultura apresentando 3,6 U/ml de actividade de urease ácida. 0 caldo de cultura acima mencionado foi submetido ao mesmo processo de pu rificação descrito no Exemplo 2, tendo-se obtido a enzima possuindo uma actividade específica de 33,4 U/mg de proteína. 0 rendimento da actividade foi de 45,3 %· As propriedades enzimoquímicas deste produto foram como se segue.

Urease ácida G

.3’ (1) Acção

(2) Especificidade do substrato

A enzima actua com mais intensidade sobre ureia e ató certo ponto sobre etilureia e biuret (Quadro 14).

Quadro 14

Substrato

Actividade relativa (%)

Ureia 100,0

Ácido alantóico 0,0

Biuret 7,9

Etilureia 25,5 (3) pH óptimo e estabilidade do pH

Conforme se mostra na fig. 25 o pH óptimo desta enzima ó de 4. A Fig. 26 apresenta as actividades residuais após se ter deixado a enzima em repouso a 37°C e a vários níveis de pH durante 30 minutos. Conforme se verifica a partir da Fig. 26 a enzima ó estável a pH 4 a 8.

(4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura

Conforme se mostra na Fig. 27 a temperatura óptima desta enzima ó de 70 a 75°C. A Fig. 28 apresenta as actividades residuais após a enzima ter sido deixada em repouso a pH 4 θ pH 6 a várias temperaturas durante 30 minutos. Con forme se verifica a partir da Fig. 28 a enzima ó estável a pH

até 75°C e a pH 4 até 65°C.

(5) Inibidores

Conforme se mostra no Quadro 15 a enzima é

inibida por cloreto mercúrico e	por ácido aceto-hidroxâmico
	Quadro 15
Inibidor	Coneentração	Actividade relativa

Nenhum			100,0
Hg01₂	0,05	mM	0,0
Ácido Iodoacético	10	mM	100,0
Ácido Ac e t o-hi dr oxâmi c o	10	mM	17,1

(6) Peso molecular

Conforme determinado por filtração em gel de Sephadex G-200, a enzima possui um peso molecular de cerca de 210 000.

(7) Ponto isoeléctrico

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima dificilmente pode ser cristaliza da.

(9) Análise elementar

-45Nao determinada por causa da dificuldade de cristalizaçao.

(10) Km valor de Km desta enzima é de 1,3 mM (pH 4, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo 8

Cultivou-se Lactobacillus reuteri UM-18 (IEO 14630, EERM BE-1905) de modo análogo ao descrito no Exem pio lo 0 procedimento deu 10 1 de um caldo de cultura apre sentando 4,5 U/ml de actividade de urease ácida. 0 caldo de cultura acima mencionado foi sujeito ao mesmo processo de purificação descrito no Exemplo 2, tendo-se obtido a enzima com uma actividade específica de 39,8 U/mg de proteina. 0 rendimento da actividade foi de 41,7 %. As propriedades enzimoquí micas deste produto são como se apresenta a seguir.

Urease ácida H (1) Acção

(2) Especificidade do substrato

A enzima actua com mais intensidade sobre ureia e até certo ponto sobre etilureia e ácido alantóico (Quadro 16).

Substrato

Quadro 16

Actividade relativa (%)

Ureia 100,0

Ácido alantóico 12,5

Biuret 82,4

Etilureia 66,2 (3) pH óptimo e estabilidade do pH i

I , !

Conforme se mostra na Fig. 29, o pH optimo j , ι desta enzima e de 5. A Fig. 30 apresenta as actividades resi Ϊ duais após se ter deixado a enzima em repouso a 37°C e a vários níveis de.pH durante 30 minutos. Como se verifica a par tir da Fig. 30, a enzima é estável a pH 5 a 8.

i (4) Temperatura óptima e estabilidade da temperatura j !

i

Conforme se mostra na Fig. 31 a temperatura I óptima desta enzima é de 70 a 75°C. A Fig. 32 apresenta as actividades residuais após a enzima ter sido deixada em repou so a pH 4 e a pH 6 durante 30 minutos. Conforme se verifica a partir da Fig. 32, a enzima é estável a pH 6 até 70°C e a pH 4 até 65°C.

(5) Inibidores

Conforme se mostra no Quadro 17 a enzima é inibida por cloreto mercúrico e por ácido aceto-hidroxâmico.

-47ϊ\

Quadro 17

Inibidor	Concentração	Actividade
		(%)

Nenhum		100,0
HgCl₂	0,05 mM	0,0
Ácido Iodoacático	10 mM	99,0
Ácido
aceto-hidroxâmico	10 mM	7,9

(6) Peso molecular

Conforme determinado por filtração em gel de Sephadex G-200 a enzima possui um peso molecular de cerca de 250 000.

(7) Ponto isoeléctrico

Conforme determinado por focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida, a enzima apresenta um ponto isoeléctrico de cerca de 4,5.

(8) Estrutura cristalina

Esta enzima dificilmente pode ser cristaliza da.

(9) Análise elementar

Nao determinada por causa da dificuldade de cristalização.

(10) Km

valor de Km desta enzima é de 4,8 mM (pH 3, tampão de citrato 0,1 M).

Exemplo de análise 1

A actividade enzimática das ureases ácidas C, D e E obtidas nos Exemplos 3 a 5 foi analizada utilizando-se a solução reacional contendo etanol em diversas concentra ções. Conforme se mostra no Quadro 18 estas ureases podem aç. tuar em ureia mesmo na presença de 20 ou 50 % de etanol.

Quadro 18

Urease ácida	Concentração de etanol (%)
0	20	50
Urease ácida C	100	84,2	51,6
Urease ácida D	100	85,0	50,4
Urease ácida E	100	82,6	47,6

Actividade relativa (%)

Exemplo de análise 2

A concentração das ureases ácidas A, Β, E, G e H obtidas nos Exemplos 1, 2, 6, 7 e 8 e de urease de ”Jack bean” foi ajustada a 10 U/ml e estas actividades enzimáticas foram analizadas na presença de 20 % de etanol a 20°C.

Os resultados são apresentados no Quadro 19.

Quadro 19

Urease ácida	Actividade relativa (%)
Urease ácida A	100,0
Urease ácida B	95,0
Urease ácida E	107,0
Urease ácida G	119,7
Urease ácida H	121,6
Urease de Jack bean”	0.5

Nota: * A urease obtida a partir de ”Jack bean”, pH óptimo 7,0 foi obtida de P. L Biochemicals, Inc., USA.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1& Processo para a preparação de uma urease áci da com as seguintes propriedades físico-químicas:

(1) Acção

Produz 2 moles de amoníaco e 1 mole de dióxi do de carbono a partir de 1 mole de ureia e 1 mole de água, (2) Especificidade do substrato:

É mais activo na transformação de ureia, (5) pH óptimo e estabilidade perante variações do pH:

0 pH óptimo é 1,5 a 5,5» é estável a pH 6 a 8 a 37°C durante 30 minutos, (4) Temperatura óptima e estabilidade perante variações de temperatura:

A temperatura óptima ao pH óptimo é de 55 a

Q χ X

75 C; a pH 6 conserva-se estável durante 30 minutos a um máximo de 50°C, (5) Inibidores:

É inibida por cloreto mercúrico e por ácido aceto-hidroxâmico, (6) Peso molecular:

0 peso molecular segundo determinação por filtração em gel é de 100 000 a 250 000, (7) Actividade específica:

A actividade específica ao pH óptimo e a 37°C é maior ou igual a 20 U/mg de proteína, caracterizado por compreender as fases de cultivar num meio de cultura um microorganismo que pertence ao género lactobacillus ou ao género Streptococcus e tem a capacidade de produzir a urease ácida com as propriedades acima referidas, provocar no caldo de cultura a formação e a acumulação da urease ácida e recuperar a urease ácida a partir do caldo de fermentação.

- 2ô processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microorganismo pertencer a uma das espécies lactobacillus fermentum, lactobacillus reuteri ou lactobacillus ruminis.

Processo de acordo com a reivindicação 1, ca· racterizado por o microorganismo pertencer a uma das espécies Streptococcus bovis, Streptococcus mitior ou Streptococcus salivarius.

- 4* Processo de acordo com a reivindicação 2, ca· racterizado por o microorganismo ser Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IPO 14511, PERM BP-1454)□

- ₅a Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o microorganismo ser lactobacillus reuteri Rt-5 (IPO 14651, PERM BP-1447).

- 6ê Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o microorganismo ser lactobacillus ruminis PG-98 (IPO 14652, PERM BP-1906).

_ ₇a _

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o microorganismo ser lactobacillus reuteri UM-12 (IPO 14629, PERM BP-1904)o

- 8§ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o microorganismo ser lactobacillus reuteri UM-18 (IPO 14650, PERM BP-1905).

_ 9& _

-52Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o microorganismo ser Streptococcus bovis PG-186 (IPO 14654, PERM BP-1449).

- 1O& Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o microorganismo ser Streptococcus mitior PG-154 (IPO 14653, PERM BP-1448).

- llê Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o microorganismo ser Streptococcus salivarius PG-305 W (IPO 14746, FERM BP-1856).

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados no Japão em 9 de Julho de 1987 e em 14 de Abril de 1988, sob os n^s. 171750/1987 e 92356/1988, respectivamente,,

Lisboa, 8 de Julho de 1988