JP3065758B2 - グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 - Google Patents
グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法Info
- Publication number
- JP3065758B2 JP3065758B2 JP3357284A JP35728491A JP3065758B2 JP 3065758 B2 JP3065758 B2 JP 3065758B2 JP 3357284 A JP3357284 A JP 3357284A JP 35728491 A JP35728491 A JP 35728491A JP 3065758 B2 JP3065758 B2 JP 3065758B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gpcp
- phosphodiesterase
- glycerylphosphorylcholine
- producing
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はグリオクラジウム属に属
する微生物によるグリセリルホスフォリルコリンホスフ
ォジエステラーゼ（以下、ＧＰＣＰと略す）の製造法に
関する。
する微生物によるグリセリルホスフォリルコリンホスフ
ォジエステラーゼ（以下、ＧＰＣＰと略す）の製造法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ＧＰＣＰは少なくとも、グリセリルホス
フォリルコリンをコリンとグリセロリン酸に加水分解す
る酵素であり、酵素番号E.C.3.1.4.2 （酵素ハンドブッ
ク 第４４９頁、1982年、朝倉書店発行）として知ら
れ、リン脂質を構成するグリセリルホスフォリルコリン
を測定するための試薬として使用される。
フォリルコリンをコリンとグリセロリン酸に加水分解す
る酵素であり、酵素番号E.C.3.1.4.2 （酵素ハンドブッ
ク 第４４９頁、1982年、朝倉書店発行）として知ら
れ、リン脂質を構成するグリセリルホスフォリルコリン
を測定するための試薬として使用される。
【０００３】
【発明の解決しようとする課題】従来より、ＧＰＣＰは
セラチア属の微生物と動物組織（ラット脳）にその存在
が知られているが（J. Biol. Chem. 206, 647 (1954),
Biochim. Biophys. Acta380, 436 (1975)）、その含量
は低く試薬としては実用的でなく、ＧＰＣＰの良好な製
造法を提供するものである。
セラチア属の微生物と動物組織（ラット脳）にその存在
が知られているが（J. Biol. Chem. 206, 647 (1954),
Biochim. Biophys. Acta380, 436 (1975)）、その含量
は低く試薬としては実用的でなく、ＧＰＣＰの良好な製
造法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明はグリオクラジウ
ム属に属するＧＰＣＰ生産菌を培地に培養し、その培養
物からＧＰＣＰを採取することを特徴とするＧＰＣＰの
製造法に関する。本発明に使用する菌株はグリオクラジ
ウム属に属し、ＧＰＣＰ生産能を有する微生物であれば
いずれの微生物でもよく、グリオクラジウム属に属する
微生物、具体的には静岡県田方郡函南町の水田土壌から
採取したグリオクラジウム ロゼウム（Ｇｌｉｏｃｌａ
ｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ Ｍ４６６４）（ＦＥＲＭ Ｐ
−６０５５）が例示される。
ム属に属するＧＰＣＰ生産菌を培地に培養し、その培養
物からＧＰＣＰを採取することを特徴とするＧＰＣＰの
製造法に関する。本発明に使用する菌株はグリオクラジ
ウム属に属し、ＧＰＣＰ生産能を有する微生物であれば
いずれの微生物でもよく、グリオクラジウム属に属する
微生物、具体的には静岡県田方郡函南町の水田土壌から
採取したグリオクラジウム ロゼウム（Ｇｌｉｏｃｌａ
ｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ Ｍ４６６４）（ＦＥＲＭ Ｐ
−６０５５）が例示される。
【０００５】次に本菌株の菌学的性質について記述す
る。 ＜各培地における生育状態＞ １）ツアペック寒天培地 生育はやや速く、２６℃１週間で４０〜４５ｍｍに達す
る。培養初期は白色で２週間を過ぎ分生子が成熟すると
次第にライトアプリコット（Ｌｔ Ａｐｒｉｃｏｔ（ｈ
ｕｅ ４ｅａ））となる。周辺部に近い部分は平坦であ
るが中心に近い部分は綿毛状でやや盛り上がる。周辺部
は滑らか。裏面の色はペールイエロー（Ｐａｌｅ Ｙｅ
ｌｌｏｗ（ｈｕｅ １ｃａ））〜ライトメロンイエロー
（ＬｔＭｅｌｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ（ｈｕｅ ３ｅ
ａ））。浸出液および拡散性色素は出さない。
る。 ＜各培地における生育状態＞ １）ツアペック寒天培地 生育はやや速く、２６℃１週間で４０〜４５ｍｍに達す
る。培養初期は白色で２週間を過ぎ分生子が成熟すると
次第にライトアプリコット（Ｌｔ Ａｐｒｉｃｏｔ（ｈ
ｕｅ ４ｅａ））となる。周辺部に近い部分は平坦であ
るが中心に近い部分は綿毛状でやや盛り上がる。周辺部
は滑らか。裏面の色はペールイエロー（Ｐａｌｅ Ｙｅ
ｌｌｏｗ（ｈｕｅ １ｃａ））〜ライトメロンイエロー
（ＬｔＭｅｌｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ（ｈｕｅ ３ｅ
ａ））。浸出液および拡散性色素は出さない。
【０００６】２）麦芽汁寒天培地 本培地での生育状態はツアペック寒天培地の場合と殆ど
同じである。裏面の色はレモンイエロー（ｈｕｅ １ｌ
ａ）。
同じである。裏面の色はレモンイエロー（ｈｕｅ １ｌ
ａ）。
【０００７】３）バレイショ・ブドウ糖寒天培地 本培地での生育状態はツアペック寒天培地の場合と全く
同じである。 ＜生理的性状＞ 生育し得る温度 ： ８〜３４℃ 最適生育温度 ： ２２〜２８℃ 生育し得るｐＨ ： ３〜１１ 最適生育ｐＨ ： ４〜８ ＜顕微鏡下における形態的特色＞分生子柄は気菌糸また
は菌糸の束から直角に発達する。時に分岐し隔壁を有す
る。４０〜１５０×２．５〜３μｍ。ペニシリは不規則
に交互または輪生状に生ずる。４０〜１２０×２．５〜
３μｍ。分生子形成様式はフィアロフォア型である。フ
ィアライドは単生、互生または輪生し２０〜３０×２〜
２．５μｍ。分生子は楕円形、５〜１０×２〜４μｍ。
淡黄色〜淡黄褐色、壁は滑面でフィアライドの先端に直
径１０〜２０μｍの擬頭状の胞子塊となって形成され
る。
同じである。 ＜生理的性状＞ 生育し得る温度 ： ８〜３４℃ 最適生育温度 ： ２２〜２８℃ 生育し得るｐＨ ： ３〜１１ 最適生育ｐＨ ： ４〜８ ＜顕微鏡下における形態的特色＞分生子柄は気菌糸また
は菌糸の束から直角に発達する。時に分岐し隔壁を有す
る。４０〜１５０×２．５〜３μｍ。ペニシリは不規則
に交互または輪生状に生ずる。４０〜１２０×２．５〜
３μｍ。分生子形成様式はフィアロフォア型である。フ
ィアライドは単生、互生または輪生し２０〜３０×２〜
２．５μｍ。分生子は楕円形、５〜１０×２〜４μｍ。
淡黄色〜淡黄褐色、壁は滑面でフィアライドの先端に直
径１０〜２０μｍの擬頭状の胞子塊となって形成され
る。
【０００８】以上述べたように本菌株は集落の色がピン
ク系統であり、分生子はフォアロフォア型で形成され、
フィアライドは単生、互生または輪生し比較的細く長い
ことからグリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕ
ｍ）属に属する。グリオクラジウム属は現在約２０種類
存在し、集落の色は白色、ピンク、緑色系統に分けられ
るが、ピンク系統はグリオクラジウム ロゼウム（Ｇｌ
ｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）とグリオクラジウ
ム バーモセニ（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｖｅｒｍｏ
ｓｅｎｉ）の２種のみである。Ｇ．ｒｏｓｅｕｍは分生
子が擬頭状（ポール状）にＧ．ｖｅｒｍｏｓｅｎｉは鎖
状（チェイン状）に形成される。本菌株は分生子が擬頭
状に形成され、分生子の形、サイズもＧｌｉｏｃｌａｄ
ｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍによく一致するのでＧｌｉｏｃｌ
ａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ Ｍ４６６４と同定し、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第６０５５号
（ＦＥＲＭ Ｐ−６０５５）として寄託した。
ク系統であり、分生子はフォアロフォア型で形成され、
フィアライドは単生、互生または輪生し比較的細く長い
ことからグリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕ
ｍ）属に属する。グリオクラジウム属は現在約２０種類
存在し、集落の色は白色、ピンク、緑色系統に分けられ
るが、ピンク系統はグリオクラジウム ロゼウム（Ｇｌ
ｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）とグリオクラジウ
ム バーモセニ（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｖｅｒｍｏ
ｓｅｎｉ）の２種のみである。Ｇ．ｒｏｓｅｕｍは分生
子が擬頭状（ポール状）にＧ．ｖｅｒｍｏｓｅｎｉは鎖
状（チェイン状）に形成される。本菌株は分生子が擬頭
状に形成され、分生子の形、サイズもＧｌｉｏｃｌａｄ
ｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍによく一致するのでＧｌｉｏｃｌ
ａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ Ｍ４６６４と同定し、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第６０５５号
（ＦＥＲＭ Ｐ−６０５５）として寄託した。
【０００９】本発明に使用する培地としては炭素源、窒
素源、無機物源等を程よく含有する培地が用いられる。
炭素源としてはグルコース、フルクトース、キシロー
ス、マルトース、グリセロールなどが使用される。窒素
源としてはフスマ、脱脂大豆粉、綿実粉、カゼイン、カ
ザミノ酸、麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス等の天然窒素源の他に硫安、塩化アンモニウム等の無
機窒素源を用いることができる。この他、無機物として
食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第二カ
リウムなどを必要に応じて使用する。培養温度は菌が発
育し、ＧＰＣＰを生産する範囲内で適宜変更し得るが、
１０〜３０℃、好ましくは２６〜２８℃とする。培地の
ｐＨはｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ５〜７とする。
素源、無機物源等を程よく含有する培地が用いられる。
炭素源としてはグルコース、フルクトース、キシロー
ス、マルトース、グリセロールなどが使用される。窒素
源としてはフスマ、脱脂大豆粉、綿実粉、カゼイン、カ
ザミノ酸、麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス等の天然窒素源の他に硫安、塩化アンモニウム等の無
機窒素源を用いることができる。この他、無機物として
食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第二カ
リウムなどを必要に応じて使用する。培養温度は菌が発
育し、ＧＰＣＰを生産する範囲内で適宜変更し得るが、
１０〜３０℃、好ましくは２６〜２８℃とする。培地の
ｐＨはｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ５〜７とする。
【００１０】培養方法としては抗生物質、酵素などを生
産する通常の培養方法を用いればよい。培養形態として
は液体培養でも固体培養でもよく、工業的にはＧＰＣＰ
生産菌体をその生産用培地に接種し、通気攪拌培養を行
うのが好ましい。培養時間は条件によって異なるが、通
常４０〜８０時間程度であってＧＰＣＰが最高力価に達
する時期を見計らって培養を終了する。
産する通常の培養方法を用いればよい。培養形態として
は液体培養でも固体培養でもよく、工業的にはＧＰＣＰ
生産菌体をその生産用培地に接種し、通気攪拌培養を行
うのが好ましい。培養時間は条件によって異なるが、通
常４０〜８０時間程度であってＧＰＣＰが最高力価に達
する時期を見計らって培養を終了する。
【００１１】ＧＰＣＰは、主として培養濾液に含有され
ており培養液を濾過することにより粗酵素液として得る
ことができる。粗ＧＰＣＰ液から公知の蛋白質や酵素等
の単離、精製手段を用いて精製ＧＰＣＰを得ることがで
きる。例えば、粗製ＧＰＣＰ液にアセトン、エタノー
ル、メタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫
安、食塩などによる塩析法などを適用してＧＰＣＰを沈
澱させ、回収する。さらにこの沈澱物を必要に応じ透
析、等電点沈澱に付した後、電気泳動法などで単一のバ
ンドを示すまでイオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体など
を用いるカラムクロマトグラフィー等により精製する。
カラムクロマトグラフィーによる精製は例えば上記の沈
澱物を透析後、リン酸緩衝液などに溶解し、これをジエ
チルアミノエチルデキストランゲル、ジエチルアミノエ
チルセルロース、トリエチルアミノエチルデキストラン
ゲル、ポリアクリルアミドゲルなどのゲル濾過剤による
クロマトグラフィーに付すことにより行う。前記精製手
段は適宜組合せて行うことができ、精製後適宜安定化剤
を添加して凍結乾燥等の手段によりＧＰＣＰ粉末を得る
ことができる。
ており培養液を濾過することにより粗酵素液として得る
ことができる。粗ＧＰＣＰ液から公知の蛋白質や酵素等
の単離、精製手段を用いて精製ＧＰＣＰを得ることがで
きる。例えば、粗製ＧＰＣＰ液にアセトン、エタノー
ル、メタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫
安、食塩などによる塩析法などを適用してＧＰＣＰを沈
澱させ、回収する。さらにこの沈澱物を必要に応じ透
析、等電点沈澱に付した後、電気泳動法などで単一のバ
ンドを示すまでイオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体など
を用いるカラムクロマトグラフィー等により精製する。
カラムクロマトグラフィーによる精製は例えば上記の沈
澱物を透析後、リン酸緩衝液などに溶解し、これをジエ
チルアミノエチルデキストランゲル、ジエチルアミノエ
チルセルロース、トリエチルアミノエチルデキストラン
ゲル、ポリアクリルアミドゲルなどのゲル濾過剤による
クロマトグラフィーに付すことにより行う。前記精製手
段は適宜組合せて行うことができ、精製後適宜安定化剤
を添加して凍結乾燥等の手段によりＧＰＣＰ粉末を得る
ことができる。
【００１２】次に本発明で得られるＧＰＣＰの理化学的
性質について説明する。これに関し、ＧＰＣＰの活性は
以下のようにして測定した。 ＜ＧＰＣＰ酵素活性測定方法＞０．２Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌ、１０ｍＭグリセリルホ
スフォリルコリン０．０５ｍｌ、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム０．０５ｍｌ、精製水０．３ｍｌを含む反応液０．５
ｍｌを３７℃で５分間予備加温後０．０５ｍｌの酵素液
を添加し、３７℃で１０分間反応させる。しかる後、
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍ
ｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ０．２ｍｌ、０．３％４−アミ
ノアンチピリン０．１ｍｌ、０．２％フェノール０．１
ｍｌ、コリンオキシダーゼ（６０Ｕ／ｍｌ）０．１ｍ
ｌ、ペルオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）０．１ｍｌ、精
製水０．３ｍｌからなる発色液１ｍｌを加え３７℃で２
０分間反応を行い５００ｎｍの吸光度を測定した。酵素
活性１単位は３７℃で１分間１マイクロモルのコリンを
遊離する酵素活性とし、以下の計算式で求めた。
性質について説明する。これに関し、ＧＰＣＰの活性は
以下のようにして測定した。 ＜ＧＰＣＰ酵素活性測定方法＞０．２Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌ、１０ｍＭグリセリルホ
スフォリルコリン０．０５ｍｌ、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム０．０５ｍｌ、精製水０．３ｍｌを含む反応液０．５
ｍｌを３７℃で５分間予備加温後０．０５ｍｌの酵素液
を添加し、３７℃で１０分間反応させる。しかる後、
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍ
ｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ０．２ｍｌ、０．３％４−アミ
ノアンチピリン０．１ｍｌ、０．２％フェノール０．１
ｍｌ、コリンオキシダーゼ（６０Ｕ／ｍｌ）０．１ｍ
ｌ、ペルオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）０．１ｍｌ、精
製水０．３ｍｌからなる発色液１ｍｌを加え３７℃で２
０分間反応を行い５００ｎｍの吸光度を測定した。酵素
活性１単位は３７℃で１分間１マイクロモルのコリンを
遊離する酵素活性とし、以下の計算式で求めた。
【００１３】
【００１４】＜酵素の理化学的性質＞ （１）作用特異性 ＧＰＣＰは以下の加水分解反応を触媒する。 Glycerylphosphorylcholine ＋ H2 O → Glycerophosphate + Choline または Glycerylphosphorylethanolamine + H2 O → Glycerophosphate + Ethanol- amine
【００１５】（２）基質特異性 グリセリルホスフォリルコリンまたはグリセリルホスフ
ォリルエタノールアミンを基質にして生成するグリセロ
リン酸（Glycerophosphate）を酵素活性測定方法のコリ
ンオキシダーゼの代わりにグリセロリン酸オキシダーゼ
を用いて測定した。その結果を表１に示した。
ォリルエタノールアミンを基質にして生成するグリセロ
リン酸（Glycerophosphate）を酵素活性測定方法のコリ
ンオキシダーゼの代わりにグリセロリン酸オキシダーゼ
を用いて測定した。その結果を表１に示した。
【００１６】
【表１】
【００１７】（３）等電点 ｐＨ３．７５（キャリア・アンフォライトを用いた電気
泳動） （４）Ｋｍ値 ０．１ｍＭ （グリセリルホスフォリルコリンに対し
て） （５）分子量 １３５，０００±１０，０００（スーパーロース１２に
よるゲル濾過法）
泳動） （４）Ｋｍ値 ０．１ｍＭ （グリセリルホスフォリルコリンに対し
て） （５）分子量 １３５，０００±１０，０００（スーパーロース１２に
よるゲル濾過法）
【００１８】（６）至適ｐＨ 前記酵素活性測定方法に従って至適ｐＨを求めたもの
で、その結果を図１に示した。ｐＨ６〜７（○−○）は
ジメチルグルタル酸緩衝液、ｐＨ７〜８（●−●）はリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９（△−△）はトリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９〜１０はグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液を使用した場合の活性値を示すもので、本酵素の至
適作用ｐＨは８〜９付近であると認められた。
で、その結果を図１に示した。ｐＨ６〜７（○−○）は
ジメチルグルタル酸緩衝液、ｐＨ７〜８（●−●）はリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９（△−△）はトリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９〜１０はグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液を使用した場合の活性値を示すもので、本酵素の至
適作用ｐＨは８〜９付近であると認められた。
【００１９】（７）ｐＨ安定性 ０．１Ｍ各種緩衝液に溶解した酵素液（ＧＰＣＰ濃度：
１０Ｕ／ｍｌ）を３７℃で１時間加温し、残存活性を測
定した。その結果を図２に示した。ｐＨ４．５〜７（○
−○）はジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．５〜９．５（●−●）はトリス−塩酸緩衝
液を使用した。少なくともｐＨ７〜９で良好な安定性を
示した。
１０Ｕ／ｍｌ）を３７℃で１時間加温し、残存活性を測
定した。その結果を図２に示した。ｐＨ４．５〜７（○
−○）はジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．５〜９．５（●−●）はトリス−塩酸緩衝
液を使用した。少なくともｐＨ７〜９で良好な安定性を
示した。
【００２０】（８）熱安定性 １０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した
ＧＰＣＰ（１０Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間加温し、
残存活性を求めた。その結果、図３に示したように５０
℃まで安定であった。
ＧＰＣＰ（１０Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間加温し、
残存活性を求めた。その結果、図３に示したように５０
℃まで安定であった。
【００２１】（９）金属イオンの影響 種々の金属イオン等の酵素活性に及ぼす影響を調べた結
果、表２に示したようにマンガン、バリウム、コバル
ト、銅、ニッケルイオンにより阻害された。
果、表２に示したようにマンガン、バリウム、コバル
ト、銅、ニッケルイオンにより阻害された。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【実施例】以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに詳
細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるも
のではない。
細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるも
のではない。
【００２４】実施例１ 脱脂大豆粉１％、グルコース１％、馬鈴薯澱粉１％、食
塩０．２％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム０．０５％からなる培地１００ｍｌにグリオクラジ
ウム ロゼウム Ｍ４６６４（ＦＥＲＭ Ｐ−６０５
５）をスラントから一白金耳移植し、２６℃で３日間振
盪培養を行い種菌を得た。ついで種菌を上記と同一組成
よりなる培地（但し、消泡剤ディスフォームＣＡ−２２
０）２０リットルを含有する３０リットル容ジャーファ
メンターに移植し本培養を行った。２６℃、３００回
転、１分間２０リットルの通気量という好気的な条件で
培養を行った。８６時間後に培養濾液中のＧＰＣＰ活性
は最大（０．１５Ｕ／ｍｌ）に達した。
塩０．２％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム０．０５％からなる培地１００ｍｌにグリオクラジ
ウム ロゼウム Ｍ４６６４（ＦＥＲＭ Ｐ−６０５
５）をスラントから一白金耳移植し、２６℃で３日間振
盪培養を行い種菌を得た。ついで種菌を上記と同一組成
よりなる培地（但し、消泡剤ディスフォームＣＡ−２２
０）２０リットルを含有する３０リットル容ジャーファ
メンターに移植し本培養を行った。２６℃、３００回
転、１分間２０リットルの通気量という好気的な条件で
培養を行った。８６時間後に培養濾液中のＧＰＣＰ活性
は最大（０．１５Ｕ／ｍｌ）に達した。
【００２５】実施例２ 実施例１で得られた培養物を濾布で遠心濾過を行い、１
４リットルの培養濾液を得た。粗酵素液を２リットルま
で減圧濃縮し３リットルの冷アセトンを加え、酵素蛋白
を沈澱させ、次いで５００ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。１５，０００回転、
１０分間の遠心分離により不溶物を除き、澄明な上清４
６０ｍｌを得た。これに５３０ｍｌの飽和硫安溶液を加
え、生じた沈澱を１５，０００回転、２０分間の遠心分
離により集め、２５０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）に溶解後、１０リットルの同緩衝液に
対して５℃で２０時間透析、脱塩を行い、精製酵素液を
得た。本精製酵素液を凍結乾燥し、１．８グラム（４４
０Ｕ／ｇ）の精製酵素を得た。
４リットルの培養濾液を得た。粗酵素液を２リットルま
で減圧濃縮し３リットルの冷アセトンを加え、酵素蛋白
を沈澱させ、次いで５００ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。１５，０００回転、
１０分間の遠心分離により不溶物を除き、澄明な上清４
６０ｍｌを得た。これに５３０ｍｌの飽和硫安溶液を加
え、生じた沈澱を１５，０００回転、２０分間の遠心分
離により集め、２５０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）に溶解後、１０リットルの同緩衝液に
対して５℃で２０時間透析、脱塩を行い、精製酵素液を
得た。本精製酵素液を凍結乾燥し、１．８グラム（４４
０Ｕ／ｇ）の精製酵素を得た。
【００２６】
【発明の効果】本発明のＧＰＣＰ生産菌は、培地中に該
酵素を分泌し、容易に該酵素を精製することができ、Ｇ
ＰＣＰを安定かつ大量に供給することが可能となった。
酵素を分泌し、容易に該酵素を精製することができ、Ｇ
ＰＣＰを安定かつ大量に供給することが可能となった。
【００２７】
第１図は、本発明のＧＰＣＰの至適ｐＨを示す。第２図
は、本発明のＧＰＣＰのｐＨ安定性を示す。第３図は、
本発明のＧＰＣＰの熱安定性を示す。
は、本発明のＧＰＣＰのｐＨ安定性を示す。第３図は、
本発明のＧＰＣＰの熱安定性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (2)
- 【請求項１】 グリオクラジウム属に属するグリセリル
ホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼ生産菌を培
地に培養し、その培養物よりグリセリルホスフォリルコ
リンホスフォジエステラーゼを採取することを特徴とす
るグリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラー
ゼの製造法。 - 【請求項２】 グリオクラジウム属に属するグリセリル
ホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼ生産菌が、
グリオクラジウム ロゼウム Ｍ４６６４（ＦＥＲＭ
Ｐ−６０５５）である請求項第１項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3357284A JP3065758B2 (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3357284A JP3065758B2 (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05168477A JPH05168477A (ja) | 1993-07-02 |
| JP3065758B2 true JP3065758B2 (ja) | 2000-07-17 |
Family
ID=18453334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3357284A Expired - Lifetime JP3065758B2 (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3065758B2 (ja) |
-
1991
- 1991-12-25 JP JP3357284A patent/JP3065758B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05168477A (ja) | 1993-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CH639695A5 (it) | Procedimento enzimatico-microbiologico per la produzione di amminoacidi otticamente attivi a partire da idantoine e/o carbamil-derivati racemi. | |
| US4387163A (en) | Process for producing the enzyme cholesterol esterase and for hydrolyzing cholesterol esters of fatty acids by using the enzyme itself | |
| JP2957246B2 (ja) | 微生物起源カルボキシペプチダーゼｂ様酵素 | |
| JPS6322188A (ja) | 新規なｌ−アミノアシラ−ゼ | |
| JP3065758B2 (ja) | グリセリルホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼの製造法 | |
| JPS61128887A (ja) | ペルオキシダ−ゼの製造法 | |
| CA1285896C (en) | .alpha.-1, 6-GLUCOSIDASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME | |
| HU181488B (en) | Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex | |
| US4357425A (en) | Process for producing L-amino acid oxidase | |
| EP0015552B1 (en) | Process for producing sphingomyelinase, sphingomyelinase and the use thereof | |
| US4918012A (en) | Method for producing carnitine, L-carnitinamide hydrolase and method for producing same | |
| JPS58152481A (ja) | 新規なホスホリパ−ゼｄ−ｐおよびその製造法 | |
| JPH0198485A (ja) | 微生物による−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 | |
| JPH0783712B2 (ja) | 新規なプロリンアシラーゼ及びその製造法 | |
| JP3642344B2 (ja) | クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 | |
| JP3433300B2 (ja) | 酵母細胞壁溶解酵素高生産菌及びこれを用いる酵母細胞壁の溶解方法 | |
| JPS582671B2 (ja) | コレステリンエステラ−ゼの製法 | |
| KR910007849B1 (ko) | 신균주 스트렙토마이세스 sp.Y-183 및 이로부터 생산되는 히단토인에이즈의 생산방법 | |
| US5585255A (en) | Bile acid sulfate sulfatase gene, plasmid containing said gene and method of producing bile acid sulfate sulfatase | |
| JPH0614772A (ja) | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 | |
| US4732857A (en) | Process for producing enzyme capable of inactivating cytosolic aspartate aminotransferase isozyme | |
| JPH08275776A (ja) | 新規キチナーゼ及びその製造方法 | |
| JP3626084B2 (ja) | エンド−β−１，３−マンナナーゼとその製造方法 | |
| JP4426664B2 (ja) | ホスホリパーゼｄおよびその製造法 | |
| JP3778297B2 (ja) | 新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20000425 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080512 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090512 Year of fee payment: 9 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090512 Year of fee payment: 9 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090512 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100512 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110512 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110512 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120512 Year of fee payment: 12 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120512 Year of fee payment: 12 |