JP3617688B2 - β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ - Google Patents
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP3617688B2 JP3617688B2 JP9535695A JP9535695A JP3617688B2 JP 3617688 B2 JP3617688 B2 JP 3617688B2 JP 9535695 A JP9535695 A JP 9535695A JP 9535695 A JP9535695 A JP 9535695A JP 3617688 B2 JP3617688 B2 JP 3617688B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acetylglucosaminidase
- enzyme
- acetyl
- stable
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するが、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合は加水分解しないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびその生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を含む糖鎖は、生体内の糖脂質および糖タンパク質に多く存在している。このような糖鎖は、近年の研究によって、生体内で重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあり、それに伴ってより簡便で正確な糖鎖の構造解析方法が望まれている。このような糖鎖の構造解析方法として、エキソグリコシダーゼを利用する方法が有望である（Ｐａｕｌｉｎｅ Ｒｕｄｄ（小西憲治訳）、化学と生物、Ｖｏｌ．３２、６６１頁、（１９９４）；佐野睦、宮村毅、「ＢＩＯ ＶＩＥＷ」、Ｎｏ．１３、１３頁、宝酒造刊（１９９４））。
【０００３】
この方法は、エキソグリコシダーゼの基質特異性を利用したものであり、例えば、構造不明の糖鎖にβ−ガラクトシダーゼを加えて加水分解させた後、糖鎖からの単糖の遊離および／または基質糖鎖の構造変化に着目し、これらを確認することによって、糖鎖（オリゴ糖）の非還元末端におけるβ−ガラクトシド結合の存在を判定するものである。
【０００４】
ところで、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用することが従来から知られているエキソグリコシダーゼはいずれも、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合のほかにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合に対しても作用することが知られている。
【０００５】
従って、これらの酵素はβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．５２）と命名され、オリゴ糖、配糖体糖鎖等の糖質から非還元末端にβグリコシド結合しているＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させる反応を触媒することで特徴付けられている（生化学辞典第２版、２９〜３０頁、東京化学同人刊、（１９９０））。上記酵素であって、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合のみに作用する酵素の存在は、これまで否定されてきた（Ｊ．Ａ．Ｃａｂｅｚａｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、Ｖｏｌ．２６１、１０５９〜１０６０頁、（１９８９）；「ＥＮＺＹＭＥ ＮＯＭＥＮＣＬＡＴＵＲＥ １９９２」、３５０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ刊（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））。
【０００６】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合同様、糖脂質、および糖タンパク質中に存在している。従って、上記糖鎖構造解析方法に従来から知られているβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを用いる場合は、該酵素反応後、基質糖鎖からの単糖の遊離および／または基質糖鎖の構造変化を確認する工程の他に、基質糖鎖の非還元末端がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであるのかまたはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンであるのかを決定するための煩雑な分析工程をさらに付加させねばならないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その目的とするところは、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するが、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合は加水分解しないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびその生産方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グラム陽性細菌であるバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する、新たに単離した菌株から、オリゴ糖、配糖体糖鎖などの糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解して、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合にはまったく作用せず、従ってＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（以下、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたは本酵素という）は、オリゴ糖および配糖体糖鎖などの糖質から非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンは遊離させないことを特徴とするエキソグリコシダーゼである。このことによって、上記目的が達成される。
【００１０】
本発明の好ましいβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、次の特性をさらに有する。
▲１▼．至適ｐＨ：５．０である。
▲２▼．安定ｐＨ範囲：３７℃で１時間保持する場合において、ｐＨ４．５〜９．５である。
▲３▼．作用適温の範囲：至適温度は５０℃である。
▲４▼．熱安定性：ｐＨ８．０で３０分間保持した場合に４５℃まで安定である。
▲５▼．ゲル濾過クロマトグラフィーにおける分子量：約１８０，０００である。
▲６▼．等電点電気泳動における等電点：４．８である。
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、バシラス属の細菌により生産される。特に好ましいバシラス属細菌は、平成７年３月２日に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称する）に寄託したバシラス・メガテリウムＡＴ１８８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＡＴ１８８）株（生命研菌寄第１４７９３号；ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９３）である。
【００１１】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの生産方法は、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産するバシラス属細菌を培養する工程、および、該培養工程により得られた培養物より、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを採取する工程を包含する。このことによって、上記目的が達成される。
【００１２】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの好ましい生産方法は、上記バシラス・メガテリウムＡＴ１８８株を用いる方法である。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、バシラス属の細菌、特にバシラス・メガテリウムＡＴ１８８株（生命研菌寄第１４７９３号；ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９３）（以下、本菌という）により生産される。本菌は、本発明者らが滋賀県甲賀郡甲西町内の土壌から分離した菌である。本菌の菌学的性質を次に示す。
【００１５】
（ａ）形態および生理学的性質
本菌を培養した結果を以下の表１〜表３に示す。ここで特に記載のない限り、培養温度は３７℃である。本菌の菌学的形態は、肉汁寒天培地上での培養により調べた。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３】
【００１９】
表１〜表３に示した菌学的性質をもとに、Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第２巻（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８６）を参照して、本菌はバシラス・メガテリウムに属する菌株であることが判明した。本発明者らは本菌株をバシラス・メガテリウムＡＴ１８８と命名した。
【００２０】
以下、本菌から本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産および採取するための条件について説明する。
【００２１】
（ｂ）培養条件
本菌の培養条件は特に限定されず、通常の液体培地または固体培地が用いられる。炭素源としては、各種の糖類が用いられ、グルコース、ショ糖、糖蜜等が好ましく使用され得る。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられるがこれらに限定されない。上記炭素源および窒素源の他、各種の無機塩類（例えばマグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩）およびビタミン類などが必要に応じて添加され得る。本菌の生育好適ｐＨは６〜８であるがこれに限定されない。
【００２２】
本菌の培養温度は本菌が生育できる温度であれば特に制限はないが、培養温度２０℃〜４６℃が好ましく、特に３７℃が好ましい。液体培養の場合は、通常２４時間〜７２時間、好気的に撹拌または振盪しながら培養を行う。培養過程における菌体増殖経時変化は、例えば、培養懸濁液の濁度変化（通常はＯ．Ｄ．６６０の計測）をモニターして、知り得る。
【００２３】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、主として菌体外に分泌される。
【００２４】
（ｃ）β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの採取方法
上記培養液から本発明の酵素を採取、精製するには、既知の精製法が単独もしくは併用して利用され得る。例えば、培養液を濾過または遠心分離することにより培養液中の菌体を除き、得られた上清液を、硫安、芒硝などによる塩析、またはメタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒による沈澱などに供することによって分画、濃縮し、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含有する粗酵素液が得られる。この粗酵素液は、さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および／またはその他の各種クロマトグラフィーを行うことにより精製され得る。好ましい精製法の概要を以下に示す。
【００２５】
（１）．培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清液を得る。
（２）．次いで、得られた上清液を硫安（５０％〜７０％飽和溶液）で塩析する。
（３）．次いで、得られた塩析液をｐＨ４．５の酢酸バッファーで透析し、ＣＭ−トヨパールカラムクロマトグラフィーにかける。
（４）．上記（３）で得られた活性画分をｐＨ８．０のトリス−塩酸バッファーで透析し、次いで、ＱＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィーにかける。
（５）．上記（４）で得られた活性画分を限外濾過膜で濃縮し、次いで、セファクリルＳ−２００カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにかける。
【００２６】
（ｄ）本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性測定法
本明細書においては、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は、パラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドを基質として用い、１分間に１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）として測定する。具体的には本明細書においては、ｐＨ５．０の２５ｍＭ酢酸バッファーに溶解させた２．５ｍＭのパラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド溶液０．４ｍｌに、０．１ｍｌの試料溶液を加え、３７℃で１０分間反応させる。その後、２％炭酸ナトリウム溶液を２．５ｍｌ加えて反応を停止させ、反応液の波長４２０ｎｍにおける吸光度（パラニトロフェノールの遊離に伴って増加する）を測定する。
【００２７】
【作用】
本発明のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド結合を特異的に加水分解するエキソグリコシダーゼである。そのため、オリゴ糖および配糖体糖鎖等の糖質の非還元末端がβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドのとき、該グリコシド結合を加水分解して、非還元末端からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、その糖質の非還元末端がβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニドのとき、本酵素は作用せず、遊離単糖も生じさせない。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらはなんら本発明を限定するものではない。
【００２９】
実施例１
（酵素液の調製）
１００ｍｌの培地（０．２５％ジ−Ｎ−アセチルキトビオース、０．５％ポリペプトン、０．２５％酵母エキス、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、および０．０２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７）を含有する５００ｍｌ容振盪フラスコ４７本に、バシラス・メガテリウムＡＴ１８８を植菌し、３７℃で２日間、往復振盪培養を行った。培養終了後、この培養液を回収し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を除き、得られた培養上清中のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定して、本酵素の活性が０．４３Ｕ／ｍｌである培養上清を３９２０ｍｌ得た。この培養上清に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるまで加えた。生じた沈澱を遠心分離して除き、得られた上清にさらに７０％飽和になるまで硫酸アンモニウムを加えた。生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱をｐＨ６．０、２５ｍＭの酢酸バッファーに溶解し、次いでｐＨ５．０、５０ｍＭの酢酸バッファーで透析した。以上の操作により、本酵素活性が３３．２Ｕ／ｍｌである酵素液を３９．５ｍｌ得た。
【００３０】
実施例２
（精製酵素標品の調製）
上記実施例１で得られた酵素液３９．５ｍｌを、ｐＨ４．５、２５ｍＭの酢酸バッファーでさらに透析した。この透析液を、ｐＨ４．５、２５ｍＭの酢酸バッファーで平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラム（東ソー株式会社製）に吸着させ、０〜０．５Ｍの食塩濃度勾配をかけて溶出した。得られた本酵素画分をさらにｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファーで透析し、この透析液をｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファーで平衡化したＱＡＥ−トヨパール５５０Ｃカラム（東ソー株式会社製）に吸着させ、０〜０．５Ｍの食塩濃度勾配をかけて溶出した。得られた本酵素画分を次に限外濾過膜で濃縮し、この濃縮液を、ｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファーで平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（ファルマシアバイオテク社製）にかけてさらに本酵素を精製した。 以上の操作により、実施例１で得られた培養上清３９２０ｍｌ（計１６９０Ｕ）から、収率１４％で１３６０倍に精製された本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ溶液を１２ｍｌ（計２３８Ｕ）得た。本精製酵素の比活性は４８．２Ｕ／ｍｇであった。上記（ｃ）に記載の（１）〜（５）に対応した本実施例１および２の各精製工程における酵素の精製度合いを、表４に示す。表中の活性値は、いずれも上記（ｄ）に記載の測定方法に準じて測定した値である。
【００３１】
【表４】
【００３２】
以下の実施例では、特に記載のない限り、上記実施例２で得られた酵素液を用いた。
【００３３】
実施例３
（本酵素の基質特異性）
表５に示した各基質（パラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド、パラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド、パラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシド、パラニトロフェニル−β−Ｄ−マンノシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、パラニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド）を２５ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．０）および２５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解して作成した各基質の２．５ｍＭ溶液０．４ｍｌに、実施例１で作成した本酵素活性が０．４３Ｕ／ｍｌである精製酵素液を０．１ｍｌ加えて、３７℃で２０時間反応させた。その後、２．５ｍｌの２％炭酸ナトリウム溶液を加えて反応を停止した。得られた反応液における、遊離したパラニトロフェノールの増加に伴う波長４２０ｎｍにおける吸光度の変化量を、上記酵素液の代わりにｐＨ６．０、２５ｍＭの酢酸バッファーを加えたものをブランクテストとして測定した。結果を表５に示す。反応ｐＨ５．０およびｐＨ７．０のいずれの条件下でも、使用したパラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド以外の基質では上記吸光度の増加は認められなかった。
【００３４】
【表５】
【００３５】
種々のオリゴ糖基質に対する本酵素の反応性を比較した。表６に示した各種基質の０．２％溶液６７．５μｌに、４０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ６．０）７７．５μｌおよび１７．２Ｕ／ｍｌの精製酵素液を５μｌ加えて、１０〜２４０分間、３７℃で反応させた。その後、反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、反応の結果生成されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを定量した。結果を表６に示す。基質にＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇａｌを用いた場合の酵素反応速度を１００とした場合の相対反応速度（％）を示した。本酵素は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合におけるβ１−２、β１−３、β１−４およびβ１−６のいずれの結合様式にも反応した。
【００３６】
【表６】
【００３７】
さらにまた、表７に示した種々のピリジルアミノ化糖鎖（宝酒造株式会社製）を基質として、それらに対する本酵素の反応性を比較した。ここで用いたピリジルアミノ化糖鎖は、還元末端を２−ピリジルアミンで修飾した糖鎖（オリゴ糖）である。２−ピリジルアミンは蛍光物質であり、本酵素の微量（ピコモル単位）分析に適する。
【００３８】
２μｌの１０ピコモル／μｌピリジルアミノ化糖鎖溶液に、６μｌの２５ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）および２μｌの１３Ｕ／ｍｌ精製酵素液を加え、３７℃で１６時間反応させた後、４０μｌの１％トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止した。次いで、この反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。結果を表７に示す。非還元末端にβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を有する基質（１）〜（３）は、すべてのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合が完全に加水分解されたが、非還元末端にβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合を有する基質（４）および（５）は全く加水分解されなかった。
【００３９】
【表７】
【００４０】
実施例４
（本酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲）
（１）至適ｐＨ
５０ｍＭブリトン−ロビンソン広域緩衝液により、ｐＨを３．０、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、８．０、および９．０に調整した以外は、上記（ｄ）に記載の方法に準じて、各ｐＨにおけるβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を測定した。結果を図１に示す。図中の横軸は反応ｐＨを表し、縦軸は、得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本酵素の至適ｐＨは５．０であった。
【００４１】
（２）安定ｐＨ範囲
９０ｍＭブリトン−ロビンソン広域緩衝液により、実施例１で得た酵素液のｐＨを３．０から１１．０まで０．５間隔で調整し、３７℃で１時間保持した後の本酵素の残存活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図２に示す。図中の横軸は上記調整ｐＨを表し、縦軸は、得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。ｐＨが４．５〜９．５の範囲で本酵素は安定であった。
【００４２】
実施例５
（本酵素の作用適温の範囲および熱安定性）
（１）作用適温の範囲
種々の反応温度条件（３０、３７、４０、４５、５０、５５、６０℃）下での本酵素活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図３に示す。図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本酵素の至適温度は５０℃であった。
【００４３】
（２）熱安定性
種々の温度条件（３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０℃）下、５ｍＭの塩化カルシウムを含む３７．５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、３０分間保持した後の本酵素の残存活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図４に示す。図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本酵素は、ｐＨ８．０で３０分間保持した場合、少なくとも４５℃までは安定であった。処理温度条件が４０℃の場合は、酵素活性は１００％保持された。
【００４４】
実施例６
（本酵素の分子量）
一般的なゲル濾過法（セファクリルＳ−２００ゲル濾過クロマトグラフィー）を用いて、本酵素の分子量を測定した。本酵素を含む試料を実施例２に記載のセファクリルＳ−２００カラムにかけ、次いで分子量既知の種々の標準試料を本酵素と同一条件でカラムにかけてゲル濾過し、それらの溶出位置と分子量の関係に基づいて分子量を測定した。図５に本酵素のセファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図中の横軸は上記カラムからの溶出液を分画回収したフラクション番号を表し、左側縦軸は回収した各フラクションの本酵素活性（Ｕ／ｍｌ；図中の●）、右側縦軸は各フラクションの２８０ｎｍ紫外吸光度（図中の○）を表す。図６に各標準試料の分子量（縦軸；×１０４）とＫａｖ値（横軸）の関係を示す。図６中のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれウシ肝臓カタラーゼ（分子量２３２，０００）、ウサギ筋肉アルドラーゼ（分子量１５８，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、およびオボ（ニワトリ卵白）アルブミン（分子量４３，０００）を示す。Ｋａｖ値は次式より求めた。
【００４５】
Ｋａｖ＝（［試料溶出体積］−［ボイド体積］）／（［カラム体積］−［ボイド体積］）。
【００４６】
ゲル濾過法（ゲル濾過クロマトグラフィー）により測定した本酵素の分子量は約１８０，０００である。
【００４７】
実施例７
（本酵素の等電点）
常法の等電点電気泳動法により本酵素の等電点を測定した。本酵素および等電点既知の種々の標準試料を同時に等電点電気泳動にかけ、その標準試料検出位置と等電点との関係に基づく検量線から、本酵素の等電点を測定した。本酵素の等電点は約４．８であった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を特異的に加水分解するβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、およびその生産方法が提供される。
【００４９】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンはまったく遊離させないので、構造解析が所望されるオリゴ糖および配糖体糖鎖の非還元末端のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの存在の有無を容易に判定し得、糖鎖の構造決定に非常に有用である。本酵素は微生物の培養によって生産されるため、簡便な工程で大量にかつ安価に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨ３．０〜９．０の範囲で本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。
【図２】本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをｐＨ３．０〜１１．０の各条件下、３７℃で１時間保持した後に測定した相対残存活性を示す。
【図３】３０〜６０℃の温度範囲で本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。
【図４】本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを３７．５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０〜６０℃の各温度条件下で３０分間保持した後に測定した相対残存活性を示す。
【図５】本酵素液のセファクリルＳ−２００カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにおけるクロマトグラムを示す。
【図６】ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの分子量を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するが、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合は加水分解しないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびその生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を含む糖鎖は、生体内の糖脂質および糖タンパク質に多く存在している。このような糖鎖は、近年の研究によって、生体内で重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあり、それに伴ってより簡便で正確な糖鎖の構造解析方法が望まれている。このような糖鎖の構造解析方法として、エキソグリコシダーゼを利用する方法が有望である（Ｐａｕｌｉｎｅ Ｒｕｄｄ（小西憲治訳）、化学と生物、Ｖｏｌ．３２、６６１頁、（１９９４）；佐野睦、宮村毅、「ＢＩＯ ＶＩＥＷ」、Ｎｏ．１３、１３頁、宝酒造刊（１９９４））。
【０００３】
この方法は、エキソグリコシダーゼの基質特異性を利用したものであり、例えば、構造不明の糖鎖にβ−ガラクトシダーゼを加えて加水分解させた後、糖鎖からの単糖の遊離および／または基質糖鎖の構造変化に着目し、これらを確認することによって、糖鎖（オリゴ糖）の非還元末端におけるβ−ガラクトシド結合の存在を判定するものである。
【０００４】
ところで、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用することが従来から知られているエキソグリコシダーゼはいずれも、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合のほかにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合に対しても作用することが知られている。
【０００５】
従って、これらの酵素はβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．５２）と命名され、オリゴ糖、配糖体糖鎖等の糖質から非還元末端にβグリコシド結合しているＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させる反応を触媒することで特徴付けられている（生化学辞典第２版、２９〜３０頁、東京化学同人刊、（１９９０））。上記酵素であって、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合のみに作用する酵素の存在は、これまで否定されてきた（Ｊ．Ａ．Ｃａｂｅｚａｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、Ｖｏｌ．２６１、１０５９〜１０６０頁、（１９８９）；「ＥＮＺＹＭＥ ＮＯＭＥＮＣＬＡＴＵＲＥ １９９２」、３５０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ刊（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））。
【０００６】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合同様、糖脂質、および糖タンパク質中に存在している。従って、上記糖鎖構造解析方法に従来から知られているβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを用いる場合は、該酵素反応後、基質糖鎖からの単糖の遊離および／または基質糖鎖の構造変化を確認する工程の他に、基質糖鎖の非還元末端がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであるのかまたはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンであるのかを決定するための煩雑な分析工程をさらに付加させねばならないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その目的とするところは、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するが、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合は加水分解しないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびその生産方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グラム陽性細菌であるバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する、新たに単離した菌株から、オリゴ糖、配糖体糖鎖などの糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解して、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合にはまったく作用せず、従ってＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（以下、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたは本酵素という）は、オリゴ糖および配糖体糖鎖などの糖質から非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンは遊離させないことを特徴とするエキソグリコシダーゼである。このことによって、上記目的が達成される。
【００１０】
本発明の好ましいβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、次の特性をさらに有する。
▲１▼．至適ｐＨ：５．０である。
▲２▼．安定ｐＨ範囲：３７℃で１時間保持する場合において、ｐＨ４．５〜９．５である。
▲３▼．作用適温の範囲：至適温度は５０℃である。
▲４▼．熱安定性：ｐＨ８．０で３０分間保持した場合に４５℃まで安定である。
▲５▼．ゲル濾過クロマトグラフィーにおける分子量：約１８０，０００である。
▲６▼．等電点電気泳動における等電点：４．８である。
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、バシラス属の細菌により生産される。特に好ましいバシラス属細菌は、平成７年３月２日に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称する）に寄託したバシラス・メガテリウムＡＴ１８８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＡＴ１８８）株（生命研菌寄第１４７９３号；ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９３）である。
【００１１】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの生産方法は、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産するバシラス属細菌を培養する工程、および、該培養工程により得られた培養物より、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを採取する工程を包含する。このことによって、上記目的が達成される。
【００１２】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの好ましい生産方法は、上記バシラス・メガテリウムＡＴ１８８株を用いる方法である。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、バシラス属の細菌、特にバシラス・メガテリウムＡＴ１８８株（生命研菌寄第１４７９３号；ＦＥＲＭ Ｐ−１４７９３）（以下、本菌という）により生産される。本菌は、本発明者らが滋賀県甲賀郡甲西町内の土壌から分離した菌である。本菌の菌学的性質を次に示す。
【００１５】
（ａ）形態および生理学的性質
本菌を培養した結果を以下の表１〜表３に示す。ここで特に記載のない限り、培養温度は３７℃である。本菌の菌学的形態は、肉汁寒天培地上での培養により調べた。
【００１６】
【表１】
【表２】
【表３】
表１〜表３に示した菌学的性質をもとに、Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第２巻（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８６）を参照して、本菌はバシラス・メガテリウムに属する菌株であることが判明した。本発明者らは本菌株をバシラス・メガテリウムＡＴ１８８と命名した。
【００２０】
以下、本菌から本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産および採取するための条件について説明する。
【００２１】
（ｂ）培養条件
本菌の培養条件は特に限定されず、通常の液体培地または固体培地が用いられる。炭素源としては、各種の糖類が用いられ、グルコース、ショ糖、糖蜜等が好ましく使用され得る。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられるがこれらに限定されない。上記炭素源および窒素源の他、各種の無機塩類（例えばマグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩）およびビタミン類などが必要に応じて添加され得る。本菌の生育好適ｐＨは６〜８であるがこれに限定されない。
【００２２】
本菌の培養温度は本菌が生育できる温度であれば特に制限はないが、培養温度２０℃〜４６℃が好ましく、特に３７℃が好ましい。液体培養の場合は、通常２４時間〜７２時間、好気的に撹拌または振盪しながら培養を行う。培養過程における菌体増殖経時変化は、例えば、培養懸濁液の濁度変化（通常はＯ．Ｄ．６６０の計測）をモニターして、知り得る。
【００２３】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、主として菌体外に分泌される。
【００２４】
（ｃ）β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの採取方法
上記培養液から本発明の酵素を採取、精製するには、既知の精製法が単独もしくは併用して利用され得る。例えば、培養液を濾過または遠心分離することにより培養液中の菌体を除き、得られた上清液を、硫安、芒硝などによる塩析、またはメタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒による沈澱などに供することによって分画、濃縮し、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含有する粗酵素液が得られる。この粗酵素液は、さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および／またはその他の各種クロマトグラフィーを行うことにより精製され得る。好ましい精製法の概要を以下に示す。
【００２５】
（１）．培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清液を得る。
（２）．次いで、得られた上清液を硫安（５０％〜７０％飽和溶液）で塩析する。
（３）．次いで、得られた塩析液をｐＨ４．５の酢酸バッファーで透析し、ＣＭ−トヨパールカラムクロマトグラフィーにかける。
（４）．上記（３）で得られた活性画分をｐＨ８．０のトリス−塩酸バッファーで透析し、次いで、ＱＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィーにかける。
（５）．上記（４）で得られた活性画分を限外濾過膜で濃縮し、次いで、セファクリルＳ−２００カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにかける。
【００２６】
（ｄ）本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性測定法
本明細書においては、本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は、パラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドを基質として用い、１分間に１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）として測定する。具体的には本明細書においては、ｐＨ５．０の２５ｍＭ酢酸バッファーに溶解させた２．５ｍＭのパラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド溶液０．４ｍｌに、０．１ｍｌの試料溶液を加え、３７℃で１０分間反応させる。その後、２％炭酸ナトリウム溶液を２．５ｍｌ加えて反応を停止させ、反応液の波長４２０ｎｍにおける吸光度（パラニトロフェノールの遊離に伴って増加する）を測定する。
【００２７】
【作用】
本発明のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド結合を特異的に加水分解するエキソグリコシダーゼである。そのため、オリゴ糖および配糖体糖鎖等の糖質の非還元末端がβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドのとき、該グリコシド結合を加水分解して、非還元末端からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、その糖質の非還元末端がβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニドのとき、本酵素は作用せず、遊離単糖も生じさせない。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらはなんら本発明を限定するものではない。
【００２９】
実施例１
（酵素液の調製）
１００ｍｌの培地（０．２５％ジ−Ｎ−アセチルキトビオース、０．５％ポリペプトン、０．２５％酵母エキス、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、および０．０２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７）を含有する５００ｍｌ容振盪フラスコ４７本に、バシラス・メガテリウムＡＴ１８８を植菌し、３７℃で２日間、往復振盪培養を行った。培養終了後、この培養液を回収し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を除き、得られた培養上清中のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定して、本酵素の活性が０．４３Ｕ／ｍｌである培養上清を３９２０ｍｌ得た。この培養上清に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるまで加えた。生じた沈澱を遠心分離して除き、得られた上清にさらに７０％飽和になるまで硫酸アンモニウムを加えた。生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱をｐＨ６．０、２５ｍＭの酢酸バッファーに溶解し、次いでｐＨ５．０、５０ｍＭの酢酸バッファーで透析した。以上の操作により、本酵素活性が３３．２Ｕ／ｍｌである酵素液を３９．５ｍｌ得た。
【００３０】
実施例２
（精製酵素標品の調製）
上記実施例１で得られた酵素液３９．５ｍｌを、ｐＨ４．５、２５ｍＭの酢酸バッファーでさらに透析した。この透析液を、ｐＨ４．５、２５ｍＭの酢酸バッファーで平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラム（東ソー株式会社製）に吸着させ、０〜０．５Ｍの食塩濃度勾配をかけて溶出した。得られた本酵素画分をさらにｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファーで透析し、この透析液をｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファーで平衡化したＱＡＥ−トヨパール５５０Ｃカラム（東ソー株式会社製）に吸着させ、０〜０．５Ｍの食塩濃度勾配をかけて溶出した。得られた本酵素画分を次に限外濾過膜で濃縮し、この濃縮液を、ｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファーで平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（ファルマシアバイオテク社製）にかけてさらに本酵素を精製した。 以上の操作により、実施例１で得られた培養上清３９２０ｍｌ（計１６９０Ｕ）から、収率１４％で１３６０倍に精製された本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ溶液を１２ｍｌ（計２３８Ｕ）得た。本精製酵素の比活性は４８．２Ｕ／ｍｇであった。上記（ｃ）に記載の（１）〜（５）に対応した本実施例１および２の各精製工程における酵素の精製度合いを、表４に示す。表中の活性値は、いずれも上記（ｄ）に記載の測定方法に準じて測定した値である。
【００３１】
【表４】
以下の実施例では、特に記載のない限り、上記実施例２で得られた酵素液を用いた。
【００３３】
実施例３
（本酵素の基質特異性）
表５に示した各基質（パラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド、パラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド、パラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシド、パラニトロフェニル−β−Ｄ−マンノシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、パラニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド）を２５ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．０）および２５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解して作成した各基質の２．５ｍＭ溶液０．４ｍｌに、実施例１で作成した本酵素活性が０．４３Ｕ／ｍｌである精製酵素液を０．１ｍｌ加えて、３７℃で２０時間反応させた。その後、２．５ｍｌの２％炭酸ナトリウム溶液を加えて反応を停止した。得られた反応液における、遊離したパラニトロフェノールの増加に伴う波長４２０ｎｍにおける吸光度の変化量を、上記酵素液の代わりにｐＨ６．０、２５ｍＭの酢酸バッファーを加えたものをブランクテストとして測定した。結果を表５に示す。反応ｐＨ５．０およびｐＨ７．０のいずれの条件下でも、使用したパラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド以外の基質では上記吸光度の増加は認められなかった。
【００３４】
【表５】
種々のオリゴ糖基質に対する本酵素の反応性を比較した。表６に示した各種基質の０．２％溶液６７．５μｌに、４０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ６．０）７７．５μｌおよび１７．２Ｕ／ｍｌの精製酵素液を５μｌ加えて、１０〜２４０分間、３７℃で反応させた。その後、反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、反応の結果生成されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを定量した。結果を表６に示す。基質にＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇａｌを用いた場合の酵素反応速度を１００とした場合の相対反応速度（％）を示した。本酵素は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合におけるβ１−２、β１−３、β１−４およびβ１−６のいずれの結合様式にも反応した。
【００３６】
【表６】
さらにまた、表７に示した種々のピリジルアミノ化糖鎖（宝酒造株式会社製）を基質として、それらに対する本酵素の反応性を比較した。ここで用いたピリジルアミノ化糖鎖は、還元末端を２−ピリジルアミンで修飾した糖鎖（オリゴ糖）である。２−ピリジルアミンは蛍光物質であり、本酵素の微量（ピコモル単位）分析に適する。
【００３８】
２μｌの１０ピコモル／μｌピリジルアミノ化糖鎖溶液に、６μｌの２５ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）および２μｌの１３Ｕ／ｍｌ精製酵素液を加え、３７℃で１６時間反応させた後、４０μｌの１％トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止した。次いで、この反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。結果を表７に示す。非還元末端にβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を有する基質（１）〜（３）は、すべてのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合が完全に加水分解されたが、非還元末端にβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニド結合を有する基質（４）および（５）は全く加水分解されなかった。
【００３９】
【表７】
実施例４
（本酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲）
（１）至適ｐＨ
５０ｍＭブリトン−ロビンソン広域緩衝液により、ｐＨを３．０、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、８．０、および９．０に調整した以外は、上記（ｄ）に記載の方法に準じて、各ｐＨにおけるβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を測定した。結果を図１に示す。図中の横軸は反応ｐＨを表し、縦軸は、得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本酵素の至適ｐＨは５．０であった。
【００４１】
（２）安定ｐＨ範囲
９０ｍＭブリトン−ロビンソン広域緩衝液により、実施例１で得た酵素液のｐＨを３．０から１１．０まで０．５間隔で調整し、３７℃で１時間保持した後の本酵素の残存活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図２に示す。図中の横軸は上記調整ｐＨを表し、縦軸は、得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。ｐＨが４．５〜９．５の範囲で本酵素は安定であった。
【００４２】
実施例５
（本酵素の作用適温の範囲および熱安定性）
（１）作用適温の範囲
種々の反応温度条件（３０、３７、４０、４５、５０、５５、６０℃）下での本酵素活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図３に示す。図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本酵素の至適温度は５０℃であった。
【００４３】
（２）熱安定性
種々の温度条件（３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０℃）下、５ｍＭの塩化カルシウムを含む３７．５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、３０分間保持した後の本酵素の残存活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図４に示す。図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本酵素は、ｐＨ８．０で３０分間保持した場合、少なくとも４５℃までは安定であった。処理温度条件が４０℃の場合は、酵素活性は１００％保持された。
【００４４】
実施例６
（本酵素の分子量）
一般的なゲル濾過法（セファクリルＳ−２００ゲル濾過クロマトグラフィー）を用いて、本酵素の分子量を測定した。本酵素を含む試料を実施例２に記載のセファクリルＳ−２００カラムにかけ、次いで分子量既知の種々の標準試料を本酵素と同一条件でカラムにかけてゲル濾過し、それらの溶出位置と分子量の関係に基づいて分子量を測定した。図５に本酵素のセファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図中の横軸は上記カラムからの溶出液を分画回収したフラクション番号を表し、左側縦軸は回収した各フラクションの本酵素活性（Ｕ／ｍｌ；図中の●）、右側縦軸は各フラクションの２８０ｎｍ紫外吸光度（図中の○）を表す。図６に各標準試料の分子量（縦軸；×１０４）とＫａｖ値（横軸）の関係を示す。図６中のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれウシ肝臓カタラーゼ（分子量２３２，０００）、ウサギ筋肉アルドラーゼ（分子量１５８，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、およびオボ（ニワトリ卵白）アルブミン（分子量４３，０００）を示す。Ｋａｖ値は次式より求めた。
【００４５】
Ｋａｖ＝（［試料溶出体積］−［ボイド体積］）／（［カラム体積］−［ボイド体積］）。
【００４６】
ゲル濾過法（ゲル濾過クロマトグラフィー）により測定した本酵素の分子量は約１８０，０００である。
【００４７】
実施例７
（本酵素の等電点）
常法の等電点電気泳動法により本酵素の等電点を測定した。本酵素および等電点既知の種々の標準試料を同時に等電点電気泳動にかけ、その標準試料検出位置と等電点との関係に基づく検量線から、本酵素の等電点を測定した。本酵素の等電点は約４．８であった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、糖質の非還元末端のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を特異的に加水分解するβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、およびその生産方法が提供される。
【００４９】
本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンはまったく遊離させないので、構造解析が所望されるオリゴ糖および配糖体糖鎖の非還元末端のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの存在の有無を容易に判定し得、糖鎖の構造決定に非常に有用である。本酵素は微生物の培養によって生産されるため、簡便な工程で大量にかつ安価に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨ３．０〜９．０の範囲で本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。
【図２】本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをｐＨ３．０〜１１．０の各条件下、３７℃で１時間保持した後に測定した相対残存活性を示す。
【図３】３０〜６０℃の温度範囲で本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。
【図４】本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを３７．５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０〜６０℃の各温度条件下で３０分間保持した後に測定した相対残存活性を示す。
【図５】本酵素液のセファクリルＳ−２００カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにおけるクロマトグラムを示す。
【図６】ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した本β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの分子量を示す。
Claims (4)
- 非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンは遊離させないエキソグリコシダーゼであり、
以下の特性：
至適ｐＨ：５ . ０；
安定ｐＨ範囲：３７℃で１時間保持する場合において、ｐＨ４ . ５〜９ . ５；
作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
熱安定性：ｐＨ８ . ０で３０分間保持した場合に、４５℃まで安定である；
ゲル濾過クロマトグラフィーにおける分子量：１８０ , ０００；および
等電点電気泳動における等電点：４ . ８；
を包含する、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ。 - バシラス属に属する細菌が生産する、請求項１に記載のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ。
- 非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンは遊離させないエキソグリコシダーゼであり、
以下の特性：
至適ｐＨ：５ . ０；
安定ｐＨ範囲：３７℃で１時間保持する場合において、ｐＨ４ . ５〜９ . ５；
作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
熱安定性：ｐＨ８ . ０で３０分間保持した場合に、４５℃まで安定である；
ゲル濾過クロマトグラフィーにおける分子量：１８０ , ０００；および
等電点電気泳動における等電点：４ . ８；
を包含する、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産する方法であって、以下の工程：
(a)該β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産するバシラス属細菌を培養する工程；
および
(b)該培養工程(a)により得られた培養物より、該β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを採取する工程；
を包含する、方法。 - 前記バシラス属細菌が、バシラス・メガテリウムＡＴ１８８株（生命研菌寄第１４７９３号）である、請求項３に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9535695A JP3617688B2 (ja) | 1995-04-20 | 1995-04-20 | β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9535695A JP3617688B2 (ja) | 1995-04-20 | 1995-04-20 | β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08289784A JPH08289784A (ja) | 1996-11-05 |
| JP3617688B2 true JP3617688B2 (ja) | 2005-02-09 |
Family
ID=14135379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9535695A Expired - Fee Related JP3617688B2 (ja) | 1995-04-20 | 1995-04-20 | β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3617688B2 (ja) |
-
1995
- 1995-04-20 JP JP9535695A patent/JP3617688B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08289784A (ja) | 1996-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6277616B1 (en) | Endo-fucoidan-lyase | |
| US4710470A (en) | Process for producing neuraminidase | |
| JP2769992B2 (ja) | グルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼ | |
| JP3026857B2 (ja) | 新規プルラナーゼおよびその製造法 | |
| JP3617688B2 (ja) | β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ | |
| JP3235904B2 (ja) | 耐熱性マンノースイソメラーゼ及びその製造法並びにこれを用いたマンノースの製造法 | |
| EP0771868A1 (en) | Novel deaminoneuraminidase and process for producing the same | |
| Chiba et al. | Stereochemical studies of D-glucal hydration by. alpha.-glucosidases and exo-. alpha.-glucanases: indications of plastic and conserved phases in catalysis by glycosylases | |
| JP3793269B2 (ja) | β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ | |
| JP2970932B2 (ja) | 新規耐熱性β―ガラクトシル基転移酵素、その製造法及びその用途 | |
| JP3100012B2 (ja) | 新規なノイラミニダーゼ、その製造法及びそれを使用するシアル酸結合化合物の製造法 | |
| JP3920073B2 (ja) | 新規α−１，２−マンノシダーゼ及び該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造法 | |
| CA1195275A (en) | Process for preparing fructose | |
| JP3183970B2 (ja) | シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造方法 | |
| TW202138557A (zh) | 寡糖氧化酵素及其製備方法與轉化幾丁寡糖酸之方法 | |
| JP4000250B2 (ja) | キトビオース生産酵素及びキトビオースの製造方法 | |
| JPS6098982A (ja) | ポリアミン測定用酵素の製造法 | |
| JPH05252946A (ja) | 新規糖質加水分解酵素 | |
| JP3812954B2 (ja) | イソマルトシルフラクトシドの製造方法 | |
| JP2819310B2 (ja) | 新規エキソ―β―Ｄ―グルコサミニダーゼ及びその製造法 | |
| JPH0789922B2 (ja) | 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 | |
| JPH10234393A (ja) | オリゴ糖の製造法 | |
| JPH07184646A (ja) | 新規なα−Ｌ−フコシダーゼ及びその製造方法 | |
| JPH04360685A (ja) | 新規なα−Ｌ−フコシダーゼ及びその製造方法 | |
| JPH062058B2 (ja) | キチナ−ゼおよびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20040819 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20041008 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20041102 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20041104 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081119 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091119 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091119 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101119 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |