JPH04200386A - β―フラクトフラノシダーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、抗う蝕性低カロリー甘味料、ビフィズス菌増
殖物質として有用なキジロシルフラクトシドやラクトシ
ルフラクトシドを生産する、高いフラクトース残基転移
能を有するβ−フラクトフラノシダーゼ及びその製造方
法に関する。

〈従来の技術〉 キシロシルフラクトシドは、キシロース残基とフラクト
ース残基からなる三糖類で抗う触性の糖やヒトの有用腸
内細菌であるビフィズス菌増殖物質として有効であり、
また構成糖のキシロースは消化吸収されにくい糖である
ため、低カロリー甘味料としても期待されている。

また、ラクトシルフラクトシドはラクトースのグルコー
ス残基にフラクトースが結合した三糖類で、抗う触性、
ビフィズス菌増殖物質として有効である。

現在、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌起源のレバン
シュークラーゼ（特開昭５９−３９２８７号）や、アエ
ロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌起源のレバン
シュークラーゼ（特開昭５５−１１８３６９号）を用い
てラクトシルフラクトシドを合成する方法、バチルス・
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の
レバンシュークラーゼ（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　、
　９０．５２１−５２６　（１９８１））、（特開昭５
５−１１８３６９号）を用い、キシロースとスクロース
からキシロシルフラクトシドを合成する方法等が報告さ
れている。

また、ペニシリウム・フレクエンタンス（Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｕｆｒｅｑｕｅｎｔａｎｓ）　（バイオインダ
ストリー、５゜２６９−２７５　（１９８８））やアー
スロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ、　Ｋ−
１）　（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、５をｐＨ
４．９１３−９１９（１９９０））のβ−フラクトフラ
ノシダーゼを用いキシロースとスクロースからキシロシ
ルフラクトシドを合成する方法等が報告されている。

しかし、これらの方法ではキシロシルフラクトシドやラ
クトシルフラクトシド以外に数種類以上のオリゴ糖が生
成し、収率が低い。

また、レバンシュークラーゼを用いた場合、キシロシル
フラクトシドのほかにレバンなどの多糖を生成し、ため
にキシロシルフラクトシドのみを分離することは極めて
難しく、実用性に乏しい。

〈問題を解決するための手段〉 本発明者らは、微生物によるキシロシルフラクトシドお
よびラクトシルフラクトシドの製造を目的として微生物
の検索を行ったところ、バチルス属の微生物が生成する
β−フラクトフラノシダーゼが高いフラクトース残基転
移能を備えていてキシロシルフラクトシドおよびラクト
シルフラクトシドを大量に生成し、かつレバン様多糖を
ほとんど生成しないことを見い出し、本発明に至った。

■に　い 本発明に用いる微生物は、β−フラクトフラノシダーゼ
生成能を有するものであり、バチルス属に属する菌種で
ある。

その−例としてバチルス、メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　ＩＦＯ−１３４９８株は
上記の特性を有し、キシロシルフラクトシドおよびラク
トシルフラクトシドを生産する。

上記微生物の培養は、通常用いられる固体培地、液体培
地のどちらを用いてもよいが、液体培地の方が好ましい
。

微生物の培養に使用される培地は、炭素源としては微生
物が利用できる炭素源を用いることが可能であるが、ス
クロースまたはグルコースが好適である。

窒素源としては、酵母エキス、カゼイン、コーンスチー
ブリカー、ペプトン、肉エキスなどの天然窒素源や硫安
、塩安、尿素などの無機窒素化合物を用いることができ
る。

炭素源の濃度は１〜２０％の範囲で、培養時間は８〜１
６時間程度である。静置培養または通気撹拌、振とう培
養のいずれの方法でも行うことができる。

−フレ　　フーノシ　−ゼ 本発明で使用されるβ−フラクトフラノシダーゼはバチ
ルス属の微生物の菌体外に生産され、菌体培養液および
菌体反応液から分離、採取するが、分離手段としては公
知の酵素精製方法を用いることができる。微生物の培養
液を粗酵素として用いてもよ（、また、塩析法、担体吸
着法、ゲル濾過法、電気泳動法などの精製手段を用いて
精製酵素として使用することもできる。

本発明で使用するバチルス属のβ−フラクトフラノシダ
ーゼは以下の理化学的性質を有する酵素である。

■作用および基質特異性 スクロースやラフィノースおよびその他のβ−フラクト
フラノシドを加水分解してフラクトースを遊離する。

また、基質からβ−フラクトフラノシル基を水に転移し
て加水分解するほか、他の糖類などへ転移する。受容体
としてキシロース、ラクトースを用いた場合、スクロー
スのβ−フラクトシル基が受容体に転移し、キシロシル
フラクトシドやラクトシルフラクトシドなどそれぞれに
相当するフラクトシル基を有するヘテロオリゴ糖生成す
る。

■力価の測定法 １０％スクロース（ｐＨ６，０、マツクルパイン（Ｍｃ
ｌｌｖａｉｎｅ）緩衝液）０．９＋＊１と酵素溶液０．
１■ｌを混合し、３０℃で３０分間反応させた後、沸騰
洛中で５分間加熱し、反応を停止させた。

生成したグルコース量をグルコースオキシダーゼ法によ
り測定し、基質スクロースから１分間に１ｇモルのグル
コースを生成する能力を１ユニツト（Ｕ）とした。

■至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 スクロースを基質として各ｐＨにおいて３０°Ｃで３０
分間反応させた結果、至適ｐＨは６．０であった。

また、３５℃で１２０分間インキュベートした後の残存
活性を調べたところ、ｐＨをｐＨ４．５〜７．０の範囲
で９０％以上の残存活性を示した。

■作用適温および熱安定性 スクロースを基質とし、各温度においてｐＨ５゜５で３
０分間反応させた結果、最適作用温度は４０〜５０℃で
あった。

また、各温度においてｐＨ５，５で１０分間インキュベ
ートした後の残存活性を調べたところ、４５℃まで安定
であった。

■阻害 １ｍＭの水銀イオン、銀イオンにより阻害を受ける。

■精製方法 前記微生物の上澄み液または菌体反応液をＤＥＡＥ−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ　ｐａｋ　６５０Ｍ（商品名）　、Ｔ
ＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ　（商品名）　、ＴＳＫｇｅ
ｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ　（商品名）などを用いたカラム
クロマトグラフィーによって精製酵素を分離、採取する
ことができる。

■分子量 ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷを用いたゲル濾過法によ
る測定で測定した結果、分子量は約４５万であった。

なお、バチルス属のレバンシュークラーゼによるキシロ
シルフラクトシドやラクトシルフラクトシドの生産は報
告されているが、本発明において使用されるバチルス属
の生産するβ−フラクトフラノシダーゼによるキシロシ
ルフラクトシドやラクトシルフラクトシド生産能につい
ては未だ報告されておらず、本発明が最初のものである
。

実施例１　　　菌体の製造 スクロース　　　　　　・・・１０ｇ 酵母エキス　　　　　・・・ｌＯｇ Ｋ　Ｈ，Ｐ　Ｏ，・・・　２ｇ ＮａｚＨＰＯ４・１２Ｈ２０−−−８ｇ水　　　　　　
　　　　・・・１０００＋ｗｆｐＨ・・・７．０ 上記組成の培地２１を小型ジャーファーメンタ−に入れ
、あらかじめ同培地で前培養しておいたバチルス・メガ
テリウムＩＦＯ−１３４９８株の培養液５０ｍ＆を接種
し、３０°Ｃで１６時間通気培養を行った。

培養終了後、２１の培養液から遠心分離（８０００ｒｐ
ｍ。

１０分間）して菌体を回収した。

回収した菌体を蒸留水で２回洗浄後、湿重量２９．６ｇ
の菌体を得た。

菌体培養液２１の上澄み液のβ−フラクトフラノシダー
ゼ総活性は１７４００ユニツトであった。また、湿重量
２９．６ｇの菌体の総活性は３２５０ユニツトであった
。

実施例２　　酵素の精製 実施例１の方法で得た菌体培養液２βの上澄み液の総活
性は１７４００ユニツトで、これを粗酵素液とした。こ
の粗酵素液をあらかじめ３０ａ＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）で平衡化した前記ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｓａｒ
ｌ　ｐａｋ　６５０Ｍ　（φ２２　ｘ　２００＋ａｍ）
カラムに吸着させ、次いで同緩衝液（０〜１．ＯＭ　Ｎ
ａＣ１のグラジェント）にて溶出し、１３００ｍｌの活
性画分を得た（１０９６０ユニツト）。次いで透析、凍
結乾燥、限ダ濾過を行い１００ｍｊ’まで濃縮した。

さらに、あらかじめ３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６゜０
）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ　（φ７
．８　Ｘ　３００＋ｎ＋＋＋）カラムでゲル濾過を行う
ことにより８０＋＋＋　（ｌの活性画分を得た。

またＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷで分画を行い、透
析、凍結乾燥後８６００ユニツトの精製酵素を得た。

この酵素はポリアクリルアミドディスク電気泳動法で単
一のバンドを示した。精製酵素の比活性は４２８ユニッ
ト／ｌＩｇ・タンパクで２７倍まで精製された。

実施例３　　酵素反応によるキシロシルフラクトシドの
生成 スクロース２００ｇとキシロース１００ｇを３０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＦＩ６．０）に溶解して１ｐとした。

これに実施例２で得られたバチルス・メガテリウムＩＦ
Ｏ〜１３４９８株の精製β−フラクトフラノシダーゼ１
００ユニツトを加え、５０℃で５時間反応させた。

高速液体クロマトグラフィーにより生成したキシロシル
フラクトシドを測定したところ、１０８ｇのキシロシル
フラクトシドが生成されていた。

得られた反応液Ｉｆを減圧濃縮した。この濃縮液をカー
ボン・セライトカラム（に１）へ通液し、水２０ｆを７
５軸１　／ｈｒの流速で流し単糖を溶出、５％エタノー
ル２Ｎでスクロースを溶出させた後、１０％エタノール
３０βを流し活性炭に吸着されているキシロシルフラク
トシドを溶出させた。

キシロシルフラクトシドを含む溶出液を減圧濃縮した後
、凍結乾燥を行うことにより白色の粉末キシロシルフラ
クトシド８８ｇを得た。

スクロース２００　ｇとラクトース２００ｇを３Ｏｎ＋
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解して１１とした。

これに実施例２で得られたバチルス・メガテリウムＩＦ
Ｏ−１３４９８株の精製β−フラクトフラノシダーゼ１
００ユニツトを加え、５０℃で５時間反応させた。

高速液体クロマトグラフィーにより生成したラクトシル
フラクトシドを測定したところ、１４８ｇのラクトシル
フラクトシドが生成していた。

得られた反応液１βを減圧濃縮した。この濃縮液をカー
ボン・セライトカラム（に　ｌ）へ通液し、水２０１を
７５Ｏｎ＋４２　／ｈｒの流速で流し単糖を溶出、２％
エタノール２０ｆｆでスクロースとラクトースを溶出さ
せた後、１０％エタノール３０１を流し、活性炭に吸着
されているラクトシルフラクトシドを溶出させた。

ラクトシルフラクトシドを含む溶出液を減圧濃縮した後
、凍結乾燥を行うことにより白色の粉末ラクトシルフラ
クトシド１２４ｇを得た。

実施例５　　菌体反応によるキシロシルフラクトシドの
生成 スクＯ−ス３００ｇとキシｏ−ス１５０ｇを３０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ（６，０）に溶解して１１とした。

これに実施例１で得られたβ−フラクトフラノシダーゼ
を有するバチルス・メガテリウムＩＦＯ−１３４９８株
の湿菌体２９ｇ　（３２５０ユニツトを加え、４０℃で
１２時間反応させた。

高速液体クロマトグラフィーにより生成したキシロシル
フラクトシドを測定したところ、１４５ｇのキシロシル
フラクトシドが生成してぃた。

得られた反応液ｉｆを減圧濃縮した。この濃縮液を実施
例３と同様な方法でカーボン。

セライトカラム（に　１）へ通液し、キシロシルフラク
トシドを分画した。

キシロシルフラクトシドを含む溶出液を減圧濃縮した後
、凍結乾燥を行うことにより白色の粉末キシロシルフラ
クトシド１２１ｇを得た。

また、反応中に菌体よりβ−フラクトフラノシダーゼが
生産され、反応液中のβ−フラクトフラノシダーゼ活性
が１９２００ユニツトになった。

実施例６　　菌体反応によるラクトシルフラクトシドの
生成 スクｏ−ス２００ｇとラクトース２００　ｇを３０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解して１１とした。

これに実施例１で得られたバチルス・メガテ！、１　ウ
ムＩＦＯ−１３４９８株の湿菌体２９ｇ　（３２５０Ｕ
）を加えて４０’Ｃで１２時間反応させた。

高速液体クロマトグラフィーにより生成したラクトシル
フラクトシドを測定したところ、１４５ｇのラクトシル
フラクトシドが生成していた。

得られた反応液１βを減圧濃縮した。この濃縮液を実施
例４と同様な方法でカーボン・セライトカラム（１・１
）へ通液し、ラクトシルフラクトシドを分画した。

ラクトシルフラクトシドを含む溶出液を減圧濃縮した後
、凍結乾燥を行うことにより白色の粉末ラクトシルフラ
クトシド１２１ｇを得た。

生成 キシロース （ラクトース）　　・・・５．００％（１０，０％）ス
クロース　　　　・・・１０．００％酵母エキス　　　
　・・・０．１０％ Ｋ　Ｈ４Ｆ　Ｏ４・・・０．２０％ Ｎａ２ＨＰＯ４’　１２Ｈ２０”””０．８０％ｐＨ・
・・７，０ 上記組成の培地２１を小型ジャーファーメンタ−に入れ
、別に前培養しておいたバチルス、メガテリウムｒＦＯ
−１３４９８株の培養液５０ｍｆを接種し、３０℃でＩ
８時間通気培養を行った。

菌体培養液２１の上澄み液のβ−フラクトフラノシダー
ゼ総活性は４２７００ユニツトであった。また、湿重量
２９６ｇの総活性は５２８ｏユニツトであった。

高速液体クロマトグラフィーにより生成したキシロシル
フラクトシドを測定したところ、１１１ｇのキシロシル
フラクトシドが生成していた。

得られた培養液２１を遠心分離（８０００ｒｐｍ）によ
り菌体を除去し、上澄み液を減圧濃縮した。この濃縮液
をカーボン・セライトカラム（に　Ｉ）へ通液し、実施
例３と同様な方法でキシロシルフラクトシドを分画した
。

キシロシルフラクトシドを含む溶出液を減圧濃縮した後
、凍結乾燥を行うことにより白色の粉末キシロシルフラ
クトシド９２ｇを得た。

同様な方法でラクトシルフラクトシド１２２ｇを得た。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の理化学的性質を有するβ−フラクトフラノ
   シダーゼ。 〔１〕作用および基質特異性スクロースやラフィノース
   およびその他のβ−フラクトフラノシドを加水分解して
   フラクトースを遊離し、また、基質からβ−フラクトフ
   ラノシル基を糖類などへ転移し、受容体としてキシロー
   ス、ラクトースを用いた場合にキシロシルフラクトシド
   やラクトシルフラクトシドなどそれぞれに相当するフラ
   クトシル基を有するヘテロオリゴ糖を生成する。 〔２〕至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲至適ｐＨをｐＨ６．
   ０に有し、安定ｐＨをｐＨ４．５〜７．０（３５℃、１
   ２０分間処理）に有する。 〔３〕作用適温の範囲４０〜４５℃に最適作用温度を有
   する。 〔４〕熱安定性ｐＨ５．５で１０分間処理の場合、４５
   ℃まで安定。 〔５〕阻害水銀イオン、銀イオンにより阻害される。 〔６〕分子量ゲル濾過法による測定で約４５万。
2. （２）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するβ−フ
   ラクトフラノシダーゼ生産菌を好気的条件下で培養し、
   培養物から特許請求の範囲第１項記載の新規β−フラク
   トフラノシダーゼを採取することを特徴とする微生物に
   よるβ−フラクトフラノシダーゼの製造方法。
3. （３）前項記載の微生物がバチルス・メガテリウム（Ｂ
   ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＦＯ−１３
   ４９８株であるβ−フラクトフラノシダーゼの製造方法
   。