JPH01281082A - ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なノイラミニダーゼ・アイソザイム及び
それを用いるガングリオシド類の製造法に関する。

従来技術とその課題 ガングリオシドは、シアル酸を含有するスフィンゴ糖脂
質群の総称であり、高等動物の脳特に神経系に存在する
ことが知られている。ガングリオシド類は、生体内にお
いて、神経機能や細胞の相互識別、分化、増殖、ガン化
、老化等に関与し、また細胞社会学的視点から、コレラ
トキシン、ボツリヌス毒素等の細胞毒素、甲状腺ホルモ
ン等のペプチドホルモン、インターフェロン等の受容体
機能にあずかり、更に細胞表面の陰性電荷に寄与してい
るものと考えられる。実際、ウシの脳から抽出されたガ
ングリオシド類が、障害を受けた末梢神経の再生に促進
的に働き、特に、アルコール症の多発性神経炎や糖尿病
性ニューロバチ−の治療薬として有用であることが報告
されている〔「医薬と薬学」、第１３巻、６号、１４０
７〜１４１２　（１９８５）、［プラクティスＪ　、４
　（４）、４５２〜４５６　（１９８７）、［医薬ジャ
ーナルＪ、２２　（７）％　５５〜６２　（１９８６）
］。

上述したように、ガングリオシド類は生体内において種
々の機能を有する重要な物質群であり、従って、各種の
ガングリオシドを純粋に取出す方法の確立が望まれてい
る。従来、特定のガングリオシドを製造するに当っては
、種々のクロマトグラフィーを使用する方法が試みられ
ているが、出発原料である牛脳等から抽出されたガング
リオシド成分が、多種類のガングリオシドを微量ずつ含
むガングリオシド類の混合物であるため、繁雑な操作を
行なっても目的物を得るのが非常に困難であり、的確な
精製方法は見出されていない。また、化学的手法によっ
てガングリオシド類を合成する試みも成されているが、
工程が複雑であり、副反応が起り易く、副生物の分離が
困難である。

一方、ノイラミニダーゼは、単独では、ガングリオシド
類には直接作用しないと考えられていた酵素であり、実
際、コール酸塩等の界面活性剤の存在下にガングリオシ
ドＧＭ１からアシアロガングリオシドＧＡｌを生成する
という報告がなされているあみである〔斎藤正樹：代謝
、１６．７６１（１９７７））。しかも、ノイラミニダ
ーゼにアイソザイムが存在することは全く知られていな
い。

課題を解決するための手段 本発明者は、上記従来技術の課題に鑑みて鋭意研究を重
ねた結果、ガングリオシド類から特定のガングリオシド
を生成し得る、新規なノイラミニダーゼ・アイソザイム
を見い出し、本発明を完成した。

即ち本発明は、 ■下記の理化学的性状を有するノイラミニダーゼ・アイ
ソザイムＳ 作用：ガングリオシド類から選択的にガングリオシドＧ
Ｄ１ｂ及び／又はガングリオシドＧＭ□を生成する。

分子ｆｆ１＝約５２０００ダルトン（ゲルか過クロマト
グラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ 電気泳動法による） 至適ｐＨ：３．８〜４，４（牛脳ガングリオシド類を基
質とした場合） 熱安定性二６０℃以下、及び ■ガングリオシド類に、請求項（１）のノイラミニダー
ゼ・アイソザイムＳを作用させて、ガングリオシドＧ　
　及び／又はガングリオシドＧＭ、をｌｂ 選択的に得ることを特徴とするガングリオシド類の製造
法に係る。

本発明者は鋭意研究の結果、アース口バクター−ウレア
７７シエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａｆ
ａｃｉｅｎｓ　）属細菌起源のノイラミニダーゼには新
規なアイソザイムが存在し、該アイソザイムをガングリ
オシド類に作用させる場合には、ガングリオシドＧ　　
（以下ＧＤ１ｂという）及び／又はガングｌｂ リオシドＧＭ１（以下ＧＭｌという）が高純度で収率良
く且つ選択的に得られることを見出した。また、本発明
によれば、副生物が生成しないので、得られるＧ、１．
及びＧＭｌを容易に精製できる。また、本酵素を用いる
場合には、従来使用されていた界面活性剤を使用する必
要がない。

本発明ノイラミニダーゼ・アイソザイムＳ（以下単にア
イソザイムＳという）の活性測定は、ノイラミニダーゼ
の通常の活性測定方法と同様にして行なえばよい。例え
ば、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー
（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉ、、　２且迭、１９７１　（
１９５９））等に記載のチオバルビツール酸洗に従って
行なえばよい。アイソザイムＳの１単位は、３７℃で１
分間に１マイクロモルのＮ−アセチルノイラミン酸を生
成する酵素量とする。

本発明アイソザイムＳの分子量測定に採用したゲル濾過
クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動け、
以下のようにして行なった。

〔ゲル濾過クロマトグラフィー〕

セファデックスＧ１５０　（ファルマシア社製）を用い
るゲル炉適法によった。溶出液としては、５０ｍＭリン
酸緩衝液を用いた。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法〕 Ｕ、　Ｋ、　　Ｌａｅａ＋ｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　、
　２２７．　６８０（１９７０））の方法に従い、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行なっ
た。

また本発明アイソザイムＳの安定ｐＨ域は３゜５〜１０
．０であり、また作用適温は４５〜５５℃である。

一方、アースロバクターφウレアファシェンス属細菌起
源のノイラミニダーゼはＩ及び■に分離されており、そ
の理化学的性質は下記第１表の通りであるとされていた
［Ｙ、　Ｕｅｈｉｄａ　ａｔ　ａｌ　、　　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、８６，４２５．（１９７９））。

第１表 上記したように、従来のノイラミニダーゼと本発明アイ
ソザイムＳは理化学的性質を異にしている。従って、本
発明アイソザイムＳは、従来報告されているアースロバ
クターφウレアファシェンス属細菌起源のノイラミニダ
ーゼとは異なった分子種の酵素であることが判る。

本発明アイソザイムＳは、アースロバフタ−・ウレアフ
ァシェンス属細菌を培養し、得られる培養物から採取で
きる。

アースロバフタ−・ウレアファシェンス属細菌としては
公知のものを用いることができ、その具体例としては、
例えば、アースロバフタ−・ウレアファシェンスＭ１０
５７株（微工研条寄第１３９１号）等を挙げることがで
きる。

アースロバフタ−・ウレアファシェンス属細菌の培養は
、通常の液体培地及び固体培地のいずれを用いても実施
できるが、通常液体培地を用いるのが有利である。また
所望酵素を生産するためには、振盪培養や通気攪拌培養
等を行なうのが好ましい。培地としては特に制限がなく
、微生物の培養に用いられる通常の栄養源等を含有する
各種の培地を使用できる。栄！ｌ源としては、例えば、
ブドウ糖、果糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビト
ール、グリセロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸
、コハク酸等の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エ
キス、酵母エキス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩
、硝酸塩等の窒素源、リン、マグネシウム、カリウム、
ナトリウム等の無機塩類、硼素、銅、沃素、鉄、マンガ
ン、亜鉛、コバルト、モリブデン等の微量元素類、ビタ
ミン類等の微量成育因子等を例示できる。更に、例えば
動物組織抽出物又は浸出物等を含有する天然乃至半合成
培地等も使用できる。該培地の具体例としては、例えば
１、トッド・ヘライツト肉汁（Ｔ　ｏｄｄＨｅｗｌｔｔ
　Ｂｒｏｔｈ）やプレイン・ハート・インフュージョン
（Ｂｒａｉｎ　　Ｈｅａｒｔ　　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培
地等の名称で市販されているもの等を例示できる。

培養条件としては、培養温度２０〜４０”Ｃ程度、好ま
しくは２５〜３０℃程麿、培養時間は１ｏ〜７０時間程
度とすればよい。

かくして得られるアースロバフタ−・ウレアファシェン
ス属細菌の培養液から、公知の方法に従って本発明アイ
ソザイムＳを採取することができる。例えば、培養液か
ら菌体を分離除去し、得られる清澄液に、硫安分画、ア
フィニティクロマトグラフィー、必要に応じイオン交換
クロマトグラフィー、クロマトフオーカシング、ゲル濾
過等の精製操作を施せばよい。

かくして得られる本発明アイソザイムＳをガングリオシ
ド類に作用させることにより、ＧＭｌ及びＧ、１．を選
択的に得ることができる。上記酵素反応は、ガングリオ
シド類（基質）及び緩衝液、更に必要に応じて殺菌水を
含む基質液に、アイソザイムＳを添加することにより行
なわれる。

上記酵素反応において、主にＧＤｌｂを得ようとする場
合、その反応条件は以下の通りである。ガングリオシド
類としては特に制限されず公知のものが使用でき、その
具体例としては、例えば、ガングリオシドＧＴｌｂ及び
／又はガングリオシドＧＱｌｂ　’牛脳抽出ガングリオ
シド混合物等を例示できる。ガングリオシド類の使用量
は特に制限されないが、通常基質液１観あたり２０ａ＋
ｇ以下、好ましくは０．１〜３ｎｉｇ程度とすればよい
。アイソザイムＳの使用量も特に制限されないが、通常
基質１夜１威当り１ｍＵ以上、好ましくは１０〜５００
ｍＵ程度とすればよい。緩衝液としてはｐＨが３〜６程
度の公知のものが使用でき、例えば、１０〜２００ｍＭ
程度の酢酸緩衝液（ｐＨ３，５〜５゜０）　、Ｍｃｌｌ
ｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３，５〜５．　５）等を例示で
きる。反応温度は酵素が作用し得る温度であれば特に制
限されないが、通常３０〜４０℃程度とすればよい。反
応時間は基質濃度、反応温度等により適宜選択すればよ
いが、例えば３７℃の時には１５分〜５時間程度とすれ
ばよい。

また、上記酵素反応において、主にＧＭＩを得ようとす
る場合には、その反応条件は以下の通りである。ガング
リオシド類としては特に制限されず公知のものが使用で
き、その具体例としては、例えば、ガングリオシドＧ　
　　、Ｇ　　　、Ｇ　　　。

Ｄｌａ　　　Ｄｌｂ　　　Ｔｌａ Ｇ　　及びＧＱｌｂから選ばれた少くとも１種、牛ｌｂ 脳抽出ガングリオシド混合物等を例示できる。ガングリ
オシド類の使用量は特に制限されないが、通常基質液１
−あたり２０ｍｇ以下、好ましくは０゜０５〜ｌ　ｍｇ
程度とすればよい。アイソザイムＳの使用量も特に制限
されないが、通常基質液１１Ｉ１１２当り３ｍＵ以上、
好ましくは５０ｍＵ程度とすればよい。緩衝液及び反応
温度はＧＤｌｂの場合と同様の条件でよい。反応時間は
基質濃度、反応温度等により適宜選択すればよいが、例
えば３７℃の時には３０分〜１２時間程度とすればよい
。

上記酵素反応において、酵素量、反応温度、反応時間等
を適宜選択することにより、ＧＭ、及びＧＤｌｂを夫々
単独で若しくは混合物として得ることができる。

反応液からＧ　及びＧＤｌｂを精製するに当ってｌ は公知の精製方法が採用できる。例えば、ＧＭｌ又はＧ
、１．を単独で得た場合には、溶媒抽出した後、凍結乾
燥等により精製できる。また混合物として得た場合には
、イオン交換樹脂カラムなどを用いてＧＭ□とＧＤｌｂ
とを分離し、次いで、濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行なう
ことにより精製できる。

発明の効果 本発明に従い、本発明アイソザイムＳをガングリオシド
類に作用させる時には、従来合成又は精製が非常に困難
とされているガングリオシド類の中、ガングリオシドＧ
Ｍ１及び／又はガングリオシドＧＤｌｂを高純度で収率
良く且つ選択的に得ることができる。しかも副生物が精
製しないので、得られるガングリオシドｑＭ１及び／又
はガングリオシドＧ、１．を容易に精製できる。また、
本酵素を用いる場合には、従来使用されていた界面活性
剤を使用する必要がない。

実施例 以下に参考例及び実施例を挙げ、本発明をより一層明瞭
なものとする。

参考例１ ラクトース５．０ｇ、リン酸第２アンモニウム２．０ｇ
、塩化ナトリウム３．０ｇ、リン酸第２カリウム１．Ｏ
ｇ、硫酸マグネシウム０．１ｇ及び脱塩水１０１００Ｏ
を含む培地（ｐＨを７．０ニ調整）を、２Ｑ容坂ロフラ
スコにいれ、オートクレーブで加熱滅菌した。

これに、アースロバフタ−・ウレアファシェンスＭ１０
５７株を接種し、２８℃で２４時間振盪培養を行ない、
得られた培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分
）して培養上清を得た。

得られた培養上清に硫安を加え、硫安８０％飽和で沈澱
する部分を採取し、これを少量の水に溶かし、１０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で透析した。透析液を、可溶
性デンプンとコロミン酸との２Ｎ水酸化ナトリウム溶液
にエピクロルヒドリンを加えて調製した、コロミン酸を
リガンドどするゲルを充填したカラムに通塔してノイラ
ミニダーゼを吸着させ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４
゜５）で溶出した。

次いで、ノイラミニダーゼ活性区分を硫安塩析し、脱塩
水で透析し、透析液をクロマトフオーカシングにより３
或分に分離した。タロマドフォーカシングは、透析液を
、２５ｍＭイミダゾール−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）で平
衡化したポリバアッファー交換体充填カラムに通塔し、
ｐＨ３，８に調整したポリブアッファ−７４〔ファルマ
シア社製〕で溶出して行なった。

得られた３或分を個々に硫安塩析し、１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、Ｕｌｔｒ。

ｇｅｔ　ＡｃＡ４４　（ｉ、　Ｂ、　Ｆ、バイオテクニ
クス社製〕を用いてゲル濾過し、４或分を得た。その中
の１或分から、アイソザイムＳの６５０単位を得た。

アイソザイムＳの酵素活性は、チオバルビッール酸法に
従い、以下のようにして行なった。

即ち、酵素液０．１或、０．４％Ｎ−アセチルノイラミ
ンラクトース溶液０．０５１１１９及び０．２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，０）０．０５ｍを、３７℃で１０分間反
応させ、遊離したＮ−アセチルノイラミン酸をチオバル
ビッール酸で定量した。アイソザイムＳの１単位は、３
７℃で１分間に１マイクロモルのＮ−アセチルノイラミ
ン酸を生成する酵素全とした。

実施例１ ０．４％ガングリオシドＧＴ１ｂ溶液１ｒｒｆ２．４０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，Ｏ）１ｍ１２、アイソザイム
Ｓ溶液１ｎ＋Ｑ　ｃｏ、　　３Ｕ／＋１１９）及び蒸留
水１或を、３７℃で１時間反応させた後、反応液にクロ
ロホルムを１／１０容添加し、酵素反応を停止した。

反応液より、クロロホルム：メタノール（２：１）を用
いて生成したＧＤｌｂを抽出した後、凍結乾燥し、Ｇｐ
ｔ５３．　２ｍｇを白色粉末として得た。

尚、ＧＤｌｂの生成は、薄層クロマトグラフィーにより
検出及び確認した。

実施例２ ガングリオシド類として、牛脳抽出ガングリオシド混合
液１１１１１２（ガングリオシド類１０ｍｇを含む）を
使用する以外は、実施例１と同様にして３７°Ｃで３時
間反応を行なった。生成したＧＤｌｂとＧＭ□をイオン
交換クロマトグラフィー〔ファルマシア社製〕により分
画及び分取し、夫々減圧濃縮、脱塩処理及び凍結乾燥を
施し、Ｇｏｉｂ約２．８ｍｇ及び０Ｍ１約４．７ｍｇを
白色粉末として得た。

実施例３ ０．２％ガングリオシドＧＤｌｂ溶液１或、４０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４，０）１戒、アイソザイムＳ溶液１或
（３Ｕ／ｍＱ）及び殺菌水１−を、３７℃で５時間反応
させた後、反応液にクロロホルムを１／１０容添加し、
酵素反応を停止した。反応液より、クロロホルム：メタ
ノール（２：　１）を用いて生成したＧＭｌを抽出した
後、凍結乾燥し、ＧＭ□約１．５ｎｔｇを白色粉末とし
て得た。

実施例４ ガングリオシド類として、牛脳抽出ガングリオシド混合
液１ｍＱ（ガングリオシド類１０ｍｇを含む）を使用す
る以外は、実施例３と同様にして反応を行なった。生成
したＧＭ、を実施例３と同様にして精製し、ＧＭ□約６
．．２ｍｇを白色粉末として得た。

（以　上）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性状を有するノイラミニダーゼ・
   アイソザイムＳ 作用：ガングリオシド類から選択的にガングリオシドＧ
   ＿Ｄ＿１＿ｂ及び／又はガングリオシドＧ＿Ｍ＿１を生
   成する。 分子量：約５２０００ダルトン（ゲルろ過クロマトグラ
   フィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ 電気泳動法による） 至適ｐＨ：３．８〜４．４（牛脳ガングリオシド類を基
   質とした場合） 熱安定性：６０℃以下
2. （２）ガングリオシド類に、請求項（１）のノイラミニ
   ダーゼ・アイソザイムＳを作用させて、ガングリオシド
   Ｇ＿Ｄ＿１＿ｂ及び／又はガングリオシドＧ＿Ｍ＿１を
   選択的に得ることを特徴とするガングリオシド類の製造
   法。