JPH0198485A - 微生物による−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 - Google Patents
微生物による−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
近年、生体内で複合糖質の糖鎖部分が細胞の分化・成長
、細胞間認識あるいは悪性腫瘍を含む多くの病気の発症
などに重要な役割を果していることが明らかにされてい
る。
、細胞間認識あるいは悪性腫瘍を含む多くの病気の発症
などに重要な役割を果していることが明らかにされてい
る。
こうした糖鎖の機能の解明には、糖鎖の構造解析、結合
様式の決定が必要とされ、複合糖質の糖鎖構造に高い特
異性を有する各種のグリコシダーゼの利用が重要な手段
となっている。
様式の決定が必要とされ、複合糖質の糖鎖構造に高い特
異性を有する各種のグリコシダーゼの利用が重要な手段
となっている。
血液型物質はその#M鎖構造が細胞内認識機構に大きな
役割を果たしていることが示される顕著な例である。血
液型のA型物質はtI!鎖の非還元末端にN−アセチル
ガラクトサミンがα結合し、A型物質としての抗原決定
基を形成している。
役割を果たしていることが示される顕著な例である。血
液型のA型物質はtI!鎖の非還元末端にN−アセチル
ガラクトサミンがα結合し、A型物質としての抗原決定
基を形成している。
A型物質に作用し、末端にα結合しているN−アセチル
ガラクトサミンを以下の様に切断遊離する酵素であるα
−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(以下α−Gal
NAcaseと略す。)は糖鎖構造の解析のための試薬
としてのみならず、A型皿液の0型への転換等抗原性を
変化させる手段として用いられる酵素である。
ガラクトサミンを以下の様に切断遊離する酵素であるα
−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(以下α−Gal
NAcaseと略す。)は糖鎖構造の解析のための試薬
としてのみならず、A型皿液の0型への転換等抗原性を
変化させる手段として用いられる酵素である。
Ga1NAc crl −+3 Gal β1 ・−−
↑ Ga1NAc、 + Gal β1−0↑ Fucα1 (従来の技術) (発明が解決しようとする問題点) 従来微生物起源のα−GalNAcaseとしては、ク
ロストリジウムパーフリンゲンス(C1ostridl
u+wPerfringens)およびアスペルギルス
ニガー(Asp−ergillus niger)由来
の酵素が部分精製されているにすぎない、この内クロス
トリジウムバーフリンゲンスは嫌気性の病原菌のため培
養が困難であり、一方アスペルギルスニガー由来の粗酵
素中には多くの他のグリコシダーゼが存在し、精製酵素
を得るには不適当である。
↑ Ga1NAc、 + Gal β1−0↑ Fucα1 (従来の技術) (発明が解決しようとする問題点) 従来微生物起源のα−GalNAcaseとしては、ク
ロストリジウムパーフリンゲンス(C1ostridl
u+wPerfringens)およびアスペルギルス
ニガー(Asp−ergillus niger)由来
の酵素が部分精製されているにすぎない、この内クロス
トリジウムバーフリンゲンスは嫌気性の病原菌のため培
養が困難であり、一方アスペルギルスニガー由来の粗酵
素中には多くの他のグリコシダーゼが存在し、精製酵素
を得るには不適当である。
(問題点を解決するための手段)
本発明者らはα−GalNAcase生産能を有する微
生物を広く自然界より検索した結果、土壌より分離され
たー菌株が、その目的にかなった性質を有していること
を見出し、本発明に到達したものである。
生物を広く自然界より検索した結果、土壌より分離され
たー菌株が、その目的にかなった性質を有していること
を見出し、本発明に到達したものである。
本発明に用いられる菌株の菌学的性質は以下に示す通り
である。
である。
(1)形態学的性質
分生子(胞子):球形、突起物を有する粗面、1.5〜
1.7X1.5〜1.8 μmという特徴を持った分生
子からなる アクレモニウム型分生子構造を 存する。栄養菌糸からは、はっ きり分化しない分生子柄上また は直接栄養菌糸上に2.3個か ら20個ぐらいの分生子が球状 にかたまりを形成。
1.7X1.5〜1.8 μmという特徴を持った分生
子からなる アクレモニウム型分生子構造を 存する。栄養菌糸からは、はっ きり分化しない分生子柄上また は直接栄養菌糸上に2.3個か ら20個ぐらいの分生子が球状 にかたまりを形成。
分生子柄 二 分生子形成細胞は隔壁がみられ、分生子
柄は先端がとがっており、 無分枝のものと分枝したものと が認められる。
柄は先端がとがっており、 無分枝のものと分枝したものと が認められる。
栄養菌糸 : 巾1.5〜3.2 μ国と太く明瞭な隔
壁が認められる。表面は滑ら かで先端は丸(、屈曲した細胞 もみられる。
壁が認められる。表面は滑ら かで先端は丸(、屈曲した細胞 もみられる。
気菌糸 : rtlO,5〜1.2μmで先端は丸
みを帯び、隔壁が認められる。
みを帯び、隔壁が認められる。
(2)各培地における生育状態
■ 麦芽汁寒天培地
発育の良否 : 適度
菌糸の形態 : 白色、綿毛状
培地裏面 : 黄褐色
■ バレイショ、ブドウ糖寒天培地
発育の良否 ; 良好
菌糸の形態 : 中央は白色綿毛状、周辺はフェルト状
。
。
培地裏面 : 淡黄色
■ ツアペック寒天培地
発育の良否 : 不良
生育の様相 : 寒天に潜行するように放射状に伸長。
菌糸の形態 : 中央は白色綿毛状、時間経過とともに
白点数 在。
白点数 在。
(3)生理的性質
生育のpHは中性付近、生育温度は28°Cが適当で、
37°Cでは生育はきわめて遅い。
37°Cでは生育はきわめて遅い。
通常の微生物の培養に用いられる培地によく生育し、炭
素源としてはアミノ糖よりグルコースを責化しやすい。
素源としてはアミノ糖よりグルコースを責化しやすい。
以上の諸性質よりこの菌株はアクレモニウム属に属する
新菌株と同定し、アクレモニウム・エスピーNa 41
3 (Acremonius sp、 No 413)
と命名した0本国株は微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第 q58’;号として寄託されている。
新菌株と同定し、アクレモニウム・エスピーNa 41
3 (Acremonius sp、 No 413)
と命名した0本国株は微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第 q58’;号として寄託されている。
次に、本発明により製造されるα−GalNAcase
の酵素化学的および理化学的性質を示す。
の酵素化学的および理化学的性質を示す。
fi+酵素の作用
本発明酵素は末端にGa1NAcがα結合しているmi
J¥に作用して以下のようにGa1NAcを遊離せしめ
る。
J¥に作用して以下のようにGa1NAcを遊離せしめ
る。
Ga1NAc α1 −走→3 Gal β1−−−
−−・−(2)基質特異性 種々のp−ニトロフェニル−グリコシドに対して、本発
明酵素を作用させた結果を第1表に示した0表から明ら
かなように本発明酵素はp−ニト第 1 表 ロフェニルーα−GalNAc 以外のp−ニトロフ
ェニル−グリコシドに対しては実質的にはほとんど活性
を示さない。
−−・−(2)基質特異性 種々のp−ニトロフェニル−グリコシドに対して、本発
明酵素を作用させた結果を第1表に示した0表から明ら
かなように本発明酵素はp−ニト第 1 表 ロフェニルーα−GalNAc 以外のp−ニトロフ
ェニル−グリコシドに対しては実質的にはほとんど活性
を示さない。
一方、本発明酵素はp−ニトロフェニル−α−GalN
Ac の他、非還元末端にα結合したGa1NAcを
有する糖鎖に作用し、馬胃A型物質、アシアロ牛顎下腺
ムチン、豚胃ムチン塘ペプチド、羊ムチン、A型ヒト唾
液糖ペプチド、A1型血球等の天然物質抗原決定部位よ
りGa1NAcを遊離する。
Ac の他、非還元末端にα結合したGa1NAcを
有する糖鎖に作用し、馬胃A型物質、アシアロ牛顎下腺
ムチン、豚胃ムチン塘ペプチド、羊ムチン、A型ヒト唾
液糖ペプチド、A1型血球等の天然物質抗原決定部位よ
りGa1NAcを遊離する。
(3)力価の測定法
酵素活性の測定は、p−ニトロフェニル−α−D −G
a1NAcを基質としてpH4,5のクエン酸緩衝液中
37°Cで反応を行い、ホウ酸緩衝液(pH9,8)を
加えて反応を停止させた後、遊離のp −二トロフェノ
ールの量を400r++wの吸光度を測定することによ
り行った。酵素活性の単位は1分間に1μ5oleのp
−二トロフェノールを遊離する酵素量を1ユニツトとし
た。
a1NAcを基質としてpH4,5のクエン酸緩衝液中
37°Cで反応を行い、ホウ酸緩衝液(pH9,8)を
加えて反応を停止させた後、遊離のp −二トロフェノ
ールの量を400r++wの吸光度を測定することによ
り行った。酵素活性の単位は1分間に1μ5oleのp
−二トロフェノールを遊離する酵素量を1ユニツトとし
た。
血球以外の天然物質を基質とした場合は、pH4,5の
クエン酸緩衝液中37°Cで反応を行い、Re1551
g法で遊離のGa1NAcを定量した。
クエン酸緩衝液中37°Cで反応を行い、Re1551
g法で遊離のGa1NAcを定量した。
天然物質のうちA型の型活性を持つものについては、抗
A血清に対する血球凝集阻止能の減少を測定し、酵素活
性を確認した。
A血清に対する血球凝集阻止能の減少を測定し、酵素活
性を確認した。
(4)至適PHおよび安定PH範囲
反応の至適PHは4.0〜4.5にあった。
安定pH範囲は4℃、2日間の処理条件の場合pH6,
0〜7.5であった。
0〜7.5であった。
(5)反応至適温度および安定温度範囲反応の至適温度
は55°Cであった。安定温度範囲はpH7,0,10
mMリン酸緩衝液中に10分間保温したとき35°C以
下であり、45°Cでは約80%の活性が残存していた
。
は55°Cであった。安定温度範囲はpH7,0,10
mMリン酸緩衝液中に10分間保温したとき35°C以
下であり、45°Cでは約80%の活性が残存していた
。
(6)阻害剤等の影響
本酵素に対する種々の添加物質の影響について検討した
結果を第2表に示した。表から明らかなように水銀によ
り著しく阻害されたが、SH試薬やその他の金属イオン
および糖によりほとんど阻害されなかった。
結果を第2表に示した。表から明らかなように水銀によ
り著しく阻害されたが、SH試薬やその他の金属イオン
および糖によりほとんど阻害されなかった。
第2表
(7)精製方法
本酵素の精製は、塩析法、各種クロマトグラフ法等を適
宜に組合わせて行うことができる。精製の具体例は実施
例に示すとおりである。
宜に組合わせて行うことができる。精製の具体例は実施
例に示すとおりである。
(8)分子量
本酵素の分子量はセファデックスG−150を用いるゲ
ルが適法により約55.000、SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によって約57゜000と算出され
た。
ルが適法により約55.000、SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によって約57゜000と算出され
た。
(9)ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製された酵素
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバ
ンドを示した。
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバ
ンドを示した。
00)アミノ酸分析
精製酵素標品を6 N −1−(α中で110°C12
2時間加水分解した後、アミノ酸自動分析機でアミノ酸
組成を測定した。その結果を第3表に示した。
2時間加水分解した後、アミノ酸自動分析機でアミノ酸
組成を測定した。その結果を第3表に示した。
第3表
次に本発明をより具体的に説明する。
本発明に使用する微生物は、アクレモニウム属に属し、
上記性質を有するα−GalNAcaseを生産する能
力を有するものであれば如何なるものでもよい。このよ
うな微生物の具体例としては、本発明者らにより土壌か
ら分離された Nα413 株があげられる。
上記性質を有するα−GalNAcaseを生産する能
力を有するものであれば如何なるものでもよい。このよ
うな微生物の具体例としては、本発明者らにより土壌か
ら分離された Nα413 株があげられる。
当該菌を用いてα−GalNAcaseを生産するには
、通常の微生物の培養に用いられるものであれば特に限
定されない。
、通常の微生物の培養に用いられるものであれば特に限
定されない。
炭素源としては例えば、グルコース、アラビノース、シ
二−クロース、可溶性澱粉、糖密、デキストリン、豚ア
シアロムチンなどの糖質、窒素源としては、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンステイープ
リカー、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等があ
げられる。培地のPHは6.5、培養温度は28°C1
培養時間は72時間程度が適当であり、好気的に培養を
行う。
二−クロース、可溶性澱粉、糖密、デキストリン、豚ア
シアロムチンなどの糖質、窒素源としては、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンステイープ
リカー、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等があ
げられる。培地のPHは6.5、培養温度は28°C1
培養時間は72時間程度が適当であり、好気的に培養を
行う。
本酵素は培養後の菌体を用いた誘導生産によっても得る
ことができる。
ことができる。
培養終了後、培養液からα−GalNAcaseを採取
、精製するには既知の方法を適当に組合せて行うことが
できる0本酵素は培養液中に分泌されるので遠心分離等
により菌体を除いた培養上澄液を硫安分画後、イオン交
換、ゲルが過、吸着等のクロマトグラフィーを行い精製
することができる。
、精製するには既知の方法を適当に組合せて行うことが
できる0本酵素は培養液中に分泌されるので遠心分離等
により菌体を除いた培養上澄液を硫安分画後、イオン交
換、ゲルが過、吸着等のクロマトグラフィーを行い精製
することができる。
(実施例)
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、以
下の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない
。
下の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない
。
実施例1
グルコース0,5%、ペプトン0.5%、酵母エキス0
.5%、塩化ナトリウム0.5%を含む培地を21容振
盪フラスコ10本に各500d分注し、滅菌した後、同
培地で前培養したアクレモニウムエスピーNα413を
5d接種し、28°Cで3日間振盪培養した。培養終了
後、遠心分離により菌体を除き、培養が液を得た。この
が液を0〜5°Cに保ちながら硫安を添加し、0.40
〜0,55飽和の間の沈澱画分を採取した。
.5%、塩化ナトリウム0.5%を含む培地を21容振
盪フラスコ10本に各500d分注し、滅菌した後、同
培地で前培養したアクレモニウムエスピーNα413を
5d接種し、28°Cで3日間振盪培養した。培養終了
後、遠心分離により菌体を除き、培養が液を得た。この
が液を0〜5°Cに保ちながら硫安を添加し、0.40
〜0,55飽和の間の沈澱画分を採取した。
得られた沈澱を0.0IMリン酸緩衝液(Pl+ 7.
0)に)容解し、同緩衝液で一夜透析した。この透析内
液を同緩衝液で予め平衡化したDEAE−セファデック
スA−50カラム(4,8X 5 、Ocm )に通し
、0.1MのNaαを含むリン酸緩衝液PH6,0で洗
浄後、0.25MNaαを含む同緩衝液で酵素を溶出し
た。活性画分を限外が過にて濃縮後、90%硫安飽和に
て沈澱を集めた。
0)に)容解し、同緩衝液で一夜透析した。この透析内
液を同緩衝液で予め平衡化したDEAE−セファデック
スA−50カラム(4,8X 5 、Ocm )に通し
、0.1MのNaαを含むリン酸緩衝液PH6,0で洗
浄後、0.25MNaαを含む同緩衝液で酵素を溶出し
た。活性画分を限外が過にて濃縮後、90%硫安飽和に
て沈澱を集めた。
この沈澱に0.001? リン酸緩衝液(pH7,0)
を加えて溶解し、同緩衝液で透析した。この透析内液を
同緩衝液で予め平衡化したハイドロキシアパタイトカラ
ム(1,4%5cm)に通し、同緩衝液で洗浄後、0.
005M リン酸緩衝液(pH7,0)で溶出した。活
性画分を限外が過にて濃縮後、0.01Mリン酸緩衝液
(PH7,0)で平衡化したセファデンクスG−150
カラム(1,8X123c+++)を用いてゲルが過を
行った。活性画分を濃縮後、0.IMNa (Jを含む
0.02M リン酸緩衝液(PH7,0)で平衡化し
たConAセファロースカラム(0,8x2゜5 c+
+)に通した。同緩衝液で非吸着画分に溶出された活性
画分、及び0.005Mα−メチル−マンノシドを含む
同緩衝液で溶出された活性画分を濃縮し、a −Ga
INAcaseの精製標品3mg(比活性90 uni
ts#++g収率I5%〕を得収率1飾 ペプトン0.5%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウ
ム0.5%、豚アシアロムチン0.5%を含む培地1
0 0 ryrlを容ff15 0 0affiの振盪
フラスコに分注し、120°C1 15分間加圧滅菌し
た後、同じ組成の培地で前培養したアクレモニウムエス
ピーNα413の菌株を5d接種し、28℃、2日間振
盪培養した。培養終了後遠沈により菌体を集菌し、生理
食塩でよく洗浄した後、培養液と等容の0.5%N−ア
セチルガラクトサミンを含む培地に懸濁し、28°C,
18時間振盪し、酵素を誘導産生させた。
を加えて溶解し、同緩衝液で透析した。この透析内液を
同緩衝液で予め平衡化したハイドロキシアパタイトカラ
ム(1,4%5cm)に通し、同緩衝液で洗浄後、0.
005M リン酸緩衝液(pH7,0)で溶出した。活
性画分を限外が過にて濃縮後、0.01Mリン酸緩衝液
(PH7,0)で平衡化したセファデンクスG−150
カラム(1,8X123c+++)を用いてゲルが過を
行った。活性画分を濃縮後、0.IMNa (Jを含む
0.02M リン酸緩衝液(PH7,0)で平衡化し
たConAセファロースカラム(0,8x2゜5 c+
+)に通した。同緩衝液で非吸着画分に溶出された活性
画分、及び0.005Mα−メチル−マンノシドを含む
同緩衝液で溶出された活性画分を濃縮し、a −Ga
INAcaseの精製標品3mg(比活性90 uni
ts#++g収率I5%〕を得収率1飾 ペプトン0.5%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウ
ム0.5%、豚アシアロムチン0.5%を含む培地1
0 0 ryrlを容ff15 0 0affiの振盪
フラスコに分注し、120°C1 15分間加圧滅菌し
た後、同じ組成の培地で前培養したアクレモニウムエス
ピーNα413の菌株を5d接種し、28℃、2日間振
盪培養した。培養終了後遠沈により菌体を集菌し、生理
食塩でよく洗浄した後、培養液と等容の0.5%N−ア
セチルガラクトサミンを含む培地に懸濁し、28°C,
18時間振盪し、酵素を誘導産生させた。
誘導終了後遠心分離によって菌体を除き、0.11un
its/dの活性をもつ誘導液を得た。
its/dの活性をもつ誘導液を得た。
(発明の効果)
本発明によれば、α−GalNAcaseを大量かつ筒
便、安価に製造できるので、糖鎖構造の解析や抗原性の
転換に極めて有用な手段を捷供するものである。
便、安価に製造できるので、糖鎖構造の解析や抗原性の
転換に極めて有用な手段を捷供するものである。
Claims (1)
- アクレモニウム属に属し、α−N−アセチルガラクト
サミニダーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、
培養物からα−N−アセチルガラクトサミニダーゼを採
取することを特徴とする微生物によるα−N−アセチル
ガラクトサミニダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25813687A JPH0789920B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | 微生物による−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25813687A JPH0789920B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | 微生物による−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0198485A true JPH0198485A (ja) | 1989-04-17 |
JPH0789920B2 JPH0789920B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=17316015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25813687A Expired - Fee Related JPH0789920B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | 微生物による−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0789920B2 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008071666A (ja) * | 2006-09-15 | 2008-03-27 | Jst Mfg Co Ltd | 差込側コネクタ |
JP2009104945A (ja) * | 2007-10-24 | 2009-05-14 | Sumitomo Wiring Syst Ltd | ロック構造およびコネクタ |
JP2009104938A (ja) * | 2007-10-24 | 2009-05-14 | Sumitomo Wiring Syst Ltd | ロック構造およびコネクタ |
JP2009104936A (ja) * | 2007-10-24 | 2009-05-14 | Sumitomo Wiring Syst Ltd | ロック構造およびコネクタ |
US7588454B2 (en) | 2007-10-24 | 2009-09-15 | Sumitomo Wiring Systems, Ltd. | Connector device and locking structure |
-
1987
- 1987-10-12 JP JP25813687A patent/JPH0789920B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008071666A (ja) * | 2006-09-15 | 2008-03-27 | Jst Mfg Co Ltd | 差込側コネクタ |
JP2009104945A (ja) * | 2007-10-24 | 2009-05-14 | Sumitomo Wiring Syst Ltd | ロック構造およびコネクタ |
JP2009104938A (ja) * | 2007-10-24 | 2009-05-14 | Sumitomo Wiring Syst Ltd | ロック構造およびコネクタ |
JP2009104936A (ja) * | 2007-10-24 | 2009-05-14 | Sumitomo Wiring Syst Ltd | ロック構造およびコネクタ |
US7588454B2 (en) | 2007-10-24 | 2009-09-15 | Sumitomo Wiring Systems, Ltd. | Connector device and locking structure |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0789920B2 (ja) | 1995-10-04 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |