JPH062071B2 - 糖類の製造法 - Google Patents
糖類の製造法Info
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- JPH062071B2 JPH062071B2 JP61186575A JP18657586A JPH062071B2 JP H062071 B2 JPH062071 B2 JP H062071B2 JP 61186575 A JP61186575 A JP 61186575A JP 18657586 A JP18657586 A JP 18657586A JP H062071 B2 JPH062071 B2 JP H062071B2
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- pullulanase
- enzyme
- producing
- starch
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規な糖類の製造法に関する。更に詳しくは、
新規なサーマス(Thermus)属に属する好熱性微生物を培
養して得られる新規な耐熱性プルラナーゼを使用したデ
ンプンまたはその加水分解物からの糖類の製造法に関す
る。
新規なサーマス(Thermus)属に属する好熱性微生物を培
養して得られる新規な耐熱性プルラナーゼを使用したデ
ンプンまたはその加水分解物からの糖類の製造法に関す
る。
従来の技術 プルラナーゼは、ベンダー(Bender)らにより、プルラリ
ヤ・プルランの生産する多糖類プルランを加水分解する
酵素として、微生物：エーロバクター・エーロゲネス(A
erobacter.aerogenes)においてはじめて見出されたもの
である〔バイオシミカ エ バイオフィジカ アクタ(B
iochim. Biophys. Acta)，36，309 (1959)、特公昭46−
7559などを参照のこと〕。その後、この酵素は、アミロ
ペクチンのα−１，６−グルコシド結合を加水分解し、
β−アミラーゼとの併用により、デンプンからマルトー
スを収量よく生産することから注目され、現在では同種
の酵素が種々の微生物により生産されることが知られて
いる。
ヤ・プルランの生産する多糖類プルランを加水分解する
酵素として、微生物：エーロバクター・エーロゲネス(A
erobacter.aerogenes)においてはじめて見出されたもの
である〔バイオシミカ エ バイオフィジカ アクタ(B
iochim. Biophys. Acta)，36，309 (1959)、特公昭46−
7559などを参照のこと〕。その後、この酵素は、アミロ
ペクチンのα−１，６−グルコシド結合を加水分解し、
β−アミラーゼとの併用により、デンプンからマルトー
スを収量よく生産することから注目され、現在では同種
の酵素が種々の微生物により生産されることが知られて
いる。
この種の酵素はプルラナーゼ、イソアミラーゼなど種々
の名称で呼ばれているが、総称してα−１，６−グルコ
シダーゼと言われている。例えば、エシェリヒア・イン
ターメディアのイソアミラーゼ〔Escherichi a.interme
dia；アプライド マイクロバイオロジー(Applied Micr
oiol.)，15,492(1967)〕、ストレプトコツカス・ミティ
スのプルラナーゼ〔Streptococcus mitis；バイオケミ
カル ジャーナル(Biochem. J.)，108，33，(1968)〕、
ストレプトマイセス属(Streptomyces・sp.) No.28のイソ
アミラーゼ〔ジャーナル オブ ザ ファーメンテーシ
ョン テクノロジ−(J. Ferment.Tech.)，49，552(197
1)〕、バチルス属のプルラナーゼ 〔アグリカルチュラ
ル＆バイオロジカルケミストリー(Agric. Biol. Che
m.)，40，1515(1976)；スターチ(Starch)，34，340(198
2)等〕などが報告されている。
の名称で呼ばれているが、総称してα−１，６−グルコ
シダーゼと言われている。例えば、エシェリヒア・イン
ターメディアのイソアミラーゼ〔Escherichi a.interme
dia；アプライド マイクロバイオロジー(Applied Micr
oiol.)，15,492(1967)〕、ストレプトコツカス・ミティ
スのプルラナーゼ〔Streptococcus mitis；バイオケミ
カル ジャーナル(Biochem. J.)，108，33，(1968)〕、
ストレプトマイセス属(Streptomyces・sp.) No.28のイソ
アミラーゼ〔ジャーナル オブ ザ ファーメンテーシ
ョン テクノロジ−(J. Ferment.Tech.)，49，552(197
1)〕、バチルス属のプルラナーゼ 〔アグリカルチュラ
ル＆バイオロジカルケミストリー(Agric. Biol. Che
m.)，40，1515(1976)；スターチ(Starch)，34，340(198
2)等〕などが報告されている。
最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα−１，６
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコースを製造し
たり、またデンプンからマルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオースなどのマルトオリゴ糖を生産する際に、こ
れら糖の増収に有効であることが認められており、現在
では、グルコースやマルトースの生産においてα−１，
６−グルコシダーゼがこれら糖質の製造用酵素であるグ
ルコアミラーゼやβ−アミラーゼと併用され、工業的に
も大量に使用されている。
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコースを製造し
たり、またデンプンからマルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオースなどのマルトオリゴ糖を生産する際に、こ
れら糖の増収に有効であることが認められており、現在
では、グルコースやマルトースの生産においてα−１，
６−グルコシダーゼがこれら糖質の製造用酵素であるグ
ルコアミラーゼやβ−アミラーゼと併用され、工業的に
も大量に使用されている。
更に、未だ大量生産には至っていないが、マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースに関しても、夫々の生成酵素とα−１，
６−グルコシダーゼが併用され、既にパイロットプラン
ト規模での生産が行なわれている。
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースに関しても、夫々の生成酵素とα−１，
６−グルコシダーゼが併用され、既にパイロットプラン
ト規模での生産が行なわれている。
しかるに、従来知られているプルラナーゼやイソアミラ
ーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼは、熱安定性に
劣り、また多くはその最適温度が45〜50℃程度でしかな
かった。
ーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼは、熱安定性に
劣り、また多くはその最適温度が45〜50℃程度でしかな
かった。
発明が解決しようとする問題点 一般に、澱粉糖の生産は、50℃以上の高温で、かつpH
4.5〜6.0の弱酸性条件下で行われているが、60℃以下の
反応温度では反応槽中の微生物汚染による反応pHの低下
を防止することは出来ず、また汚染によるpH低下を補償
するために多量の水酸化ナトリウムが水酸化カルシウム
などのアルカリ試薬をpH調整の目的で添加しなければな
らなかった。このため、生産物の脱塩・精製のために後
処理が必要となるばかりか、多大の費用が必要となる。
従って、このような微生物汚染を防止するためには60℃
以上、好ましくは65〜75℃に酵素反応の最適温度を有
し、同時にpH低下を調整するためのアルカリ剤の添加量
を低減するために反応の至適pHを中性〜弱アルカリ性に
有する酵素が求められている。
4.5〜6.0の弱酸性条件下で行われているが、60℃以下の
反応温度では反応槽中の微生物汚染による反応pHの低下
を防止することは出来ず、また汚染によるpH低下を補償
するために多量の水酸化ナトリウムが水酸化カルシウム
などのアルカリ試薬をpH調整の目的で添加しなければな
らなかった。このため、生産物の脱塩・精製のために後
処理が必要となるばかりか、多大の費用が必要となる。
従って、このような微生物汚染を防止するためには60℃
以上、好ましくは65〜75℃に酵素反応の最適温度を有
し、同時にpH低下を調整するためのアルカリ剤の添加量
を低減するために反応の至適pHを中性〜弱アルカリ性に
有する酵素が求められている。
以上の如く、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα−
１，６−グルコシダーゼに関しても、より高い最適温度
を持つ酵素の必要性が認識されており、このような目的
でストレプトマイセス属〔Streptomyces sp.，ジャーナ
ル オブ ザ ファーメンテーション テクノロジー
(J.Ferment. Tech.)，49,552，(1971)〕、クレブシエラ
・ニューモニアエ〔Klebsiella pneumoniae，特開昭60-
186283号〕、バチルス・アシドプルリティカス〔Bacill
us acidopullulyticus，プロセス バイオケミストリー
(Proocess Biochemistry)，19-4,129 (1984)〕あるいは
バチルス ステアロサーモフィルス〔Bacillus Stearot
hermophilus，ヨーロピアン ジャーナル オブ ザ
アプライド マイクロバイオロジー＆バイオテクノロジ
ー(Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.)，17-１，24 (1
983)〕、更にはクロストリジウム サーモハイドロサル
フュリカム〔Clostridium thermohydrosulfuricum，ア
プライド エンバイアロンメンタル マイクロバイオロ
ジー(Appl.Environ.Microbiol.)，49-5,1168 (1985)〕
などの微生物が新たに検索・分離され、これらが良好な
温度安定性を有し、高い至適温度を有するα−１，６−
グルコシダーゼ産生を有することを報告している。
１，６−グルコシダーゼに関しても、より高い最適温度
を持つ酵素の必要性が認識されており、このような目的
でストレプトマイセス属〔Streptomyces sp.，ジャーナ
ル オブ ザ ファーメンテーション テクノロジー
(J.Ferment. Tech.)，49,552，(1971)〕、クレブシエラ
・ニューモニアエ〔Klebsiella pneumoniae，特開昭60-
186283号〕、バチルス・アシドプルリティカス〔Bacill
us acidopullulyticus，プロセス バイオケミストリー
(Proocess Biochemistry)，19-4,129 (1984)〕あるいは
バチルス ステアロサーモフィルス〔Bacillus Stearot
hermophilus，ヨーロピアン ジャーナル オブ ザ
アプライド マイクロバイオロジー＆バイオテクノロジ
ー(Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.)，17-１，24 (1
983)〕、更にはクロストリジウム サーモハイドロサル
フュリカム〔Clostridium thermohydrosulfuricum，ア
プライド エンバイアロンメンタル マイクロバイオロ
ジー(Appl.Environ.Microbiol.)，49-5,1168 (1985)〕
などの微生物が新たに検索・分離され、これらが良好な
温度安定性を有し、高い至適温度を有するα−１，６−
グルコシダーゼ産生を有することを報告している。
しかしながら、これらの微生物のうちクレブシエラ属
（特願昭60-186283号）やバチルス属〔特開昭51-26288
号；プロセス バイオケミストリー(Process Biochemis
try)，19−４，129 (1984)〕などのα−１，６−グルコ
シダーゼの至適温度は60℃前後であり、従来から知られ
ているエーロバクター エーロゲネス〔Aerobactor aer
ogenes （本菌は現在では分類学的にクレブシエラ ニ
ューモニアエ：Klebsiella pneumoniaeとされてい
る）〕やシュードモナス属〔Pseudomonas,バイオシミカ
エ バイオフィジカ アクタ(Biochim.Biophys.act
a.），212，458 (1970)〕あるいはその他の微生物が生
産する酵素と比較して、より高温で作用するが、実用的
には更に高い温度で作用する酵素が求められている。
（特願昭60-186283号）やバチルス属〔特開昭51-26288
号；プロセス バイオケミストリー(Process Biochemis
try)，19−４，129 (1984)〕などのα−１，６−グルコ
シダーゼの至適温度は60℃前後であり、従来から知られ
ているエーロバクター エーロゲネス〔Aerobactor aer
ogenes （本菌は現在では分類学的にクレブシエラ ニ
ューモニアエ：Klebsiella pneumoniaeとされてい
る）〕やシュードモナス属〔Pseudomonas,バイオシミカ
エ バイオフィジカ アクタ(Biochim.Biophys.act
a.），212，458 (1970)〕あるいはその他の微生物が生
産する酵素と比較して、より高温で作用するが、実用的
には更に高い温度で作用する酵素が求められている。
一方、バチルス ステアロサーモフィルス(B.Stearothe
rmophilus)やクロストリジウム サーモハイドロサルフ
ュリカム(Cl. thermohydrosulfuricum)のα−１，６−
グルコシダーゼは65〜67.5℃および85℃に至適温度を有
しており、工業的意味において優れた特性を有している
と考えられるが、酵素の生産性や培養の困難さのために
実用的とは言えなかった。
rmophilus)やクロストリジウム サーモハイドロサルフ
ュリカム(Cl. thermohydrosulfuricum)のα−１，６−
グルコシダーゼは65〜67.5℃および85℃に至適温度を有
しており、工業的意味において優れた特性を有している
と考えられるが、酵素の生産性や培養の困難さのために
実用的とは言えなかった。
このような情況の下で、高い（70℃前後の）酵素反応の
至適作用温度を有し、しかも弱酸性〜弱アルカリ性領域
に安定pH範囲を有するα−１，６−グルコシダーゼの開
発が強く要求されている。また、このような酵素を開発
することによって、デンプンからのグルコース、マルト
ースあるいはマルトオリゴ糖の製造を安価かつ高い生産
性で実施することが可能となる。
至適作用温度を有し、しかも弱酸性〜弱アルカリ性領域
に安定pH範囲を有するα−１，６−グルコシダーゼの開
発が強く要求されている。また、このような酵素を開発
することによって、デンプンからのグルコース、マルト
ースあるいはマルトオリゴ糖の製造を安価かつ高い生産
性で実施することが可能となる。
従って、本発明の目的は上記要件を満足する新規なプル
ラナーゼを使用し、デンプンもしくはその分解生成物か
ら収率よく糖類を得る方法を提供することにある。
ラナーゼを使用し、デンプンもしくはその分解生成物か
ら収率よく糖類を得る方法を提供することにある。
問題点を解決するための手段 そこで、本発明者らは培養が容易であり、酵素反応の至
適温度が70℃前後であり、かつ弱酸性側に至適pHを有す
る、温度安定性に優れたα−１，６−グルコシダーゼを
生産する微生物を得るべく鋭意検索した結果、温泉の高
温土壌中から採取された好熱性細菌であるサーマス(The
mus)属に属する新規微生物が上記目的を達成する上で極
めて有用であり、これを好気的に培養することにより、
培養物中に上記要件を満足する新規プルラナーゼが高収
率で生成蓄積されることを見出し、本発明を完成したも
のである。
適温度が70℃前後であり、かつ弱酸性側に至適pHを有す
る、温度安定性に優れたα−１，６−グルコシダーゼを
生産する微生物を得るべく鋭意検索した結果、温泉の高
温土壌中から採取された好熱性細菌であるサーマス(The
mus)属に属する新規微生物が上記目的を達成する上で極
めて有用であり、これを好気的に培養することにより、
培養物中に上記要件を満足する新規プルラナーゼが高収
率で生成蓄積されることを見出し、本発明を完成したも
のである。
すなわち、本発明の糖類の製造法は以下の理化学的性質
を有する新規耐熱性プルラナーゼ： （イ）作用 アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する； （ロ）基質的異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
加水分解する； （ハ）至適pHおよび安定pH範囲 至適pHは5.5〜6.0であり、50℃、30分間の加熱条件下で
はpH５〜９の範囲内で安定である； （ニ）温度に対する安定性 pH 6.0、30分間の処理では60℃まで安定である； （ホ）作用適温の範囲 70℃近傍に至適作用温度を有する； （ヘ）失活条件 50℃、30分間の処理条件ではpH４および11で完全に失活
し、また、pH 6.0、30分間の処理では80℃で完全に失活
する； （ト）阻害および活性化 銅、水銀、亜鉛およびＥＤＴＡ（エチレンジアミンテト
ラアセテート）で阻害され、カルシウムで安定化され
る； （チ）ゲル濾過法による分子量 128,000±5,000； をエキソ型もしくはエンド型アミラーゼと併用し、デン
プンもしくはその加水分解生成物に作用させることを特
徴とするものである。
を有する新規耐熱性プルラナーゼ： （イ）作用 アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する； （ロ）基質的異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
加水分解する； （ハ）至適pHおよび安定pH範囲 至適pHは5.5〜6.0であり、50℃、30分間の加熱条件下で
はpH５〜９の範囲内で安定である； （ニ）温度に対する安定性 pH 6.0、30分間の処理では60℃まで安定である； （ホ）作用適温の範囲 70℃近傍に至適作用温度を有する； （ヘ）失活条件 50℃、30分間の処理条件ではpH４および11で完全に失活
し、また、pH 6.0、30分間の処理では80℃で完全に失活
する； （ト）阻害および活性化 銅、水銀、亜鉛およびＥＤＴＡ（エチレンジアミンテト
ラアセテート）で阻害され、カルシウムで安定化され
る； （チ）ゲル濾過法による分子量 128,000±5,000； をエキソ型もしくはエンド型アミラーゼと併用し、デン
プンもしくはその加水分解生成物に作用させることを特
徴とするものである。
本発明の方法において上記の新規耐熱性プルラナーゼは
サーマス属に属する微生物を好気的に培養することによ
り、該酵素を培養液中に細胞吸着型および菌体外分泌型
酵素として生成蓄積せしめ、これを分離・精製すること
を特徴とする方法によって得ることができる。
サーマス属に属する微生物を好気的に培養することによ
り、該酵素を培養液中に細胞吸着型および菌体外分泌型
酵素として生成蓄積せしめ、これを分離・精製すること
を特徴とする方法によって得ることができる。
本発明において使用する新規耐熱性プルラナーゼ生産菌
株はいずれも本発明者等により新たに天然界から検索・
単離されたものである。これらの菌株をバージェーズ・
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology)、
第１巻に従って同定すると、いずれも好気性無胞子桿菌
であり、運動性がなく、グラム染色陰性であり36℃以下
および75℃以上では生育できず、生育の最適温度が65℃
前後であることからサーマス(Thermus)属に属すると考
えられた。
株はいずれも本発明者等により新たに天然界から検索・
単離されたものである。これらの菌株をバージェーズ・
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology)、
第１巻に従って同定すると、いずれも好気性無胞子桿菌
であり、運動性がなく、グラム染色陰性であり36℃以下
および75℃以上では生育できず、生育の最適温度が65℃
前後であることからサーマス(Thermus)属に属すると考
えられた。
しかしながら、これまでにこのサーマス属に属する微生
物の中でプルナラーゼを菌体外生産するものは知られて
いないので、本発明の耐熱性プルナラーゼ生産菌株は新
規なものであると考えた。
物の中でプルナラーゼを菌体外生産するものは知られて
いないので、本発明の耐熱性プルナラーゼ生産菌株は新
規なものであると考えた。
以下の第１表に単離した三種の耐熱性プルラナーゼ生産
菌の菌学的諸性質を示す。
菌の菌学的諸性質を示す。
なお、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に夫
々、FERM P-8881(AMD-6)、FERM P-8882(AMD-22)およびF
ERM P-8883(AMD-28)として寄託している。
々、FERM P-8881(AMD-6)、FERM P-8882(AMD-22)およびF
ERM P-8883(AMD-28)として寄託している。
本発明において使用する新規な耐熱性プルラナーゼの製
造法につきさらに詳しく説明する。
造法につきさらに詳しく説明する。
上記のような耐熱性プルラナーゼ生産菌を適当な培地に
接種し、その生育温度の観点から37〜74℃、好ましくは
55〜65℃にて48〜96時間、好気的に培養することにより
培養液中に細胞吸着型および菌体外分泌型酵素として該
プルラナーゼが生成蓄積される。
接種し、その生育温度の観点から37〜74℃、好ましくは
55〜65℃にて48〜96時間、好気的に培養することにより
培養液中に細胞吸着型および菌体外分泌型酵素として該
プルラナーゼが生成蓄積される。
本方法に用いられる培地は安価に入手し得る公知の各種
材料を使用することができる。例えば、窒素源として
は、コーン・スティープ・リカー、ポリペプトン、大豆
粕、フスマ、ゼラチン、肉エキス、酵母エキス、硫酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素、アミノ酸液、な
どであり、炭素源としては水飴、マルトース、各種デン
プン、可溶性デンプン液化液、デキストリン、プルラン
などである。
材料を使用することができる。例えば、窒素源として
は、コーン・スティープ・リカー、ポリペプトン、大豆
粕、フスマ、ゼラチン、肉エキス、酵母エキス、硫酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素、アミノ酸液、な
どであり、炭素源としては水飴、マルトース、各種デン
プン、可溶性デンプン液化液、デキストリン、プルラン
などである。
また、これらの炭素源や窒素源の他に各種の塩、例えば
マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機
塩や各種ビタミン類を必要により添加する。
マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機
塩や各種ビタミン類を必要により添加する。
本発明の上記方法において使用するのに適した培地は、
例えば１％プルラン、１％大豆粕、0.1％K2ＨＰO4、0.0
4％MgSO4・７H2Ｏを含有する液体培地である。
例えば１％プルラン、１％大豆粕、0.1％K2ＨＰO4、0.0
4％MgSO4・７H2Ｏを含有する液体培地である。
また、上記方法で使用する微生物の生育pHは弱酸から弱
塩基性の範囲内であるので、適当なpH調整剤を用いて培
地のpHを調整する必要がある。そのために種々の緩衝液
を用いることができるが、0.2 〜１％程度の炭酸カルシ
ウムを用いることが特に便利である。
塩基性の範囲内であるので、適当なpH調整剤を用いて培
地のpHを調整する必要がある。そのために種々の緩衝液
を用いることができるが、0.2 〜１％程度の炭酸カルシ
ウムを用いることが特に便利である。
既に述べたように、本発明において有用な新規微生物は
細胞吸着型の酵素および菌体外分泌型の酵素を産生す
る。これらは夫々以下のような操作に従って分離・精製
することができる。
細胞吸着型の酵素および菌体外分泌型の酵素を産生す
る。これらは夫々以下のような操作に従って分離・精製
することができる。
即ち、上記のような組成の培地中で、上記条件下で培養
した後、培養液から菌体外分泌型酵素を、また菌体から
細胞吸着型酵素を夫々回収する。培養上澄中に蓄積され
る菌体外分泌型酵素は、遠心分離により菌体を除去した
後に得られる粗酵素液の形で、また、細胞吸着型酵素は
遠心分離により得た菌体自体を用いることが経済的に有
利であるが、これをさらに精製して使用することもでき
る。そのために、例えば硫安等による塩析、エタノー
ル、アセトン、イソプロパノール等による溶媒沈澱法、
限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般
的な酵素精製法により精製することができる。
した後、培養液から菌体外分泌型酵素を、また菌体から
細胞吸着型酵素を夫々回収する。培養上澄中に蓄積され
る菌体外分泌型酵素は、遠心分離により菌体を除去した
後に得られる粗酵素液の形で、また、細胞吸着型酵素は
遠心分離により得た菌体自体を用いることが経済的に有
利であるが、これをさらに精製して使用することもでき
る。そのために、例えば硫安等による塩析、エタノー
ル、アセトン、イソプロパノール等による溶媒沈澱法、
限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般
的な酵素精製法により精製することができる。
以下に、本発明において有用なプルラナーゼの好ましい
精製法の１例につき更に詳しく説明する。
精製法の１例につき更に詳しく説明する。
好熱性細菌サーマス属に属する例えばAMD-28菌株を１％
プルラン、１％大豆粕、0.1％K2HPO4、0.04％MgSO4・７
H2Ｏ、0.25％炭酸カルシウムを含む培地に植菌し、60℃
にて72時間、通気量１v.v.m. 250r.p.m.で好気的に培養
して得られる培養液を10,000r.p.m.、４℃にて連続遠心
して菌体を除き、約５の上澄液を得る。次いで、該上
澄液に固形硫酸アンモニウムを添加し、80％飽和とし、
４℃で一液放置する。生じた沈澱を濾過により集め、10
mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた後、同緩衝液に対
して一夜４℃で透析する。透析により生じる沈澱は遠心
分離により除き、得られる上澄液を10mMリン酸緩衝液(p
H7.0)で平衡化したDEAE−セルロースカラムに吸着さ
せ、０〜0.8ＭのNaClを含む上記と同様な緩衝液の濃度
勾配法によって酵素を溶出させる。溶出した活性画分を
集め平均分画分子量30,000の限外濾過膜を用いて濃縮し
た後、0.1Ｍ食塩を含む上記同様のリン酸緩衝液を用い
て一夜透析する。次いで、該透析酵素を同様に0.1Ｍ食
塩を含む上記リン酸緩衝液で平衡化したセファクリルS-
200カラムに充填し、0.1Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出す
る。
プルラン、１％大豆粕、0.1％K2HPO4、0.04％MgSO4・７
H2Ｏ、0.25％炭酸カルシウムを含む培地に植菌し、60℃
にて72時間、通気量１v.v.m. 250r.p.m.で好気的に培養
して得られる培養液を10,000r.p.m.、４℃にて連続遠心
して菌体を除き、約５の上澄液を得る。次いで、該上
澄液に固形硫酸アンモニウムを添加し、80％飽和とし、
４℃で一液放置する。生じた沈澱を濾過により集め、10
mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた後、同緩衝液に対
して一夜４℃で透析する。透析により生じる沈澱は遠心
分離により除き、得られる上澄液を10mMリン酸緩衝液(p
H7.0)で平衡化したDEAE−セルロースカラムに吸着さ
せ、０〜0.8ＭのNaClを含む上記と同様な緩衝液の濃度
勾配法によって酵素を溶出させる。溶出した活性画分を
集め平均分画分子量30,000の限外濾過膜を用いて濃縮し
た後、0.1Ｍ食塩を含む上記同様のリン酸緩衝液を用い
て一夜透析する。次いで、該透析酵素を同様に0.1Ｍ食
塩を含む上記リン酸緩衝液で平衡化したセファクリルS-
200カラムに充填し、0.1Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出す
る。
活性画分を集め限外濾過膜を用いて濃縮した後、ショデ
ックス(Shodex) WS-2003カラムを用いる高速液体クロマ
トグラフ法にて再度クロマトグラフィーに付して活性画
分を集める。かくして得られる精製酵素はポリアクリル
アミドゲルディスク電気泳動（ゲル濃度7.5％）的に単
一であり、活性収率は約21％であった。なお、本発明の
方法において有用なAMD-6菌株およびAMD-22菌株のプル
ラナーゼについても同様な方法で精製可能である。
ックス(Shodex) WS-2003カラムを用いる高速液体クロマ
トグラフ法にて再度クロマトグラフィーに付して活性画
分を集める。かくして得られる精製酵素はポリアクリル
アミドゲルディスク電気泳動（ゲル濃度7.5％）的に単
一であり、活性収率は約21％であった。なお、本発明の
方法において有用なAMD-6菌株およびAMD-22菌株のプル
ラナーゼについても同様な方法で精製可能である。
さらに、細胞吸着型酵素は、例えばトライトン(Triton)
X-100 あるいはドデシル硫酸ナトリウム(SPS)などの界
面活性剤で菌体を洗浄することにより容易に溶離するの
で遠心分離により集菌した菌体を0.05〜0.5％（ｗ／
ｖ）程度の該界面活性剤で処理した後、遠心分離して得
られる上澄から上記と同様な方法により精製できる。
X-100 あるいはドデシル硫酸ナトリウム(SPS)などの界
面活性剤で菌体を洗浄することにより容易に溶離するの
で遠心分離により集菌した菌体を0.05〜0.5％（ｗ／
ｖ）程度の該界面活性剤で処理した後、遠心分離して得
られる上澄から上記と同様な方法により精製できる。
勿論、培養液の遠心分離処理前に、培養液中に上記のよ
うな界面活性剤を添加して、予め細胞吸着型酵素を培養
液中に溶離させ、次いで上記の精製・分離操作を行っ
て、これら両者を同時に回収することも可能である。
うな界面活性剤を添加して、予め細胞吸着型酵素を培養
液中に溶離させ、次いで上記の精製・分離操作を行っ
て、これら両者を同時に回収することも可能である。
なお、上記方法により得られる細胞吸着型酵素と菌体外
分泌型酵素の理化学的性質は、ほぼ同一である。
分泌型酵素の理化学的性質は、ほぼ同一である。
更に、プルラナーゼの活性測定法並びに活性表示法は以
下の通りである。
下の通りである。
即ち、0.1Ｍのリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解させた３％(w
／v)のプルラン溶液0.3mlに酵素液0.05mlを混合し、60
℃で30分間反応させた後、ＤＮＳ試液〔ジェイ．アー
ル．サマー，ジ−．イ−．ソマーズ，“ラボラトリー
イクスペリメンツ インバイオロジカル ケミストリ
ー”，アカデミックプレス，ニューヨーク(J. R. Summe
r, G. E. Somers,"Laboratory Experiments in Biologi
cal Chemistry,"Academemic Press, New York),3435
頁，1944年〕１mlを加えて反応を止める。ついで、沸騰
水浴中で５分間加熱した後急冷し、 3mlの水を加えて十
分に撹拌する。同様に処理した0.35mlの 0.5mg／mlグル
コース溶液を標準とし、その着色度をクレトーサマーソ
ン(Klett-Summerson)型光電比色計フィルターNo.52を用
いて測定する。酵素活性の単位は前述の条件下で１分間
に１μmoleのマルトトリオース生成に相当する還元力を
有する酵素量を１単位とした。
／v)のプルラン溶液0.3mlに酵素液0.05mlを混合し、60
℃で30分間反応させた後、ＤＮＳ試液〔ジェイ．アー
ル．サマー，ジ−．イ−．ソマーズ，“ラボラトリー
イクスペリメンツ インバイオロジカル ケミストリ
ー”，アカデミックプレス，ニューヨーク(J. R. Summe
r, G. E. Somers,"Laboratory Experiments in Biologi
cal Chemistry,"Academemic Press, New York),3435
頁，1944年〕１mlを加えて反応を止める。ついで、沸騰
水浴中で５分間加熱した後急冷し、 3mlの水を加えて十
分に撹拌する。同様に処理した0.35mlの 0.5mg／mlグル
コース溶液を標準とし、その着色度をクレトーサマーソ
ン(Klett-Summerson)型光電比色計フィルターNo.52を用
いて測定する。酵素活性の単位は前述の条件下で１分間
に１μmoleのマルトトリオース生成に相当する還元力を
有する酵素量を１単位とした。
本発明の方法において糖類の製造に有用なデンプンとし
ては特に制限されず、貯蔵炭水化物として各種高等植物
の種子、根茎等の貯蔵器官に貯蔵された任意のもの、も
しくはその酸または他の酵素による分解生成物であり
得、例えば米（ウルチ米、モチ米）、小麦、トウモロコ
シ、モチトウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、サ
ゴ、タピオカ、バナナの他、分解生成物として水アメ等
を容易に入手できるものとして例示できる。
ては特に制限されず、貯蔵炭水化物として各種高等植物
の種子、根茎等の貯蔵器官に貯蔵された任意のもの、も
しくはその酸または他の酵素による分解生成物であり
得、例えば米（ウルチ米、モチ米）、小麦、トウモロコ
シ、モチトウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、サ
ゴ、タピオカ、バナナの他、分解生成物として水アメ等
を容易に入手できるものとして例示できる。
更に、上記の新規耐熱性プルラナーゼと共に併用される
アミラーゼとしてはエキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシ
ダーゼ、β−アミラーゼ、エキソマルトトリオヒドロラ
ーゼ、エキソマルトテトラオヒドロラーゼ、エキソマル
トヘキサオヒドロラーゼ等のエキソ型アミラーゼ、ある
いはα−アミラーゼ、イソアミラーゼもしくは上記以外
のプルラナーゼなどのエンド型アミラーゼがいずれも使
用出来、これらは２種以上の混合物として使用すること
もできる。これら酵素は上記の如く、微生物の培養液
（粗酵素液）または菌体自体として使用する他、精製酵
素として、更には公知の酵素固定化法により適当な担体
上に固定化し、回収・再利用可能なものとした後使用し
てもよいことは勿論である。
アミラーゼとしてはエキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシ
ダーゼ、β−アミラーゼ、エキソマルトトリオヒドロラ
ーゼ、エキソマルトテトラオヒドロラーゼ、エキソマル
トヘキサオヒドロラーゼ等のエキソ型アミラーゼ、ある
いはα−アミラーゼ、イソアミラーゼもしくは上記以外
のプルラナーゼなどのエンド型アミラーゼがいずれも使
用出来、これらは２種以上の混合物として使用すること
もできる。これら酵素は上記の如く、微生物の培養液
（粗酵素液）または菌体自体として使用する他、精製酵
素として、更には公知の酵素固定化法により適当な担体
上に固定化し、回収・再利用可能なものとした後使用し
てもよいことは勿論である。
プルラナーゼとアミラーゼとを併用する場合、始めから
これらを共存させても、また予めプルラナーゼで分解
し、その分解生成物を更にアミラーゼの作用に付しても
よい。
これらを共存させても、また予めプルラナーゼで分解
し、その分解生成物を更にアミラーゼの作用に付しても
よい。
本発明の糖類の製造方法では、使用する新規耐熱性プル
ラナーゼの至適温度（あるいは安定温度範囲内）にて、
至適pH（あるいは安定pH範囲内）の下で実施する。ま
た、その使用量は特に制限はないが、反応速度、生産性
など経済的な観点から、分解すべき糖類基質１ｇにつき
0.1 〜 5単位で使用することが好ましい。尚、アミラ
ーゼについては従来と同様である。
ラナーゼの至適温度（あるいは安定温度範囲内）にて、
至適pH（あるいは安定pH範囲内）の下で実施する。ま
た、その使用量は特に制限はないが、反応速度、生産性
など経済的な観点から、分解すべき糖類基質１ｇにつき
0.1 〜 5単位で使用することが好ましい。尚、アミラ
ーゼについては従来と同様である。
作用 プルラナーゼはアミロペクチンのα−１，６−グルコシ
ド結合を加水分解し、またβ−アミラーゼと併用した場
合にはデンプンからマルトースを高収率で生産できる。
このマルトースは澱粉糖の一種で麦芽糖とも呼ばれ、一
般に甘味剤、栄養剤などとして有用なものである。
ド結合を加水分解し、またβ−アミラーゼと併用した場
合にはデンプンからマルトースを高収率で生産できる。
このマルトースは澱粉糖の一種で麦芽糖とも呼ばれ、一
般に甘味剤、栄養剤などとして有用なものである。
既に詳しく述べたように、デンプンもしくはその分解生
成物からマルトースあるいはマルトオリゴ糖を生成する
加水分解反応においては、該反応を高温度下にて中性〜
弱酸性条件下で行なうことが量産性、経済性の点で有利
であるとされている。
成物からマルトースあるいはマルトオリゴ糖を生成する
加水分解反応においては、該反応を高温度下にて中性〜
弱酸性条件下で行なうことが量産性、経済性の点で有利
であるとされている。
即ち、低温での反応では反応槽中の微生物汚染が著し
く、そのため反応pHが著しく低下することが知られてお
り、これを回避するためにアルカリ試薬の添加が余儀な
くされ、それに伴う操作上の難点が生じる。また、この
反応で使用する酵素は高温安定性を有し、しかもその生
産性、収量などといった、製造上の観点からも経済的に
有利なものでなければならないが、この要求をいずれも
満足する酵素はこれまでのところ知られていなかった。
く、そのため反応pHが著しく低下することが知られてお
り、これを回避するためにアルカリ試薬の添加が余儀な
くされ、それに伴う操作上の難点が生じる。また、この
反応で使用する酵素は高温安定性を有し、しかもその生
産性、収量などといった、製造上の観点からも経済的に
有利なものでなければならないが、この要求をいずれも
満足する酵素はこれまでのところ知られていなかった。
上記デンプン等の加水分解による有用糖類の生成反応に
おける各種難点は、本発明者等が新たに検索・単離した
微生物の生産する新規な耐熱性プルラナーゼを使用する
ことによって、いずれも解決された。
おける各種難点は、本発明者等が新たに検索・単離した
微生物の生産する新規な耐熱性プルラナーゼを使用する
ことによって、いずれも解決された。
本発明の方法において使用する耐熱性プルラナーゼの理
科学的、酵素化学的諸性質と従来公知の微生物由来のα
−１，６−グルコシダーゼとを比較して第２表に示す。
科学的、酵素化学的諸性質と従来公知の微生物由来のα
−１，６−グルコシダーゼとを比較して第２表に示す。
即ち第２表から明らかな如く、まず本発明のプルラナー
ゼは約70℃に酵素反応の至適温度を有しており、また至
適pHも弱酸性〜中性領域にある。従って、澱粉の酵素分
解反応を高温でしかも中性領域近傍で実施することが可
能となる。この事実は、微生物汚染を確実に防止するこ
とを保証し、また汚染に基くpH低下を補償する目的でア
ルカリ試薬を添加する必要もなくなり、その結果、脱塩
等の後処理が不要となるのでコストパーフォーマンスに
おける大巾な改善が期待できる。更に、高温での反応が
可能なことから反応速度の改善が期待でき、これは分解
生成物の量産性を保証する。
ゼは約70℃に酵素反応の至適温度を有しており、また至
適pHも弱酸性〜中性領域にある。従って、澱粉の酵素分
解反応を高温でしかも中性領域近傍で実施することが可
能となる。この事実は、微生物汚染を確実に防止するこ
とを保証し、また汚染に基くpH低下を補償する目的でア
ルカリ試薬を添加する必要もなくなり、その結果、脱塩
等の後処理が不要となるのでコストパーフォーマンスに
おける大巾な改善が期待できる。更に、高温での反応が
可能なことから反応速度の改善が期待でき、これは分解
生成物の量産性を保証する。
一方、該プルラナーゼの製法の観点からしても、本発明
で使用する新規微生物においては、菌体（細胞吸着型酵
素）および培養液中（菌体外分泌型酵素）の両者から有
用なα−１，６−グリコシダーゼを単離することができ
る。従って、収率が高く、培養操作も簡単であり、特に
菌体外分泌型酵素の場合には精製・分離操作が簡単であ
り、酵素の製法としては極めて有利である。尚、細胞吸
着型酵素においても、界面活性剤の使用により菌体から
容易に溶離でき、その後は菌体外分泌型酵素と同様に精
製・分離できる。
で使用する新規微生物においては、菌体（細胞吸着型酵
素）および培養液中（菌体外分泌型酵素）の両者から有
用なα−１，６−グリコシダーゼを単離することができ
る。従って、収率が高く、培養操作も簡単であり、特に
菌体外分泌型酵素の場合には精製・分離操作が簡単であ
り、酵素の製法としては極めて有利である。尚、細胞吸
着型酵素においても、界面活性剤の使用により菌体から
容易に溶離でき、その後は菌体外分泌型酵素と同様に精
製・分離できる。
かくして、本発明の方法によれば澱粉の酵素分解のため
に有用なプルラナーゼを安価かつ大量に供給でき、また
かくして得られる酵素により工業的に大規模な澱粉糖の
生成を有利に実施できる。
に有用なプルラナーゼを安価かつ大量に供給でき、また
かくして得られる酵素により工業的に大規模な澱粉糖の
生成を有利に実施できる。
実施例 以下、実施例に従って本発明の新規耐熱性プルラナーゼ
を用いたデンプンまたはその分解生成物からの有用な糖
類の製造法につき更に具体的に説明する。
を用いたデンプンまたはその分解生成物からの有用な糖
類の製造法につき更に具体的に説明する。
しかしながら、本発明の範囲は以下の実施例によって何
等制限されるものではない。
等制限されるものではない。
実施例１ 好熱性細菌サーマスNo. AND-6 (Thermus sp. No.AMD-
6：FERMＰ−8881)菌株を500ml容の三角フラスコ中のプ
ルラン１％、大豆粕１％、K2ＨＰO40.1％、MgＳO4・７H
2Ｏ0.04％およびCaＣＯ3 0.25％を含む培地(pH7.0) 100
mlに植菌し、70℃で30時間200r.p.m.で回転振とう培養
した後、トリトン(Triton)X-100を0.4％添加し、37℃で
20時間、200r.p.m.で回転振とうして細胞吸着型酵素を
細胞表層から溶離抽出した。ついで12,000ｇ、４℃で30
分間遠心分離して菌体を除き、9.2単位／mlの粗酵素液8
9mlを得た。次いで平均分画分子量30,000の限外濾過膜
を用いて、これを濃縮し、175単位／mlのプルラン分解
活性を有する濃縮粗酵素液を約５ml得た。尚、酵素の活
性単位は上記方法によって測定した（以下同様）。
6：FERMＰ−8881)菌株を500ml容の三角フラスコ中のプ
ルラン１％、大豆粕１％、K2ＨＰO40.1％、MgＳO4・７H
2Ｏ0.04％およびCaＣＯ3 0.25％を含む培地(pH7.0) 100
mlに植菌し、70℃で30時間200r.p.m.で回転振とう培養
した後、トリトン(Triton)X-100を0.4％添加し、37℃で
20時間、200r.p.m.で回転振とうして細胞吸着型酵素を
細胞表層から溶離抽出した。ついで12,000ｇ、４℃で30
分間遠心分離して菌体を除き、9.2単位／mlの粗酵素液8
9mlを得た。次いで平均分画分子量30,000の限外濾過膜
を用いて、これを濃縮し、175単位／mlのプルラン分解
活性を有する濃縮粗酵素液を約５ml得た。尚、酵素の活
性単位は上記方法によって測定した（以下同様）。
ついで、５mlの３５％(w/v)とうもろこしデンプン懸濁
液を細菌液化型耐熱性α−アミラーゼ（大和化成株製、
クライスターゼＴ−５）を用いて105℃で液化した後、
ただちに125℃で30分間オートクレープし、D.E(Dextros
e Equivalent：直接還元糖に対する全固定物の割合）×
８デンプンン液化液を得た。該デンプン液化液に対し、
３単位／ｇデンプンのリゾプス属のグルコアミラーゼ
（新日本化学株製、スミチーム、3,000単位／ｇ）およ
びデンプン１ｇあたり１単位のAMD-6菌の前述の方法で
調製した濃縮粗酵素液（プルラナーゼ）を添加し、pH5
〜5.5、55℃で60時間反応させた。尚、比較対照とし
て、プルラナーゼを添加せず他は同様な条件で反応させ
た。
液を細菌液化型耐熱性α−アミラーゼ（大和化成株製、
クライスターゼＴ−５）を用いて105℃で液化した後、
ただちに125℃で30分間オートクレープし、D.E(Dextros
e Equivalent：直接還元糖に対する全固定物の割合）×
８デンプンン液化液を得た。該デンプン液化液に対し、
３単位／ｇデンプンのリゾプス属のグルコアミラーゼ
（新日本化学株製、スミチーム、3,000単位／ｇ）およ
びデンプン１ｇあたり１単位のAMD-6菌の前述の方法で
調製した濃縮粗酵素液（プルラナーゼ）を添加し、pH5
〜5.5、55℃で60時間反応させた。尚、比較対照とし
て、プルラナーゼを添加せず他は同様な条件で反応させ
た。
ついで、反応終了後の糖液に対して、0.2％(w/v)の活性
炭を添加し、沸騰水浴中で５分間加熱した後、0.45μｍ
ポアサイズのメンブランフィルターで濾別して得られる
糖液中のグルコース含有量をショデックス(Shodex)KS-8
01カラムを用いる高速液体クロマトグラフ法で測定した
結果、プルラナーゼ無添加区では94.4％であったが、添
加区では96.1％であった。
炭を添加し、沸騰水浴中で５分間加熱した後、0.45μｍ
ポアサイズのメンブランフィルターで濾別して得られる
糖液中のグルコース含有量をショデックス(Shodex)KS-8
01カラムを用いる高速液体クロマトグラフ法で測定した
結果、プルラナーゼ無添加区では94.4％であったが、添
加区では96.1％であった。
実施例２ 好熱性細菌サーマスNo. AMD-22 (Thermus sp. No.AMD-2
2:FERM P-8882)菌株を500ml容の三角フラスコ中の可溶
性デンプン１％、コーン・スティープ・リカー４％、酵
母エキス0.2％、K2ＨＰO4 0.1％、MgＳO4・７H2Ｏ0.02
％を含む培地(pH6)100mlに植菌し、50℃で72時間、200
r.p.m.で回転振とう培養した。培養液を12,000ｇ、４℃
で30分間遠心分離して得られる培養上澄93ml中には3.5
単位／mlの菌体外分泌型プルラナーゼが含まれていた。
さらに遠心分離により得られる菌体を、0.1％(w/v)のＳ
ＤＳを含む25mlの50mM燐酸緩衝液(pH7.0)に懸濁させ、3
0℃℃で18時間、200r.p.m.で回転振とう抽出した後、1
2,000ｇ、４℃で30分間遠心分離した。得られる上澄22m
l中には31.2単位／mlの細胞吸着型プルラナーゼが含ま
れていた。
2:FERM P-8882)菌株を500ml容の三角フラスコ中の可溶
性デンプン１％、コーン・スティープ・リカー４％、酵
母エキス0.2％、K2ＨＰO4 0.1％、MgＳO4・７H2Ｏ0.02
％を含む培地(pH6)100mlに植菌し、50℃で72時間、200
r.p.m.で回転振とう培養した。培養液を12,000ｇ、４℃
で30分間遠心分離して得られる培養上澄93ml中には3.5
単位／mlの菌体外分泌型プルラナーゼが含まれていた。
さらに遠心分離により得られる菌体を、0.1％(w/v)のＳ
ＤＳを含む25mlの50mM燐酸緩衝液(pH7.0)に懸濁させ、3
0℃℃で18時間、200r.p.m.で回転振とう抽出した後、1
2,000ｇ、４℃で30分間遠心分離した。得られる上澄22m
l中には31.2単位／mlの細胞吸着型プルラナーゼが含ま
れていた。
該培養上澄（菌体外分泌型）液およびSDS溶出液（細胞
吸着型）を混合した後、平均分画分子量30,000の限外濾
過膜を用いて濃縮し107.5単位／mlのプルラン分解活性
を有する濃縮粗酵素液約8mlを得た。
吸着型）を混合した後、平均分画分子量30,000の限外濾
過膜を用いて濃縮し107.5単位／mlのプルラン分解活性
を有する濃縮粗酵素液約8mlを得た。
ついで、２mlの35％(w/v)馬鈴薯デンプン懸濁液を細菌
液化型α−アミラーゼ（大和化成株製、クライスターゼ
Ｌ−１）を用いて90℃で液化した後、直ちに125℃で3
0分間オートクレーブし、DE.10のデンプン液化液を得
た。
液化型α−アミラーゼ（大和化成株製、クライスターゼ
Ｌ−１）を用いて90℃で液化した後、直ちに125℃で3
0分間オートクレーブし、DE.10のデンプン液化液を得
た。
該デンプン液化液の固形物に対し、0.06％のアスペルギ
ルス属のグルコアミラーゼ〔ノボ(NOVO)社製、AMG300
L〕およびデンプン１ｇ当り１単位のAMD-22菌の濃縮粗
酵素液（プルラナーゼ）を添加し、pH５、60℃で50時間
反応させた。
ルス属のグルコアミラーゼ〔ノボ(NOVO)社製、AMG300
L〕およびデンプン１ｇ当り１単位のAMD-22菌の濃縮粗
酵素液（プルラナーゼ）を添加し、pH５、60℃で50時間
反応させた。
尚、比較対照はプルラナーゼ無添加とし、他は同様な処
理を行った。
理を行った。
ついで、得られる糖液を実施例１と同様な方法で脱色、
濾過し、糖液中のグルコースの含有量を高速液体クロマ
トグラフ法で測定した結果、プルラナーゼ無添加区では
94.3％であったが、添加区では95.8％であった。
濾過し、糖液中のグルコースの含有量を高速液体クロマ
トグラフ法で測定した結果、プルラナーゼ無添加区では
94.3％であったが、添加区では95.8％であった。
実施例３ 好熱性細菌サーマスNo. AMD-28(Thermus sp. AMD-28：F
ERM P- 8883)菌株を10容のジャーファーメンター中
の可溶性デンプン１％、マルトース0.2 ％、コーン・ス
ティープ・リカー３％、大豆粕１％、K2ＨＰO40.1％、M
gＳO4・７H2Ｏ0.02％、CaCl2 0.005％、FeＳO4・７H2Ｏ
0.003％を含む培地(pH7)６に、予め、実施例１で述べ
た培地を用いてNo. AMD-28菌株を60℃で18時間前培養し
て得られる種菌液180mlを添加し、60℃で250r.p.m.、通
気量１v.v.m.で72時間通気撹拌培養した。培養終了後、
温度を37℃に下げ、ＳＤＳ0.1％(w/v)を添加して、更に
18時間撹拌した。ついで、10,000r.p.m.、４℃で連続遠
心して菌体を除いた後、平均分画分子量30,000の限外濾
過膜を用いて約10倍に濃縮した。ついで、該濃縮液に固
型硫酸アンモニウムを80％飽和まで添加し、４℃で一夜
放置した。本操作により生じた沈澱を濾過により集め、
減圧下、室温で乾燥して3.5 ｇの 162,000単位／ｇのプ
ルラン分解活性をもつ粗酵素粉末を得た。
ERM P- 8883)菌株を10容のジャーファーメンター中
の可溶性デンプン１％、マルトース0.2 ％、コーン・ス
ティープ・リカー３％、大豆粕１％、K2ＨＰO40.1％、M
gＳO4・７H2Ｏ0.02％、CaCl2 0.005％、FeＳO4・７H2Ｏ
0.003％を含む培地(pH7)６に、予め、実施例１で述べ
た培地を用いてNo. AMD-28菌株を60℃で18時間前培養し
て得られる種菌液180mlを添加し、60℃で250r.p.m.、通
気量１v.v.m.で72時間通気撹拌培養した。培養終了後、
温度を37℃に下げ、ＳＤＳ0.1％(w/v)を添加して、更に
18時間撹拌した。ついで、10,000r.p.m.、４℃で連続遠
心して菌体を除いた後、平均分画分子量30,000の限外濾
過膜を用いて約10倍に濃縮した。ついで、該濃縮液に固
型硫酸アンモニウムを80％飽和まで添加し、４℃で一夜
放置した。本操作により生じた沈澱を濾過により集め、
減圧下、室温で乾燥して3.5 ｇの 162,000単位／ｇのプ
ルラン分解活性をもつ粗酵素粉末を得た。
ついで、実施例２と同様な方法で液化したDE.2.5の25％
(w/v)馬鈴薯デンプン液化液(5ml)に対し、15単位／ｇデ
ンプンの大豆β−アミラーゼ（長瀬生化学工業製、10,0
00単位／ｇ）および前述の方法で得たAMD-28菌のプルラ
ン分解酵素粉末をデンワプン１ｇ当たり３単位添加し、
pH 6.6、65℃で40時間反応させた。
(w/v)馬鈴薯デンプン液化液(5ml)に対し、15単位／ｇデ
ンプンの大豆β−アミラーゼ（長瀬生化学工業製、10,0
00単位／ｇ）および前述の方法で得たAMD-28菌のプルラ
ン分解酵素粉末をデンワプン１ｇ当たり３単位添加し、
pH 6.6、65℃で40時間反応させた。
なお、比較対照はプルラナーゼ無添加とし、他は同様な
処理を行った。次いで得られる糖液を実施例１と同様な
方法で脱色・濾過し、糖液中のマルトースの含有量を実
施例１と同様に高速液体クロマトグラフ法で測定した結
果、プルラナーゼ無添加区では60.3％であったが、添加
区では87.5％であった。
処理を行った。次いで得られる糖液を実施例１と同様な
方法で脱色・濾過し、糖液中のマルトースの含有量を実
施例１と同様に高速液体クロマトグラフ法で測定した結
果、プルラナーゼ無添加区では60.3％であったが、添加
区では87.5％であった。
実施例４ 実施例３で得た25％(w/v)馬鈴薯デンプン液化液に対し
２単位／ｇ・デンプンのシュードモナス シュテッツェ
リ(Pseudomonas Stetzeri)のマルトテトラオース生成ア
ミラーゼ（日本食品化工製、20,000単位／ｇ）および実
施例３で得たAMD-28菌のプルラナーゼ粉末をデンプン１
ｇ当たり２単位添加し、pH6.5、55℃で30時間反応させ
た。なお、比較対照はプルラナーゼ無添加とし、他は同
様な処理を行った。
２単位／ｇ・デンプンのシュードモナス シュテッツェ
リ(Pseudomonas Stetzeri)のマルトテトラオース生成ア
ミラーゼ（日本食品化工製、20,000単位／ｇ）および実
施例３で得たAMD-28菌のプルラナーゼ粉末をデンプン１
ｇ当たり２単位添加し、pH6.5、55℃で30時間反応させ
た。なお、比較対照はプルラナーゼ無添加とし、他は同
様な処理を行った。
次いで、得られる糖液を実施例１と同様な方法で脱色・
濾過し、糖液中のマルトテトラオース含有量を実施例１
と同様に高速液体クロマトグラフ法で測定した結果、プ
ルラナーゼ無添加区では44.8％であったが、添加区では
62.1％であった。
濾過し、糖液中のマルトテトラオース含有量を実施例１
と同様に高速液体クロマトグラフ法で測定した結果、プ
ルラナーゼ無添加区では44.8％であったが、添加区では
62.1％であった。
発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によれば高温度域（70
℃前後）に酵素反応の至適温度を有し、しかも弱酸性〜
弱塩基性領域に安定pH範囲を有するα−１，６−グルコ
シダーゼを使用したことにより、このものの前記諸特性
に基き、澱粉の酵素分解反応の収率、効率を大巾に改善
することが可能となる。しかも、余分な試薬の必要性を
排除し、脱塩などの後処理をも不要とするので工程の経
済性も著しく向上する。
℃前後）に酵素反応の至適温度を有し、しかも弱酸性〜
弱塩基性領域に安定pH範囲を有するα−１，６−グルコ
シダーゼを使用したことにより、このものの前記諸特性
に基き、澱粉の酵素分解反応の収率、効率を大巾に改善
することが可能となる。しかも、余分な試薬の必要性を
排除し、脱塩などの後処理をも不要とするので工程の経
済性も著しく向上する。
更に、本発明の方法によれば、使用する新規微生物が菌
体並びに培養液両者に上記の優れた諸特性を有するα−
１，６−グルコシダーゼを簡単な工程で、しかも高収率
で得ることを可能とすることから酵素自体のコストを著
しく低減する。
体並びに培養液両者に上記の優れた諸特性を有するα−
１，６−グルコシダーゼを簡単な工程で、しかも高収率
で得ることを可能とすることから酵素自体のコストを著
しく低減する。
かくして、本発明は安価かつ大規模での澱粉糖の製造を
可能とするので工業的に極めて大きな意義を有するもの
である。
可能とするので工業的に極めて大きな意義を有するもの
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (5)
- 【請求項１】以下の理化学的性質を有する新規耐熱性プ
ルラナーゼ： （イ）作用 アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する； （ロ）基質特異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
加水分解する； （ハ）至適pHおよび安定pH範囲 至適pHは5.5〜6.0であり、50℃、30分間の加熱条件下で
はpH５〜９の範囲内で安定である； （ニ）温度に対する安定性 pH6.0、30分間の処理では60℃まで安定である； （ホ）作用適温の範囲 70℃近傍に至適作用温度を有する； （ヘ）失活条件 50℃、30分間の処理条件ではpH４および11で完全に失活
し、また、pH 6.0、30分間の処理では80℃で完全に失活
する； （ト）阻害および活性化 銅、水銀、亜鉛およびエチレンジアミンテトラアセテー
トで阻害され、カルシウムで安定化される； （チ）ゲルろ過法による分子量 128,000±5,000 をエキソ型もしくはエンド型アミラーゼと併用して、デ
ンプンもしくはその加水分解物に作用させることを特徴
とする糖類の製造法。 - 【請求項２】上記プルラナーゼが細胞吸着型酵素である
特許請求の範囲第１項記載の糖類の製造法。 - 【請求項３】上記プルラナーゼが菌体外分泌型酵素であ
る特許請求の範囲第１項記載の糖類の製造法。 - 【請求項４】上記プルラナーゼが細胞吸着型酵素と菌体
外分泌型酵素との混合物である特許請求の範囲第１項記
載の糖類の製造法。 - 【請求項５】上記プルラナーゼが該プルラナーゼ生産能
を有し、サーマス属に属する微生物、微工研菌寄第8881
号、同第8882号または同第8883号を培養し、採取したも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第１〜４項の
いずれか１項に記載の糖類の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61186575A JPH062071B2 (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | 糖類の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61186575A JPH062071B2 (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | 糖類の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6342696A JPS6342696A (ja) | 1988-02-23 |
| JPH062071B2 true JPH062071B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=16190938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61186575A Expired - Lifetime JPH062071B2 (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | 糖類の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062071B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0415397B1 (en) * | 1989-08-31 | 1994-10-19 | Kao Corporation | Alkaline pullulanase, microorganism producing the same, and process for producing the same |
| JP3633648B2 (ja) * | 1993-07-20 | 2005-03-30 | 株式会社林原生物化学研究所 | マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途 |
| EP0693558B1 (en) * | 1994-07-19 | 2002-12-04 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Trehalose and its production and use |
-
1986
- 1986-08-08 JP JP61186575A patent/JPH062071B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6342696A (ja) | 1988-02-23 |
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