JP2866460B2 - 多糖類の糖化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、α−アミラーゼ活性を有する新規なアルカ
リプルラナーゼＹを用いた多糖類の糖化方法、詳しく
は、新規なバチルス(Bacillus)属に属する好アルカリ微
生物を培養して得られる、α−アミラーゼ活性を有する
新規なアルカリプルラナーゼＹを用いた多糖類の糖化方
法に関する。

〔従来の技術〕

プルラナーゼは、プルラン分子中のα−1,6グルコシ
ド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオースを生成
する酵素で、1961年にベンダー（Bender）とウォーレン
フェルス（Wallenfels）（Biochem.Z.,334,79（1961）
により、アエロバクター アエロゲネス(Aerobacter ae
rogenes)の１菌株から初めて発見されたものである。現
在、本酵素は、プルランのみならず、澱粉、グリコーゲ
ン、アミロペクチンやこれらの部分分解により生じた分
岐オリゴ糖中のα−1,6グルコシド結合に対しても水解
活性を有することが判明しており、「枝切り酵素」と呼
ばれている。

上記プルラナーゼは、エンド型アミラーゼやエキソ型
アミラーゼと併用することにより、澱粉からグルコース
やマルトース、あるいはマルトトリオース、マルトテト
ラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等
のマルトオリゴ糖を高収量で生産し得る点が注目され、
バチルス エスピー(Bacillus sp.）〔J.Jpn.Soc.Starc
h Sci.,30,200（1983）〕、バチルス アシドプルリテ
ィクス(Bacillus acidopullulytics）〔Agric.Biol.Che
m.,52,2293（1984）〕、バチルス ステアロサーモフィ
ルス(Bacillus stearothermophilus）〔Eur.J.Appl.Mic
robiol.Biotechnol.,17,24（1983）〕、ストレプトコッ
カス ミティス(Streptococcus mitis）〔Biochem.J.,1
08,33（1968）〕、ラクトバチルス(Lactobacillus）
〔澱粉科学,28,72（1981）〕、クロストリディウム エ
スピー(Clostridium sp.）〔Appl.Environ.Microbiol.,
53,7（1987）〕、クロストリディウム サーモヒドロサ
ルフリキューム(Clostridium thermohydrosulfuricum）
〔Appl.Environ.Microbiol.,49,5（1985）、J.Bacterio
l.,164,3（1985）、Biochem.J.,246（1987）〕、サーマ
ス アクアティカス(Thermus aquaticus）〔Enzyme Mic
rob.Thechnol.,8（1986）〕、サーマス エスピー(Ther
mus sp.）〔J.Jpn.Soc.Starch Sci.,34,1（1987）〕等
の微生物が本酵素を生産することが報告されている。

また、このような２種以上の酵素を用いた糖の製造工
程を更に簡略化するために、α−1,6−グルコシド結合
のみならずα−1,4グルコシド結合に対しても反応する
酵素、即ちα−アミラーゼ活性を有するプルラナーゼの
探索が行われており、バチルス サチルス(Bacillus su
btilis）TU〔Agric.Biol.Chem.,51,9（1987）、特公平
１−18717号公報〕の生産する“プルラナーゼ−アミラ
ーゼ複合酵素”、バチルス サーキュランスBacillus c
irculans)（特開昭64−60376号公報）の生産するプルラ
ナーゼ活性を有するアミラーゼ（特開昭64−60376号公
報）及びバチルス ステアロサーモフィルス(Bacillus
stearothermophilus）TRS40〔J.Bacteriol.,170,4（198
8）、特開平１−171486号公報、特開平１−171488号公
報、特開平１−171493号公報〕の生産するネオプルラナ
ーゼが報告されている。

しかし、自然界において従来見出されているプルラナ
ーゼの殆どは、中性乃至酸性領域において最大且つ安定
な酵素活性を示す、所謂中性もしくは酸性プルラナーゼ
に分類されるものであり、アルカリ領域で最大活性を示
すか、あるいはアルカリ耐性を有するプルラナーゼ、所
謂アルカリプルラナーゼ及びアルカリ耐性プルラナーゼ
の存在は、極めて少なく、更にα−1,4グルコシド結合
に対しても対応する、即ちα−アミラーゼ活性を有する
アルカリプルラナーゼに至っては殆ど見出されていない
のが実情である。

即ち、従来知られているアルカリプルラナーゼ及びア
ルカリ耐性プルラナーゼの生産方法としては、唯一、好
アルカリ性バチルス属細菌の培養によるアルカリプルラ
ナーゼを生産する方法が堀越等により報告されているの
みであり〔Biochem.Biophys.Acta.,397,188（1975）、
特公昭53−27786号公報〕、しかもこの方法は工業的醗
酵生産に適うものではなかった。

尚、ここで言うアルカリプルラナーゼとは、至適pHが
アルカリ領域にあるものを言い、アルカリ耐性プルラナ
ーゼとは、至適pHが中性から酸性領域にあるが、アルカ
リ性領域においても至適pHにおける活性に比較して充分
に活性を有し且つ安定性を保持するものを言う。また、
中性領域とはpH6〜８の範囲を言い、アルカリ性領域と
はそれ以上のpH範囲を言う。

また、一般に、澱粉の糖化反応は、50℃以下の反応温
度で、且つpHが4.5〜6.5の弱酸性条件下で行った場合、
反応槽中に微生物汚染が起こり、pHの低下が引き起こさ
れる。

そこで、pHの低下を防止するために、多量の水酸化ナ
トリウムや水酸化カルシウム等のアルカリ試薬を添加す
ることが行われている。また、微生物汚染を防止するた
めに、50℃以上、好ましくは80〜95℃に酵素反応の最適
温度を有する酵素を用いて、高温領域にて糖化反応を行
う方法も行われている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、上記アルカリ試薬の添加は、反応酵素
の失活を誘発し、糖化率が著しく低下する欠点がある。

また、高温領域にて糖化反応を行う上記の方法は、反
応槽を高温に維持する必要があり、多大の電力を消費す
る欠点がある。

このような欠点を解消するためには、澱粉の糖化反応
を比較的低温下で且つアルカリ条件下で行うことが好ま
しく、そのためには、アルカリ耐性を有するか、アルカ
リ領域に至適pHを有する酵素の取得が要望され、更に、
糖の製造工程を更に簡略化するために、α−1,4グルコ
シド結合及びα−1,6グルコシド結合の両方に作用する
酵素の開発が要望される。

従って、本発明の目的は、上記要件を満足する新規な
酵素を使用して、多糖類から効率良く糖を得る方法を提
供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、上記目的を達成するために、培養が容
易で、酵素反応の至適pHがアルカリ領域にあり且つ至適
温度が50℃以上にある、温度安定性に優れたα−アミラ
ーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼを生産する微生
物を自然界に求め、鋭意探索を続けてきた結果、栃木県
栃木市の土壌より採取した特定の好アルカリ微生物が、
糖の製造に有効なα−アミラーゼ活性を有する新規なア
ルカリプルラナーゼ（アルカリプルラナーゼＹと命名）
を生産することを知見した。

本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、多糖
類に、バチルス属細菌が生産するα−アミラーゼ活性を
有するアルカリプルラナーゼＹを作用させることを特徴
とする多糖類の糖化方法を提供するものである。

以下、本発明の多糖類の糖化方法（糖の製造法）につ
いて詳述する。

本発明で用いられるα−アミラーゼ活性を有する新規
なアルカリプルラナーゼＹを生産する上記微生物（バチ
ルス属細菌）は、次のような菌学的性質を示す。尚、以
下において菌株の分類に用いた培地は、次の培地21種類
であり、特に断りのない限り別滅菌した0.5％（W/V）の
炭酸ナトリウム（Na₂CO₃）を含有する。

・使用した培地の組成（表示は重量％） 培地1.ニュートリエントブロス0.8％；寒天末（和光純
薬製）1.5％ 培地2.ニュートリエントブロス0.8％ 培地3.ニュートリエントブロス0.8％；ゼラチン20.0
％；寒天末（和光純薬製）1.5％ 培地4.バクトリトマミルク10.5％ 培地5.ニュートリエントブロス0.8％；KNO₃0.1％ 培地6.バクトペプトン0.7％;NaCl0.5％；ブドウ糖％0.5 培地7.SIM寒天培地（栄研化学製）指示量 培地8.TSI寒天培地（栄研化学製）指示量 培地9.酵母エキス0.5％；バクトペプトン1.5％；K₂HPO₄
0.1％；MgSO₄・７H₂O0.02％；可溶性澱粉2.0％；寒天末
（和光純薬製）1.5％ 培地10.コーサー培地（栄研化学製）指示量 培地11.クリステンセン培地（栄研化学製）指示量 培地12.酵母エキス0.05％；Na₂SO₄0.1％；KH₂PO₄0.1;
ブドウ糖1.0％ 酵母エキス0.05％；Na₂SO₄0.1％；KH₂PO₄0.1％；ブ
ドウ糖1.0％；CaCl₂・２H₂O0.05％；MnSO₄・４〜６H₂O
0.01％；FeSO₄・７H₂O0.001％：MgSO₄・７H₂O0.02％ 窒素源は、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化
アンモニウム及びリン酸アンモニウムをそれぞれ0.25
％、0.2025％、0.158％、0.195％となるように上記及
びの培地に加えて用いた。

培地13.キングＡ培地“栄研”（栄研化学製）指示量 培地14.キングＢ培地“栄研”（栄研化学製）指示量 培地15.尿素培地“栄研”（栄研化学製）指示量 培地16.チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日水
製薬製） 培地17.3％過酸化水素水 培地18.バクトペプトン0.5％；酵母エキス0.5％；K₂HPO
₄0.1％；ブドウ糖1.0％；MgSO₄・７H₂O0.02％ 培地19.バクトペプトン2.7％;NaCl5.5％；K₂HPO₄0.3
％；ブドウ糖0.5％；ブロモチモールブルー0.06％；寒
天末（和光純薬製）1.5％ 培地20.(NH₄)₂HPO₄0.1％;KCl0.02％；MgSO₄・７H₂O0.02
％；酵母エキス0.05％；糖1.0％ 培地21.カゼイン0.5％；酵母エキス0.5％；ブドウ糖1.0
％；K₂HPO₄0.1％；MgSO₄・７H₂O0.02％；寒天末（和光
純薬製）1.5％ 〔菌学的性質〕 （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、0.8〜2.4μｍ×1.8〜4.0μｍの桿菌
であり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（1.0〜1.2μｍ
×1.2〜1.4μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。
グラム染色は不定。抗酸性はない。

（ｂ）各種培地における成育状態 肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面及び
周縁は円滑である。また、集落の色調は黄色半透明で光
沢がある。

肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、色調は黄
色半透明である。

肉汁液体培養（培地２） 生育する。

肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良い。ゼラチン液化が認められる。

リトマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固及びペプトン化は認められない。リトマ
スの変色は培地がアルカリ性のため判定できない。

（ｃ）生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５） 硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。

MRテスト（培地６） 培地がアルカリ性のため、陰性、陽性は判定できな
い。

VPテスト（培地６） 陰性。

インドールの生成（培地７） 陰性。

硫化水素の生成（培地８） 陰性。

澱粉の加水分解（培地９） 陽性。

クエン酸の利用 コーサー培地（培地10）で陰性。クリステンセン培地
（培地11）では陽性か陰性か判定できない。

無機窒素源の利用（培地12） 硝酸塩、アンモニウム塩及び亜硝酸塩ともに利用す
る。

色素の生成（培地13、培地14） 陰性。

ウレアーゼ（培地15） 陰性。

オキシダーゼ（培地16） 陰性。

カタラーゼ（培地17） 陽性。

生育の範囲（培地18） 生育の温度範囲は20〜40℃、生育最適温度範囲は30〜
35℃である。

生育のpH範囲はpH7〜10.5、生育最適pHはpH10であ
る。

酸素に対する態度 好気性。

Ｏ−Ｆテスト（培地19） 培地がアルカリ性のため変色は判定できない。

好気状態でのみ生育する。

糖の利用性（培地20） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクト
ース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソル
ビット、Ｄ−マンニット、イノシット、グリセリン、デ
ンプン、ラフィノース、サリシン、Ｄ−リボース及びデ
キストリンを利用する。

食塩含有培地における生育（培地１を改変） 食塩濃度７％では生育するが、10％では生育できな
い。

カゼインの分解（培地21） 陽性。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ
・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオ
ロジー（Bergey′s Mannual of Determinative Bacter
iology）第８版及びザ・ジーナス・バチルス〔“The G
enus Bacillus"Ruth,E.Gorpdon,Agriculture Handbook
No.427,Agricultural Research Service,U.S.Depertme
nt of Agriculture Washington D.C.,（1973）〕を参照
し、比較検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチ
ルス(Bacillus)属の一種であると認められる。

しかし、本菌株は中性領域では生育が困難で、高アル
カリ性領域で良好な生育を示すことから、最近、堀越
（Horikosi）と秋葉（Akiba）（“Alkalophilic Microo
rganism",Japan Scientific Society Press（Tokyo）19
82年刊）の主張している、所謂好アルカリ性（Alkaloph
ilic）微生物として、従来の中性領域で生育するバチル
ス属細菌とは区別される。

また、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチ
ルスのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判
断してバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM−AP137
8と命名し、微工研菌寄第10886号として工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託した。

上記菌株を用いて本発明で用いられるα−アミラーゼ
活性を有するアルカリプルラナーゼＹを得るには、培地
に上記菌株を接種し、常法に従って培養すれば良い。

上記培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当
量含有せしめておくことが好ましい。この炭素源及び窒
素源としては特に制限はなく、例えば、窒素源として
は、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉
エキス、トリプトン、ソイトン、ハイプロ、アジパワ
ー、綿実油粕、カルチベーター、アジプロン、ゼスト等
の有機窒素源、及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナト
リウム、酢酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられ
る。また、炭素源としては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、
アミロペクチン、グリコーゲン、プルラン及びこれらの
部分分解により生じた分岐オリゴ糖の他、資化し得る炭
素源、例えば、グルコース、アラビノース、キシロー
ス、リボース、マンノース、フラクトース、ガラクトー
ス、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニッ
ト、ソルビット、グリセリン、サリシンや、資化し得る
有機酸、例えば、クエン酸や酢酸等が挙げられる。ま
た、その他、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、
カリウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機又は有機
微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるα−
アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹの採取
及び精製は、通常の酵素の採取及び精製の手段に準じて
行うことができる。即ち、培養後、遠心分離又は濾過等
の通常の固液分離手段により菌体を培養液から除去して
粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液は、そのま
ま使用することもできるが、必要に応じて、塩析法、沈
殿法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素を得、更に
公知の方法により精製結晶化し、精製酵素として使用す
ることも可能である。

次に、本発明で用いられるα−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼＹの好ましい製造法の一例を挙
げ、該酵素について更に詳しく説明する。

先ず、アルカリ性バチルス属細菌である上記のバチル
ス エスピーKSM−AP1378（FERM P−10886）株を、１％
プルラン、１％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.1％
KH₂PO₄、0.25％Na₂HPO₄・12H₂O、0.02％MgSO₄・７H₂O及
び0.5％炭酸ナトリウムを含む培地に接種し、30℃で３
日間好気的に振盪培養する。培養後、培養液から菌体を
除去し、上澄液（粗酵素液）を得る。

次に、上記上澄液中からの酵素の精製を次のようにし
て行う。上記上澄液にDEAEセルロース粉末を加え、上澄
液中の酵素を完全にDEAEセルロースに吸着させる。次い
で、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8）で上記セルロース
を洗浄した後、0.6Mの食塩を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8）で酵素を溶出する。次いで、該酵素を、10mM
トリス−塩酸緩衝液（pH8）で透析後、10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH8）で平衡化したα−シクロデキストリン
アフィニティー カラムに吸着させ、β−シクロデキ
ストリン含有10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8）により溶
出し、その活性画分を集める。

集められた活性画分は、透析後、10mMトリス−塩酸緩
衝液（pH8）で平衡化したDEAEトヨパール（Toyopearl）
650Sに吸着させる。吸着した酵素を、10mMトリス−塩酸
緩衝液（pH8）中、0.1から1Mの食塩の濃度勾配により溶
出し、その活性画分を集める。集められた活性画分は、
透析後、0.1M食塩を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8）で平衡化したセファクリル Ｓ−200カラムに充填
し、0.1M食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性画分を
集める。集められた活性画分は、限外濾過膜を用いて濃
縮した後、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8）を用いて１
夜透析し、精製酵素を得る。

このようにして得られる精製酵素は、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度15％）及びソディム・ドデ
シル・サルフェート（SDS）電気泳動で単一のバンドを
与えた。また、活性収率は約２％であった。

バチルス エスピー KSM−AP1378により上記の如く
して生産されるアルカリプルラナーゼＹの酵素学的諸性
質について、以下に説明する。

尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々50mM宛）を用
い、以下の方法に従って行った。

pH4 〜６ 酢酸緩衝液 pH6 〜８ リン酢緩衝液 pH8 〜11 グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液 pH11〜12 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性測定法； プルラナーゼ活性 各種緩衝液中にプルラン（反応系における最終濃度は
0.25％）を溶解させた基質溶液0.9mlに、酵素液0.1mlを
加え、40℃で30分間反応させた。

反応後、3,5−ジニトロ−サリチル酸（3,5−dinitro
−salicylic acid（DNS）法にて、還元糖の定量を行っ
た。即ち、反応液1.0mlにDNS試薬1.0mlを加え、５分
間、100℃で加熱発色させ、冷却後、4.0mlの脱イオン水
を加えて希釈し、波長535nmで比色定量した。酵素の力
価は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位（1U）とした。

α−アミラーゼ活性 各種緩衝液中に可溶性澱粉（反応系における最終濃度
は0.25％）を溶解させた基質溶液0.9mlに、酵素液0.1ml
を加え、50℃で15分間反応させた。

反応後、DNS法にて、還元糖の定量を行った。即ち、
反応液1.0mlにDNS試薬1.0mlを加え、５分間、100℃で加
熱発色させ、冷却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈
し、波長535nmで比色定量した。酵素の力価は、１分間
に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵
素量を１単位（1U）とした。

酵素学的諸性質： 作用 プルラン及び可溶性澱粉に作用し、前者からは主とし
てマルトトリオース（G3）を、後者からは主としてマル
トテトラオース（G4）及びマルトペンタオース（G5）を
生成する。また、グリコーゲンにも作用してマルトテト
ラオース（G4）及びマルトペンタオース（G5）を生成す
る。

基質特異性 澱粉の他に、アミロース、アミロペクチン及びそれら
の部分分解物のα−1,4グルコシド結合、及びα−1,6グ
ルコシド結合で分岐した枝分かれ糖のα−1,6−グルコ
シド結合に作用する。

作用pH及び最適pH プルランに対する作用はpH5〜11のpH範囲で認めら
れ、最適pHはpH9〜10の範囲にあると認められる〔0.25
％プルランを用い、10mM酢酸緩衝液（pH4〜６）、リン
酸緩衝液（pH6〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH8〜11）及び塩化カリウム−水酸化ナト
リウム緩衝液（pH11〜12）中で、40℃、30分間反応〕。

また、可溶性澱粉に対する作用はpH4〜11のpH範囲で
認められ、最適pHはpH8.5〜９の範囲にあると認められ
る〔0.25％可溶性澱粉を用い、10mM酢酸緩衝液（pH4〜
５）、トリス緩衝液（pH5〜９）、グリシン−食塩−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH9〜11）及び炭酸緩衝液（pH1
1〜12）中で、50℃、15分間反応）。

pH安定性 プルランに対するpH安定性は、pH6〜10.5の範囲で認
められる〔0.25％プルランを用い、10mM酢酸緩衝液（pH
4〜６）、リン酸緩衝液（pH6〜８）、グリシン−食塩−
水酸化ナトリウム緩衝液（pH8〜11）及び塩化カリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH11〜12）中で、45℃、10
分間反応）。

また、可溶性澱粉に対するpH安定性は、pH4〜11の範
囲で認められる〔0.25％可溶性澱粉を用い、10mM酢酸緩
衝液（pH4〜６）、リン酸緩衝液（pH6〜８）、グリシン
−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8〜11）及び塩化
カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH11〜12）中で、
50℃、15分間反応）。

作用温度範囲及び最適作用温度 プルラン及び可溶性澱粉に対する活性は、10〜60℃の
範囲で認められ、最適作用温度は約50℃にあると認めら
れる。また、カルシウムイオンの存在下では、最適作用
温度は約65℃にあると認められる。

温度安定性 pH9.5の条件で温度を変化させ、各温度で30分間処理
することにより失活の条件を調べたところ、50℃までは
極めて安定である。また、カルシウムイオン1mM存在下
では、熱安定性が著しく増大し、プルラナーゼ活性は60
℃で約60％の残存活性を有し、α−アミラーゼ活性は80
℃でも約50％の残存活性が認められる。

分子量 SDS電気泳動法による分子量は約200,000±5,000であ
る（アクリルアミドゲル濃度7.5％）。

金属イオンの影響 プルラナーゼ活性は、Hg²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺で阻害され
る。また、アミラーゼ活性は、Hg²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺、C
d²⁺、Zn²⁺で阻害される。

以上の酵素学的諸性質から判るように、本発明で用い
られるアルカリプルラナーゼＹは、従来のプルラナーゼ
活性を有するアミラーゼとは明らかに理化学的性質の異
なる新規な酵素である。

ここで、本発明で用いられる酵素の新規な点を更に明
らかにするために、本酵素と、従来報告されているプル
ラナーゼ活性を有するアミラーゼとの理化学的性質を下
記表１に比較して示す。

下記表１に示した通り、本発明で用いられるアルカリ
プルラナーゼＹは、その理化学的性質が、従来知られて
いるバチルス サチルス、TU由来のプルラナーゼ−アミ
ラーゼ複合酵素及びバチルス サーキュランス Ｆ−２
由来のプルラナーゼ活性を有するアミラーゼとは明らか
に異なるものである。

而して、本発明の多糖類の糖化方法は、多糖類に上記
アルカリプルラナーゼＹを作用させて多糖類を糖化させ
るもので、この糖化反応は、通常、pH6〜９、温度30〜6
0℃の条件下に行うことが好ましい。

また、上記多糖類としては、澱粉、可溶性澱粉、プル
ラン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、糊
化澱粉、修飾澱粉、β−限界デキストリン及びこれらの
部分分解物等が挙げられる。

また、本発明の糖化方法により糖を得るに際しては、
上記アルカリプルラナーゼＹと共に、グルコアミラーゼ
及びβ−アミラーゼ等の他の酵素を必要に応じて併用す
ることができ、また、得ようとする糖の種類を種類に応
じて、多糖類の種類及び併用する酵素の種類を選択する
ことができる。

例えば、フルコース（G1）を得ようとする場合には、
上記アルカリプルラナーゼＹ及びグルコアミラーゼを澱
粉又は可溶性澱粉に作用させると良く、また、マルトー
ス（G2）を得ようとする場合には、上記アルカリプルラ
ナーゼＹ及びβ−アミラーゼを澱粉又は可溶性澱粉に作
用させると良く、また、マルトトリオース（G3）を得よ
うとする場合には、上記アルカリプルラナーゼＹを単独
でプルランに作用させると良く、更に、マルトテトラオ
ース（G4）及びマルトペンタオース（G5）を得ようとす
る場合には、上記アルカリプルラナーゼＹを単独で澱
粉、可溶性澱粉、アミロース、アミロペクチン又はフリ
コーゲンに作用させると良い。上記のアルカリプルラナ
ーゼＹを単独で澱粉等に作用させた場合に得られる糖化
物は、マルトテトラオースとマルトペンタオースの両方
の特性を持つものであり、甘味料、甘味調製剤、食品増
量剤等、種々の食品の添加物として利用できるものであ
る。

〔作用〕

本発明の多糖類の糖化方法によれば、使用されるアル
カリプルラナーゼＹの作用により、多糖類のα−1,6グ
ルコシド結合及びα−1,4グルコシド結合が分解され、
多糖類が糖化される。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県栃木市の土壌を薬匙一杯（約0.5g）、滅菌生理
食塩水に懸濁し、80℃で15分間熱処理した。この熱処理
液の上澄を適当に希釈して、下記組成の分離用寒天培地
（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを30℃で３日間培
養し、集落を形成させた。集落の周囲に着色プルラン及
び着色澱粉の溶解に基づく透明帯を形成するものを選出
し、α−アミラーゼ活性を有するプルラナーゼ生産菌を
取得した。更に、取得菌を下記組成の液体培地（培地
Ｂ）に接種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、培
養液を遠心分離して得られた上澄液についてプルラナー
ゼ活性及びアミラーゼ活性を、pH10にて測定し、α−ア
ミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼ生産菌をス
クリーニングした。

上述の方法により、本発明で用いられるα−アミラー
ゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹを生産するバチ
ルス エスピー KSM−AP1378（FERM P−10886）を取得
することができた。

培地Ａ （％） プルラン…… 0.5 可溶性澱粉…… 0.5 着色プルラン…… 0.2 着色澱粉…… 0.2 ポリペプトン…… 0.2 酵母エキス…… 0.1 KH₂PO₄…… 0.03 (NH₄)₂SO₄…… 0.1 MgSO₄・７H₂O…… 0.02 CaCl₂・２H₂O…… 0.02 FeSO₄・７H₂O…… 0.001 MnCl₂・４H₂O…… 0.0001 寒天…… 1.5 Na₂CO₃…… 0.5 pH 10.0 培地Ｂ （％） プルラン…… 0.5 可溶性澱粉…… 0.5 トリプトン…… 0.2 酵母エキス…… 0.1 KH₂PO₄…… 0.03 (NH₄)₂SO₄…… 0.1 MgSO₄・７H₂O…… 0.02 CaCl₂・２H₂O…… 0.02 FeSO₄・７H₂O…… 0.001 MnCl₂・４H₂O…… 0.0001Na₂CO₃…… 0.5 pH 10.0 実施例２ α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ
生産菌であるバチルス エスピーKSM−AP1378株を実施
例１で用いた液体培地Ｂと同じ組成の培地に接種し、30
℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離して
除去し、粗酵素液を得た。更に、この粗酵素液を、通常
の方法に従ってエタノール乾燥粉末とし、下記表２に示
すα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ
酵素標品を得ることができた。尚、下記表２に示す酵素
活性はpH9における測定値である。

実施例３ 実施例１で用いた液体培地Ｂにおいて、プルラン及び
可溶性澱粉に代えてマルトースを１％添加した培地に、
α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ生
産菌であるバチルス エスピー KSM−AP1378株を接種
し、30℃で２乃至３日間振盪培養した。培養後、培養液
を遠心分離して得られた上澄液についてプルラナーゼ活
性を測定した結果、211U/Lの活性が得られた。

実施例４ 実施例２で得られた粗酵素液を市販のグルコアミラー
ゼと併用して澱粉の糊化反応を次のようにして行った。
基質としては、35％（W/V）馬鈴薯澱粉を市販の液化型
耐熱性α−アミラーゼ（大和化成（株）製、クライスタ
ーゼＬ−１）で液化したDE10.6の澱粉液化液を使用し
た。

上記澱粉液化液に対し、リゾプス属のグルコアミラー
ゼ（新日本化学工業（株）製、スミチーム）を２単位/g
乾物澱粉、及び実施例２で得られた粗酵素液を、プルラ
ナーゼ活性として５単位/g乾物澱粉を添加し、pH6〜
７、60℃で50時間反応させた。尚、比較対照として、粗
酵素液を添加しない他は上記と同様な条件で反応させ
た。次いで、反応終了後の反応液に対し、0.2％（W/V）
の活性炭を添加し、沸騰水浴中で５分間加熱した後、0.
45μｍポアサイズのメンブランフィルターで濾過して得
られる糖化液中のグルコース含有量をショーデックス
（Syodex）KS−801カムラを用いる高速液体クロマトグ
ラフ法で測定した結果、粗酵素液未添加区では95.2％で
あったが、添加区では97.3％の変換率であった。

実施例５ 実施例２で得られた粗酵素液を市販のβ−アミラーゼ
と併用して澱粉の糖化反応を次のようにして行った。基
質としては、ポテト澱粉を市販の液化酵素（ノボ・ジャ
パン（株）製）で液化したDE4.2の液化澱粉を使用し
た。

上記液化澱粉に対し、固形分として、1gの液化澱粉当
り50単位の、市販の植物由来のβ−アミラーゼ（天野製
薬（株）製）を添加し、全量をイオン水で10mlとし、55
℃で50時間反応させた。次いで、この糖化液の一部（固
形分として1g）に、実施例２で得られた粗酵素液を、プ
ルラナーゼ活性として10単位添加し、55℃で50時間反応
させた。得られた反応液を実施例４と同様の処理で脱
色、濾過し、得られた糖化液中のマルトース含有量を実
施例４と同様に高速液体クロマトグラフ法で測定した結
果、粗酵素液未添加区では65.4％であったが、添加区で
は86.4％の変換率であった。

実施例６ 実施例２で得られた粗酵素液を、DE4.2の液化澱粉
（固形分として1g）に加えて、全量10mlとし、pH8付近
に維持しながら50℃で２日間反応させた。反応終了後、
糖化液の糖組成を高速液体クロマトグラフ法により測定
した。その結果、得られた糖化液の糖組成は、グルコー
ス（G1）3.2％、マルトース（G2）12.3％、マルトトリ
オース（G3）13.1％、マルトテトラオース（G4）33.1
％、マルトペンタオース（G5）23.4％、マルトヘキサオ
ース（G6）1.5％、その他の糖13.4％であった。

〔発明の効果〕

本発明の多糖類の糖化方法によれば、使用されるアル
カリプルラナーゼＹが、α−1,6グルコシド結合の加水
分解活性の他にα−1,4グルコシド結合を分解するα−
アミラーゼ活性を有しているため、このような活性を有
しない従来のプルラナーゼやイソアミラーゼ等を用いた
従来の糖化方法に比して、多糖類の糖化反応が促進さ
れ、多糖類から、グルコース、マルトース、マルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオース等の
糖を効率良く得ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 19/14 C12P 19/16 C12P 19/20 C12P 19/22

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】多糖類に、バチルス属細菌が生産するα−
   アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹを作用
   させることを特徴とする多糖類の糖化方法。
2. 【請求項２】多糖類が、澱粉、可溶性澱粉、プルラン、
   アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、糊化澱
   粉、修飾澱粉、β−限界デキストリン及びこれらの部分
   分解物の何れか１種以上である、請求項（１）記載の多
   糖類の糖化方法。
3. 【請求項３】澱粉又は可溶性澱粉をグルコアミラーゼで
   糖化してグルコースを製造するに際し、バチルス属細菌
   が生産するα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラ
   ナーゼＹを作用させることを特徴とする糖の製造法。
4. 【請求項４】澱粉又は可溶性澱粉をβ−アミラーゼで糖
   化してマルトースを製造するに際し、バチルス属細菌が
   生産するα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナ
   ーゼＹを作用させることを特徴とする糖の製造法。
5. 【請求項５】澱粉又は可溶性澱粉に、バチルス属細菌が
   生産するα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナ
   ーゼＹを作用させ、マルトテトラオース（G4）及びマル
   トペンタオース（G5）を製造することを特徴とする糖の
   製造法。