JPH0669380B2 - バリエナミンおよびバリダミンの製造法 - Google Patents

バリエナミンおよびバリダミンの製造法

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JPH0669380B2
JPH0669380B2 JP22268286A JP22268286A JPH0669380B2 JP H0669380 B2 JPH0669380 B2 JP H0669380B2 JP 22268286 A JP22268286 A JP 22268286A JP 22268286 A JP22268286 A JP 22268286A JP H0669380 B2 JPH0669380 B2 JP H0669380B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バリエナミンおよび(または)バリダミンの
製造法に関する。
バリエナミン、バリダミンおよびバリエナミンから誘導
されるバリオールアミンは、それぞれα−グルコシダー
ゼ阻害活性を有しており、肥満、脂肪過多、糖尿病など
の予防、治療薬として有用である。そしてこれらのN−
置換体にはさらに強力なα−グルコシダーゼ阻害活性を
有するものが知られている(特開昭57−64648,特開昭57
−114554,特開昭57−200335)。したがってバリエナミ
ンやバリダミンはそれら置換体の原料化合物としても重
要なものである。
従来の技術 本発明者らは先にバリダマイシンAまたはバリドキシル
アミンAにシュードモナス・デニトリフィカンス(Pseu
domonas denitrificans)の菌体を作用させることによ
り、バリエナミン 〔valienamine;1L−(1,3,4/2)−4−アミノ−6−
ヒドロキシメチル−5−シクロヘキセン−1,2,3−トリ
オール〕およびバリダミン〔validmine;1L−(1,3,4/
2,6)−4−アミノ−6−ヒドロキシメチル−1,2,3−シ
クロヘキサントリオール〕が得られること〔ジャーナル
・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアティ・ケミカル・モミ
ュニケーション(J.Chem.Soc.Chem.Commum.)1972年,74
6〜747頁〕、フラボバクテリウム・サッカロフィルム
(Flavobacterium saccharophilum)IFO 13984がバリ
ダマイシンをバリダミンおよびバリエナミンに分解しう
ること(特開昭57−54593)、またサイトファーガ・ヘ
パリナ(Cytophaga Heparina)IFO 12017,ATCC 1312
5が同様にバリダマイシンをバリダミンおよびバリエナ
ミンに分解しうること(特開昭58−152496)を見いだし
た。
発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、前述の属に属する微生物以外にもバリダ
マイシンやバリドキシルアミンを分解して効率よくバリ
ダミンおよび(または)バリエナミンを生成しうるもの
が存在しないかと鋭意研究を重ねてきた。
問題を解決するための手段 その結果、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属お
よびアエロモナス(Aeromonas)属に属する微生物また
はその処理物がバリダマイシンまたはバリドキシルアミ
ンに作用して効率よくバリエナミンおよび(または)バ
リダミンを生成しうることを見出し、本発明を完成する
に至った。
即ち、本発明は、アグロバクテリウム属またはアエロモ
ナス属に属し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミ
ンに作用してバリエナミンおよび(または)バリダミン
を生成しうる酵素を産生する微生物またはその処理物を
バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用させる
ことを特徴とするバリエナミンおよび(または)バリダ
ミンの製造法である。
本発明の方法において原料として用いられるバリダマイ
シンの化学構造は、バリドキシルアミンとD−グルコー
スとから成り立っている。バリドキシルアミンは現在A,
BおよびGが知られており、そのバリドキシルアミンA,B
およびGとD−グルコースとの組み合わせによりバリダ
マイシンは、A,B,C,D,E,F,Gとして存在することが知ら
れている〔ザ・ジャーナル・オブ・アンティバクティク
ス(J.Antibiotics)第25巻,48〜53頁(1972年)および
昭和61年特許願第95940号参照〕。
本発明方法においては、このようなバリダマイシン,バ
リドキシルアミンあるいはその混合物を原料として用い
ることができ、たとえばバリダマイシン生産菌の培養物
あるいはその処理物が有利に用いられる。
本発明の方法で用いられる微生物は、バリダマイシンま
たはバリドキシルアミンをバリエナミンおよび(また
は)バリダミンに変換する能力を有するアグロバクテリ
ウム属またはアエロモナス属に属する微生物およびその
変異株であればいずれでもよく、アグロバクテリウム属
に属する微生物としては、例えば、アグロバクテリウム
・ラジオバクター(Agrobacterium Radiobacter)IFO
12664(ATCC 4718)株,IFO 13258(ATCC 13332)
株,IFO 13259(ATCC 13333)株,IFO 13532(ATCC 1
9358)株,IFO 13533(ATCC 25235)株,およびアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tum
efaciens)IFO 3058株等が、アエロモナス属に属する
微生物としては、例えば、アエロモナス・ハイドロフィ
ラ・サブスピーシス・アナエロゲネス(Aeromonas hyd
rophila subsp.anaerogenes)IFO 13282,同サブスピ
ーシス・ハイドロフィラ(subsp.hydrophila)IFO 132
86,同サブスピーシス・プロテオリティカ(subsp.prote
olytica)IFO 13287,アエロモナス・パンクタータ・サ
ブスピーシス・キャビエ(aeromonas punctata subs
p.cavice)IFO 13288,およびアエロモナス・サルモニ
シダ・サブスピーシス・サルモニシダ(Aeromonas sal
monicida subsp.salmonicida)IFO 12659等が挙げら
れる。
上記の微生物の培養に用いられる培地は上記の菌株が利
用し得る栄養源を含むものなら、液体でも固状でもよい
が、大量を処理するときには液体培地を用いるのがより
適当である。培地には上記の微生物が利用し得る炭酸
源,消化し得る窒素源,無機物質微量栄養素等が配合さ
れる。炭酸源としては、たとえばぶどう糖,乳糖,しょ
糖,麦芽糖,デキストリン,でん粉,グリセリン,マン
ニトール,ソルビトール等の炭水化物類や油脂類(例え
ば、大豆油,ラード油,チキン油等)その他が、窒素源
としては、例えば肉エキス,酵母エキス,乾燥酵母,大
豆粉,コーン・スチープ・リカー,ペプトン,棉実粉,
糖蜜,尿素,アンモニウム塩類(例えば、硫酸アンモニ
ウム,塩化アンモニウム,硝酸アンモニウム,酢酸アン
モニウム等)その他が用いられる。さらにナトリウム,
カリウム,カルシウム,マグネシウム,鉄,マンガン,
亜鉛,コバルト,ニッケルなどの金属塩類,りん酸,硫
酸,硝酸,炭酸,塩酸などの塩類や酢酸,プロピオン
酸,酪酸,酒石酸,くえん酸,フマル酸,グルコン酸な
どの有機酸の塩類が適宜用いられる。その他、アミノ酸
(例えば、グルタミン酸,アスパラギン酸,グリシン,
アラニン,バリン,リジン,メチオニン,プロリン
等),ペプチド(例えば、ジペプチド,トリペプチド
等),ピタミン類(例えば、B1,B2,ニコチン酸,B12,C
等),核酸類(例えば、プリン,ピリミジンおよびその
誘導体等)等を含有させてもよい。もちろん培地のpHを
調節する目的で無機または有機の酸,アルカリ類,緩衝
剤等を加え、あるいは消泡の目的で油脂類,表面活性剤
等の適量を添加してもよい。
微生物を培養する手段としては静置培養、振盪培養、通
気培養あるいは撹拌培養法等の手段が単独または組み合
わせて用いられる。大量培養には、いわゆる深部通気撹
拌培養が望ましい。培養の条件は培地の状態,組成,菌
株の種類,培養の手段等によっても異なるが、通常、15
℃〜40℃の温度で初発pHを中性附近に選択するのがよ
い。培養中期の温度は20℃〜30℃、また初発pHは6.5〜
8.5の条件が望ましい。培養時間は6〜100時間程度で良
いが、とくに16〜60時間が良好である。
本発明では、上記の微生物あるいはその処理物を用いる
ことができる。該微生物はどのような存在状態にあるも
のでもよく、例えば、培養物中に存在するままの状態の
ものであっても、また培養物に公知の手段を施すことに
より含まれる微生物の菌体濃度を変化させたものであっ
ても、菌体のみを取り出した状態のものであってもよ
い。ここに「処理物」とは、該微生物の菌体に、例え
ば、超音波処理、フレンチプレス処理、アルミナ磨砕、
溶菌酵素処理、界面活性剤処理、有機溶媒処理等の物
理、化学的処理を単独または組み合わせて行なうことに
よって得られる、バリダマイシンまたはバリドキシルア
ミンに作用してバリエナミンおよび(または)バリダミ
ンを生成しうる酵素を含有する菌体破砕物、あるいは、
上記の微生物の培養物、菌体または菌体破砕物に、微生
物酵素の単離精製法として公知の処理を施して得られ
る、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用し
てバリエナミンおよび(または)バリダミンを生成しう
る酵素および酵素含有物をいう。微生物またはその処理
物は、公知の方法で固定化したものであってもよい。
本発明方法は、原料化合物と上記の微生物またはその処
理物とを接触させることにより行なわれる。反応液中の
原料化合物の濃度は1〜5%が適当である。反応温度は
15〜45℃,初発pHは5〜8が適当であるが、特に温度は
24〜30℃,初発pHは6.5〜7.5が良好である。反応時間は
反応液に加える上記の微生物の発育状態および菌体量に
よっても異なるが、24〜200時間、さらに好ましくは48
〜100時間が適当である。また反応は静止,振盪,通気
または撹拌の条件下でもよいが、振盪,通気または撹拌
する方が良好な結果が得られる。反応液中には、所望に
より反応促進剤,酵素安定化剤,防腐剤などを添加して
もよい。
反応液中から目的物を採取するには、通常微生物代謝物
を採取するのに用いられる手段が単独あるいは組み合わ
せて、また反復して用いられる。すなわち、たとえば、
濾過,遠心分離,濃縮,乾燥,凍結乾燥,吸着,脱着,
各種溶媒に対する溶解度の差を利用する方法(たとえ
ば、沈澱,結晶化,再結晶)、クロマトグラフィーなど
が用いられる。またバリエナミンおよびバリダミンが水
に可溶で、一般の有機溶媒に難溶な塩基性物質であるこ
とを利用して、いわゆる水溶性塩基性物質の単離精製に
用いられる方法、たとえばイオン交換樹脂,活性炭,ハ
イポーラスポリマー,セファデックス,セファデックス
イオン交換体,セルローズ,イオン交換セルローズ,シ
リカゲル,アルミナ等を用いるクロマトグラフィーや吸
脱着法が有利に用いられる。
発明の効果 上記のように、アグロバクテリウム属またはアエロモナ
ス属に属する微生物またはその処理物をバリダマイシン
やバリドキシルアミンに作用させることによって、α−
グルコシダーゼ阻害剤の製造原料として有用な化合物で
あるバリエナミンおよび(または)バリダミンを効率よ
く製造することができる。本特許の方法は、更に発酵工
学の分野で一般に行なわれている菌株の育種改良、培養
条件や反応条件の改良を行なうことによって、工業的規
模のバリエナミンおよび(または)バリダミンの製造法
の一つとして用いることが可能である。
また工業的規模での発酵生産においてバクテリオファー
ジの汚染により大きな被害を受けることがある。この様
な汚染があった場合、先願の方法で用いるフラボバクテ
リウム属やサイトファーガ属菌種と本出願の方法で用い
るアグロバクテリウム属やアエロモナス属菌種とは系統
的に全く異なるので、互いにファージ汚染を回避するこ
とが可能であり、使用する菌種を互いに変えることによ
って生産を継続することができる。
また、アグロバクテリウム属またはアエロモナス属に属
し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用し
てバリエナミンおよび(または)バリダミンを生成しう
る酵素を産成する微生物またはその処理物をバリダマイ
シンG(バリダマイシンAのバリダミン部分がバリオー
ルアミンで置き換わった構造の化合物)およびバリドキ
シルアミンG(バリドキシルアミンAのバリダミン部分
がバリオールアミンで置き換わった構造の化合物)(昭
和61年特許願第95940号参照)に作用させた場合にはバ
リオールアミンおよび(または)バリエナミンが生成す
る。
次に実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例1. a) 2L坂口フラスコ中、トリプチカーゼ (Tripticase ,BBL社製)15gを水500mLに溶解し、滅菌
後アグロバクテリウム・ラジオバクター(IFO 12664,A
TCC 4718)を接種し、28℃で24時間振盪培養した。一
方、50L発酵槽中にポリペプトン300g,酵母エキス210gお
よび塩化ナトリウム90gを水30Lに溶解し、消泡剤(アク
トコール,Actocol ,武田薬品工業製)15gを加え、pH
7.1に調整して、滅菌した。この前培養培地に前記微生
物の培養液を加え、28℃で、通気,撹拌下に24時間培養
した。この培養液のうち5Lを、200L発酵槽中で硫酸アン
モニウム1.0kg,りん酸一水素カリウム0.7kg,りん酸二水
素カリウム0.3kg,硫酸マグネシウム0.01kg,およびバリ
ダマイシンAの粗製液(バリダマイシンA含有率:約20
%)10Lを水100Lに溶解し、消泡剤0.05kgを加え、pH7.1
に調整し、滅菌した主発酵培地に移植した。反応は28℃
で、通気、撹拌下に96時間培養して行なった。
b) a)で得られた反応液を遠心分離し、上澄液をア
ンバーライトIRC−50(▲NH+ 4▼型,ローム・アンド・
ハース社製)のカラム30Lに通過吸着させ、カラムを水9
0Lで洗浄後、0.5Nアンモニア水で溶出した。溶出画分
(フラクションNo.5〜10;各フラクシヨン10L)を集め、
約3.8Lにまで減圧濃縮した。
上記の濃縮液のうちの1/10量(380mL)をダウエック
ス1×2(OH-型,ダウ・ケミカル社製)のカラムクロ
マトグラフィー(1.8L)に付し、カラムを水で溶出し
た。各溶出画分は薄層クロマトグラフィー〔シリカゲル
60F254(メルク社製);展開溶媒,n−プロピルアルコー
ル・酢酸・水(4:1:1);呈色試薬,ニンヒドリン;バ
リエナミンRf=0.42,バリダミンRf=0.35〕で調べた。
先に溶出してくるバリダミンの溶出画分を集め減圧濃縮
後、凍結乾燥するとバリダミンの白色粉末(7.1g)が得
られた。結晶化はメタノール−エタノールで行なった。
後に溶出してくるバリエナミンの溶出画分を集め減圧濃
縮し、得られたシロップ状物質にエタノールに加えると
バリエナミンの結晶(13.4g)が得られた。
実施例2 バリダマイシンA1%,硫酸アンモニウム1%,りん酸−
水素カリウム1.7%,りん酸二水素カリウム0.3%,硫酸
マグネシウム0.01%の水溶液(2L)をpH7.1に調整し、
滅菌した培地に、アグロバクテリウム・ラジオバクター
(IFO 12664,ATCC 4718)を接種し、27℃で4日間振
盪培養した。培養液を遠心分離して菌体を除き、上澄を
アンバーアイトIRC−50(▲NH+ 4▼型,ローム・アンド
・ハース社製)のカラム(500mL)に吸着させ、水洗
後、0.5Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧濃縮
し、濃縮液をダウエックス1×2(OH-型,ダウ・ケミ
カル社製)(500mL)のカラムクロマトに付し、水で溶
出した。各溶出画分は実施例1−b)と同様の方法で薄
層クロマトで調べた。先に溶出してくるバリダミンの溶
出画分を集め、減圧濃縮後、凍結乾燥するとバリダミン
の白色粉末(0.96g)が得られた。ついで溶出してくる
バリエナミンの溶出画分を集め、減圧濃縮乾固し、80%
エタノール水より結晶化するとバリエナミンの結晶(2.
2g)が得られた。
実施例3. 2L坂口フラスコ中、トリプチカーゼ15gを水500mLに溶解
し、滅菌後、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(IFO 3058)を接種し、27℃で24時間振盪培養した。
培養液を遠心分離して菌体を集め、0.1Mりん酸緩衝液
(pH7.0)で一回洗浄して湿菌体約5.3gを得た。この菌
体バリドキシルアミンA(3.0g)の0.1Mりん酸緩衝液溶
液(pH7.0,2L)に加え、振盪下27℃で72時間反応を行な
った。反応液を遠心分離して菌体を除去し、上澄液をア
ンバーライトIRC−50(▲NH+ 4▼型,100mL)に吸着さ
せ、以下実施例2と同様の方法で処理して、バリダミン
(180mg)およびバリエナミン(230mg)を得た。
実施例4. 硫酸アンモニウム1%,りん酸一水素カリウム0.7%,
りん酸二水素カリウム0.3%,硫酸マグネシウム0.01%
を含む水溶液(50mL)にバリダマイシンEおよびFの混
合物(約3:2の混合物)0.50gを溶解し、pH7に調整し、
滅菌後、アグロバクテリウム・ラジオバクター(IFO 1
2664,ATCC 4718)を接種し、27℃で4日間振盪培養を
行なった。培養ろ液を実施例1と同様の方法で処理し
て、バリダミン(31mg)およびバリエナミン(35mg)を
得た。
実施例5. 2L坂口フラスコ中、トリプチカーゼ5gを水125mLと海水3
75mLの混合液に溶解し、滅菌後、アエロモナス・ハイド
ロフィラ・サブスピーシス・プロテオリティカ(IFO 1
3287)を接種し、27℃で40時間振盪培養した。培養液を
遠心分離して菌体を集め、0.1Mりん酸緩衝液(pH7.0)
で洗浄して湿菌体約5.3gを得た。この菌体をバリダマイ
シンA(5.0g)の0.1Mりん酸緩衝液(pH7.0,2L)に加
え、振盪下に27℃で72時間反応を行なった。反応液を遠
心分離して菌体を除去し、上澄液をアンバーライトIRC
−50(▲NH+ 4▼,100mL)に吸着させ、以下実施例2と同
様の方法で処理して、バリダミン(170mg)およびバリ
エナミン(220mg)を得た。
実施例6. 実施例5と同様の方法でアエロモナス・ハイドロフィラ
の代わりにアエロモナス・パンクタータ・サブスピーシ
ス・キャビエ(IFO 13288)およびアエロモナス・サル
モニシダ・サブスピーシス・サルモニシダ(IFO 1265
9)を用いてバリダマイシンAの分解反応を行いバリダ
ミンおよびバリエナミンを得た。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】アグロバクテリウム属またはアエロモナス
    属に属し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに
    作用してバリエナミンおよび(または)バリダミンを生
    成しうる酵素を産生する微生物またはその処理物を、バ
    リダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用させるこ
    とを特徴とするバリエナミンおよび(または)バリダミ
    ンの製造法。
JP22268286A 1985-10-08 1986-09-19 バリエナミンおよびバリダミンの製造法 Expired - Fee Related JPH0669380B2 (ja)

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