JPH0789922B2 - 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法Info
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- JPH0789922B2 JPH0789922B2 JP62214230A JP21423087A JPH0789922B2 JP H0789922 B2 JPH0789922 B2 JP H0789922B2 JP 62214230 A JP62214230 A JP 62214230A JP 21423087 A JP21423087 A JP 21423087A JP H0789922 B2 JPH0789922 B2 JP H0789922B2
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- chitin
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵素によるＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造
方法に関するものである。
方法に関するものである。
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の応用用途については、６量
体であるＮ−アセチルキトヘキサオースの免疫機能増強
作用、抗腫瘍効果など、医薬面での効果が期待されてい
る。臨床検査薬分野においては、β−Ｎ−アセチルグリ
コサミニダーゼやリゾチームの測定基質として使用する
ことができる。
体であるＮ−アセチルキトヘキサオースの免疫機能増強
作用、抗腫瘍効果など、医薬面での効果が期待されてい
る。臨床検査薬分野においては、β−Ｎ−アセチルグリ
コサミニダーゼやリゾチームの測定基質として使用する
ことができる。
従来の技術 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法としては、酸による
部分分解により各種オリゴ糖を得る方法〔ジェイ・エイ
・ルプリー；バイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ
（Biochem.Biophys.Acta）83,245−255（1964）〕があ
るが、本方法によっては、特定のオリゴ糖を選択的に得
ることはできず、また分解条件を必ずしも一定に保つこ
とは難しく、そのため収率も低い。
部分分解により各種オリゴ糖を得る方法〔ジェイ・エイ
・ルプリー；バイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ
（Biochem.Biophys.Acta）83,245−255（1964）〕があ
るが、本方法によっては、特定のオリゴ糖を選択的に得
ることはできず、また分解条件を必ずしも一定に保つこ
とは難しく、そのため収率も低い。
一方、キチンを原料としてキチナーゼにより酵素分解し
て調製する方法〔アール・エフ・パウニングら；ネイチ
ャー（Nature）200,1128（1963）〕もあるが、本方法に
よっても、特定のＮ−アセチルキトオリゴ糖を効率的に
調製することは同様に困難である。
て調製する方法〔アール・エフ・パウニングら；ネイチ
ャー（Nature）200,1128（1963）〕もあるが、本方法に
よっても、特定のＮ−アセチルキトオリゴ糖を効率的に
調製することは同様に困難である。
さらに、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法について
は、ノカルジア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
の逆反応を利用する方法が報告されている（特開昭62−
146598）。本方法は、硫安沈澱、カラムクロマト分離な
どにより精製された精製キチナーゼを用いて、Ｎ−アセ
チルキトテトラオースからＮ−アセチルキトヘキサオー
ス、Ｎ−アセチルキトペンタオースからＮ−アセチルキ
トヘプタオースなど２糖単位の付加転移を行うものであ
る。本方法の場合、高度に精製した酵素を用いることが
必須であり、必ずしも安価なＮ−アセチルキトオリゴ糖
の製造法とはいえない。
は、ノカルジア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
の逆反応を利用する方法が報告されている（特開昭62−
146598）。本方法は、硫安沈澱、カラムクロマト分離な
どにより精製された精製キチナーゼを用いて、Ｎ−アセ
チルキトテトラオースからＮ−アセチルキトヘキサオー
ス、Ｎ−アセチルキトペンタオースからＮ−アセチルキ
トヘプタオースなど２糖単位の付加転移を行うものであ
る。本方法の場合、高度に精製した酵素を用いることが
必須であり、必ずしも安価なＮ−アセチルキトオリゴ糖
の製造法とはいえない。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、酵素を用いてより安価に重合度の高いＮ−ア
セチルキトオリゴ糖を製造する方法を提供する。
セチルキトオリゴ糖を製造する方法を提供する。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、より安価なＮ−セチルキトオリゴ糖の製
造方法について鋭意検討した結果、トリコデルマ属に属
する微生物の培養物に、糖転移付加反応の強いキチナー
ゼ活性を見出し、さらにノカルジア属に属する微生物の
培養物より精製されたキチナーゼに見出されている２糖
の転移付加活性に加え、１糖単位が転移付加される活性
を新たに見出し本発明を完成させるに至った。本発明に
示す微生物の培養物中のキチナーゼの糖転移付加活性
は、ノカルジア属に属する微生物の場合に比べはるかに
強力であって、従って、ノカルジア属に属する微生物の
場合と同様に微生物の培養物から精製した酵素を反応に
用いることができるにとどまらず、精製した酵素を用い
ずに、その培養液、菌体あるいは、培養物よりキトビア
ーゼ活性を除去した粗精製酵素を用いてもＮ−アセチル
キトオリゴ糖を製造することができる。例えば、ノカル
ジア属に属する微生物の場合には、菌体を除去した培養
液から塩析により取得した沈殿物を、さらに、溶解、透
析、イオン交換体クロマトグラフィー、塩析、溶解、透
析、ゲルクロマトグラフィーの順に従って精製した酵素
を用いることが必須であったが、本発明による微生物の
場合には、菌体を除去した培養液から塩析により取得し
た沈殿物を、単に、緩衝液に溶解し、イオン交換体クロ
マトグラフィーによって精製するだけで、Ｎ−アセチル
キトオリゴ糖を製造することのできる酵素を取得するこ
とができる。
造方法について鋭意検討した結果、トリコデルマ属に属
する微生物の培養物に、糖転移付加反応の強いキチナー
ゼ活性を見出し、さらにノカルジア属に属する微生物の
培養物より精製されたキチナーゼに見出されている２糖
の転移付加活性に加え、１糖単位が転移付加される活性
を新たに見出し本発明を完成させるに至った。本発明に
示す微生物の培養物中のキチナーゼの糖転移付加活性
は、ノカルジア属に属する微生物の場合に比べはるかに
強力であって、従って、ノカルジア属に属する微生物の
場合と同様に微生物の培養物から精製した酵素を反応に
用いることができるにとどまらず、精製した酵素を用い
ずに、その培養液、菌体あるいは、培養物よりキトビア
ーゼ活性を除去した粗精製酵素を用いてもＮ−アセチル
キトオリゴ糖を製造することができる。例えば、ノカル
ジア属に属する微生物の場合には、菌体を除去した培養
液から塩析により取得した沈殿物を、さらに、溶解、透
析、イオン交換体クロマトグラフィー、塩析、溶解、透
析、ゲルクロマトグラフィーの順に従って精製した酵素
を用いることが必須であったが、本発明による微生物の
場合には、菌体を除去した培養液から塩析により取得し
た沈殿物を、単に、緩衝液に溶解し、イオン交換体クロ
マトグラフィーによって精製するだけで、Ｎ−アセチル
キトオリゴ糖を製造することのできる酵素を取得するこ
とができる。
本発明の方法において用いられる酵素は、トリコデルマ
属に属する微生物の生産するキチナーゼであって少なく
とも３種類の酵素である。そのうちの１種は精製単離さ
れており次に示す如き理化学的性質を有する。
属に属する微生物の生産するキチナーゼであって少なく
とも３種類の酵素である。そのうちの１種は精製単離さ
れており次に示す如き理化学的性質を有する。
（ａ） 作 用 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、強い２糖単位の糖
転移反応を起こす。本酵素の酵素量に対し過剰のＮ−ア
セチルキトオリゴ糖を作用させた場合、糖転移反応によ
り重合度の高いＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成する。
またキチンまたはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、
これを加水分解する。
転移反応を起こす。本酵素の酵素量に対し過剰のＮ−ア
セチルキトオリゴ糖を作用させた場合、糖転移反応によ
り重合度の高いＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成する。
またキチンまたはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、
これを加水分解する。
（ｂ） 至適pH コロイドキチンを基質として40℃で反応を行った場合、
本酵素はpH5.5に至適pHを有する。
本酵素はpH5.5に至適pHを有する。
（ｃ） pH安定性 本酵素は４℃で24時間の処理においてpH4〜８で安定で
ある。
ある。
（ｄ） 至適温度 コロイドキチンを基質としてpH5.5で反応を行った場
合、本酵素は40℃付近に至適温度を有する。
合、本酵素は40℃付近に至適温度を有する。
（ｅ） 熱安定性 本酵素はpH5.5で30分間の処理において55℃以下で安定
である。
である。
（ｆ） 分子量 SDS−ディスク電気泳動により測定される本酵素の分子
量は約68000である。
量は約68000である。
（ｇ） 等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定される本酵
素の等電点は4.5〜4.6である。
素の等電点は4.5〜4.6である。
本発明のキチナーゼは、次のようにして製造することが
できる。
できる。
本発明に用いられるキチナーゼは、トリコデルマ属に属
するキチナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物中にキチ
ナーゼを生成させ、これを採取することにより得ること
ができる。
するキチナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物中にキチ
ナーゼを生成させ、これを採取することにより得ること
ができる。
酵素生産に用いるトリコデルマ属に属するキチナーゼ生
産菌としては、トリコデルマ属に属しキチナーゼを生産
する菌であればいずれでも用いることができる。その例
としては、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichode
rma reesei）が挙げられ、具体的にはトリコデルマ・リ
ーセイKDD−10（NRRL−15497）（特開昭60−27385）、
同KDR−11（FERM−P6635）（特開昭59−17984）、同PC
−３−７（NRRL−15500）（特開昭60−27384）、同PCD
−10（FERM−P8172）（特開昭61−265089）、同CDU−11
（FERM−P8173）（特開昭61−265089）などが挙げられ
る。培養に用いられる培地は、上記微生物が利用し得る
炭素源、窒素源、無機物など程よく含むものであれば天
然培地または合成培地のいづれでも用いることができ
る。
産菌としては、トリコデルマ属に属しキチナーゼを生産
する菌であればいずれでも用いることができる。その例
としては、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichode
rma reesei）が挙げられ、具体的にはトリコデルマ・リ
ーセイKDD−10（NRRL−15497）（特開昭60−27385）、
同KDR−11（FERM−P6635）（特開昭59−17984）、同PC
−３−７（NRRL−15500）（特開昭60−27384）、同PCD
−10（FERM−P8172）（特開昭61−265089）、同CDU−11
（FERM−P8173）（特開昭61−265089）などが挙げられ
る。培養に用いられる培地は、上記微生物が利用し得る
炭素源、窒素源、無機物など程よく含むものであれば天
然培地または合成培地のいづれでも用いることができ
る。
炭素源としては、アビセル、ホエー、紙、一般紙類
（例えば、新聞紙、トイレットペーパー）、バガス、も
みがら、稲わらなどの植物繊維質およびその含有物、シ
ュークロース、グルコース、ケーンモラセス、ゲルセロ
ール、セロビオース、キシロース、アラビノースなどが
単独もしくは組み合わせて用いられる。
（例えば、新聞紙、トイレットペーパー）、バガス、も
みがら、稲わらなどの植物繊維質およびその含有物、シ
ュークロース、グルコース、ケーンモラセス、ゲルセロ
ール、セロビオース、キシロース、アラビノースなどが
単独もしくは組み合わせて用いられる。
窒素源としては、硫安などの無機アンモニウム塩、尿
素、アミノ酸、肉エキス、ポリペプトン、ペプトンなど
の有機物が単独もしくは組み合わせて用いられる。
素、アミノ酸、肉エキス、ポリペプトン、ペプトンなど
の有機物が単独もしくは組み合わせて用いられる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カ
リウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化銅、
硫酸鉄、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛などが単独もしく
は組み合わせて用いられる。
リウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化銅、
硫酸鉄、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛などが単独もしく
は組み合わせて用いられる。
さらに必要に応じて、培地に界面活性剤などを添加して
もよい。
もよい。
また、キチナーゼの生産能をより高めるには誘導基質で
あるキチンを添加することが好ましい。
あるキチンを添加することが好ましい。
培地は、液体培地でも固体培地でも良いが、大量に行う
場合には液体培地が好ましい。培養方法としては通常、
通気撹拌培養などの方法が用いられる。培養条件は、培
地の組成、菌株の種類によって異なるが、培養温度は25
〜35℃、pHは３〜６、培養時間は２〜15日間である。培
養は、培養途中でさらに新たな培地を該培養培地に一括
添加または間欠もしくは連続添加しながら行うこともで
きる。目的とするキチナーゼは通常菌体外に蓄積される
ので、公知の分離精製手段により、培養物から分離精製
される。例えば、培養物から遠心分離あるいは過によ
り菌体を除去した後、培養液に飽和量の芒硝（硫酸ナ
トリウム10水塩）または硫酸アンモニウムなどの塩を加
えて沈殿物を得る。この沈澱物を過あるいは遠心分離
などの方法によ分離取得した後、風乾、凍結乾燥、アセ
トンなど親水溶媒による脱水乾燥などの方法で乾燥粉末
とする。このような方法で得られた材料を、粗酵素粉末
とする。粗酵素粉末からのキチナーゼの分離精製は、DE
AE−Sepharose（ファルマシア・ファイン・ケミカル社
製）などの１段階のイオン交換クロマトグラフィー、ま
たは硫安分画操作など、キトビアーゼ活性を除くことの
できる操作ならいずれの操作でもよく、簡単な単位操作
で精製を行うことができる。
場合には液体培地が好ましい。培養方法としては通常、
通気撹拌培養などの方法が用いられる。培養条件は、培
地の組成、菌株の種類によって異なるが、培養温度は25
〜35℃、pHは３〜６、培養時間は２〜15日間である。培
養は、培養途中でさらに新たな培地を該培養培地に一括
添加または間欠もしくは連続添加しながら行うこともで
きる。目的とするキチナーゼは通常菌体外に蓄積される
ので、公知の分離精製手段により、培養物から分離精製
される。例えば、培養物から遠心分離あるいは過によ
り菌体を除去した後、培養液に飽和量の芒硝（硫酸ナ
トリウム10水塩）または硫酸アンモニウムなどの塩を加
えて沈殿物を得る。この沈澱物を過あるいは遠心分離
などの方法によ分離取得した後、風乾、凍結乾燥、アセ
トンなど親水溶媒による脱水乾燥などの方法で乾燥粉末
とする。このような方法で得られた材料を、粗酵素粉末
とする。粗酵素粉末からのキチナーゼの分離精製は、DE
AE−Sepharose（ファルマシア・ファイン・ケミカル社
製）などの１段階のイオン交換クロマトグラフィー、ま
たは硫安分画操作など、キトビアーゼ活性を除くことの
できる操作ならいずれの操作でもよく、簡単な単位操作
で精製を行うことができる。
この精製方法により、３種のキチナーゼを得ることがで
きる。１種は１糖単位の転移付加反応を有し、他の２種
は２糖単位の転移付加反応を有する。２糖単位の転移付
加反応の活性が強い方の酵素の理化学的性質は前記のと
おりである。
きる。１種は１糖単位の転移付加反応を有し、他の２種
は２糖単位の転移付加反応を有する。２糖単位の転移付
加反応の活性が強い方の酵素の理化学的性質は前記のと
おりである。
このようにして得られるキチナーゼの活性や糖転移反応
は次のようにして測定する。
は次のようにして測定する。
（１） キチナーゼの活性 0.2％コロイドキチンを含む0.2M酢酸緩衝液（pH5.6）2.
0mlに酵素液を加えて40℃で10分間反応させる。反応後
はシャール試薬（0.5gのフェリシアン化カリウムを0.5M
炭酸ナトリウム溶液１に溶解したもの）3.0mlを加え
沸騰湯中で15分間加熱する。水で冷却後、遠心分離して
不溶物を除き上清液の420nmにおける吸光度の減少を測
定する。還元糖の生成はＮ−アセチルグルコサミンを用
いた標準曲線から求める。酵素活性1Uは１分間に１μmo
leのＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵素量とし
た。
0mlに酵素液を加えて40℃で10分間反応させる。反応後
はシャール試薬（0.5gのフェリシアン化カリウムを0.5M
炭酸ナトリウム溶液１に溶解したもの）3.0mlを加え
沸騰湯中で15分間加熱する。水で冷却後、遠心分離して
不溶物を除き上清液の420nmにおける吸光度の減少を測
定する。還元糖の生成はＮ−アセチルグルコサミンを用
いた標準曲線から求める。酵素活性1Uは１分間に１μmo
leのＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵素量とし
た。
（２） 糖転移反応 ５％のＮ−アセチルキトオリゴ糖を含む0.1Mリン酸緩衝
液（pH5.6）2mlに酵素溶液を加えて40℃で60時間反応さ
せる。一定時間ごとに反応液を採取し沸騰湯中で10分加
熱し反応を停止させる。これら溶液を高速液体クロマト
グラフィーに供し、反応生成物を確認する。
液（pH5.6）2mlに酵素溶液を加えて40℃で60時間反応さ
せる。一定時間ごとに反応液を採取し沸騰湯中で10分加
熱し反応を停止させる。これら溶液を高速液体クロマト
グラフィーに供し、反応生成物を確認する。
本発明の原料としては、キチン部分加水分解物、Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖などが用いられる。
セチルキトオリゴ糖などが用いられる。
これらキチン部分加水分解物は、キチンを濃塩酸で40℃
で２〜３時間加水分解しアルカリで中和した後、活性炭
に吸着させアルコールで溶出することによって調製でき
る。また、キチン部分加水分解物は、キチンを酸または
アルカリで可溶化後中和し、キチナーゼを作用させて部
分分解させ、その後、UF膜で処理した透過液を活性炭に
吸着させアルコールで溶出することによって調製でき
る。キチン部分加水分解物は、２〜８量体のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を含むそれぞれのＮ−アセチルキトオリ
ゴ糖は、上記アルコール溶出時に、アルコール濃度勾配
をかけて溶出したり、あるいは、ゲル過や高速液体ク
ロマトグラフィーなどの手段により分離し調製すること
ができる。
で２〜３時間加水分解しアルカリで中和した後、活性炭
に吸着させアルコールで溶出することによって調製でき
る。また、キチン部分加水分解物は、キチンを酸または
アルカリで可溶化後中和し、キチナーゼを作用させて部
分分解させ、その後、UF膜で処理した透過液を活性炭に
吸着させアルコールで溶出することによって調製でき
る。キチン部分加水分解物は、２〜８量体のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を含むそれぞれのＮ−アセチルキトオリ
ゴ糖は、上記アルコール溶出時に、アルコール濃度勾配
をかけて溶出したり、あるいは、ゲル過や高速液体ク
ロマトグラフィーなどの手段により分離し調製すること
ができる。
本発明で上記原料と上記キチナーゼを作用させるには、
原料を0.5〜30重量％含むものを基質とし、pH3〜７、温
度30〜60℃で酵素量は基質1g当り１〜2000Uを用いて反
応させると良い。反応時間は、基質量、反応pH、温度、
酵素量などによって大きく異なるが、通常30分〜60時間
である。かくして酵素反応を終了した反応混合物は沸騰
湯中で10分間加熱し反応を停止させる。
原料を0.5〜30重量％含むものを基質とし、pH3〜７、温
度30〜60℃で酵素量は基質1g当り１〜2000Uを用いて反
応させると良い。反応時間は、基質量、反応pH、温度、
酵素量などによって大きく異なるが、通常30分〜60時間
である。かくして酵素反応を終了した反応混合物は沸騰
湯中で10分間加熱し反応を停止させる。
上記酵素反応により１以上の糖が転移付加したＮ−アセ
チルキトオリゴ糖を含む反応混合物が得られる。
チルキトオリゴ糖を含む反応混合物が得られる。
このようにして得られる反応混合物からのＮ−アセチル
キトオリゴ糖の分離精製は、周知の分離、精製手段によ
り行うことができる。たとえば、活性炭に反応混合物を
吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離溶出させる
方法や、ゲル過、高速液体クロマトグラフィーなどの
手段により分離、精製することができる。
キトオリゴ糖の分離精製は、周知の分離、精製手段によ
り行うことができる。たとえば、活性炭に反応混合物を
吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離溶出させる
方法や、ゲル過、高速液体クロマトグラフィーなどの
手段により分離、精製することができる。
次に、本発明の参考例および実施例についてさらに具体
的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するもの
ではない。
的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するもの
ではない。
参考例１ KDR−11をポテトデキストロース寒天培地で28℃で７日
間培養し活性化した。該活性化胞子を生理食塩水に均一
に懸濁した（約108個/ml）。その懸濁液0.5mlを50mlの
第１表に示す標準培地に植菌し、28℃、pH4で２日間培
養した。
間培養し活性化した。該活性化胞子を生理食塩水に均一
に懸濁した（約108個/ml）。その懸濁液0.5mlを50mlの
第１表に示す標準培地に植菌し、28℃、pH4で２日間培
養した。
アビセルpH301（旭化成社製） １ ％ ポリペプトン 0.1 ％ 酵母エキス 0.05 ％ （NH4）2SO4 0.14 ％ KH2PO4 0.2 ％ MgSO4・7H2O 0.03 ％ CaCl2・2H2O 0.03 ％ トゥイーン−80（花王アトラス社製） 1ml/ 微量金属塩液＊ 1ml/ ＊〔ホウ酸 ６ mg モリブデン酸アンモニウム 26 mg 塩化第二鉄 100 mg 硫酸銅 40 mg 塩化マンガン ８ mg 塩化亜鉛 200 mg を100mlのイオン交換水に溶かしたもの〕 ついで、該培養液250ml（フラスコ５本分）を2500mlの
標準培地を含有する５ジャーファーメンターに添加し
て28℃、pH4で２日間種培養した。さらに該種培養液250
mlを2500mlの培地（第１表の標準培地において、アビセ
ルpH301を６％に代え、さらにコロイドキチン0.5％を加
えたもの）を含有する５ジャーファーメンターに添加
し、28℃、pH4で10日間培養した。
標準培地を含有する５ジャーファーメンターに添加し
て28℃、pH4で２日間種培養した。さらに該種培養液250
mlを2500mlの培地（第１表の標準培地において、アビセ
ルpH301を６％に代え、さらにコロイドキチン0.5％を加
えたもの）を含有する５ジャーファーメンターに添加
し、28℃、pH4で10日間培養した。
培養終了後、培養液を過し、その上澄液中のキチナー
ゼ活性を求めたところ、6.2U/mlであった。
ゼ活性を求めたところ、6.2U/mlであった。
さらに、培養液を8000r.p.m.15分間で遠心分離した。得
られた液に硫安を0.8飽和度で添加し、５℃で24時間
塩析した。沈澱したタンパク質と塩の混合物を別し
液を水に溶解抽出後、セファデックスＧ−25（フアルマ
シア・ファイン・ケミカル社製）カラムに通液し蒸留水
で溶出を行い脱塩した。
られた液に硫安を0.8飽和度で添加し、５℃で24時間
塩析した。沈澱したタンパク質と塩の混合物を別し
液を水に溶解抽出後、セファデックスＧ−25（フアルマ
シア・ファイン・ケミカル社製）カラムに通液し蒸留水
で溶出を行い脱塩した。
ついで溶出液を凍結乾燥し、粗酵素標品約50gを得た。
本粗酵素標品のキチナーゼ活性は0.28U/mgであった。
本粗酵素標品のキチナーゼ活性は0.28U/mgであった。
この粗酵素標品2gを、予め50mM酢酸緩衝液（pH5.0）で
平衡化しておいたDEAE−Sepharose Fast Flow（ファル
マシア・ファイン・ケミカル社製）イオン交換体カラム
（3.2φ×50cm）に通塔し、18mlずつ分取したところ、
素通り画分に２つのキチナーゼ活性を有する画分Ｆ−Ｉ
（フラクション番号10−30）とＦ−II（フラクション番
号40−45）を得た。
平衡化しておいたDEAE−Sepharose Fast Flow（ファル
マシア・ファイン・ケミカル社製）イオン交換体カラム
（3.2φ×50cm）に通塔し、18mlずつ分取したところ、
素通り画分に２つのキチナーゼ活性を有する画分Ｆ−Ｉ
（フラクション番号10−30）とＦ−II（フラクション番
号40−45）を得た。
さらに、吸着部を０〜0.5M NaCl直線濃度勾配により溶
出させると、フラクション130〜140にキチナーゼ活性を
有するＦ−III画分を得た。第１図に本カラムの溶出パ
ターンを示した。Ｆ−III画分をさらにSephacryl S−20
0（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製1.6φ×95c
m）に通塔し、50mMの酢酸緩衝液（pH5.5）で溶出を行っ
た。2mlずつ分取し、キチナーゼ活性を有するフラクシ
ョン40−52を集め、濃縮し、凍結乾燥したところ、精製
酵素粉末約250mgを得た。このようにして得られたキチ
ナーゼはSDS−ディスク電気泳動で均一であった。
出させると、フラクション130〜140にキチナーゼ活性を
有するＦ−III画分を得た。第１図に本カラムの溶出パ
ターンを示した。Ｆ−III画分をさらにSephacryl S−20
0（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製1.6φ×95c
m）に通塔し、50mMの酢酸緩衝液（pH5.5）で溶出を行っ
た。2mlずつ分取し、キチナーゼ活性を有するフラクシ
ョン40−52を集め、濃縮し、凍結乾燥したところ、精製
酵素粉末約250mgを得た。このようにして得られたキチ
ナーゼはSDS−ディスク電気泳動で均一であった。
実施例１ Ｎ−アセチルキトトリオース1gを40mlの0.1Mリン酸緩衝
液（pH5.6）に溶解し、30℃に保った後、参考例１のＦ
−Ｉ画分を４〜5U相当分添加して、30℃で24時間反応さ
せた。
液（pH5.6）に溶解し、30℃に保った後、参考例１のＦ
−Ｉ画分を４〜5U相当分添加して、30℃で24時間反応さ
せた。
反応終了後、100℃で10分間加熱し、反応を停止させ
た。得られた反応混合物を3,000r.p.m.10分間遠心分離
し、その上清を高速液体クロマトグラフィーにかけ、そ
の組成を調べたところ、Ｎ−アセチルキトテトラオース
13％、Ｎ−アセチルキトペンタオース２％、Ｎ−アセチ
ルキトトリオース47％、Ｎ−アセチルキトビオース26
％、Ｎ−アセチルグルコサミン12％であった。
た。得られた反応混合物を3,000r.p.m.10分間遠心分離
し、その上清を高速液体クロマトグラフィーにかけ、そ
の組成を調べたところ、Ｎ−アセチルキトテトラオース
13％、Ｎ−アセチルキトペンタオース２％、Ｎ−アセチ
ルキトトリオース47％、Ｎ−アセチルキトビオース26
％、Ｎ−アセチルグルコサミン12％であった。
実施例２ Ｎ−アセチルキトテトラオース1gを40mlの0.1Mリン酸緩
衝液（pH5.6）に溶解し、30℃に保った後、Ｆ−II画分
を４〜5U相当分添加して、30℃で24時間反応させた。反
応終了後、100℃で10分間加熱し、反応を停止させた。
得られた反応混合物を3,000r.p.m.、10分間遠心分離に
かけ、その上清を高速液体クロマトグラフィーにかけ
て、その組成を調べたところ、Ｎ−アセチルキトヘキサ
オース２％、Ｎ−アセチルキトテトラオース88％、Ｎ−
アセチルキトトリオース７％、Ｎ−アセチルキトビオー
ス２％、Ｎ−アセチルグルコサミン１％であった。
衝液（pH5.6）に溶解し、30℃に保った後、Ｆ−II画分
を４〜5U相当分添加して、30℃で24時間反応させた。反
応終了後、100℃で10分間加熱し、反応を停止させた。
得られた反応混合物を3,000r.p.m.、10分間遠心分離に
かけ、その上清を高速液体クロマトグラフィーにかけ
て、その組成を調べたところ、Ｎ−アセチルキトヘキサ
オース２％、Ｎ−アセチルキトテトラオース88％、Ｎ−
アセチルキトトリオース７％、Ｎ−アセチルキトビオー
ス２％、Ｎ−アセチルグルコサミン１％であった。
実施例３ Ｎ−アセチルキトテトラオース100mgを2mlの0.1Mリン酸
緩衝液（pH5.6）に溶解し、40℃に保った後、Ｆ−III画
分を４〜5U相当分添加して、40℃で56時間反応させた。
反応が進むにつれて、反応液の濁りが増大し、最後には
沈殿物を生成した。反応終了後、100℃で10分間加熱
し、反応を停止させた。沈殿物を遠心分離（3,000r.p.
m.10分間）して除き、上清液をBio Gel P−４（2.6φ×
95cm;バイオラッド社製）に通塔し、蒸留水で溶出を行
い、4mlずつ分取した。フラクション番号34〜40を集め
て減圧濃縮し、次いで凍結乾燥することによりＮ−アセ
チルキトヘキサオース16mgを得た。なお、反応液中の不
溶（5mg）は、７糖以上の重合度の高い高級オリゴマー
であることを確認した。
緩衝液（pH5.6）に溶解し、40℃に保った後、Ｆ−III画
分を４〜5U相当分添加して、40℃で56時間反応させた。
反応が進むにつれて、反応液の濁りが増大し、最後には
沈殿物を生成した。反応終了後、100℃で10分間加熱
し、反応を停止させた。沈殿物を遠心分離（3,000r.p.
m.10分間）して除き、上清液をBio Gel P−４（2.6φ×
95cm;バイオラッド社製）に通塔し、蒸留水で溶出を行
い、4mlずつ分取した。フラクション番号34〜40を集め
て減圧濃縮し、次いで凍結乾燥することによりＮ−アセ
チルキトヘキサオース16mgを得た。なお、反応液中の不
溶（5mg）は、７糖以上の重合度の高い高級オリゴマー
であることを確認した。
実施例４ Ｎ−アセチルキトテトラオース100mgを2mlの0.1Mリン酸
緩衝液（pH5.6）に溶解し、40℃に保った後、精製した
キチナーゼ４〜5U添加して、40℃で56時間反応させた。
反応終了後100℃で10分間加熱し、反応を停止させた。
沈殿物を遠心分離（3,000r.p.m.10分間）して除き、上
清液をBio Gel P−４（2.6φ×95cm;バイオラッド社
製）に通塔し、蒸留水で溶出を行い、4mlずつ分取し
た。フラクション番号58〜65を集めて減圧濃縮し、次い
で凍結乾燥することにより、Ｎ−アセチルキトヘキサオ
ース15mgを得た。
緩衝液（pH5.6）に溶解し、40℃に保った後、精製した
キチナーゼ４〜5U添加して、40℃で56時間反応させた。
反応終了後100℃で10分間加熱し、反応を停止させた。
沈殿物を遠心分離（3,000r.p.m.10分間）して除き、上
清液をBio Gel P−４（2.6φ×95cm;バイオラッド社
製）に通塔し、蒸留水で溶出を行い、4mlずつ分取し
た。フラクション番号58〜65を集めて減圧濃縮し、次い
で凍結乾燥することにより、Ｎ−アセチルキトヘキサオ
ース15mgを得た。
発明の効果 本発明により、工業的に安価に重合度の高いＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を得ることができる。
ルキトオリゴ糖を得ることができる。
第１図は、参考例１に示したDEAE−Sepharose Fast flo
wの溶出パターンを示したものである。 −−は280nmでの吸光度、○−−○はキチナーゼ活性、
●−−●はキトビアーゼ活性、……はNaCl濃度を示す。
wの溶出パターンを示したものである。 −−は280nmでの吸光度、○−−○はキチナーゼ活性、
●−−●はキトビアーゼ活性、……はNaCl濃度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:885）
Claims (3)
- 【請求項１】トリコデルマ属に属し、キチナーゼ生産能
を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にキチナ
ーゼを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とする
キチナーゼの製造法。 - 【請求項２】トリコデルマ属に属し、キチナーゼ生産能
を有する微生物の培養液、菌体、またはそれらの処理物
と、キチン部分加水分解物またはＮ−アセチルキトオリ
ゴ糖とを水性溶液中で接触させることにより該水性溶液
中に原料中のＮ−アセチルキトオリゴ糖に１以上の糖が
転移付加したＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成蓄積さ
せ、これを採取することを特徴とする酵素によるＮ−ア
セチルキトオリゴ糖の製造法。 - 【請求項３】下記理化学的性質を有する新規キチナーゼ １）作用および基質特異性:N−アセチルキトオリゴ糖に
作用し、強い２糖単位の糖転移反応を起こす。また、キ
チンまたはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを
加水分解する。 ２）至適pH:40℃でpH5.5に至適pHを有する（基質：コロ
イドキチン） ３）至適温度:pH5.5で40℃付近に至適温度を有する（基
質：コロイドキチン） ４）熱安定性:pH5.5、55℃、30分間の処理に安定 ５）pH安定性:4℃、pH4〜８、24時間の処理に安定 ６）分子量:68000（SDS−PAGE法） ７）等電点:4.5〜4.6
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62214230A JPH0789922B2 (ja) | 1987-08-28 | 1987-08-28 | 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62214230A JPH0789922B2 (ja) | 1987-08-28 | 1987-08-28 | 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01174383A JPH01174383A (ja) | 1989-07-10 |
| JPH0789922B2 true JPH0789922B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16652343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62214230A Expired - Lifetime JPH0789922B2 (ja) | 1987-08-28 | 1987-08-28 | 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789922B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040003228A (ko) * | 2002-07-02 | 2004-01-13 | 최형준 | 키토산 올리고당을 함유한 기능성 탁주 및 그의 제조방법 |
| CN111393488A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-10 | 安徽科博瑞环境科技有限公司 | 一种水溶性壳寡糖提纯和浓缩的方法 |
-
1987
- 1987-08-28 JP JP62214230A patent/JPH0789922B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01174383A (ja) | 1989-07-10 |
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