JP3065758B2 - グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 - Google Patents
グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法Info
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Description
する微生物によるグリセリルホスフォリルコリンホスフ
ォジエステラーゼ(以下、GPCPと略す)の製造法に
関する。
フォリルコリンをコリンとグリセロリン酸に加水分解す
る酵素であり、酵素番号E.C.3.1.4.2 (酵素ハンドブッ
ク 第449頁、1982年、朝倉書店発行)として知ら
れ、リン脂質を構成するグリセリルホスフォリルコリン
を測定するための試薬として使用される。
セラチア属の微生物と動物組織(ラット脳)にその存在
が知られているが(J. Biol. Chem. 206, 647 (1954),
Biochim. Biophys. Acta380, 436 (1975))、その含量
は低く試薬としては実用的でなく、GPCPの良好な製
造法を提供するものである。
ム属に属するGPCP生産菌を培地に培養し、その培養
物からGPCPを採取することを特徴とするGPCPの
製造法に関する。本発明に使用する菌株はグリオクラジ
ウム属に属し、GPCP生産能を有する微生物であれば
いずれの微生物でもよく、グリオクラジウム属に属する
微生物、具体的には静岡県田方郡函南町の水田土壌から
採取したグリオクラジウム ロゼウム(Gliocla
dium roseum M4664)(FERM P
−6055)が例示される。
る。 <各培地における生育状態> 1)ツアペック寒天培地 生育はやや速く、26℃1週間で40〜45mmに達す
る。培養初期は白色で2週間を過ぎ分生子が成熟すると
次第にライトアプリコット(Lt Apricot(h
ue 4ea))となる。周辺部に近い部分は平坦であ
るが中心に近い部分は綿毛状でやや盛り上がる。周辺部
は滑らか。裏面の色はペールイエロー(Pale Ye
llow(hue 1ca))〜ライトメロンイエロー
(LtMelon Yellow(hue 3e
a))。浸出液および拡散性色素は出さない。
同じである。裏面の色はレモンイエロー(hue 1l
a)。
同じである。 <生理的性状> 生育し得る温度 : 8〜34℃ 最適生育温度 : 22〜28℃ 生育し得るpH : 3〜11 最適生育pH : 4〜8 <顕微鏡下における形態的特色>分生子柄は気菌糸また
は菌糸の束から直角に発達する。時に分岐し隔壁を有す
る。40〜150×2.5〜3μm。ペニシリは不規則
に交互または輪生状に生ずる。40〜120×2.5〜
3μm。分生子形成様式はフィアロフォア型である。フ
ィアライドは単生、互生または輪生し20〜30×2〜
2.5μm。分生子は楕円形、5〜10×2〜4μm。
淡黄色〜淡黄褐色、壁は滑面でフィアライドの先端に直
径10〜20μmの擬頭状の胞子塊となって形成され
る。
ク系統であり、分生子はフォアロフォア型で形成され、
フィアライドは単生、互生または輪生し比較的細く長い
ことからグリオクラジウム属(Gliocladiu
m)属に属する。グリオクラジウム属は現在約20種類
存在し、集落の色は白色、ピンク、緑色系統に分けられ
るが、ピンク系統はグリオクラジウム ロゼウム(Gl
iocladium roseum)とグリオクラジウ
ム バーモセニ(Gliocladium vermo
seni)の2種のみである。G.roseumは分生
子が擬頭状(ポール状)にG.vermoseniは鎖
状(チェイン状)に形成される。本菌株は分生子が擬頭
状に形成され、分生子の形、サイズもGlioclad
ium roseumによく一致するのでGliocl
adium roseum M4664と同定し、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第6055号
(FERM P−6055)として寄託した。
素源、無機物源等を程よく含有する培地が用いられる。
炭素源としてはグルコース、フルクトース、キシロー
ス、マルトース、グリセロールなどが使用される。窒素
源としてはフスマ、脱脂大豆粉、綿実粉、カゼイン、カ
ザミノ酸、麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス等の天然窒素源の他に硫安、塩化アンモニウム等の無
機窒素源を用いることができる。この他、無機物として
食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第二カ
リウムなどを必要に応じて使用する。培養温度は菌が発
育し、GPCPを生産する範囲内で適宜変更し得るが、
10〜30℃、好ましくは26〜28℃とする。培地の
pHはpH4〜11、好ましくはpH5〜7とする。
産する通常の培養方法を用いればよい。培養形態として
は液体培養でも固体培養でもよく、工業的にはGPCP
生産菌体をその生産用培地に接種し、通気攪拌培養を行
うのが好ましい。培養時間は条件によって異なるが、通
常40〜80時間程度であってGPCPが最高力価に達
する時期を見計らって培養を終了する。
ており培養液を濾過することにより粗酵素液として得る
ことができる。粗GPCP液から公知の蛋白質や酵素等
の単離、精製手段を用いて精製GPCPを得ることがで
きる。例えば、粗製GPCP液にアセトン、エタノー
ル、メタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫
安、食塩などによる塩析法などを適用してGPCPを沈
澱させ、回収する。さらにこの沈澱物を必要に応じ透
析、等電点沈澱に付した後、電気泳動法などで単一のバ
ンドを示すまでイオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体など
を用いるカラムクロマトグラフィー等により精製する。
カラムクロマトグラフィーによる精製は例えば上記の沈
澱物を透析後、リン酸緩衝液などに溶解し、これをジエ
チルアミノエチルデキストランゲル、ジエチルアミノエ
チルセルロース、トリエチルアミノエチルデキストラン
ゲル、ポリアクリルアミドゲルなどのゲル濾過剤による
クロマトグラフィーに付すことにより行う。前記精製手
段は適宜組合せて行うことができ、精製後適宜安定化剤
を添加して凍結乾燥等の手段によりGPCP粉末を得る
ことができる。
性質について説明する。これに関し、GPCPの活性は
以下のようにして測定した。 <GPCP酵素活性測定方法>0.2Mトリス−塩酸緩
衝液(pH8.0)0.1ml、10mMグリセリルホ
スフォリルコリン0.05ml、10mM塩化カルシウ
ム0.05ml、精製水0.3mlを含む反応液0.5
mlを37℃で5分間予備加温後0.05mlの酵素液
を添加し、37℃で10分間反応させる。しかる後、
0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)0.1m
l、0.1M EDTA0.2ml、0.3%4−アミ
ノアンチピリン0.1ml、0.2%フェノール0.1
ml、コリンオキシダーゼ(60U/ml)0.1m
l、ペルオキシダーゼ(50U/ml)0.1ml、精
製水0.3mlからなる発色液1mlを加え37℃で2
0分間反応を行い500nmの吸光度を測定した。酵素
活性1単位は37℃で1分間1マイクロモルのコリンを
遊離する酵素活性とし、以下の計算式で求めた。
ォリルエタノールアミンを基質にして生成するグリセロ
リン酸(Glycerophosphate)を酵素活性測定方法のコリ
ンオキシダーゼの代わりにグリセロリン酸オキシダーゼ
を用いて測定した。その結果を表1に示した。
泳動) (4)Km値 0.1mM (グリセリルホスフォリルコリンに対し
て) (5)分子量 135,000±10,000(スーパーロース12に
よるゲル濾過法)
で、その結果を図1に示した。pH6〜7(○−○)は
ジメチルグルタル酸緩衝液、pH7〜8(●−●)はリ
ン酸緩衝液、pH7.5〜9(△−△)はトリス−塩酸
緩衝液、pH9〜10はグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液を使用した場合の活性値を示すもので、本酵素の至
適作用pHは8〜9付近であると認められた。
10U/ml)を37℃で1時間加温し、残存活性を測
定した。その結果を図2に示した。pH4.5〜7(○
−○)はジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝
液、pH7.5〜9.5(●−●)はトリス−塩酸緩衝
液を使用した。少なくともpH7〜9で良好な安定性を
示した。
GPCP(10U/ml)を各温度で10分間加温し、
残存活性を求めた。その結果、図3に示したように50
℃まで安定であった。
果、表2に示したようにマンガン、バリウム、コバル
ト、銅、ニッケルイオンにより阻害された。
細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるも
のではない。
塩0.2%、リン酸二カリウム0.1%、硫酸マグネシ
ウム0.05%からなる培地100mlにグリオクラジ
ウム ロゼウム M4664(FERM P−605
5)をスラントから一白金耳移植し、26℃で3日間振
盪培養を行い種菌を得た。ついで種菌を上記と同一組成
よりなる培地(但し、消泡剤ディスフォームCA−22
0)20リットルを含有する30リットル容ジャーファ
メンターに移植し本培養を行った。26℃、300回
転、1分間20リットルの通気量という好気的な条件で
培養を行った。86時間後に培養濾液中のGPCP活性
は最大(0.15U/ml)に達した。
4リットルの培養濾液を得た。粗酵素液を2リットルま
で減圧濃縮し3リットルの冷アセトンを加え、酵素蛋白
を沈澱させ、次いで500mlの10mMトリス−塩酸
緩衝液(pH7.5)に溶解した。15,000回転、
10分間の遠心分離により不溶物を除き、澄明な上清4
60mlを得た。これに530mlの飽和硫安溶液を加
え、生じた沈澱を15,000回転、20分間の遠心分
離により集め、250mlの10mMトリス−塩酸緩衝
液(pH7.5)に溶解後、10リットルの同緩衝液に
対して5℃で20時間透析、脱塩を行い、精製酵素液を
得た。本精製酵素液を凍結乾燥し、1.8グラム(44
0U/g)の精製酵素を得た。
酵素を分泌し、容易に該酵素を精製することができ、G
PCPを安定かつ大量に供給することが可能となった。
は、本発明のGPCPのpH安定性を示す。第3図は、
本発明のGPCPの熱安定性を示す。
Claims (2)
- 【請求項1】 グリオクラジウム属に属するグリセリル
ホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼ生産菌を培
地に培養し、その培養物よりグリセリルホスフォリルコ
リンホスフォジエステラーゼを採取することを特徴とす
るグリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラー
ゼの製造法。 - 【請求項2】 グリオクラジウム属に属するグリセリル
ホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼ生産菌が、
グリオクラジウム ロゼウム M4664(FERM
P−6055)である請求項第1項記載の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3357284A JP3065758B2 (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3357284A JP3065758B2 (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05168477A JPH05168477A (ja) | 1993-07-02 |
JP3065758B2 true JP3065758B2 (ja) | 2000-07-17 |
Family
ID=18453334
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3357284A Expired - Lifetime JP3065758B2 (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3065758B2 (ja) |
-
1991
- 1991-12-25 JP JP3357284A patent/JP3065758B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05168477A (ja) | 1993-07-02 |
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