JP3093039B2 - 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 - Google Patents
新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、立体異性体をもつエス
テルを選択的に加水分解する新規酵素およびその製造法
に関する。
テルを選択的に加水分解する新規酵素およびその製造法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】数多くの生物学的に活性な化合物に立体
異性体が存在することは広く知られている。所望の生物
学的活性は、通常主として一つの立体異性体にあり、他
の立体異性体は所望の生物学的活性を持たないか、ある
いは毒性を含む望ましくない生理的作用をもつことがあ
る。立体異性体をもつ生物学的に活性な化合物の立体異
性体を分割する適当な手法がない場合、その立体異性体
の混合物がそのままで農業および製薬用途にしばしば用
いられている。この場合、混合物の生物学的活性は半減
されたり、混合物が毒性を含む望ましくない生理的作用
をもつことがある。この問題を克服するために、立体異
性体の分割法が種々検討されている。その一法に、被分
割立体異性体の各種エステル誘導体を調製し、立体選択
的にエステルを加水分解する酵素を作用させ、反応系の
溶媒に対する溶解度の差などにより分離する方法が提案
されている。そして該法を実現させるため、種々の立体
選択性をもつエステル分解酵素の開発が望まれている。
異性体が存在することは広く知られている。所望の生物
学的活性は、通常主として一つの立体異性体にあり、他
の立体異性体は所望の生物学的活性を持たないか、ある
いは毒性を含む望ましくない生理的作用をもつことがあ
る。立体異性体をもつ生物学的に活性な化合物の立体異
性体を分割する適当な手法がない場合、その立体異性体
の混合物がそのままで農業および製薬用途にしばしば用
いられている。この場合、混合物の生物学的活性は半減
されたり、混合物が毒性を含む望ましくない生理的作用
をもつことがある。この問題を克服するために、立体異
性体の分割法が種々検討されている。その一法に、被分
割立体異性体の各種エステル誘導体を調製し、立体選択
的にエステルを加水分解する酵素を作用させ、反応系の
溶媒に対する溶解度の差などにより分離する方法が提案
されている。そして該法を実現させるため、種々の立体
選択性をもつエステル分解酵素の開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、高い立体選択性をもつ新規なエステル分解酵素およ
びその製造方法を提供することにある。
は、高い立体選択性をもつ新規なエステル分解酵素およ
びその製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、高い立体
選択性をもつエステル分解酵素の工業生産を目的とし
て、その給源を微生物に求め、広く自然界より該酵素を
生産する菌株を検索した結果、佐賀市近郊の土壌中より
純粋分離された、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiel
la oxytoca）と同定された１菌株が、高い立体選択性を
もつエステル分解酵素生産能を有することを認め、本発
明を完成するに至った。
選択性をもつエステル分解酵素の工業生産を目的とし
て、その給源を微生物に求め、広く自然界より該酵素を
生産する菌株を検索した結果、佐賀市近郊の土壌中より
純粋分離された、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiel
la oxytoca）と同定された１菌株が、高い立体選択性を
もつエステル分解酵素生産能を有することを認め、本発
明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明の新規エステル分解酵素
（エステル分解酵素Ａと命名した）は以下の理化学的性
質を有している。 (1) 作用 酸性−弱アルカリ条件下（ｐＨ３〜９）でエステルの加
水分解能を有する。 (2) 基質特異性 直鎖型脂肪族有機酸のｐ−ニトロフェニルエステルを基
質としたとき、プロピオン酸のｐ−ニトロフェニルエス
テルに最も高い基質特異性を示す。 (3) 至適ｐＨ 酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、３７℃で反応さ
せた場合、至適ｐＨは７〜７．５である。 (4) 安定ｐＨ領域 種々のｐＨで８０℃、３０分間処理後の残存活性を酪酸
ｐ−ニトロフェニルを基質として測定した場合、ｐＨ４
〜７．５の範囲において安定であり、ｐＨ３以下および
ｐＨ１１以上では著しい失活がみられる。 (5) 至適温度 酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、ｐＨ８．０で反
応させた場合、至適温度は６５℃である。 (6) 温度安定性 ｐＨ８．０、７０℃にて１時間熱処理後の残存活性を測
定した場合、１００％活性が残存する。 (7) 金属イオンの影響 Ｈｇ，Ｐｂ，Ｓｎにより約５０％活性が阻害される。 (8) 阻害剤，活性化剤の影響 ＤＦＰ，ＰＭＳＦにより特異的に活性が阻害される。ま
た、２−ＭＥ，ＤＴＴにより活性化される。 (9) 分子量 約１１００００（ゲル濾過法による）
（エステル分解酵素Ａと命名した）は以下の理化学的性
質を有している。 (1) 作用 酸性−弱アルカリ条件下（ｐＨ３〜９）でエステルの加
水分解能を有する。 (2) 基質特異性 直鎖型脂肪族有機酸のｐ−ニトロフェニルエステルを基
質としたとき、プロピオン酸のｐ−ニトロフェニルエス
テルに最も高い基質特異性を示す。 (3) 至適ｐＨ 酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、３７℃で反応さ
せた場合、至適ｐＨは７〜７．５である。 (4) 安定ｐＨ領域 種々のｐＨで８０℃、３０分間処理後の残存活性を酪酸
ｐ−ニトロフェニルを基質として測定した場合、ｐＨ４
〜７．５の範囲において安定であり、ｐＨ３以下および
ｐＨ１１以上では著しい失活がみられる。 (5) 至適温度 酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、ｐＨ８．０で反
応させた場合、至適温度は６５℃である。 (6) 温度安定性 ｐＨ８．０、７０℃にて１時間熱処理後の残存活性を測
定した場合、１００％活性が残存する。 (7) 金属イオンの影響 Ｈｇ，Ｐｂ，Ｓｎにより約５０％活性が阻害される。 (8) 阻害剤，活性化剤の影響 ＤＦＰ，ＰＭＳＦにより特異的に活性が阻害される。ま
た、２−ＭＥ，ＤＴＴにより活性化される。 (9) 分子量 約１１００００（ゲル濾過法による）
【０００６】本発明によれば、この新規エステル分解酵
素Ａはクレブシエラ属に属し、かつエステル分解酵素生
産能を有する微生物、特にクレブシエラ・オキシトカ
（Klebsiella oxytoca）ＳＮＳＭ−８７（微工研菌寄第
１２９５３号）を培養し、培養物からエステル分解酵素
を採取することにより製造し得る。
素Ａはクレブシエラ属に属し、かつエステル分解酵素生
産能を有する微生物、特にクレブシエラ・オキシトカ
（Klebsiella oxytoca）ＳＮＳＭ−８７（微工研菌寄第
１２９５３号）を培養し、培養物からエステル分解酵素
を採取することにより製造し得る。
【０００７】本発明方法を実施するのに好ましいクレブ
シエラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８７株（微工研菌寄第
１２９５３号）は以下に示すような菌学的性質を有す
る。 A.形 態 (1) 細胞の形 桿菌 (2) 細胞の大きさ 0.4 〜0.6 μｍ×1.0 〜2.8 μｍ (3) 運動性の有無 − (4) 胞子の有無 − (5) グラム染色 − (6) 抗酸性染色 − B.各培地における生育状態 (1) 標準寒天平板培養 灰白色、光沢有り、正円、スムーズ (2) 標準寒天斜面培養 灰白色、光沢有り、ムコイド状、スム ーズ (3) 標準液体培養 全体混濁 (4) 標準ゼラチン穿刺培養 層状液化 (5) リトマスミルク 変化なし C.生理学的性質 (1) 硝硝酸塩の還元性 ＋ (2) 脱窒反応 − (3) メチルレッド試験 ＋ (4) アセチルメチルカルビノール の生成 − (5) インドールの生成 ＋ (6) 硫化水素の生成 − (7) 澱粉の加水分解 ＋ (8) クエン酸の利用 ＋ (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩：＋ アンモニウム塩：＋ (10)色素の生成 − (11)ウレアーゼ活性 ＋ (12)オキシダーゼ活性 − (13)カタラーゼ活性 ＋ (14)生育の範囲 ｐＨ 5.7 ＋ 5.0 ＋ 4.5 ＋ 4.0 − 温度 10℃＋ 37℃＋ 45℃− 50℃− (15)酸素に対する態度 通性嫌気性 (16)ジオキシアセトンの生成 − (17)馬尿酸の分解 ＋ (18)アミノ酸の分解 リジン− アルギニン− オルニチン − (19)フェニルアラニンの脱アミノ − (20)温度抵抗性（85℃、 10分） − (21)塩化ナトリウムの耐性 2.0%＋ 5.0%＋ 7.0%− 10% − (22)サブロウ寒天培地の生育 − (23)0.001%リゾチーム培地の生育 ＋ (24)チロシンの分解 − (25)クエン酸・アンモニウム寒天 でのアルカリ産生 ＋ (26)カゼインの分解性 ＋ (27)ゼラチンの分解性 ＋ (28)嫌気性培地における発育性 ＋ (29)マッコンキー培地生育性 ＋ (30)レシチナーゼ反応 ＋ (31)ＶＰ培地におけるアルカリ 産生能 − (32)糖類の利用と生酸性 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ 麦芽糖 ＋ しょ糖 ＋ 乳糖 ＋ トレハロース ＋ Ｄ−ソルビット ＋ Ｄ−マンニット ＋ イノシット ＋ グリセリン ＋ デンプン ＋ メリビオース ＋ サリシン ＋ エタノール − Ｄ−セロビオース ＋ アドニット ＋ ズルシット ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｄ−ラフィノース ＋ Ｄ−リボース ＋ (33)エスクリン加水分解 ＋ (34)グルコン酸の酸化 −
シエラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８７株（微工研菌寄第
１２９５３号）は以下に示すような菌学的性質を有す
る。 A.形 態 (1) 細胞の形 桿菌 (2) 細胞の大きさ 0.4 〜0.6 μｍ×1.0 〜2.8 μｍ (3) 運動性の有無 − (4) 胞子の有無 − (5) グラム染色 − (6) 抗酸性染色 − B.各培地における生育状態 (1) 標準寒天平板培養 灰白色、光沢有り、正円、スムーズ (2) 標準寒天斜面培養 灰白色、光沢有り、ムコイド状、スム ーズ (3) 標準液体培養 全体混濁 (4) 標準ゼラチン穿刺培養 層状液化 (5) リトマスミルク 変化なし C.生理学的性質 (1) 硝硝酸塩の還元性 ＋ (2) 脱窒反応 − (3) メチルレッド試験 ＋ (4) アセチルメチルカルビノール の生成 − (5) インドールの生成 ＋ (6) 硫化水素の生成 − (7) 澱粉の加水分解 ＋ (8) クエン酸の利用 ＋ (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩：＋ アンモニウム塩：＋ (10)色素の生成 − (11)ウレアーゼ活性 ＋ (12)オキシダーゼ活性 − (13)カタラーゼ活性 ＋ (14)生育の範囲 ｐＨ 5.7 ＋ 5.0 ＋ 4.5 ＋ 4.0 − 温度 10℃＋ 37℃＋ 45℃− 50℃− (15)酸素に対する態度 通性嫌気性 (16)ジオキシアセトンの生成 − (17)馬尿酸の分解 ＋ (18)アミノ酸の分解 リジン− アルギニン− オルニチン − (19)フェニルアラニンの脱アミノ − (20)温度抵抗性（85℃、 10分） − (21)塩化ナトリウムの耐性 2.0%＋ 5.0%＋ 7.0%− 10% − (22)サブロウ寒天培地の生育 − (23)0.001%リゾチーム培地の生育 ＋ (24)チロシンの分解 − (25)クエン酸・アンモニウム寒天 でのアルカリ産生 ＋ (26)カゼインの分解性 ＋ (27)ゼラチンの分解性 ＋ (28)嫌気性培地における発育性 ＋ (29)マッコンキー培地生育性 ＋ (30)レシチナーゼ反応 ＋ (31)ＶＰ培地におけるアルカリ 産生能 − (32)糖類の利用と生酸性 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ 麦芽糖 ＋ しょ糖 ＋ 乳糖 ＋ トレハロース ＋ Ｄ−ソルビット ＋ Ｄ−マンニット ＋ イノシット ＋ グリセリン ＋ デンプン ＋ メリビオース ＋ サリシン ＋ エタノール − Ｄ−セロビオース ＋ アドニット ＋ ズルシット ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｄ−ラフィノース ＋ Ｄ−リボース ＋ (33)エスクリン加水分解 ＋ (34)グルコン酸の酸化 −
【０００８】以上の性質を「バージェーズ・マニュアル
・オブ・システマティック・バクテリオロジー」（１９
８４年）より検索した結果、本菌株はクレブシエラ・オ
キシトカに属する菌株と同定され、クレブシエラ・オキ
シトカ ＳＮＳＭ−８７と命名した。この菌株は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２９５３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５３）として寄託されている。
・オブ・システマティック・バクテリオロジー」（１９
８４年）より検索した結果、本菌株はクレブシエラ・オ
キシトカに属する菌株と同定され、クレブシエラ・オキ
シトカ ＳＮＳＭ−８７と命名した。この菌株は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２９５３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５３）として寄託されている。
【０００９】本発明の方法の実施にあたり用い得る微生
物は、前記クレブシエラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８７
株に限られるものではなく、クレブシエラ属に属しかつ
前記エステル分解酵素Ａを生産し得る微生物であればよ
い。また、それらの生物種の天然または人為的変異株
や、該エステル分解酵素Ａ活性の発現に必要な遺伝子断
片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種で
あっても本発明に用いることができる。
物は、前記クレブシエラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８７
株に限られるものではなく、クレブシエラ属に属しかつ
前記エステル分解酵素Ａを生産し得る微生物であればよ
い。また、それらの生物種の天然または人為的変異株
や、該エステル分解酵素Ａ活性の発現に必要な遺伝子断
片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種で
あっても本発明に用いることができる。
【００１０】上記菌株クレブシエラ・オキシトカ ＳＮ
ＳＭ−８７（Klebsiella oxytocaＳＮＳＭ−８７）を用
いて高い立体選択性を有するエステル分解酵素Ａの製造
法について説明すると、本菌は栄養培地で液体培養する
ことにより該酵素を菌体内に蓄積するので、公知の方法
で、精製、乾燥することにより、酵素粉末を得ることが
できる。更に具体的に説明すると、本菌を適当な培地、
例えば適当な糖質、窒素、無機塩類と酵素生産を高める
ために、天然油脂および各種エステル化合物を含む培地
中で培養し、該酵素を蓄積せしめる。ここで糖質には、
グルコース、シュークロースなどの単・二糖類、澱粉お
よび澱粉加水分解物などが使用できる。窒素源には、酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカ
ー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が有効である。無機
塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸
第１鉄などが使用できる。培地のｐＨは４．５〜９と
し、通気攪拌培養などの好気的培養および公知の方法に
よる嫌気的培養を２０〜４０℃で１〜６日間行う。
ＳＭ−８７（Klebsiella oxytocaＳＮＳＭ−８７）を用
いて高い立体選択性を有するエステル分解酵素Ａの製造
法について説明すると、本菌は栄養培地で液体培養する
ことにより該酵素を菌体内に蓄積するので、公知の方法
で、精製、乾燥することにより、酵素粉末を得ることが
できる。更に具体的に説明すると、本菌を適当な培地、
例えば適当な糖質、窒素、無機塩類と酵素生産を高める
ために、天然油脂および各種エステル化合物を含む培地
中で培養し、該酵素を蓄積せしめる。ここで糖質には、
グルコース、シュークロースなどの単・二糖類、澱粉お
よび澱粉加水分解物などが使用できる。窒素源には、酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカ
ー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が有効である。無機
塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸
第１鉄などが使用できる。培地のｐＨは４．５〜９と
し、通気攪拌培養などの好気的培養および公知の方法に
よる嫌気的培養を２０〜４０℃で１〜６日間行う。
【００１１】上記の方法で得られた該酵素を含む培養液
から濾過または遠心分離によって菌体を集め、菌体磨
砕、自己消化、溶菌、超音波処理などの公知の方法によ
って無細胞酵素液としたのち、不溶成分を濾過または遠
心分離によって取り除き、その濾液または上澄みから、
硫酸アンモニウム塩析、あるいはアセトン、アルコール
等を用いる溶剤沈澱および限外濾過（例えば、ダイヤフ
ローメンブレンＹＣ、アミコン社製）による濃縮などの
公知の方法で酵素標品を得る。更に高度に精製された酵
素標品を得るには、イオン交換、疎水クロマト等を応用
した吸着溶出法、ゲル濾過法および電気泳動法などを用
いればよい。また酵素粉末を得るためには、真空乾燥あ
るいは真空凍結乾燥を行えばよい。
から濾過または遠心分離によって菌体を集め、菌体磨
砕、自己消化、溶菌、超音波処理などの公知の方法によ
って無細胞酵素液としたのち、不溶成分を濾過または遠
心分離によって取り除き、その濾液または上澄みから、
硫酸アンモニウム塩析、あるいはアセトン、アルコール
等を用いる溶剤沈澱および限外濾過（例えば、ダイヤフ
ローメンブレンＹＣ、アミコン社製）による濃縮などの
公知の方法で酵素標品を得る。更に高度に精製された酵
素標品を得るには、イオン交換、疎水クロマト等を応用
した吸着溶出法、ゲル濾過法および電気泳動法などを用
いればよい。また酵素粉末を得るためには、真空乾燥あ
るいは真空凍結乾燥を行えばよい。
【００１２】以下本発明のエステル分解酵素Ａの酵素学
的性質および理化学的性質について詳述する。
的性質および理化学的性質について詳述する。
【００１３】（作用）酸性−弱アルカリ条件下（ｐＨ３
〜９）でエステルの加水分解能を有する。
〜９）でエステルの加水分解能を有する。
【００１４】（力価の測定方法）０．５ｍＭ 酪酸ｐ−
ニトロフェニル水溶液１．５ｍｌに酵素溶液０．５ｍｌ
を加え、３７℃にて１０分間反応後、反応液に１ｍＭ
炭酸ナトリウム水溶液２．０ｍｌを加え、４００ｎｍに
おける吸光度を測定する。ブランクは、酵素溶液の代り
に酵素を溶解した緩衝液を用いて同様に測定する。１単
位（ｕｎｉｔ）は１分間に１μｍｏｌｅのｐ−ニトロフ
ェノールを遊離する酵素量と定義した。
ニトロフェニル水溶液１．５ｍｌに酵素溶液０．５ｍｌ
を加え、３７℃にて１０分間反応後、反応液に１ｍＭ
炭酸ナトリウム水溶液２．０ｍｌを加え、４００ｎｍに
おける吸光度を測定する。ブランクは、酵素溶液の代り
に酵素を溶解した緩衝液を用いて同様に測定する。１単
位（ｕｎｉｔ）は１分間に１μｍｏｌｅのｐ−ニトロフ
ェノールを遊離する酵素量と定義した。
【００１５】（基質特異性）直鎖型脂肪族有機酸のｐ−
ニトロフェニルエステル類を基質とした場合のエステル
分解作用を示した。直鎖型脂肪族有機酸のｐ−ニトロフ
ェニルエステル類に対するエステル分解作用を第１表に
示す。 この結果、直鎖型脂肪族有機酸のｐ−ニトロフェニルエ
ステル類を基質とした時、プロピオン酸および酪酸エス
テルに高い基質特異性を示したが、これらよりも炭素鎖
の短い有機酸のエステルおよび炭素鎖の長い有機酸のエ
ステルへの反応性は低い。特にラウリン酸より長い炭素
鎖の有機酸エステルには全く作用しない。
ニトロフェニルエステル類を基質とした場合のエステル
分解作用を示した。直鎖型脂肪族有機酸のｐ−ニトロフ
ェニルエステル類に対するエステル分解作用を第１表に
示す。 この結果、直鎖型脂肪族有機酸のｐ−ニトロフェニルエ
ステル類を基質とした時、プロピオン酸および酪酸エス
テルに高い基質特異性を示したが、これらよりも炭素鎖
の短い有機酸のエステルおよび炭素鎖の長い有機酸のエ
ステルへの反応性は低い。特にラウリン酸より長い炭素
鎖の有機酸エステルには全く作用しない。
【００１６】（至適ｐＨ）各ｐＨの Britton− Robinso
n 広域緩衝液（１／２５Ｍ（Ｈ3 ＰＯ4 , ＣＨ3ＣＯＯ
Ｈ , Ｈ3 ＢＯ3 ）−Ｎ／５ ＮａＯＨ）に０．０３単
位／ｍｌとなるようエステル分解酵素Ａを加え、活性測
定を行った。至適ｐＨでの活性を１００％としたときの
各ｐＨでの相対活性を図１に示した。この図から明らか
な如く、本発明のエステル分解酵素Ａの至適ｐＨは７〜
７．５である。
n 広域緩衝液（１／２５Ｍ（Ｈ3 ＰＯ4 , ＣＨ3ＣＯＯ
Ｈ , Ｈ3 ＢＯ3 ）−Ｎ／５ ＮａＯＨ）に０．０３単
位／ｍｌとなるようエステル分解酵素Ａを加え、活性測
定を行った。至適ｐＨでの活性を１００％としたときの
各ｐＨでの相対活性を図１に示した。この図から明らか
な如く、本発明のエステル分解酵素Ａの至適ｐＨは７〜
７．５である。
【００１７】（安定ｐＨ範囲）Britton− Robinson 広
域緩衝液（１／２５Ｍ（Ｈ3 ＰＯ4 , ＣＨ3 ＣＯＯＨ,
Ｈ3 ＢＯ3 ）−Ｎ／５ ＮａＯＨ）にエステル分解酵素
Ａを０．２単位／ｍｌになるように加え、８０℃で３０
分間インキュベートした。この処理液を０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍に希釈後、
残存活性を測定した。処理前の酵素活性を１００％と
し、各ｐＨ領域にて処理したサンプルの残存活性を相対
的に表わした。この結果を図２に示す。この図より明ら
かな如く、本発明のエステル分解酵素ＡはｐＨ４〜７．
５の範囲で安定である。
域緩衝液（１／２５Ｍ（Ｈ3 ＰＯ4 , ＣＨ3 ＣＯＯＨ,
Ｈ3 ＢＯ3 ）−Ｎ／５ ＮａＯＨ）にエステル分解酵素
Ａを０．２単位／ｍｌになるように加え、８０℃で３０
分間インキュベートした。この処理液を０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍に希釈後、
残存活性を測定した。処理前の酵素活性を１００％と
し、各ｐＨ領域にて処理したサンプルの残存活性を相対
的に表わした。この結果を図２に示す。この図より明ら
かな如く、本発明のエステル分解酵素ＡはｐＨ４〜７．
５の範囲で安定である。
【００１８】（至適温度）各温度でのエステル分解酵素
Ａの活性測定を行い、至適温度での活性を１００％とし
て各温度での活性を相対的に表わした。この結果を図３
に示す。この図より明らかな如く、本発明のエステル分
解酵素の至適温度は、６５℃である。
Ａの活性測定を行い、至適温度での活性を１００％とし
て各温度での活性を相対的に表わした。この結果を図３
に示す。この図より明らかな如く、本発明のエステル分
解酵素の至適温度は、６５℃である。
【００１９】（温度安定性）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にエステル分解酵素Ａを０．２
単位／ｍｌになるように加え、各温度で１時間熱処理し
氷冷した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）で１０倍に希釈後、残存活性を測定した。処理
前の酵素活性を１００％とし、各温度にて処理したサン
プルの残存活性を相対的に表わした。この結果を図４に
示す。この図より明らかな如く、本発明のエステル分解
酵素は７０℃の温度まで活性が維持される。
ｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にエステル分解酵素Ａを０．２
単位／ｍｌになるように加え、各温度で１時間熱処理し
氷冷した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）で１０倍に希釈後、残存活性を測定した。処理
前の酵素活性を１００％とし、各温度にて処理したサン
プルの残存活性を相対的に表わした。この結果を図４に
示す。この図より明らかな如く、本発明のエステル分解
酵素は７０℃の温度まで活性が維持される。
【００２０】（金属イオンの影響）金属イオンの酵素活
性におよぼす影響について調べた結果を第２表に示す。
各金属塩を反応時の最終濃度が２ｍＭとなるように添加
し、活性を測定した。金属塩無添加の系を対照として用
い、その活性を１００％としたときの相対値で各金属イ
オンの影響を表した。
性におよぼす影響について調べた結果を第２表に示す。
各金属塩を反応時の最終濃度が２ｍＭとなるように添加
し、活性を測定した。金属塩無添加の系を対照として用
い、その活性を１００％としたときの相対値で各金属イ
オンの影響を表した。
【００２１】
【表１】 この結果、特に強い阻害を示す金属塩はなかったが、Ｈ
ｇ，Ｐｂ，Ｓｎにより約５０％活性が阻害された。
ｇ，Ｐｂ，Ｓｎにより約５０％活性が阻害された。
【００２２】（阻害剤および活性化剤の影響）阻害剤お
よび活性化剤の酵素活性におよぼす影響について調べた
結果を第３表に示す。阻害剤および活性化剤を反応時の
最終濃度が２ｍＭとなるように添加し、活性を測定し
た。阻害剤および活性化剤無添加の系を対照として用
い、その活性を１００％としたときの相対値で阻害剤お
よび活性化剤の影響を表した。 この結果、本発明のエステル分解酵素ＡはＤＦＰおよび
ＰＭＳＦにより阻害されることから、活性中心にセリン
を有する酵素であることがわかる。また、ＳＨ基保護剤
である２−ＭＥ，ＤＴＴによる活性の上昇がみられた。
よび活性化剤の酵素活性におよぼす影響について調べた
結果を第３表に示す。阻害剤および活性化剤を反応時の
最終濃度が２ｍＭとなるように添加し、活性を測定し
た。阻害剤および活性化剤無添加の系を対照として用
い、その活性を１００％としたときの相対値で阻害剤お
よび活性化剤の影響を表した。 この結果、本発明のエステル分解酵素ＡはＤＦＰおよび
ＰＭＳＦにより阻害されることから、活性中心にセリン
を有する酵素であることがわかる。また、ＳＨ基保護剤
である２−ＭＥ，ＤＴＴによる活性の上昇がみられた。
【００２３】（分子量）Superdex ２００（ファルマシ
ア製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより、エ
ステル分解酵素Ａの分子量を測定した。このゲル濾過に
おいて、溶出液としては０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用
い、また標準蛋白としてフェリチン（Ｍｗ：４４０００
０）、カタラーゼ（Ｍｗ：２３２０００）、アルドラー
ゼ（Ｍｗ：１５８０００）、牛血清アルブミン（Ｍｗ：
６７０００）リボヌクレアーゼＡ（Ｍｗ：１３７００）
を用いた。この結果、本発明のエステル分解酵素Ａの分
子量は、約１１００００であると決定した。
ア製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより、エ
ステル分解酵素Ａの分子量を測定した。このゲル濾過に
おいて、溶出液としては０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用
い、また標準蛋白としてフェリチン（Ｍｗ：４４０００
０）、カタラーゼ（Ｍｗ：２３２０００）、アルドラー
ゼ（Ｍｗ：１５８０００）、牛血清アルブミン（Ｍｗ：
６７０００）リボヌクレアーゼＡ（Ｍｗ：１３７００）
を用いた。この結果、本発明のエステル分解酵素Ａの分
子量は、約１１００００であると決定した。
【００２４】
【実施例】以下、実施例によって本発明を更に説明する
が、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものでは
ない。
が、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものでは
ない。
【００２５】実施例 １ 可溶性デンプン１．０％、ポリペプトン０．５％、酵母
エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％ 硫酸マグネ
シウム０．０５％、塩化マンガン０．００１％、塩化カ
ルシウム０．０５％、リン酸１カリウム０．２％、硫酸
アンモニウム０．２％、ｐＨ６．０からなる培地２．５
リットルを含む３リットル容ジャーファーメンターに本
発明による菌クレブシエラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８
７を植菌し、３７℃、１２０時間、通気攪拌（４００ｒ
ｐｍ）培養後、培養液から遠心分離によって菌体を集
め、得られた菌体湿物３６ｇを超音波処理にてエステル
分解酵素Ａを抽出し、遠心分離によって不溶物を除去
し、上澄みに３５（ｗ／ｖ）％の硫酸アンモニウムを添
加、溶解し、４℃で一夜放置後、遠心分離により塩析物
を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に塩析物を溶解し、同緩衝液に対して一夜透析すること
により脱塩後、真空凍結乾燥した結果、該酵素粉末１．
１ｇを得た。
エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％ 硫酸マグネ
シウム０．０５％、塩化マンガン０．００１％、塩化カ
ルシウム０．０５％、リン酸１カリウム０．２％、硫酸
アンモニウム０．２％、ｐＨ６．０からなる培地２．５
リットルを含む３リットル容ジャーファーメンターに本
発明による菌クレブシエラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８
７を植菌し、３７℃、１２０時間、通気攪拌（４００ｒ
ｐｍ）培養後、培養液から遠心分離によって菌体を集
め、得られた菌体湿物３６ｇを超音波処理にてエステル
分解酵素Ａを抽出し、遠心分離によって不溶物を除去
し、上澄みに３５（ｗ／ｖ）％の硫酸アンモニウムを添
加、溶解し、４℃で一夜放置後、遠心分離により塩析物
を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に塩析物を溶解し、同緩衝液に対して一夜透析すること
により脱塩後、真空凍結乾燥した結果、該酵素粉末１．
１ｇを得た。
【００２６】実施例 ２ 実施例１で使用した培地２０リットルを含む３０リット
ル容ジャーファーメンターに本発明による菌クレブシエ
ラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８７を植菌し、３７℃、９
２時間、通気攪拌（３００ｒｐｍ）培養後、培養液から
遠心分離によって菌体を集め、得られた菌体湿物３９３
ｇをリン酸１カリウム５４ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ １．
５ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ２．８ｍｌ、塩化リ
ゾチーム１．２ｇ（力価）を含む液３．９リットルに分
散し、３７℃、２４ｈｒ放置することにより溶菌し、不
溶物を遠心分離によって除去し、実施例１と同様の処理
により該酵素粉末１０．８ｇを得た。
ル容ジャーファーメンターに本発明による菌クレブシエ
ラ・オキシトカ ＳＮＳＭ−８７を植菌し、３７℃、９
２時間、通気攪拌（３００ｒｐｍ）培養後、培養液から
遠心分離によって菌体を集め、得られた菌体湿物３９３
ｇをリン酸１カリウム５４ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ １．
５ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ２．８ｍｌ、塩化リ
ゾチーム１．２ｇ（力価）を含む液３．９リットルに分
散し、３７℃、２４ｈｒ放置することにより溶菌し、不
溶物を遠心分離によって除去し、実施例１と同様の処理
により該酵素粉末１０．８ｇを得た。
【００２７】実施例 ３ 実施例２で得られた酵素粉末５ｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌに溶解し、同
緩衝液に対して一夜透析し、ＤＥＡＥ−Cellulofine Ａ
−５００（チッソ株式会社製）のアニオン交換樹脂カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、０〜０．２Ｍ ＮａＣｌ
のリニアグラジェントにより溶出を行った。エステル分
解酵素Ａは０．１Ｍ ＮａＣｌ付近で溶出された。溶出
された活性画分を集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．０）に対し透析することにより脱塩後、
真空凍結乾燥した結果、該酵素粉末８００ｍｇを得た。
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌに溶解し、同
緩衝液に対して一夜透析し、ＤＥＡＥ−Cellulofine Ａ
−５００（チッソ株式会社製）のアニオン交換樹脂カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、０〜０．２Ｍ ＮａＣｌ
のリニアグラジェントにより溶出を行った。エステル分
解酵素Ａは０．１Ｍ ＮａＣｌ付近で溶出された。溶出
された活性画分を集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．０）に対し透析することにより脱塩後、
真空凍結乾燥した結果、該酵素粉末８００ｍｇを得た。
【００２８】参考例 （Ｓ）−２−（４−イソブチルフ
ェニル）プロピオン酸（Ｉｂｕ）の製造 ０．３Ｍ リン酸カリ緩衝液１００ｍｌに実施例２で得
た酵素粉末１．０ｇ、（Ｒ，Ｓ）−２−（４−イソブチ
ルフェニル）プロピオン酸エチル（ＩＢＵ−Ｅｔ）２．
３ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え（ｐＨ８．０）、３５℃
で、２４時間振とう攪拌した。反応液を遠心分離し、エ
ステルと生成した酸の混合物を反応液から採取した。こ
れに、トルエン２ｍｌ、１５（ｗ／ｖ）％炭酸ナトリウ
ム水溶液２ｍｌを加え、攪拌、分液した。水相を塩酸で
酸性にし（ｐＨ２〜５）、析出した結晶をろ取、乾燥し
光学活性（Ｓ）−ＩＢＵ ０．４１ｇを得た（収率２０
％）。ＨＰＬＣによる光学純度は９９％以上であった。 ＨＰＬＣ分析条件 カラム：ＵＬＴＲＯＮ ＥＶ−ＯＶＭ（信和化工社製） 移動相：０．０２Ｍ リン酸カリ緩衝液（ｐＨ３）／ア
セトニトリル＝９５／５ 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＵＶ，２２０ｎｍ
ェニル）プロピオン酸（Ｉｂｕ）の製造 ０．３Ｍ リン酸カリ緩衝液１００ｍｌに実施例２で得
た酵素粉末１．０ｇ、（Ｒ，Ｓ）−２−（４−イソブチ
ルフェニル）プロピオン酸エチル（ＩＢＵ−Ｅｔ）２．
３ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え（ｐＨ８．０）、３５℃
で、２４時間振とう攪拌した。反応液を遠心分離し、エ
ステルと生成した酸の混合物を反応液から採取した。こ
れに、トルエン２ｍｌ、１５（ｗ／ｖ）％炭酸ナトリウ
ム水溶液２ｍｌを加え、攪拌、分液した。水相を塩酸で
酸性にし（ｐＨ２〜５）、析出した結晶をろ取、乾燥し
光学活性（Ｓ）−ＩＢＵ ０．４１ｇを得た（収率２０
％）。ＨＰＬＣによる光学純度は９９％以上であった。 ＨＰＬＣ分析条件 カラム：ＵＬＴＲＯＮ ＥＶ−ＯＶＭ（信和化工社製） 移動相：０．０２Ｍ リン酸カリ緩衝液（ｐＨ３）／ア
セトニトリル＝９５／５ 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＵＶ，２２０ｎｍ
【００２９】
【発明の効果】本発明の新規エステル分解酵素Ａは広い
ｐＨ領域で安定であり、耐熱性にすぐれ、高い立体選択
性をもつので立体異性体の混合物の分割に用いることが
できる。また本発明によるときは、かかるエステル酵素
Ａはクレブシエラ属の微生物の培養により大量に製造す
ることができる。
ｐＨ領域で安定であり、耐熱性にすぐれ、高い立体選択
性をもつので立体異性体の混合物の分割に用いることが
できる。また本発明によるときは、かかるエステル酵素
Ａはクレブシエラ属の微生物の培養により大量に製造す
ることができる。
【図１】本発明のエステル分解酵素Ａの３７℃での各ｐ
Ｈにおける相対活性を表わすグラフ。
Ｈにおける相対活性を表わすグラフ。
【図２】本発明のエステル分解酵素Ａの８０℃での各ｐ
Ｈにおける安定性を表わすグラフ。
Ｈにおける安定性を表わすグラフ。
【図３】本発明のエステル分解酵素ＡのｐＨ８．０での
各温度における活性を表わすグラフ。
各温度における活性を表わすグラフ。
【図４】本発明のエステル分解酵素ＡのｐＨ８．０で各
温度で１時間保温後の活性を示すグラフ。
温度で１時間保温後の活性を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:22） (72)発明者 神山 俊治 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号 長瀬産業株式会社内 (72)発明者 橘 佳永 京都府福知山市長田町１丁目52番地 ナ ガセ生化学工業株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 次の理化学的性質を有する新規エステル
分解酵素Ａ． (1) 作用 酸性−弱アルカリ条件下（ｐＨ３〜９）でエステルの加
水分解能を有する。 (2) 基質特異性 直鎖型脂肪族有機酸のｐ−ニトロフェニルエステルを基
質としたとき、プロピオン酸のｐ−ニトロフェニルエス
テルに最も高い基質特異性を示す。 (3) 至適ｐＨ 酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、３７℃で反応さ
せた場合、至適ｐＨは７〜７．５である。 (4) 安定ｐＨ領域 種々のｐＨで８０℃、３０分間処理後の残存活性を酪酸
ｐ−ニトロフェニルを基質として測定した場合、ｐＨ４
〜７．５の範囲において安定であり、ｐＨ３以下および
ｐＨ１１以上では著しい失活がみられる。 (5) 至適温度 酪酸ｐ−ニトロフェニルを基質として、ｐＨ８．０で反
応させた場合、至適温度は６５℃である。 (6) 温度安定性 ｐＨ８．０、７０℃にて１時間熱処理後の残存活性を測
定した場合、１００％活性が残存する。 (7) 金属イオンの影響 Ｈｇ，Ｐｂ，Ｓｎにより約５０％活性が阻害される。 (8) 阻害剤，活性化剤の影響 ＤＦＰ，ＰＭＳＦにより特異的に活性が阻害される。ま
た、２−ＭＥ，ＤＴＴにより活性化される。 (9) 分子量 約１１００００（ゲル濾過法による） - 【請求項２】 クレブシエラ属に属し前記エステル分解
酵素Ａ生産能を有する微生物を培養し、培養物から該エ
ステル分解酵素Ａを採取することを特徴とするエステル
分解酵素Ａの製造法。 - 【請求項３】 微生物がクレブシエラ・オキシトカ（Kl
ebsiella oxytoca）ＳＮＳＭ−８７（微工研菌寄第１２
９５３号）である請求項２記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04197901A JP3093039B2 (ja) | 1992-06-30 | 1992-06-30 | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04197901A JP3093039B2 (ja) | 1992-06-30 | 1992-06-30 | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0614772A JPH0614772A (ja) | 1994-01-25 |
| JP3093039B2 true JP3093039B2 (ja) | 2000-10-03 |
Family
ID=16382168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04197901A Expired - Lifetime JP3093039B2 (ja) | 1992-06-30 | 1992-06-30 | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3093039B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6897496A (en) * | 1996-01-11 | 1997-08-01 | Thermogen, Inc. | Stable biocatalysts for ester hydrolysis |
| DE19731990A1 (de) * | 1997-07-25 | 1999-01-28 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Verfahren zur Herstellung und Identifizierung von neuen Hydrolasen mit verbesserten Eigenschaften |
| JP4592125B2 (ja) | 1998-10-05 | 2010-12-01 | 大陽日酸株式会社 | 流下液膜式凝縮蒸発器 |
-
1992
- 1992-06-30 JP JP04197901A patent/JP3093039B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0614772A (ja) | 1994-01-25 |
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