JPH0783712B2 - 新規なプロリンアシラーゼ及びその製造法 - Google Patents
新規なプロリンアシラーゼ及びその製造法Info
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- JPH0783712B2 JPH0783712B2 JP62232381A JP23238187A JPH0783712B2 JP H0783712 B2 JPH0783712 B2 JP H0783712B2 JP 62232381 A JP62232381 A JP 62232381A JP 23238187 A JP23238187 A JP 23238187A JP H0783712 B2 JPH0783712 B2 JP H0783712B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ロドトルラ属に属する菌株により生産される
プロリンアシラーゼ及びその製造方法に関するものであ
る。
プロリンアシラーゼ及びその製造方法に関するものであ
る。
（従来技術及び発明が解決しようとする問題点） 従来、N‐アシル‐L-プロリンに作用するプロリンアシ
ラーゼとしては、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に
属する微生物が生産するプロリンアシラーゼ（特開昭55
-7015）及びシュードモナス（Pseudomonas）属に属する
微生物が生産するプロリンアシラーゼ（特開昭55-7149
1）が知られているのみである。プロリンアシラーゼ
は、N‐アシル‐DL-プロリンをN‐アシル‐D-プロリン
とL-プロリンに不斉加水分解し、L-プロリンを効率よく
製造する方法に用いられる酵素であり、有用性が高い。
ラーゼとしては、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に
属する微生物が生産するプロリンアシラーゼ（特開昭55
-7015）及びシュードモナス（Pseudomonas）属に属する
微生物が生産するプロリンアシラーゼ（特開昭55-7149
1）が知られているのみである。プロリンアシラーゼ
は、N‐アシル‐DL-プロリンをN‐アシル‐D-プロリン
とL-プロリンに不斉加水分解し、L-プロリンを効率よく
製造する方法に用いられる酵素であり、有用性が高い。
そこで、本発明者らは、上記の属以外の微生物につい
て、種々検索を行った結果、ロドトルラ属に属する菌株
がプロリンアシラーゼを生産することを発見し、本発明
に至った。
て、種々検索を行った結果、ロドトルラ属に属する菌株
がプロリンアシラーゼを生産することを発見し、本発明
に至った。
（問題点を解決するための手段） すなわち本発明は、新規なプロリンアシラーゼ及びその
製造方法である。
製造方法である。
本発明者らは、プロリンアシラーゼ生産菌をスクリーン
グするために、ベンジルオキシカルボニルグリシル‐L-
プロリン（以下、Z-Gly-L-Proと略す）を窒素源として
資化できる微生物を検索したところ、ロドトルラ・ルブ
ラAHU3243がプロリンアシラーゼを生産することを発見
し、本発明に至った。
グするために、ベンジルオキシカルボニルグリシル‐L-
プロリン（以下、Z-Gly-L-Proと略す）を窒素源として
資化できる微生物を検索したところ、ロドトルラ・ルブ
ラAHU3243がプロリンアシラーゼを生産することを発見
し、本発明に至った。
次に、ロドトルラ・ルブラAHU3243により生産されるプ
ロリンアシラーゼの理化学的性質及び酵素学的性質につ
いて記述する。
ロリンアシラーゼの理化学的性質及び酵素学的性質につ
いて記述する。
作用；N ‐アシル‐L-プロリンに作用してL-プロリンと有機酸
を生じる。
を生じる。
基質特異性； L-プロリンなどイミノ酸のN‐アシル体にのみ作用し、
他のL-アミノ酸やD-アミノ酸には作用しない。アシル基
としてはベンジルオキシカルボニルグリシル基（Z-Gly
-）に最もよく作用し、アセチル基,Z基にも作用する。
他のL-アミノ酸やD-アミノ酸には作用しない。アシル基
としてはベンジルオキシカルボニルグリシル基（Z-Gly
-）に最もよく作用し、アセチル基,Z基にも作用する。
至適pH; リン酸カリウム緩衝液でpH6.0 最適温度； 50℃ 熱安定性； 60℃,10分間の熱処理で約12％の残存活性を有する。
pH安定性； pH6〜10の範囲で安定である。
阻害剤； Cu2＋イオン,PCMBによりほぼ完全に阻害される。
分子量； 560,000（ゲルろ過法による） 活性測定法； リン酸カリウム緩衝液pH6.0 25μmol,Z-Gly-L-Pro 5μm
ol及び酵素を含む500μｌの反応液中で30℃,30分間反応
させ、生成したL-プロリンをアミノ酸分析計により、測
定した。
ol及び酵素を含む500μｌの反応液中で30℃,30分間反応
させ、生成したL-プロリンをアミノ酸分析計により、測
定した。
尚、1Uは上記条件１分間に１μmolのL-プロリンの生成
を触媒する酵素量とした。
を触媒する酵素量とした。
本発明のプロリンアシラーゼは、ロドトルラ属に属する
プロリンアシラーゼ生産能を有する微生物をZ-Gly-L-Pr
o,アセチル‐L-プロリン（以下Ac-L-Proと略す），ポリ
ペプトンなどの誘導物質を含む培地中で培養し、培養物
からプロリンアシラーゼを取得することを特徴とする方
法によって製造することが出来る。
プロリンアシラーゼ生産能を有する微生物をZ-Gly-L-Pr
o,アセチル‐L-プロリン（以下Ac-L-Proと略す），ポリ
ペプトンなどの誘導物質を含む培地中で培養し、培養物
からプロリンアシラーゼを取得することを特徴とする方
法によって製造することが出来る。
本発明において使用するプロリンアシラーゼを生産する
ことのできる微生物としては、ロドトルラ属に属するす
べての菌株，突然変異株，変種を含む。それらのうち好
ましい菌株は北海道大学農学部から購入する事ができる
ロドトルラ・ルブラ（Phodotorula rubra）AHU3243であ
る。ロドトルラ・ルブラAHU3243の培養は、プロリンア
シラーゼの誘導物質を含む培地中で行われる。
ことのできる微生物としては、ロドトルラ属に属するす
べての菌株，突然変異株，変種を含む。それらのうち好
ましい菌株は北海道大学農学部から購入する事ができる
ロドトルラ・ルブラ（Phodotorula rubra）AHU3243であ
る。ロドトルラ・ルブラAHU3243の培養は、プロリンア
シラーゼの誘導物質を含む培地中で行われる。
プロリンアシラーゼの誘導物質としては、Z-Gly-L-Pro
又はAc-L-Proが特に好ましく、0.1〜1.0％の濃度で加え
るのが好ましい。誘導物質以外の培地成分としては、グ
リセリン，酵母エキス，リン酸塩，金属類，ビタミン類
などがもちいられ、培地のpHは５〜８程度が好ましい。
又はAc-L-Proが特に好ましく、0.1〜1.0％の濃度で加え
るのが好ましい。誘導物質以外の培地成分としては、グ
リセリン，酵母エキス，リン酸塩，金属類，ビタミン類
などがもちいられ、培地のpHは５〜８程度が好ましい。
培養は、通常振とう又は通気攪はん下に20〜40℃で15〜
40時間行うことによってプロリンアシラーゼが菌体中に
生産される。
40時間行うことによってプロリンアシラーゼが菌体中に
生産される。
生産されたプロリンアシラーゼの精製は、通常の方法を
組み合わせることによって行われる。例えば、培養物を
遠心分離することにより菌体を回収し、アルミナを加え
て乳鉢中で磨りつぶして無細胞抽出液を得、DEAE-トヨ
パールイオン交換クロマトグラフィー，セルロファイン
GCL-2000ゲルろ過,MonoQイオン交換クロマトグラフィ
ー，スーパーロース６ゲルろ過によって約104倍生成さ
れる。
組み合わせることによって行われる。例えば、培養物を
遠心分離することにより菌体を回収し、アルミナを加え
て乳鉢中で磨りつぶして無細胞抽出液を得、DEAE-トヨ
パールイオン交換クロマトグラフィー，セルロファイン
GCL-2000ゲルろ過,MonoQイオン交換クロマトグラフィ
ー，スーパーロース６ゲルろ過によって約104倍生成さ
れる。
以下、実施例によって詳しく説明するが本発明がこれに
限定されるものではない。
限定されるものではない。
（発明の効果） 本発明により既知の酵素に比較し、プロリダーゼ活性が
なく、Z-Gly-アミノ酸のうちZ-Gly-Proにしか作用しな
い等、より特異性が高く、又、pH安定性の高い酵素を得
ることができた。
なく、Z-Gly-アミノ酸のうちZ-Gly-Proにしか作用しな
い等、より特異性が高く、又、pH安定性の高い酵素を得
ることができた。
実施例１ プロリンアシラーゼ生産に及ぼす窒素源の影響 後に記載の培地Ａに窒素源を添加したpH5.0の培地5ml中
でロドトルラ・ルブラAHU3243を30時間培養し、その無
細胞抽出液のプロリンアシラーゼ活性を前記の測定法で
測定し、Z-Gly-Proを0.3％添加した場合の総活性を100
とした相対活性で表したところ、第１表の結果となっ
た。
でロドトルラ・ルブラAHU3243を30時間培養し、その無
細胞抽出液のプロリンアシラーゼ活性を前記の測定法で
測定し、Z-Gly-Proを0.3％添加した場合の総活性を100
とした相対活性で表したところ、第１表の結果となっ
た。
実施例２ プロリンアシラーゼのロドトルラ・ルブラAHU3243から
の精製 ロドトルラ・ルブラAHU3243をZ-Gly-L-Pro0.3％を含むp
H5の培地A2lで培養し、遠心分離により菌体を回収し
た。回収した菌体40g（湿重量）にアルミナ40g海砂20g
を加え、乳鉢中で菌体をよくすりつぶした後、後記の緩
衝液I160mlを加えて懸濁し、遠心分離した。遠心分離の
上清を緩衝液Ｉに透析して、無細胞抽出液を得た。無細
胞抽出液を緩衝液Ｉで平衡化したDEAE-トヨパールに吸
着させ、塩化カリウムの濃度勾配で溶出させ活性画分を
分取した。プロリンアシラーゼの活性画分を限外ろ過に
より濃縮後、セルロファインGCL-2000でゲルろ過した。
溶出した活性画分を濃縮後、緩衝液IIで平衡化したMono
Qに吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出させ
た。分取した活性画分を濃縮後、さらに緩衝液Ｉで平衡
化したスーパーロース６でゲルろ過した。これらの操作
により、プロリンアシラーゼの比活性は、約104倍増加
した。精製の要約を第２表に示した。
の精製 ロドトルラ・ルブラAHU3243をZ-Gly-L-Pro0.3％を含むp
H5の培地A2lで培養し、遠心分離により菌体を回収し
た。回収した菌体40g（湿重量）にアルミナ40g海砂20g
を加え、乳鉢中で菌体をよくすりつぶした後、後記の緩
衝液I160mlを加えて懸濁し、遠心分離した。遠心分離の
上清を緩衝液Ｉに透析して、無細胞抽出液を得た。無細
胞抽出液を緩衝液Ｉで平衡化したDEAE-トヨパールに吸
着させ、塩化カリウムの濃度勾配で溶出させ活性画分を
分取した。プロリンアシラーゼの活性画分を限外ろ過に
より濃縮後、セルロファインGCL-2000でゲルろ過した。
溶出した活性画分を濃縮後、緩衝液IIで平衡化したMono
Qに吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出させ
た。分取した活性画分を濃縮後、さらに緩衝液Ｉで平衡
化したスーパーロース６でゲルろ過した。これらの操作
により、プロリンアシラーゼの比活性は、約104倍増加
した。精製の要約を第２表に示した。
実施例３ プロリンアシラーゼの基質特異性 実施例２により得た精製酵素を用いて、L-プロリン含有
ペプチド及びプロリン誘導体に対する活性を測定した。
基質濃度は10mMとし、その他の反応条件は前記活性測定
方法に従った。その結果をZ-Gly-Proに対する活性を100
とした相対活性で第３表に示した。
ペプチド及びプロリン誘導体に対する活性を測定した。
基質濃度は10mMとし、その他の反応条件は前記活性測定
方法に従った。その結果をZ-Gly-Proに対する活性を100
とした相対活性で第３表に示した。
実施例４ プロリンアシラーゼ活性に及ぼす酵素阻害剤の影響 実施例３で精製した酵素のプロリンアシラーゼ活性に及
ぼす阻害剤の影響を調べた。活性の測定は、基質を除く
前記の反応液に各種阻害剤を添加し、30℃で30分間処理
した後に、基質Z-Gly-L-Proを５μmol加え、30分間反応
させて行った。阻害剤を添加しなかった場合の活性を10
0とした相対活性で第４表に示した。
ぼす阻害剤の影響を調べた。活性の測定は、基質を除く
前記の反応液に各種阻害剤を添加し、30℃で30分間処理
した後に、基質Z-Gly-L-Proを５μmol加え、30分間反応
させて行った。阻害剤を添加しなかった場合の活性を10
0とした相対活性で第４表に示した。
実施例５ プロリンアシラーゼ活性に及ぼす金属イオンの影響 実施例３で精製した酵素のプロリンアシラーゼ活性に及
ぼす金属イオンの影響を調べた。活性の測定は、基質を
除く前記の反応液に各種金属イオン2mMの濃度で添加
し、実施例４と同様にして活性を測定し、金属イオンを
添加しなかった場合の活性を100とした相対活性で第５
表に示した。
ぼす金属イオンの影響を調べた。活性の測定は、基質を
除く前記の反応液に各種金属イオン2mMの濃度で添加
し、実施例４と同様にして活性を測定し、金属イオンを
添加しなかった場合の活性を100とした相対活性で第５
表に示した。
実施例６ プロリンアシラーゼ活性に及ぼすpHの影響 実施例３で精製した酵素のプロリンアシラーゼ活性に及
ぼすpHの影響を調べた。前記した活性測定のうち、緩衝
液の種類及びpHをかえて活性を測定し、pH6.0の場合の
活性を100とした相対活性で表し、第１図に示した。但
し、pH3〜5.5は100mM酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液,pH6
〜8.5は50mMリン酸カリウム緩衝液,pH9は100mMトリス‐
塩酸緩衝液,pH11は100mMリン酸二ナトリウム‐水酸化ナ
トリウム緩衝液を使用した。
ぼすpHの影響を調べた。前記した活性測定のうち、緩衝
液の種類及びpHをかえて活性を測定し、pH6.0の場合の
活性を100とした相対活性で表し、第１図に示した。但
し、pH3〜5.5は100mM酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液,pH6
〜8.5は50mMリン酸カリウム緩衝液,pH9は100mMトリス‐
塩酸緩衝液,pH11は100mMリン酸二ナトリウム‐水酸化ナ
トリウム緩衝液を使用した。
実施例７ プロリンアシラーゼの安定性に対するpHの影響 プロリンアシラーゼのpHに対する安定性を調べた。酵素
を各種pHの緩衝液III（ブリトンとロビンソン（Britton
and Robinson）の緩衝液）中、30℃,30分間処理した
後、pH6.0の200mMリン酸カリウム緩衝液と10mM Z-Gly-L
-Proを含む反応液を加えて、30℃,30分間反応を行っ
た。pH6.0の場合の活性を100とした相対活性で表し、第
２図に示した。
を各種pHの緩衝液III（ブリトンとロビンソン（Britton
and Robinson）の緩衝液）中、30℃,30分間処理した
後、pH6.0の200mMリン酸カリウム緩衝液と10mM Z-Gly-L
-Proを含む反応液を加えて、30℃,30分間反応を行っ
た。pH6.0の場合の活性を100とした相対活性で表し、第
２図に示した。
実施例８ プロリンアシラーゼ活性に及ぼす温度の影響 プロリンアシラーゼ活性を各種温度で測定し、50℃の活
性を100とした相対活性で表し、第３図に示した。
性を100とした相対活性で表し、第３図に示した。
実施例９ プロリンアシラーゼの安定性に及ぼす温度の影響 プロリンアシラーゼの温度に対する安定性を調べた。酵
素を各種温度で10分間熱処理した後、30℃,30分間反応
させ、活性を測定し、熱処理しなかった場合の活性を10
0とした相対活性で表し、第４図に示した。
素を各種温度で10分間熱処理した後、30℃,30分間反応
させ、活性を測定し、熱処理しなかった場合の活性を10
0とした相対活性で表し、第４図に示した。
培地Ａ グリセリン １ （％W/V） 酵母エキス 0.1 KH2PO4 0.1 NaHPO4・12H2O 0.1 MgSO4・7H2O 0.05 CaCl2 １×10-3 FeCl2 １×10-3 MnCl2 １×10-3 ピリドキシン塩酸塩 ２×10-4 ニコチン酸 ２×10-4 ビオチン４×10-6 緩衝液Ｉ 10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2） 0.02％2-メルカプトエタノール 緩衝液II 50mMトリス‐塩酸緩衝液（pH7.6） 0.02％2-メルカプトエタノール 緩衝液III
第１図は、プロリンアシラーゼ活性のpH依存性をpH6.0
における活性を100とした相対活性で表したものであ
る。 第２図は、プロリンアシラーゼのpH安定性を表したもの
であり、ブリトン・ロビンソン緩衝液中において、30
℃,30分間の処理後の活性をpH6.0における活性を100と
した相対活性で表したものである。 第３図は、プロリンアシラーゼ活性の温度依存性を表し
たものであり、50℃における活性を100とした相対活性
で表した。 第４図は、プロリンアシラーゼの温度安定性を表したも
のであり、未処理の活性を100とし、各温度で10分間処
理後の活性を相対活性で表した。
における活性を100とした相対活性で表したものであ
る。 第２図は、プロリンアシラーゼのpH安定性を表したもの
であり、ブリトン・ロビンソン緩衝液中において、30
℃,30分間の処理後の活性をpH6.0における活性を100と
した相対活性で表したものである。 第３図は、プロリンアシラーゼ活性の温度依存性を表し
たものであり、50℃における活性を100とした相対活性
で表した。 第４図は、プロリンアシラーゼの温度安定性を表したも
のであり、未処理の活性を100とし、各温度で10分間処
理後の活性を相対活性で表した。
Claims (3)
- 【請求項１】次の理化学的性質を有する新規なプロリン
アシラーゼ 作用；N ‐アシル‐L-プロリンに作用してL-プロリンと有機酸
を生じる。 基質特異性； L-プロリンなどイミノ酸のアシル体にのみ作用し、他の
L-アミノ酸やD-アミノ酸には作用しない。アシル基とし
てはベンジルオキシカルボニルグリシル基（Z-Gly-）に
最もよく作用し、アセチル基,Z基にも作用する。 至適pH; リン酸カリウム緩衝液でpH6.0 最適温度； 50℃ 熱安定性； 60℃,10分間の熱処理で約12％の残存活性 pH安定性； pH6〜10の範囲で安定である。 阻害剤； Cu2＋イオン，p‐クロロ安息香酸第二水銀（以下PCMBと
略す）によりほぼ完全に阻害される。 分子量； 560,000（ゲルろ過法による） - 【請求項２】ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する菌
株を培養し、培養物からプロリンアシラーゼを取得する
ことを特徴とするプロリンアシラーゼの製造方法。 - 【請求項３】ロドトルラ属に属する菌株がロドトルラ・
ルブラ（Rhodotorula rubra）AHU3243である特許請求の
範囲第二項記載のプロリンアシラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62232381A JPH0783712B2 (ja) | 1987-09-18 | 1987-09-18 | 新規なプロリンアシラーゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62232381A JPH0783712B2 (ja) | 1987-09-18 | 1987-09-18 | 新規なプロリンアシラーゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6474987A JPS6474987A (en) | 1989-03-20 |
| JPH0783712B2 true JPH0783712B2 (ja) | 1995-09-13 |
Family
ID=16938338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62232381A Expired - Fee Related JPH0783712B2 (ja) | 1987-09-18 | 1987-09-18 | 新規なプロリンアシラーゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0783712B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5219741A (en) * | 1989-09-06 | 1993-06-15 | Degussa Ag | Method of making L-proline using an N-acyl-L-protine acylase |
| JPH03146360A (ja) * | 1989-10-31 | 1991-06-21 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | サーマルヘッド断線検知回路 |
| DE4116980A1 (de) * | 1991-05-24 | 1992-11-26 | Degussa | Verfahren zur herstellung enantiomerenreiner offenkettiger n-alkyl-l oder d-aminosaeuren |
| AU5757498A (en) * | 1996-12-16 | 1998-07-15 | Lonza A.G. | Method for production of d-proline derivatives |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5840473B2 (ja) * | 1978-06-29 | 1983-09-06 | 財団法人野田産業科学研究所 | 新規なプロリンアシラ−ゼ及びその製法 |
| JPS5571491A (en) * | 1978-11-24 | 1980-05-29 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Preparation of proline acylase |
-
1987
- 1987-09-18 JP JP62232381A patent/JPH0783712B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6474987A (en) | 1989-03-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |