JPH0614775A - アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 - Google Patents
アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法Info
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- JPH0614775A JPH0614775A JP17567792A JP17567792A JPH0614775A JP H0614775 A JPH0614775 A JP H0614775A JP 17567792 A JP17567792 A JP 17567792A JP 17567792 A JP17567792 A JP 17567792A JP H0614775 A JPH0614775 A JP H0614775A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記酵素学的性質を有するアルカリイソアミ
ラーゼ。 （１）グリコーゲン等のα−１，６グルコシド結合を分
解する。 （２）pH５〜１１．５で作用し、至適pHが９付近であ
る。 （３）pH７〜１０で極めて安定である。 （４）４０〜６０℃で作用し、至適温度が約５５℃であ
る。 （５）５０℃まで極めて安定である。 （６）分子量が６５０００±１０００である。 【効果】 洗浄剤組成物配合成分として好適に使用でき
る。
ラーゼ。 （１）グリコーゲン等のα−１，６グルコシド結合を分
解する。 （２）pH５〜１１．５で作用し、至適pHが９付近であ
る。 （３）pH７〜１０で極めて安定である。 （４）４０〜６０℃で作用し、至適温度が約５５℃であ
る。 （５）５０℃まで極めて安定である。 （６）分子量が６５０００±１０００である。 【効果】 洗浄剤組成物配合成分として好適に使用でき
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規、かつ洗浄剤成分等
として有用なアルカリイソアミラーゼ及びこれを生産す
る微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法に
関する。
として有用なアルカリイソアミラーゼ及びこれを生産す
る微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】イソア
ミラーゼは、グリコーゲン、アミロペクチン等の分岐構
造を有する澱粉系多糖類分子中のα−１，６グルコシド
結合のみを切断する酵素で、１９５１年丸尾と小林〔Ｎ
ａｔｕｒｅ，１６７，６０６（１９５１）〕により、酵
母菌体中から初めて発見されたものである。その後、原
田らによりシュードモナス アミロデラモーサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ ＳＢ
−１５）〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，２１２，４５８（１９７０）〕の生産するイソアミ
ラーゼが分離精製され、その性質が明らかにされた。
ミラーゼは、グリコーゲン、アミロペクチン等の分岐構
造を有する澱粉系多糖類分子中のα−１，６グルコシド
結合のみを切断する酵素で、１９５１年丸尾と小林〔Ｎ
ａｔｕｒｅ，１６７，６０６（１９５１）〕により、酵
母菌体中から初めて発見されたものである。その後、原
田らによりシュードモナス アミロデラモーサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ ＳＢ
−１５）〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，２１２，４５８（１９７０）〕の生産するイソアミ
ラーゼが分離精製され、その性質が明らかにされた。
【０００３】更にフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）〔Ｓｔａｅｒｋｅ ３２，１
３２（１９８０）〕、シトファージ（Ｃｙｔｏｐｈａｇ
ｅｓｐ．）〔ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，１２，９６（１９
７０）〕、バチルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
〔ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，５７，１（１９７５）〕、エ
ッシェリシア インターメディア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，１５，４９２（１９６７）〕、酵母リポマ
イセス コノネンコエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｋｏｎｏ
ｎｅｋｏａｅ）〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，４４，１２５３（１９８２）〕等の微生
物がイソアミラーゼを生産することが報告されている。
ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）〔Ｓｔａｅｒｋｅ ３２，１
３２（１９８０）〕、シトファージ（Ｃｙｔｏｐｈａｇ
ｅｓｐ．）〔ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，１２，９６（１９
７０）〕、バチルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
〔ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，５７，１（１９７５）〕、エ
ッシェリシア インターメディア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，１５，４９２（１９６７）〕、酵母リポマ
イセス コノネンコエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｋｏｎｏ
ｎｅｋｏａｅ）〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，４４，１２５３（１９８２）〕等の微生
物がイソアミラーゼを生産することが報告されている。
【０００４】イソアミラーゼはグリコーゲン及びアミロ
ペクチンのみならず、澱粉、プルランやこれらの部分分
解により生じた分岐オリゴ糖中のα−１，６グルコシド
結合に対しても水解活性を有することが知られており、
『枝切り酵素』と呼ばれている。また、イソアミラーゼ
はグリコーゲンやアミロペクチンの微細構造の研究に利
用されており、更に本酵素は他の枝切り酵素に比して非
常に強力であるため、逆反応が強く、種々の分岐シクロ
デキストリンを容易に合成できることから、工業的に利
用されつつある〔「澱粉科学」，３３，１１９（１９８
６）〕。
ペクチンのみならず、澱粉、プルランやこれらの部分分
解により生じた分岐オリゴ糖中のα−１，６グルコシド
結合に対しても水解活性を有することが知られており、
『枝切り酵素』と呼ばれている。また、イソアミラーゼ
はグリコーゲンやアミロペクチンの微細構造の研究に利
用されており、更に本酵素は他の枝切り酵素に比して非
常に強力であるため、逆反応が強く、種々の分岐シクロ
デキストリンを容易に合成できることから、工業的に利
用されつつある〔「澱粉科学」，３３，１１９（１９８
６）〕。
【０００５】かかるイソアミラーゼを含む枝切り酵素を
アミラーゼとともに洗浄剤に配合することにより、主と
して澱粉汚れに対する洗浄力が飛躍的に向上することが
見出されている（特開平１−１３２１９２号公報）。
アミラーゼとともに洗浄剤に配合することにより、主と
して澱粉汚れに対する洗浄力が飛躍的に向上することが
見出されている（特開平１−１３２１９２号公報）。
【０００６】しかし、自然界に於いて従来見出されてい
るイソアミラーゼはpHが３．５〜６．５と中性乃至酸性
領域に於いて最大かつ安定な酵素活性を示す、所謂中性
若しくは酸性イソアミラーゼであり、食器用洗浄剤及び
衣料用洗浄剤組成物成分として要求されるアルカリ領域
で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有するイ
ソアミラーゼ、所謂アルカリイソアミラーゼ及びアルカ
リ耐性イソアミラーゼは未だ見出されていない。
るイソアミラーゼはpHが３．５〜６．５と中性乃至酸性
領域に於いて最大かつ安定な酵素活性を示す、所謂中性
若しくは酸性イソアミラーゼであり、食器用洗浄剤及び
衣料用洗浄剤組成物成分として要求されるアルカリ領域
で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有するイ
ソアミラーゼ、所謂アルカリイソアミラーゼ及びアルカ
リ耐性イソアミラーゼは未だ見出されていない。
【０００７】なお、本明細書に於いてアルカリイソアミ
ラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にあるものを言い、
アルカリ耐性イソアミラーゼとは、至適pHは中性から酸
性領域にあるが、アルカリ領域に於いても至適pHでの活
性と同程度の活性を有しかつ安定性を保持するものを言
う。また、中性とはpH６〜８の範囲を言い、アルカリ性
とはそれを超えるpH範囲を言う。
ラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にあるものを言い、
アルカリ耐性イソアミラーゼとは、至適pHは中性から酸
性領域にあるが、アルカリ領域に於いても至適pHでの活
性と同程度の活性を有しかつ安定性を保持するものを言
う。また、中性とはpH６〜８の範囲を言い、アルカリ性
とはそれを超えるpH範囲を言う。
【０００８】そこで、洗浄剤組成物成分として好適な、
アルカリ領域に至適pHを有するイソアミラーゼの開発が
望まれていた。
アルカリ領域に至適pHを有するイソアミラーゼの開発が
望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる実
情に鑑み鋭意検討した結果、特定のバチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属に属する微生物を培養することによって、
アルカリ領域に至適pHを有するイソアミラーゼが得られ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
情に鑑み鋭意検討した結果、特定のバチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属に属する微生物を培養することによって、
アルカリ領域に至適pHを有するイソアミラーゼが得られ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は下記（１）〜（６）の
酵素学的性質を有するアルカリイソアミラーゼを提供す
るものである。
酵素学的性質を有するアルカリイソアミラーゼを提供す
るものである。
【００１１】（１）作用、 グリコーゲン及びアミロペクチンのα−１，６グルコシ
ド結合を加水分解する。また、アミロース、プルランの
α−１，６グルコシド結合を加水分解しない。 （２）作用pH及び至適pH、 pH５から１１．５のpH範囲で作用し、至適pHを９付近に
有する。 （３）pH安定性、 pH７から１０の範囲で極めて安定であり、pH６〜１０．
５においても約５０％以上の活性を維持する（４０℃、
１０分間処理）。 （４）作用温度範囲及び至適作用温度、 ４０〜６０℃の範囲で作用し、至適作用温度は約５５℃
である。 （５）温度安定性、 ５０℃までは極めて安定である（pH９．０のグリシン−
食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間処理）。 （６）分子量、 ソジウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動法による分子
量が約６５０００±１０００である。
ド結合を加水分解する。また、アミロース、プルランの
α−１，６グルコシド結合を加水分解しない。 （２）作用pH及び至適pH、 pH５から１１．５のpH範囲で作用し、至適pHを９付近に
有する。 （３）pH安定性、 pH７から１０の範囲で極めて安定であり、pH６〜１０．
５においても約５０％以上の活性を維持する（４０℃、
１０分間処理）。 （４）作用温度範囲及び至適作用温度、 ４０〜６０℃の範囲で作用し、至適作用温度は約５５℃
である。 （５）温度安定性、 ５０℃までは極めて安定である（pH９．０のグリシン−
食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間処理）。 （６）分子量、 ソジウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動法による分子
量が約６５０００±１０００である。
【００１２】本発明はまた、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属に属し、かつ上記アルカリイソアミラーゼ生産能
を有する微生物を提供するものである。
ｓ）属に属し、かつ上記アルカリイソアミラーゼ生産能
を有する微生物を提供するものである。
【００１３】本発明は、更に、上記微生物を培養し、そ
の培養物から上記アルカリイソアミラーゼを採取するこ
とを特徴とするアルカリイソアミラーゼの製造方法を提
供するものである。
の培養物から上記アルカリイソアミラーゼを採取するこ
とを特徴とするアルカリイソアミラーゼの製造方法を提
供するものである。
【００１４】本発明のアルカリイソアミラーゼの酵素学
的性質について以下に説明する。なお、酵素活性測定
は、測定pHに応じそれぞれ以下に示す緩衝液（各々４０
mM）を使用し、下記の方法に従った。
的性質について以下に説明する。なお、酵素活性測定
は、測定pHに応じそれぞれ以下に示す緩衝液（各々４０
mM）を使用し、下記の方法に従った。
【００１５】（緩衝液種） pH４〜６； 酢酸緩衝液、 pH６〜８； トリス−マレイン酸緩衝液、 pH８〜１１； グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩
衝液、 pH１１〜１２； 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液、
衝液、 pH１１〜１２； 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液、
【００１６】（酵素活性測定方法） （１）ＤＮＳ法によるイソアミラーゼ活性の測定、 各種緩衝液中にカキ由来グリコーゲン（反応系に於ける
最終濃度は０．５％）を溶解させた緩衝液０．９mlに、
酵素液０．１mlを加え、４０℃で、３０分間反応させ
た。反応後、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法
にて、還元糖の定量を行った。すなわち、反応液１．０
mlにＤＮＳ試薬１．０mlを加え、５分間、１００℃で加
熱発色させ、冷却後、４．０mlの脱イオン水を加えて希
釈し、波長５３５nmで比色定量した。酵素の力価は、１
分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成す
る酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
最終濃度は０．５％）を溶解させた緩衝液０．９mlに、
酵素液０．１mlを加え、４０℃で、３０分間反応させ
た。反応後、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法
にて、還元糖の定量を行った。すなわち、反応液１．０
mlにＤＮＳ試薬１．０mlを加え、５分間、１００℃で加
熱発色させ、冷却後、４．０mlの脱イオン水を加えて希
釈し、波長５３５nmで比色定量した。酵素の力価は、１
分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成す
る酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００１７】（２）沃素発色法によるイソアミラーゼ活
性の測定、 精製ステップにおける活性測定は、以下の条件で行っ
た。すなわち、１％（ｗ／ｖ）ポテト由来アミロペクチ
ン１mlに酵素液０．５ml加え、４０℃で３０分間反応を
行った。反応後、反応液から０．２mlを抜き取り、沃素
溶液（０．００５％ Ｉ2 ＋０．０１５％ ＫＩ）２ml
を加え、更に８．０mlの脱イオン水を加えて希釈し、波
長６００nmで比色定量した。酵素の力価は、吸光度を１
分間に０．０１上昇させるのに必要な酵素量を１単位
（１Ｕ）とした。
性の測定、 精製ステップにおける活性測定は、以下の条件で行っ
た。すなわち、１％（ｗ／ｖ）ポテト由来アミロペクチ
ン１mlに酵素液０．５ml加え、４０℃で３０分間反応を
行った。反応後、反応液から０．２mlを抜き取り、沃素
溶液（０．００５％ Ｉ2 ＋０．０１５％ ＫＩ）２ml
を加え、更に８．０mlの脱イオン水を加えて希釈し、波
長６００nmで比色定量した。酵素の力価は、吸光度を１
分間に０．０１上昇させるのに必要な酵素量を１単位
（１Ｕ）とした。
【００１８】（酵素学的性質） （１）作用、 グリコーゲン及びアミロペクチンのα−１，６グルコシ
ド結合を加水分解する。また、アミロース、プルランの
α−１，６グルコシド結合を加水分解しない。表１にア
ルカリイソアミラーゼのそれぞれの基質に対する相対活
性測定結果を示す。
ド結合を加水分解する。また、アミロース、プルランの
α−１，６グルコシド結合を加水分解しない。表１にア
ルカリイソアミラーゼのそれぞれの基質に対する相対活
性測定結果を示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】（２）作用pH及び至適pH、 pH５〜１１．５の範囲で作用し、至適pHを９付近に有す
る。なお、イソアミラーゼ活性は０．５％カキ由来グリ
コーゲン、１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、トリス−マ
レイン酸緩衝液（pH６〜８）、グリシン−食塩−水酸化
ナトリウム緩衝液（pH８〜１１）及び塩化カリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH１１〜１２）の反応系を用
い、４０℃で１５分間反応させて測定した反応pHと相対
活性との関係を図１に示す。
る。なお、イソアミラーゼ活性は０．５％カキ由来グリ
コーゲン、１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、トリス−マ
レイン酸緩衝液（pH６〜８）、グリシン−食塩−水酸化
ナトリウム緩衝液（pH８〜１１）及び塩化カリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH１１〜１２）の反応系を用
い、４０℃で１５分間反応させて測定した反応pHと相対
活性との関係を図１に示す。
【００２１】（３）pH安定性、 pH７から１０で極めて安定であり、pH６〜１０．５に於
いても約５０％以上の活性を維持する（４０℃１０分間
処理）。なお、各pHにおけるイソアミラーゼ活性は０．
５％カキ由来グリコーゲン、１０mM酢酸緩衝液（pH４〜
６）、トリス−マレイン酸緩衝液（pH６〜８）、グリシ
ン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１１）及び
塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１１〜１
２）の反応系を用い、４０℃で１０分間反応させて測定
した処理pHと残存活性との関係を図２に示す。
いても約５０％以上の活性を維持する（４０℃１０分間
処理）。なお、各pHにおけるイソアミラーゼ活性は０．
５％カキ由来グリコーゲン、１０mM酢酸緩衝液（pH４〜
６）、トリス−マレイン酸緩衝液（pH６〜８）、グリシ
ン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１１）及び
塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１１〜１
２）の反応系を用い、４０℃で１０分間反応させて測定
した処理pHと残存活性との関係を図２に示す。
【００２２】（４）作用温度範囲及び至適作用温度、 ４０〜６０℃の広範囲で作用し、至適作用温度は約５５
℃に認められる。なお、pH９．０に於いて上記条件で反
応させたときの反応温度と相対活性との関係を測定した
結果を図３に示す。
℃に認められる。なお、pH９．０に於いて上記条件で反
応させたときの反応温度と相対活性との関係を測定した
結果を図３に示す。
【００２３】（５）温度安定性、 ５０℃までは極めて安定である（pH９．０のグリシン−
食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間処理）。ま
た、５５℃に於いても４０％以上の残存活性を示す。上
記条件で反応させて測定した処理温度と残存活性との関
係を図４に示す。
食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間処理）。ま
た、５５℃に於いても４０％以上の残存活性を示す。上
記条件で反応させて測定した処理温度と残存活性との関
係を図４に示す。
【００２４】（６）分子量、 ＳＤＳ電気泳動法により測定した分子量が約６５０００
±１０００である。
±１０００である。
【００２５】本発明のアルカリイソアミラーゼは、更
に、下記（７）〜（９）の性質を有する。
に、下記（７）〜（９）の性質を有する。
【００２６】（７）金属イオンの影響、 １mMのHg2+で強く活性が阻害される。
【００２７】（８）界面活性剤の影響、 各種界面活性剤（例えば、線状アルキルベンゼンスルフ
ォン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、アルキル硫酸エステルナ
トリウム塩（ＡＳ）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸
エステルナトリウム塩（ＥＳ）、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム（ＡＯＳ）、α−スルフォン化脂肪酸
エステルナトリウム（α−ＳＦＥ）、アルキルスルフォ
ン酸ナトリウム（ＳＡＳ）、石鹸及びソフタノールの
０．０５％溶液で４０℃、３０分間処理しても殆ど活性
阻害を受けない。
ォン酸ナトリウム（ＬＡＳ）、アルキル硫酸エステルナ
トリウム塩（ＡＳ）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸
エステルナトリウム塩（ＥＳ）、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム（ＡＯＳ）、α−スルフォン化脂肪酸
エステルナトリウム（α−ＳＦＥ）、アルキルスルフォ
ン酸ナトリウム（ＳＡＳ）、石鹸及びソフタノールの
０．０５％溶液で４０℃、３０分間処理しても殆ど活性
阻害を受けない。
【００２８】（９）キレート剤の影響、 キレート剤であるＥＤＴＡ（１０mM）、クエン酸（０．
０５％）及びゼオライト（０．０５％）により殆ど活性
阻害を受けない。
０５％）及びゼオライト（０．０５％）により殆ど活性
阻害を受けない。
【００２９】本発明のアルカリイソアミラーゼを生産し
得る微生物としては、バチルス属に属し、上記酵素学的
性質（１）〜（６）を有するイソアミラーゼを生産する
能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば
茨城県水戸市の土壌より採取した好アルカリ微生物の一
種であるバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．）ＫＳＭ−３３０９が挙げられる。
得る微生物としては、バチルス属に属し、上記酵素学的
性質（１）〜（６）を有するイソアミラーゼを生産する
能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば
茨城県水戸市の土壌より採取した好アルカリ微生物の一
種であるバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．）ＫＳＭ−３３０９が挙げられる。
【００３０】本発明微生物の一例であるバチルス エス
ピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−３３０９は
次のような菌学的性質を有する。なお、以下において菌
株の分類に用いた培地は次の培地２０種類であり、特に
断りの無い限り別滅菌した炭酸ナトリウム（Ｎａ2Ｃ
Ｏ3）を０．５重量％（以下、単に％という）含有す
る。
ピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−３３０９は
次のような菌学的性質を有する。なお、以下において菌
株の分類に用いた培地は次の培地２０種類であり、特に
断りの無い限り別滅菌した炭酸ナトリウム（Ｎａ2Ｃ
Ｏ3）を０．５重量％（以下、単に％という）含有す
る。
【００３１】使用した培地の組成（表示は％）： 培地１．ニュートリエントブロス，０．８；寒天末（和
光純薬社製），１．５。 培地２．ニュートリエントブロス，０．８。 培地３．ニュートリエントブロス，０．８；ゼラチン，
２０．０；寒天末（和光純薬社製），１．５。 培地４．バクトリトマスミルク，１０．５。 培地５．ニュートリエントブロス，０．８；ＫＮＯ3 ，
０．１。 培地６．バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．５；
ブドウ糖，０．５。 培地７．ＳＩＭ寒天培地（栄研化学社製），指示量。 培地８．ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製），指示量。 培地９．酵母エキス，０．５；バクトペプトン，１．
５；Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．１；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．
０２；可溶性澱粉，２．０；寒天末（和光純薬社製），
１．５。 培地10．コーサー培地（栄研化学社製），指示量。
光純薬社製），１．５。 培地２．ニュートリエントブロス，０．８。 培地３．ニュートリエントブロス，０．８；ゼラチン，
２０．０；寒天末（和光純薬社製），１．５。 培地４．バクトリトマスミルク，１０．５。 培地５．ニュートリエントブロス，０．８；ＫＮＯ3 ，
０．１。 培地６．バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．５；
ブドウ糖，０．５。 培地７．ＳＩＭ寒天培地（栄研化学社製），指示量。 培地８．ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製），指示量。 培地９．酵母エキス，０．５；バクトペプトン，１．
５；Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．１；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．
０２；可溶性澱粉，２．０；寒天末（和光純薬社製），
１．５。 培地10．コーサー培地（栄研化学社製），指示量。
【００３２】培地11．（イ）酵母エキス，０．０５；Ｎ
ａ2ＳＯ4 ，０．１；ＫＨ2ＰＯ4 ，０．１；ブドウ糖，
１．０。 （ロ）酵母エキス，０．０５；Ｎａ2ＳＯ4 ，０．１；
ＫＨ2ＰＯ4 ，０．１；ブドウ糖，１．０；ＣａＣｌ2・
２Ｈ2Ｏ，０．０５；ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ，０．０
１；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１；ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ，０．０２。なお、窒素源としては、硝酸ナトリ
ウム、亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸
アンモニウムをそれぞれ０．２５％、０．２０２５％、
０．１５８％、０．１９５％となるように上記（イ）及
び（ロ）の培地に加えて用いた。 培地12．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量。 培地13．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量。 培地14．尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量。 培地15．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日水
製薬社製）。 培地16．３％過酸化水素水。 培地17．バクトペプトン，０．５；酵母エキス，０．
５；Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．１；ブドウ糖，１．０；ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ，０．０２。 培地18．バクトペプトン，２．７；ＮａＣｌ，５．５；
Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．３；ブドウ糖，０．５；ブロモチモ
ールブルー，０．０６；寒天末（和光純薬社製），１．
５。 培地19．（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ，０．１；ＫＣｌ，０．０
２；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．０２；酵母エキス，０．
０５；糖，１．０。 培地20．カゼイン，０．５；酵母エキス，０．５；ブド
ウ糖，１．０；Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．１；ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５。
ａ2ＳＯ4 ，０．１；ＫＨ2ＰＯ4 ，０．１；ブドウ糖，
１．０。 （ロ）酵母エキス，０．０５；Ｎａ2ＳＯ4 ，０．１；
ＫＨ2ＰＯ4 ，０．１；ブドウ糖，１．０；ＣａＣｌ2・
２Ｈ2Ｏ，０．０５；ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ，０．０
１；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１；ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ，０．０２。なお、窒素源としては、硝酸ナトリ
ウム、亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸
アンモニウムをそれぞれ０．２５％、０．２０２５％、
０．１５８％、０．１９５％となるように上記（イ）及
び（ロ）の培地に加えて用いた。 培地12．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量。 培地13．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量。 培地14．尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量。 培地15．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日水
製薬社製）。 培地16．３％過酸化水素水。 培地17．バクトペプトン，０．５；酵母エキス，０．
５；Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．１；ブドウ糖，１．０；ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ，０．０２。 培地18．バクトペプトン，２．７；ＮａＣｌ，５．５；
Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．３；ブドウ糖，０．５；ブロモチモ
ールブルー，０．０６；寒天末（和光純薬社製），１．
５。 培地19．（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ，０．１；ＫＣｌ，０．０
２；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．０２；酵母エキス，０．
０５；糖，１．０。 培地20．カゼイン，０．５；酵母エキス，０．５；ブド
ウ糖，１．０；Ｋ2ＨＰＯ4 ，０．１；ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５。
【００３３】（菌学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果、 菌体の大きさは、０．８〜１．２μm ×２．８〜４．０
μm の桿菌であり、菌体の中央に楕円形の内生胞子
（０．８〜１．０μm ×２．０〜２．５μm ）を作る。
周鞭毛を有し運動性がある。グラム染色は陽性。抗酸性
はない。
μm の桿菌であり、菌体の中央に楕円形の内生胞子
（０．８〜１．０μm ×２．０〜２．５μm ）を作る。
周鞭毛を有し運動性がある。グラム染色は陽性。抗酸性
はない。
【００３４】（ｂ）各種培地に於ける生育状態、 （イ）肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良好。集落の形状は不規則であり、表面は粗
雑、周縁は樹根状である。集落の色調は淡黄色半透明で
ある。 （ロ）肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。 （ハ）肉汁液体培養（培地２） 生育状態は不良。 （ニ）肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良い。ゼラチンの液化が認められる。 （ホ）リトマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。リトマスの
変色は培地がアルカリのため判定できない。
雑、周縁は樹根状である。集落の色調は淡黄色半透明で
ある。 （ロ）肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。 （ハ）肉汁液体培養（培地２） 生育状態は不良。 （ニ）肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良い。ゼラチンの液化が認められる。 （ホ）リトマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。リトマスの
変色は培地がアルカリのため判定できない。
【００３５】（ｃ）生理学的性質、 （イ）硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５） 硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。 （ロ）ＭＲテスト（培地６） 培地がアルカリのため判定できない。 （ハ）ＶＰテスト（培地６） 陰性。 （ニ）インドールの生成（培地７） 陰性。 （ホ）硫化水素の生成（培地８） 陰性。 （ヘ）澱粉の加水分解（培地９） 陽性。 （ト）クエン酸の利用 コーサー培地（培地１０）で陽性。
【００３６】（チ）無機窒素源の利用（培地１１） 硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。 （リ）色素の生成（培地１２，１３） 陰性。 （ヌ）ウレアーゼ（培地１４） 陰性。 （ル）オキシダーゼ（培地１５） 陰性。 （ヲ）カタラーゼ（培地１６） 陽性。 （ワ）生育の範囲（培地１７） 生育の温度範囲は１２〜４５℃、生育最適温度範囲は１
８〜４２℃であった。生育のpH範囲はpH８．５〜１０．
５、生育最適pHはpH９．５であった。 （カ）酸素に対する態度 好気的。
８〜４２℃であった。生育のpH範囲はpH８．５〜１０．
５、生育最適pHはpH９．５であった。 （カ）酸素に対する態度 好気的。
【００３７】（ヨ）Ｏ−Ｆテスト（培地１８） アルカリ性のため変色は判定できない。好気状態でのみ
生育する。 （タ）糖の利用性（培地１９） Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ
−フラクトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロース、Ｄ−
マンニトール、Ｄ−イノシトール、Ｄ−ソルビトール、
グリセリン、デンプン及びデキストリンを利用する。 （レ）食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） 食塩濃度が７％まで生育。食塩濃度が１０％で生育不
良。 （ソ）カゼインの分解（培地２０） 陽性。
生育する。 （タ）糖の利用性（培地１９） Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ
−フラクトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロース、Ｄ−
マンニトール、Ｄ−イノシトール、Ｄ−ソルビトール、
グリセリン、デンプン及びデキストリンを利用する。 （レ）食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） 食塩濃度が７％まで生育。食塩濃度が１０％で生育不
良。 （ソ）カゼインの分解（培地２０） 陽性。
【００３８】以上の菌学的性質に基づき、バージーズ・
マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻及び
ザ．ジーナス．バチルス（“Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ”Ｒ．Ｅ．Ｇｏｒｄｏｎら，Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ．４２７，Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃ
ｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｅｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，（１
９７３））を参照し、比較検索した結果、本菌株は有胞
子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一種で
あると認められる。そして、本菌株は中性領域では生育
できず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すことか
ら、最近ＨｏｒｉｋｏｓｈｉとＡｋｉｂａ（“Ａｌｋａ
ｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ”，Ｊ
ａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（Ｔｏｋｙｏ），１９８２年刊）が主張してい
る、所謂好アルカリ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微
生物（中性pH範囲で生育するバチルス属細菌）とは区別
される。
マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻及び
ザ．ジーナス．バチルス（“Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ”Ｒ．Ｅ．Ｇｏｒｄｏｎら，Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ．４２７，Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃ
ｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｅｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，（１
９７３））を参照し、比較検索した結果、本菌株は有胞
子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一種で
あると認められる。そして、本菌株は中性領域では生育
できず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すことか
ら、最近ＨｏｒｉｋｏｓｈｉとＡｋｉｂａ（“Ａｌｋａ
ｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ”，Ｊ
ａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（Ｔｏｋｙｏ），１９８２年刊）が主張してい
る、所謂好アルカリ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微
生物（中性pH範囲で生育するバチルス属細菌）とは区別
される。
【００３９】更に、本菌株の菌学的性質は、上記好アル
カリ性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新
規菌株と判断してバチルス エスピー ＫＳＭ−３３０
９と命名し、微工研菌寄第１３００５号として通産省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。
カリ性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新
規菌株と判断してバチルス エスピー ＫＳＭ−３３０
９と命名し、微工研菌寄第１３００５号として通産省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。
【００４０】上記の菌株を用いて本発明のアルカリイソ
アミラーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従
って培養すればよい。培地中には、資化し得る炭素源及
び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ましい。
アミラーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従
って培養すればよい。培地中には、資化し得る炭素源及
び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ましい。
【００４１】この炭素源及び窒素源については特に制限
はないが、具体例としては、窒素源としてコーングルテ
ンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エキス、トリプ
トン、ソイトン、ハイプロ、アジパワー、ソイビーンミ
ール、綿実油粕、カルチベーター、アジプロン、ゼスト
など有機窒素源及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナト
リウム、酢酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられ、
また炭素源としては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロ
ペクチン、グリコーゲン、プルラン及びこれらの部分分
解により生じた分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素
源、例えばグルコース、マルトース、キシロース、マン
ノース、フラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハ
ロース、マンニット、ソルビット、グリセリンや資化し
うる有機酸、例えば酢酸などが挙げられる。
はないが、具体例としては、窒素源としてコーングルテ
ンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エキス、トリプ
トン、ソイトン、ハイプロ、アジパワー、ソイビーンミ
ール、綿実油粕、カルチベーター、アジプロン、ゼスト
など有機窒素源及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナト
リウム、酢酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられ、
また炭素源としては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロ
ペクチン、グリコーゲン、プルラン及びこれらの部分分
解により生じた分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素
源、例えばグルコース、マルトース、キシロース、マン
ノース、フラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハ
ロース、マンニット、ソルビット、グリセリンや資化し
うる有機酸、例えば酢酸などが挙げられる。
【００４２】その他、リン酸塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウ
ム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要に応じ、無機、有
機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
シウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウ
ム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要に応じ、無機、有
機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
【００４３】かくして得られる培養物中の目的物質であ
るアルカリイソアミラーゼの採取及び精製は、一般の酵
素の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。す
なわち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段によ
り菌体を培養液から除去して粗酵素液を得ることができ
る。この粗酵素液は、そのまま使用することもできる
が、必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分
離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結
晶化して、精製酵素として使用することもできる。
るアルカリイソアミラーゼの採取及び精製は、一般の酵
素の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。す
なわち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段によ
り菌体を培養液から除去して粗酵素液を得ることができ
る。この粗酵素液は、そのまま使用することもできる
が、必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分
離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結
晶化して、精製酵素として使用することもできる。
【００４４】以下に本発明のアルカリイソアミラーゼの
製造方法及び精製方法の例を挙げる。アルカリ性バチル
ス属細菌ＫＳＭ−３３０９株を１％グリコーゲン（カキ
由来）、０．２％トリプトン、０．１％酵母エキス、
０．０３％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％（ＮＨ4）ＳＯ4 、
０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２％ＣａＣｌ2
・２Ｈ2Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０
００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ及び０．５％Ｎａ2ＣＯ3を
含む培地で、３０℃にて３日間好気的に振盪培養し、得
られた培養液から菌体を除き、上澄液を得る。次いで、
該上澄液に硫安を８０％飽和になる様に加え、５℃にて
１２時間攪拌し蛋白を沈澱させる。遠心分離により沈澱
物を回収し、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に
懸濁した後、同緩衝液にて一昼夜透析する。
製造方法及び精製方法の例を挙げる。アルカリ性バチル
ス属細菌ＫＳＭ−３３０９株を１％グリコーゲン（カキ
由来）、０．２％トリプトン、０．１％酵母エキス、
０．０３％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％（ＮＨ4）ＳＯ4 、
０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２％ＣａＣｌ2
・２Ｈ2Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０
００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ及び０．５％Ｎａ2ＣＯ3を
含む培地で、３０℃にて３日間好気的に振盪培養し、得
られた培養液から菌体を除き、上澄液を得る。次いで、
該上澄液に硫安を８０％飽和になる様に加え、５℃にて
１２時間攪拌し蛋白を沈澱させる。遠心分離により沈澱
物を回収し、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に
懸濁した後、同緩衝液にて一昼夜透析する。
【００４５】得られた透析液にＤＥＡＥ−セルロース粉
末を加え、イソアミラーゼを完全にＤＥＡＥ−セルロー
スに吸着させる。次いで、１０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH８．０）で樹脂を洗浄した後、１Ｍの食塩を含む１
０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で酵素を溶出す
る。更に、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に対
して透析濃縮後、同緩衝液で平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｂ
ｉｏ Ｇｅｌ Ａ」（バイオラッド社製）に吸着させ、
１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用いて０〜１
Ｍの食塩の濃度勾配により溶出し、その活性画分を集
め、平均分画分子量１００００の限外濾過膜を用いて濃
縮した後、０．１Ｍ食塩を含む１０mMトリス−塩酸緩衝
液（pH８．０）を用いて一夜透析する。
末を加え、イソアミラーゼを完全にＤＥＡＥ−セルロー
スに吸着させる。次いで、１０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH８．０）で樹脂を洗浄した後、１Ｍの食塩を含む１
０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で酵素を溶出す
る。更に、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に対
して透析濃縮後、同緩衝液で平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｂ
ｉｏ Ｇｅｌ Ａ」（バイオラッド社製）に吸着させ、
１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用いて０〜１
Ｍの食塩の濃度勾配により溶出し、その活性画分を集
め、平均分画分子量１００００の限外濾過膜を用いて濃
縮した後、０．１Ｍ食塩を含む１０mMトリス−塩酸緩衝
液（pH８．０）を用いて一夜透析する。
【００４６】活性画分は、更に０．１Ｍ食塩を含む１０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化した「Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００」（ファルマシア社製）カ
ラムに充填し、０．１Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出し、
その活性画分を集めた。これを限外濾過膜を用いて濃縮
した後、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用い
て一夜透析する。
mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化した「Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００」（ファルマシア社製）カ
ラムに充填し、０．１Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出し、
その活性画分を集めた。これを限外濾過膜を用いて濃縮
した後、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用い
て一夜透析する。
【００４７】かくして得られる精製酵素は、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度７．５％）及びＳＤＳ
電気泳動（ゲル濃度１５％）で単一のバンドを与え、活
性収率は約４％である。
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度７．５％）及びＳＤＳ
電気泳動（ゲル濃度１５％）で単一のバンドを与え、活
性収率は約４％である。
【００４８】
【発明の効果】本発明のアルカリイソアミラーゼは、従
来得られているイソアミラーゼとは異なってアルカリ側
に至適pHを有するとともに広範囲のpHにおいて極めて安
定なものであり、しかも至適温度である５５℃において
も４０％以上の活性が残存するものであることから、洗
浄剤組成物の配合成分として好適に使用することができ
る。更に、このようなアルカリイソアミラーゼを生産し
得る微生物を使用して該酵素を簡便に製造することがで
きる本発明は、工業的に大きな意義を有するものであ
る。
来得られているイソアミラーゼとは異なってアルカリ側
に至適pHを有するとともに広範囲のpHにおいて極めて安
定なものであり、しかも至適温度である５５℃において
も４０％以上の活性が残存するものであることから、洗
浄剤組成物の配合成分として好適に使用することができ
る。更に、このようなアルカリイソアミラーゼを生産し
得る微生物を使用して該酵素を簡便に製造することがで
きる本発明は、工業的に大きな意義を有するものであ
る。
【００４９】
【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】実施例１ 茨城県水戸市の土壌を薬匙一杯（約０．５ｇ）、滅菌生
理食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理した。この
熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（培
地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培
養し、集落を形成させた。集落の周囲にグリコーゲン
（カキ由来）の溶解に基づく透明帯を形成するものを選
出し、イソアミラーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌
を液体培地Ｂに接種し、３０℃で３日間振盪培養した。
培養後、遠心分離した上清液についてイソアミラーゼ活
性を、pH９．０にて測定し、アルカリイソアミラーゼ生
産菌をスクリーニングし、本発明のアルカリイソアミラ
ーゼ生産菌バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０９（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３００５）を取得した。以下に培地Ａ及
び培地Ｂの組成を示す。
理食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理した。この
熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（培
地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培
養し、集落を形成させた。集落の周囲にグリコーゲン
（カキ由来）の溶解に基づく透明帯を形成するものを選
出し、イソアミラーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌
を液体培地Ｂに接種し、３０℃で３日間振盪培養した。
培養後、遠心分離した上清液についてイソアミラーゼ活
性を、pH９．０にて測定し、アルカリイソアミラーゼ生
産菌をスクリーニングし、本発明のアルカリイソアミラ
ーゼ生産菌バチルス エスピー ＫＳＭ−３３０９（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３００５）を取得した。以下に培地Ａ及
び培地Ｂの組成を示す。
【００５１】
【表２】 培地Ａ： 組成 （重量％） グリコーゲン（カキ由来） ０．５ ポリペプトン ０．２ 酵母エキス ０．１ ＫＨ2ＰＯ4 ０．０３ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．１ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０２ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．０００１ 寒天 １．５ Ｎａ2ＣＯ3 ０．５ 精製水 バランス pH９．２
【００５２】
【表３】 培地Ｂ： 組成 （重量％） グリコーゲン（カキ由来） １ トリプトン ０．２ 酵母エキス ０．１ ＫＨ2ＰＯ4 ０．０３ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．１ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０２ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．０００１ Ｎａ2ＣＯ3 ０．５ 精製水 バランス pH９．２
【００５３】実施例２ アルカリイソアミラーゼ生産菌、バチルス エスピー
ＫＳＭ−３３０９株を実施例１の液体培地Ｂに接種し、
３０℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離
して除き、粗イソアミラーゼ酵素液とした。更に、通常
の方法に従って凍結乾燥し、下記表４に示す粗酵素標品
を得た（酵素活性はpH９．０に於ける測定値である）。
ＫＳＭ−３３０９株を実施例１の液体培地Ｂに接種し、
３０℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離
して除き、粗イソアミラーゼ酵素液とした。更に、通常
の方法に従って凍結乾燥し、下記表４に示す粗酵素標品
を得た（酵素活性はpH９．０に於ける測定値である）。
【００５４】
【表４】
【００５５】実施例３ 実施例２で得られた粗酵素液について、以下の手順に従
って精製を行い、アルカリイソアミラーゼを得た。すな
わち、粗酵素液の上澄液に硫安を８０％飽和になるよう
に攪拌しながら加えた後、５℃にて１２時間保存し蛋白
を沈澱させる。遠心分離により沈澱物を回収し、１０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸濁した後、同緩衝
液にて一昼夜透析する。次いで透析液にＤＥＡＥ−セル
ロース粉末を加え、イソアミラーゼを完全にＤＥＡＥ−
セルロースに吸着させる。次いで、１０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH８．０）で洗浄した後、１Ｍの食塩を含む１
０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で酵素を溶出させ
る。更に、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に対
して透析濃縮後、同緩衝液で平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｂ
ｉｏ Ｇｅｌ Ａ」に吸着させ、１０mMトリス−塩酸緩
衝液（pH８．０）を用いて０〜１Ｍの食塩の濃度勾配に
より溶出し、その活性画分を集め、平均分画分子量１０
０００の限外濾過膜を用いて濃縮した後、０．１Ｍ食塩
を含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用いて
一夜透析する。上記活性画分を０．１Ｍ食塩を含む１０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化した「Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００」カラムに充填し、０．１
Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性画分を集め
た。これを限外濾過膜を用いて濃縮した後、１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用いて一夜透析した。得
られたイソアミラーゼについて図５に示すようにデービ
ス（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１，４
０４（１９６４））の方法に従って電気泳動を行った
後、コマシー・ブリリアント・ブルーで染色し、単一の
バンドを与えることを確認した。
って精製を行い、アルカリイソアミラーゼを得た。すな
わち、粗酵素液の上澄液に硫安を８０％飽和になるよう
に攪拌しながら加えた後、５℃にて１２時間保存し蛋白
を沈澱させる。遠心分離により沈澱物を回収し、１０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸濁した後、同緩衝
液にて一昼夜透析する。次いで透析液にＤＥＡＥ−セル
ロース粉末を加え、イソアミラーゼを完全にＤＥＡＥ−
セルロースに吸着させる。次いで、１０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH８．０）で洗浄した後、１Ｍの食塩を含む１
０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で酵素を溶出させ
る。更に、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に対
して透析濃縮後、同緩衝液で平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｂ
ｉｏ Ｇｅｌ Ａ」に吸着させ、１０mMトリス−塩酸緩
衝液（pH８．０）を用いて０〜１Ｍの食塩の濃度勾配に
より溶出し、その活性画分を集め、平均分画分子量１０
０００の限外濾過膜を用いて濃縮した後、０．１Ｍ食塩
を含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用いて
一夜透析する。上記活性画分を０．１Ｍ食塩を含む１０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化した「Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００」カラムに充填し、０．１
Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性画分を集め
た。これを限外濾過膜を用いて濃縮した後、１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH８．０）を用いて一夜透析した。得
られたイソアミラーゼについて図５に示すようにデービ
ス（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１，４
０４（１９６４））の方法に従って電気泳動を行った
後、コマシー・ブリリアント・ブルーで染色し、単一の
バンドを与えることを確認した。
【００５６】実施例４ 実施例３で得られたイソアミラーゼについて、常法に従
い、ＳＤＳ電気泳動を行った。結果を図６に示す。これ
より本酵素の分子量は６５０００±１０００であること
がわかった。
い、ＳＤＳ電気泳動を行った。結果を図６に示す。これ
より本酵素の分子量は６５０００±１０００であること
がわかった。
【図１】本発明のアルカリイソアミラーゼの反応pHと相
対活性との関係を示す図面である。
対活性との関係を示す図面である。
【図２】本発明のアルカリイソアミラーゼの処理pHと残
存活性との関係を示す図面である。
存活性との関係を示す図面である。
【図３】本発明のアルカリイソアミラーゼの反応温度
（pH９．０）と相対活性との関係を示す図面である。
（pH９．０）と相対活性との関係を示す図面である。
【図４】本発明のアルカリイソアミラーゼの処理温度
（pH９．０）と残存活性との関係を示す図面である。
（pH９．０）と残存活性との関係を示す図面である。
【図５】本発明のアルカリイソアミラーゼをデービスの
方法に従って電気泳動を行った結果を示す図面である。
方法に従って電気泳動を行った結果を示す図面である。
【図６】本発明のアルカリイソアミラーゼのＳＤＳ電気
泳動の結果を示す図面である。
泳動の結果を示す図面である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１２月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】（２）沃素発色法によるイソアミラーゼ活
性の測定、 精製ステップにおける活性測定は、以下の条件で行っ
た。すなわち、１％（ｗ／ｖ）ポテト由来アミロペクチ
ン０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加え、４０℃で３０分
間反応を行った。反応後、反応液から０．２ｍｌを抜き
取り、沃素溶液（０．００５％ Ｉ２＋０．０１５％
ＫＩ）２ｍｌを加え、更に８．０ｍｌに脱イオン水を加
えて希釈し、波長６００ｎｍで比色定量した。酵素の力
価は、吸光度を１分間に０．０１上昇させるのに必要な
酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
性の測定、 精製ステップにおける活性測定は、以下の条件で行っ
た。すなわち、１％（ｗ／ｖ）ポテト由来アミロペクチ
ン０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加え、４０℃で３０分
間反応を行った。反応後、反応液から０．２ｍｌを抜き
取り、沃素溶液（０．００５％ Ｉ２＋０．０１５％
ＫＩ）２ｍｌを加え、更に８．０ｍｌに脱イオン水を加
えて希釈し、波長６００ｎｍで比色定量した。酵素の力
価は、吸光度を１分間に０．０１上昇させるのに必要な
酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (5)
- 【請求項１】 下記の酵素学的性質を有するアルカリイ
ソアミラーゼ。 （１）作用、 グリコーゲン及びアミロペクチンのα−１，６グルコシ
ド結合を加水分解する。また、アミロース、プルランの
α−１，６グルコシド結合を加水分解しない。 （２）作用pH及び至適pH、 pH５から１１．５のpH範囲で作用し、至適pHを９付近に
有する。 （３）pH安定性、 pH７から１０の範囲で極めて安定であり、pH６〜１０．
５においても約５０％以上の活性を維持する（４０℃、
１０分間処理）。 （４）作用温度範囲及び至適作用温度、 ４０〜６０℃の範囲で作用し、至適作用温度は約５５℃
である。 （５）温度安定性、 ５０℃までは極めて安定である（pH９．０のグリシン−
食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間処理）。 （６）分子量、 ソジウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動法による分子
量が約６５０００±１０００である。 - 【請求項２】 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属
し、かつ請求項１記載のアルカリイソアミラーゼ生産能
を有する微生物。 - 【請求項３】 バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）ＫＳＭ−３３０９と命名され微工研菌寄第１
３００５号として寄託された請求項１記載のアルカリイ
ソアミラーゼ生産能を有する微生物。 - 【請求項４】 請求項２記載の微生物を培養し、その培
養物からアルカリイソアミラーゼを採取することを特徴
とするアルカリイソアミラーゼの製造方法。 - 【請求項５】 請求項３記載の微生物を培養し、その培
養物からアルカリイソアミラーゼを採取することを特徴
とするアルカリイソアミラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17567792A JP2676453B2 (ja) | 1992-07-02 | 1992-07-02 | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17567792A JP2676453B2 (ja) | 1992-07-02 | 1992-07-02 | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0614775A true JPH0614775A (ja) | 1994-01-25 |
| JP2676453B2 JP2676453B2 (ja) | 1997-11-17 |
Family
ID=16000310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17567792A Expired - Fee Related JP2676453B2 (ja) | 1992-07-02 | 1992-07-02 | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2676453B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6959492B1 (en) | 1998-11-24 | 2005-11-01 | Matsushita Electric Industrial, Co., Ltd. | Plate type heat exchanger and method of manufacturing the heat exchanger |
| KR100966758B1 (ko) * | 2002-03-01 | 2010-06-30 | 라이온 가부시키가이샤 | 제균처리 방법, 제균세정제 조성물 및 세탁 방법 |
-
1992
- 1992-07-02 JP JP17567792A patent/JP2676453B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6959492B1 (en) | 1998-11-24 | 2005-11-01 | Matsushita Electric Industrial, Co., Ltd. | Plate type heat exchanger and method of manufacturing the heat exchanger |
| KR100966758B1 (ko) * | 2002-03-01 | 2010-06-30 | 라이온 가부시키가이샤 | 제균처리 방법, 제균세정제 조성물 및 세탁 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2676453B2 (ja) | 1997-11-17 |
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