JP2989217B2 - エキソ‐β‐１，４‐ガラクタナーゼ及びその利用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規酵素に関するものであり、更に詳細には
従来未知のエキソ（exo）型のβ−1,4−ガラクタナー
ゼ、その生産菌及びその利用に関するものである。

（従来の技術） 柑橘類、バレイショ、大豆等に含まれるアラビノガラ
クタンやガラクタンのようにβ−1,4−ガラクトシド結
合を有する主鎖を含む多糖を加水分解する酵素としてβ
−1,4−ガラクタナーゼ（ガラクタナーゼ）が知られて
いる。

しかしながら、これらガラクタナーゼとしては、Peni
cillium citrinum（以下P.citrinum）やBacillus subti
lis（以下B.subtilis）起源のエンド−1,4−β−Ｄ−ガ
ラクタナーゼ（EC 3.2.1.89）が知られているにすぎ
ず、いずれもこれらは作用様式がエンド型であってエキ
ソ型ではない。

本発明は、基質をエキソ型の様式で分解する性質を有
するβ−1,4−ガラクタナーゼを新たに分離精製するこ
とに成功したものであるが、このようなことは従来全く
知られておらず新規である。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記した技術の現状に鑑みてなされたもので
あって、従来既知のエンド型ではない全く新規なタイプ
のガラクタナーゼを開発する目的でなされたものであ
る。

（問題点を解決するための手段） 上記目的を達成するために微生物のスクリーニングを
広範に実施したところ、B.subtilisの一株がβ−1,4−
ガラクタナーゼを産生すること、そしてこの酵素の作用
様式がエキソ型であることをつきとめた。そして更に検
討した結果、その反応様式は従来報告されているいずれ
のβ−1,4−ガラクタナーゼとも異なる新規なものであ
るとの知見を得た。

本発明はこの新知見、つまり新規エキソ型β−1,4−
ガラクタナーゼの発見に基づき更に検討の結果、完成さ
れたものである。

本酵素の採取源としては、例えばB.subtilis K401株
を用いる。本菌株は、小豆より分離した細菌であって、
グラム陽性の好気性桿菌であり、大きさは１〜1.2×2.5
〜3.0μｍ、胞子の大きさは1.0〜1.2×1.5〜1.7μｍで
ある。現在本菌株は、大阪市立工業研究所生物化学課に
おいて肉汁寒天（日水製薬社製）の斜面培地上で継代維
持されており、微工研において微工研菌寄第11373号と
して受託されている。

本酵素は本菌の培養物から得られるのであるが、本菌
の培養は常法によって行えばよい。培養条件としては、
細菌の培養条件が適宜利用され、通気攪拌培養等が行わ
れるが、培養をβ−1,4−ガラクタンの存在下で行うと
収率の大幅向上が認められ好適である。β−1,4−ガラ
クタンとしては精製品、粗製品のいずれもが使用できる
し、その含有物も有利に使用できる。含有物の例として
は、大豆粉、脱脂大豆粉、豆腐粕（オカラ）といった大
豆関連物質や、柑橘類由来のポリペクチンナトリウム等
が挙げられる。大豆由来のアラビノガラクタン（soybea
n arabinogalactan;以下SAG）（Agric.Biol.Chem.,35,1
891（1971））も使用可能である。

本酵素は培養菌体内及び培養液に蓄積されるが、前者
においては常法どおり菌体を破壊した後に酵素を抽出
し、後者においては培養液を濾過した濾液から抽出す
る。本菌は後者の方により多量にガラクタナーゼを分泌
することが認められている。

このようにして培養濾液は、抽出し精製処理を行っ
て、目的とするガラクタナーゼを得る。抽出精製処理
は、常法によって行い、例えば、塩析、カラムクロマト
グラフィー、ゲル濾過、電気泳動、高速液体クロマトグ
ラフィー等を適宜単用ないし併用する。

得られた精製エキソ−β−1,4−ガラクタナーゼの諸
性質の詳細は後記のとおりであるが、ガラクトオリゴ糖
を基質とする加水分解物の分析結果からして、基質より
ガラクトビオース（Ga_２）残基を遊離させる新規エキ
ソ型のガラクタナーゼである点で、特に特徴的である。

本発明に係るガラクタナーゼが有する上記した新しい
性質を利用することによって、β−1,4−ガラクトシド
結合を有する各種原料に応じてそれぞれ各種のガラクト
オリゴ糖を製造することができる。例えば、SAGを酵素
処理すれば、ガラクトビオース（Ga_２）及びガラクト
テトラオース（Ga_４）等のガラクトオリゴ糖を得るこ
とができるし、また、ガラクトテトラオース（Ga_４）
及びガラクトトリオース（Ga_３）といったガラクトオ
リゴ糖を酵素処理することによって、前者からはGa_２
を製造することができるし、後者からはGa_２とGaを
製造することができる。

そのうえ、本発明に係る酵素は、上記のようなβ−1,
4−ガラクタン、ガラクトオリゴ糖といった原料を加水
分解する作用のほかに、Ga_２を他に転移させる作用も
有する。例えばSAGにGaを添加した原料及びSAGにGa
_２を添加した原料を酵素処理することによって、Ga_２
転移反応を生せじめてGa_３及びGa_４をそれぞれ著量
蓄積せしめることができ、これらの転移反応を利用する
ことによっても各種のガラクトオリゴ糖を製造すること
ができる。

本発明においてガラクタナーゼを利用する場合には、
精製した酵素はもとより、粗製酵素から精製酵素へ至る
各種精製段階における酵素、粗製酵素も利用することが
できる。また、酵素源として微生物自体（B.subtilis）
を用いることもでき、その場合は単離した微生物菌体の
ほか、菌体を単離することのない培養物、培養液、及び
これらの濃縮物、乾燥物、ペースト、破壊物といった各
種の処理物も広く利用することができる。

実施例１ 微生物の培養 B.subtilis K401（FERM P−11373）を培地で培養し
た。

培養培地の組成は、30gの脱脂大豆粉、10gの（NH₄）₂
HPO₄、0.2gのNaCl及び0.2gのMgSO₄・7H₂Oを１の精製
水に懸濁溶解したものである。培地のpHは滅菌前に7.2
に調整した。培養は、上記の培地75mを入れた500m
の培養フラスコ中、27℃で、ロータリーシェーカーにて
回転振盪培養した。48時間の培養後、ガラクタナーゼの
産生量は最大に達したので水不溶性物質と細胞とを遠心
分離により除去した。

実施例２ 酵素の精製 ステップ1:硫安塩析 実施例１で得た培養濾液に固形硫安を55％飽和となる
まで加え、16時間経過してから沈澱物を遠心分離により
採取した。次いで、この沈澱物を20mM酢酸緩衝液（pH6.
0）に溶かし、同緩衝液に対して透析を行った。

ステップ2:S−セファロースカラムクロマトグラフィー 20mM酢酸緩衝液（pH6.0）で予め平衡化しておいたＳ
−セファロース（ファルマシア社製）カラム（φ３×長
さ30cm）に、ステップ１で得られた透析内液をかけた。
次いで、20mM酢酸緩衝液（pH6.0）１と、0.5MのNaCl
を加えた20mM酢酸緩衝液（pH6.0）１とにより調製し
た。直線形NaCl濃度勾配により酵素を溶出した（流速は
30m／時間）。溶出液は10mづつ分画し、活性画分を
合わせて限外濾過で濃縮した。

ステップ3:ウルトロゲルAcA 44によるゲル濾過 100mM NaClを含む25mM燐酸緩衝液（pH7.0）で予め平
衡化しておいたウルトロゲル（Ultrogel）AcA 44（LKB
社製）カラム（φ1.5×長さ97cm）に、ステップ２で得
られた限外濾過濃縮液をかけ、上記緩衝液により流速9.
0m／時間の割合で溶出した。溶出液は2.0mづつ分画
し、活性画分を合わせ、50mM燐酸緩衝液（pH7.0）に対
して透析した。得られた透析内液を精製酵素の標品とし
て用いた。

ガラクタナーゼの精製の概略を表１に示す。最終的に
酵素は1,400倍に精製され、収率は約20％であった。最
終精製標品はポリアクリルアミドゲル電気泳動及びSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上でシングルバンド
を示した（第１図）。

なお、酵素活性の測定及び電気泳動は次のようにして
行った。

（酵素活性の測定方法） 50mM燐酸緩衝液（pH6.5）に0.625％の割合で溶解させ
たSAG溶液0.4mと、同上の燐酸緩衝液に溶解させた酵
素溶液0.1mとからなる反応混合液を、40℃で10分間反
応させた。反応は1.0mのSomogyi試薬により停止させ
た。反応により遊離された還元糖の量は、ガラクトース
を標準として、Somogyi−Nelsonの方法に従って測定し
た。上記反応条件において、１分間当たり１μmoleの還
元糖を遊離する酵素活性を１ユニットと定義した。

（電気泳動） ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Davisの方法に
より、ポリアクリルアミドゲル濃度を7.5％とし、pHを
４に保った緩衝系を含むカラムにて行った。SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動は、WeberとOsbornの方法
に従って行った。用いた標準蛋白質は、α_２−マクログ
ロブリン（分子量170,000）、ホスホリラーゼｂ（同97,
400）、グルタミン酸デヒ ドロゲナーゼ（同55,40
0）、乳酸デヒドロゲナーゼ（同36,500）及びトリプシ
ン・インヒビター（同20,100）である。

実施例３ 本酵素の性質 （１）精製及び均質性 ガラクタナーゼは実施例２で述べたように、培養濾液
から1400倍に精製され、最終精製標品は電気泳動にてシ
ングルバンドを示した（第１図）。

（２）分子量及び等電点 SDS−PAGEによれば、本酵素の分子量は36,000であっ
た。

本酵素の等電点は、等電点電気泳動法によれば、pH7.
88であった。なお、等電点電気泳動は次のようにして行
った。

等電点電気泳動は、VesterbergとSvenssonの方法に従
い、pH範囲が3.5〜10のAmpholyte（LKB社製）を入れた
カラム（110m）で行った。４℃に保ったカラムに定電
圧400Vを48時間かけた。その後試料を2mづつ分画し、
各々の画分について酵素活性とpHを測定した。

（３）pH及び温度の影響 本酵素のpHに対する安定性を調べるに当たっては、温
度15℃に保った、種々のpHのBritton−Robinsonユニバ
ーサル緩衝液中に、酵素を24時間置いた。この条件で
は、本酵素はpH6〜10の間で安定であった（第２図Ａ○
−○）。

一方、温度安定性を見るために、pH7.5で種々の温度
に10分間さらしたところ、55℃以下で安定であった（第
２図Ｂ○−○）。

至適pHを見るために種々のpHの50mM燐酸緩衝液中で、
40℃における本酵素の活性を測定したところ、pH6.5〜
7.0において最も活性が高かった（第２図Ａ●…●）。

pH6.5で種々の温度に10分間さらしたところ、酵素活
性が最大値となったのは、温度が60℃のときであった
（第２図Ｂ●…●）。

これらの結果から明らかなように、本酵素の至適pHは
６〜７（温度40℃）であり、至適温度は50〜60℃（pH6.
5）であった。

（４）種々の試薬及び金属イオンの影響 本酵素に対する種々の試薬及び金属イオンの影響を次
のようにして調べた。すなわち、各々の試薬或いは金属
イオンの40mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.3）溶液に、酵
素を30℃で２時間インキュベートした。残存活性は上述
の測定方法に従って測定した。

その結果を表２に示した。表２の結果から明らかなよ
うに、Hg²⁺及びCu²⁺が酵素活性を阻害した。これ以外の
試薬は、Ca²⁺及びEDTAを含めて、酵素の活性に有意な影
響は与えなかった。

（５）Km値 本酵素のKm値は、種々のSAG濃度（Ｓ）と還元糖の解
離速度（ｖ）とから、Ｓ対S/vのグラフを作成して、1.0
6mg/mという値を得た。

（６）基質特異性 種々のオリゴ糖（0.5％）及び酵素（0.2ユニット/m
）を50mM燐酸緩衝液（pH6.5）に溶かした反応混合液
（1.0m）を40℃で24時間反応させた。遊離された還元
糖の量はガラクトースを標準としてSomogyi−Nelsonの
方法によって測定し、その結果を表３に示した。

これらの結果から次のことが判明した。

本酵素は、SAGからばかりではなく、ポリペクチンナ
トリウム（柑橘果実由来；シグマ社製；β−1,4−ガラ
クタンを構成要素として有していることが知られてい
る）からも還元糖を遊離する。ポリペクチンナトリウム
から遊離されたオリゴ糖を分析したところ、SAGから遊
離されたオリゴ糖と同じであった。一方カラマツアラビ
ノガラクタン、コーヒー豆アラビノガラクタン及びアラ
ビアガム（これらの主鎖は、β−1,3−ガラクトシド結
合からなっていることが知られている）は、本酵素によ
っては分解されなかった。

（７）本発明酵素によるSAG加水分解産物の分析 SAG 1.5gと精製酵素５ユニットとを50mM燐酸緩衝液に
溶解した反応混合液50mを40℃で８時間反応させた。
未反応のSAGは、100mのエタノールを前記反応液に添
加して沈澱させた後に、遠心分離で除去した。上清を蒸
留により濃縮し、次いで、蒸留残液10mを、５％エタ
ノールで予め平衡化しておいたバイオゲルＰ−２（バイ
オラッド社製）カラムにかけた。５％エタノールによ
り、流速15m／時間の割合で溶出し、5mづつ分画し
た。各々の画分の糖はフェノール−硫酸法で測定した。
Ga_２に相当する画分（画分番号70〜78）及び未知のオ
リゴ糖（Ｘ）画分（同61〜65）を別々に集め、減圧濃縮
し、更に上記と同じカラムを用いて再び分画を行って精
製した。以上のようにして得られた二つの画分は、TLC
上でシングル・スポットを示した。

以上から、SAGの酵素加水分解産物は、TLC分析の結
果、Ga_２が主要産物であり、この他に未知のオリゴ糖
Ｘが痕跡量検出された。ＸはTLC上の移動速度はGa_４
と殆ど同じであることから、Ga_４であることが推定さ
れた。

なお、TLC（薄層クロマトグラフィー）は次のように
して行った。

薄層クロマトグラフィー 薄層クロマトグラフィー（TLC）は、シリカゲル60プ
レコートプレート（蛍光指示薬不含、メルク社製）を用
い、酢酸エチル：酢酸：水＝3:1:1（v/v）の溶媒系で、
多重展開上昇法（multiple ascending method）により
行った。糖の検出は、プレートにH₂SO₄:メタノール＝1:
1（v/v）を噴霧した後、プレートを110℃に10〜20分間
保つことにより行った。

（８）本発明酵素によるガラクトオリゴ糖類の加水分解
産物の分析 本酵素（0.92ユニット/m）をGa_２、Ga_３又はGa
_４（それぞれ5.0mM）と、pH6.5、40℃で４時間反応さ
せ、各々のオリゴ糖の加水分解産物をTLCで分析した。G
a_３は完全にGaとGa_２とに加水分解され、Ga_４
からはGa_２のみが生成された。Ga_２は本酵素によっ
ては全く加水分解されなかった。

又、還元末端にｏ−ニトロフェニル基を有するガラク
トオリゴ糖類（ONPG及びG₂−ONP〜G₅−ONP;Agric.Biol.
chem.,50,3005（1986））を基質として、本酵素のよる
加水分解産物を、ONPの定量及びTLCにより分析した。

なおここで、ONPGはｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトサイド、ONPはｏ−ニトロフェノール、G₂−ONP〜
G₅−ONPはｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトビオ
サイド〜ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトペンタ
オサイドを、それぞれ意味する。

ONPの解離の分析においては、各々の基質（1.0mM）に
ついて、本酵素（0.23ユニット/m）と40℃で反応さ
せ、ｏ−ニトロフェニルを、0.1MのNa₂CO₃の溶液中で、
410nmにおける吸光度を測定することにより定量した。
基質がONPG、G₃−ONP及びG₅−ONPの場合では、ONPの解
離は起こらなかった。一方、G₂−ONP及びG₄−ONPから
は、30分間の反応で、それぞれ0.955μmole/m及び0.9
42μmole/mのONPが解離された。

ONP以外の加水分解産物については、以下のようにし
て分析した。5mMの燐酸緩衝液（pH6.5）中に、各々の基
質（１μmole/m）及び酵素（0.046ユニット/m）を
含む反応混合液（400μ）を、40℃で反応させ、定時
間隔に、2M酢酸８μを加えて反応を止めた。反応液を
凍結乾燥後、試料を80μの水に溶かし、15μをTLC
プレートにスポットして分析した。結果を第４図に示
す。図中、Ｍはマーカー（Ga〜Ga_４）、ＡはONPG、
ＢはG₂−ONP、ＣはG₃−ONP、ＤはG₄−ONP、ＥはG₅−ONP
を、それぞれ表す。ONPGは全く加水分解されなかった。
G₂−ONP及びG₄−ONPからは、Ga_２が加水分解産物とし
て検出された。G₃−ONP及びG₅−ONPからは、ONPG及びGa
_２が最終産物として蓄積されていた。更にG₄−ONP及
びG₅−ONPを基質としたときは、それぞれG₂−ONP及びG₃
−ONPが中間産物として生成されていることが検出され
た。

（９）本発明のガラクタナーゼと既知のガラクタナーゼ
によるSAGの加水分解産物の比較 本発明に係るB.subtilis由来のガラクタナーゼによる
SAG加水分解生成物（第３図Ｂ）と、P.citrinum由来の
ガラクタナーゼＩによるSAG加水分解産物（第３図Ａ）
とをHPLC分析により時系列的に比較した。反応時間は、
2.5分、15分及び120分である。SAGは0.5％（w/v）、酵
素は0.2ユニット/m、緩衝液はB.subtilis由来のガラ
クタナーゼの場合は25mM燐酸緩衝液（pH6.5）、P.citri
num由来のガラクタナーゼの場合は25mM酢酸緩衝液（pH
4.5）、温度は40℃であった。

P.citrinum由来の酵素はエンド型酵素であるため、ガ
ラクトース及び種々のオリゴ糖、特にSAGの部分加水分
解産物である比較的高分子のオリゴ糖を生成した。一
方、B.subtilis由来の酵素によるSAG加水分解産物中に
は、反応のいずれの段階においても、単糖類、三糖類及
び高分子の部分加水分解産物は検出されなかった。

（10）本発明のガラクタナーゼによるGa_２の転移反応 SAGを本酵素で加水分解するに際し、Ga或いはGa
_２を反応混合液に添加しておいた場合の反応産物をHPLC
で分析して本酵素による転移反応を確認した（第５図及
び第６図）。

25mM燐酸緩衝液（pH6.5）中に、SAG（16.8mg/m）
と、種々の濃度のGa（第５図）あるいはGa_２（第６
図）、及び酵素（0.46ユニット/m）を含む反応混合液
（200μｍ）を、40℃で１時間反応させた。反応液を
沸騰させて反応を停止させ、反応生成物をHPLCで分析し
た。

第５図において、○−○はGa_２を、△−△はGa_３
を、●−●はGa_４を、それぞれ表す。

第６図において、○−○はGa_２を、●−●はGa_４
を、それぞれ表す。

反応混合液にGaを添加することにより、反応生成物
中のGa_３が増加し、Ga_２及びGa_４は減少した（第
５図）。一方、反応混合液にGa_２を添加しておくと、
反応生成物中のGa_４が増加していた（第６図）。

（11）作用様式 本酵素はアラビノガラクタンを基質としてこれを加水
分解させると、Ga_２及び少量のGa_４を生成した。そ
して通常の反応条件の下では、Ga、Ga_３あるいは高
分子量の多糖部分加水分解物が生成されている証拠は全
く見あたらなかった。一連のガラクトオリゴ糖を基質と
する加水分解物の分析結果から、本酵素はGa_２残基を
解離するエキソ型のガラクタナーゼであることが強く示
唆された。更に、置換オリゴ糖に対して本酵素が作用す
る様相から、本酵素による加水分解は、基質の非還元末
端から二番目のガラクトシド結合に起こることが推定さ
れた（第７図）。なお、図中、↓は加水分解される結合
箇所を、○はGa残基を、●はONPをそれぞれ表す。こ
のような様式で作用するガラクタナーゼは、カビ由来の
ものを含めても、これまで報告がなく新規である。

実施例４ ガラクトオリゴ糖の製造（１） SAG 1.5gと実施例２で得た精製酵素５ユニットとを50
mM燐酸緩衝液に溶解した反応混合液50mを40℃で８時
間反応させた。未反応のオリゴ糖は、100mのエタノー
ルを前記反応液に添加して沈澱させた後に、遠心分離で
除去した。上清を蒸留により濃縮し、次いで、蒸留残液
10mを、５％エタノールで予め平衡化しておいたバイ
オゲルＰ−２（バイオラッド社製）カラムにかけた。５
％エタノールにより、流速15m／時間の割合で溶出
し、5mづつ分画した。各々の画分の糖はフェノール−
硫酸法で測定し、画分番号70〜78にGa_２を得、画分番
号61〜65にGa_４を得た。

実施例５ ガラクトオリゴ糖の製造（２） 本酵素を用いてガラクトオリゴ糖を加水分解すること
により他のガラクトオリゴ糖を製造した。

つまり、本酵素（0.92ユニット/m）を、ガラクトト
リオース（Ga_３）又はガラクトテトラオース（Ga
_４）（それぞれ5.0mM）と、pH6.5、40℃で４時間反応
させ、Ga_３からはGaとGa_２とを得、Ga_４からは
Ga_２をそれぞれ得た。

（発明の効果） 本発明によってガラクタナーゼが提供されるが、この
酵素はエキソ型β−1,4−ガラクタナーゼであって従来
未知の全く新しいタイプのものである。

本酵素によれば各種のガラクトオリゴ糖が製造でき、
しかも本酵素の工業的製法も本発明によって確立したの
で、各種のガラクトオリゴ糖を工業生産することがはじ
めて可能となった。

したがって本発明は、飲食品、栄養品、医薬品等の各
技術分野において重要な役割を果すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図：精製ガラクタナーゼの電気泳動図 ＡはPAGE、ＢはSDS−PAGE。ゲルはクーマシー・プリリ
アント・ブルー（Coomassie Brilliant Blue）Ｒ−250
で染色した。 第２図：ガラクタナーゼの活性及び安定性に対するpHと
温度の関係を示したグラフ Ａは、pHの酵素活性（●…●）及び酵素安定性（○−
○）に対する影響を示す。Ｂは、温度の酵素活性（●…
●）及び酵素安定性（○−○）に対する影響を示す。 第３図:B.subtilis由来のガラクタナーゼとP.citrinum
由来のガラクタナーゼによる、SAGの加水分解生成物の
比較図 ＢはB.subtilis由来のガラクタナーゼによるSAGの加水
分解生成物を、ＡはP.citrinum由来のガラクタナーゼに
よるSAGの加水分解生成物を、HPLCで分析したものであ
る。 第４図:ONP置換ガラクトオリゴ糖の加水分解生成物の薄
層クロマトグラム 図中、Ｍはマーカー（Ga〜Ga_４）、ＡはONPG、Ｂは
G₂−ONP、ＣはG₃−ONP、ＤはG₄−ONP、ＥはG₅−ONPを表
す。 第５図：ガラクタナーゼとSAGとからなる反応混合液へ
のGa添加の影響を示すグラフ 図中、○−○はGa_２を、△−△はGa_３を、●−●は
Ga_４を、それぞれ表す。 第６図：ガラクタナーゼとSAGとからなる反応混合液へ
のGa_２添加の影響を示すグラフ 図中、○−○はGa_２を、●−●はGa_４を、それぞれ
表す。 第７図:ONP置換ガラクトオリゴ糖に対するガラクタナー
ゼの推定反応様式模式図 図中、↓は加水分解される結合箇所を、○はGa残基
を、●はONPをそれぞれ表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 鰺坂 勝美 神奈川県小田原市成田540番地 明治乳 業ヘルスサイエンス研究所内 (72)発明者 藤本 浩 神奈川県小田原市成田540番地 明治乳 業ヘルスサイエンス研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の性質を有することを特徴とするエキソ
   −β−1,4−ガラクタナーゼ； （Ａ）作用 基質の非還元末端から２番目のガラクトシド結合を加水
   分解する。 （Ｂ）基質特許性 大豆アラビノガラクタン及び柑橘果実ガラクタンは分解
   するが、カラマツアラビノガラクタン及びコーヒー豆ア
   ラビノガラクタンはほとんど分解せず、アラビアガムは
   全く分解しない。 （Ｃ）分子量 36,000（SDS−PAGE法） （Ｄ）等電点 pH7.88（等電点電気泳動法） （Ｅ）至適pH pH6〜７（60℃） （Ｆ）至的温度 50〜60℃（pH6.5） （Ｇ）活性阻害 Hg²⁺、Cu²⁺は酵素活性を阻害する。
2. 【請求項２】バチルス属に属するエキソβ−1,4−ガラ
   クタナーゼ生産菌を培地で培養することを特徴とする請
   求項１に記載のエキソ−β−1,4−ガラクタナーゼの製
   造方法。
3. 【請求項３】β−1,4−ガラクタンの存在下で培養を行
   うことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
4. 【請求項４】エキソ−β−1,4−ガラクタナーゼ生産
   菌、バチルス・ズブチリス（K401（Bacillus subtilis
   K401）（FERM Ｐ−11373）。
5. 【請求項５】請求項１に記載のエキソ−β−1,4−ガラ
   クタナーゼを使用することを特徴とするガラクトオリゴ
   糖の製造方法。
6. 【請求項６】請求項１に記載のエキソ−β−1,4−ガラ
   クタナーゼを使用することを特徴とするガラクトビオー
   スの転移方法。
7. 【請求項７】請求項１に記載のエキソ−β−1,4−ガラ
   クタナーゼが、精製酵素若しくは粗製酵素、又は該酵素
   生成菌体、菌体含有物若しくはその処理物であることを
   特徴とする請求項５又は６に記載の方法。