JP3544383B2 - アルカリに安定なサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ及びその製造法 - Google Patents
アルカリに安定なサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ及びその製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９、以下ＣＧＴａｓｅという）、その製造法に関する。更に詳しくは、ＣＧＴａｓｅ生産能を有するバチルス属に属する菌を培養し、培養物中に耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを産生せしめ、これを採取するＣＧＴａｓｅの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイクロデキストリンはグルコースが６、７又は８個などからなる環状オリゴ糖の総称であり、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のバチルス属細菌、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等の細菌などの生産するＣＧＴａｓｅにより澱粉から生産される。又、ある種の好アルカリ性菌、例えば、好アルカリ性バチルス Ｎｏ．３８−２は、ｐＨ５．５とｐＨ８．５に最適ｐＨをもつＣＧＴａｓｅを生産し、澱粉からβ−サイクロデキストリンを生産する。これらの微生物の生産するＣＧＴａｓｅについては、例えば、発酵と工業 ３６（３） １７６−１８３ （１９７８）， 醸造 ８０（７） ４３４−４４０ （１９８５），（株）学会出版センター発行「好アルカリ性微生物」 １０１−１１０ （１９８２）等に詳しくまとめられている。
【０００３】
上記の各種ＣＧＴａｓｅを澱粉に作用させて生成したサイクロデキストリンは各種の有機化合物を包蔵し、不安定物質の安定化、芳香の保持、悪臭物質の消臭、苦みの除去、乳化促進、起泡性改善等の作用が知られ、医薬、食品分野に使用されている。例えば、サイクロデキストリンを洗浄剤に配合し、その起泡性を改善したり（特開昭６３−６８５２０、特開平２−３４６９３、特開平３−１７２３９７）、香料の持続効果を図ったり（特開平１−１８５３９９）する方法が知られている。
【０００４】
【課題が解決しようとする課題】
本発明の目的は、より耐アルカリ性で、かつ効率的にサイクロデキストリンを生成するＣＧＴａｓｅを生産する微生物を、広く自然界に求めてスクリーニングして見いだすことであり、当該菌株から得られる耐アルカリ性のＣＧＴａｓｅは洗浄剤などの用途に新たな道を開くものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は広く自然界に耐アルカリ性のＣＧＴａｓｅ生産菌を求めた結果、土壌より分離したバチルス・エスピーＹＴ−１株の生産するＣＧＴａｓｅが、最適ｐＨは６付近にあるが、ｐＨ５−１２の広いｐＨ域で安定で、ｐＨ４〜１２の広いｐＨ域でサイクロデキストリンを合成する性質を有し、特に、ｐＨ５〜１０においても、至適ｐＨの活性の９０％以上の活性を有する耐アルカリ性の性質を有し、更にｐＨ９以上ではα−サイクロデキストリンの生成は抑制され、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンを主成分として生産することを認めた。
【０００６】
このように、本酵素が、ｐＨ９以上のアルカリ性下で、澱粉質から生産するサイクロデキストリンは、空洞の大きいβ−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンが主成分となるため、このＣＧＴａｓｅを洗剤とともに使用すれば、食器等の澱粉質等の汚れの分解除去の他に、生成したサイクロデキストリンの消臭などのマスキング効果も顕著に発揮され、又、起泡性の改善と汚れの乳化促進などによる洗滌効果向上等、洗剤成分として極めて有用であることを認めた。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
本発明において例示菌として使用されるバチルス・エスピーＹＴ−１株は、以上の目的のために、自然界から分離した多数の微生物の中から選び出されたものである。バチルス・エスピーＹＴ−１の菌学的性質は下記の通りである。なお本菌は工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３８７７として寄託されている。
【０００８】
（１） 形態：桿菌（幅０．８〜１．０μｍ、長さ３．０〜４．０μｍ）
（２） 胞子：卵形で菌体を膨張させる。径０．９〜１．２μｍ、菌端または中央に形成する。
（３） グラム染色：陰性
（４） 運動性：＋
（５） オキシダーゼ：＋
（６） カタラーゼ反応：＋
（７） インドール：−
（８） ＶＰ：−
（９） ＶＰ培地におけるｐＨ：７．８
（１０） リトマスミルク反応：−
（１１） メチレンブルー還元：−
（１２） チロシン分解：−
（１３） 食塩（５，７，１０％）生育：−
（１４） 尿素の分解：−
（１５） クエン酸塩利用（ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：−
（１６） ＯＦ反応：−
（１７） 酸素に対する態度：好気性
（１８） ブドウ糖の分解：−
（１９） エスクリンの分解：＋
（２０） 硝酸塩還元：±
（２１） マッコンキー生育：−
（２２） 澱粉の分解：＋
（２３） ゼラチン：＋
（２４） ツイン８０：−
（２５） ＤＮａｓｅ：＋
（２６） フェニルアラニン：−
（２７） エッグヨーク：−
（２８） カゼイン：＋（但し１８日）
（２９） 生育温度（℃）：１０〜４１（最適３２〜３６）
（３０） 生育ｐＨ：７．２〜１１．５（最適８．０〜９．０）
（３１） 食塩生育（％）：０〜１
（３２） 栄養要求：
ビオチン ±
ナイアシン −
サイアミン −
葉酸 −
トリプトファン −
（３３） 糖から酸の産生（フェノールレッド半流動培地−２１日）：
マンニット ＋
サッカロース −
キシロース −
ソルビット −
サリシン ＋
アラビノース −
グリセリン −
ダルシット −
グルコース −
マルトース −
マンノース −
ラクトース −
【０００９】
以上の菌学的性質について、
▲１▼ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． ２（１９８６）， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｕ．Ｓ．Ａ、
▲２▼ Ｎ． Ｒ． Ｓｍｉｔｈ， Ｒ． Ｅ． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｆ． Ｅ． Ｃｌａｒｋ（１９５２）Ａｅｒｏｂｉｃ Ｓｐｏｒｅｆｏｒｍｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ． Ａｇｒ． Ｍｏｎｏｇｒａｇｈ、
▲３▼ Ｒ． Ｅ． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｗ． Ｃ． Ｈａｙｎｅｓ， Ｃ． Ｈ． Ｐａｎｇ．（１９７３）Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ． Ａｇｒ． Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ．４２７ Ｕｎｉｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ． Ｃ．
等を参照して同定した。本菌は２％食塩に生育せず、その他の性状においても極めてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓに類似するが、澱粉を分解し、チロシンを分解しないことから当該菌と同定できなかった。もちろん糖の資化性等からＢａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ等に相当しないことより、本菌をバチルス・エスピーＹＴ−１と命名した。
【００１０】
本菌の生産するＣＧＴａｓｅの酵素的性質の概要を以下に示す。
（ａ） 作用及び基質特異性：澱粉を分解してα−、β−及びγ−サイクロデキストリン合成する。これらサイクロデキストリンの生成比は、ｐＨ７〜８において、通常、２０〜３０：６０〜７０：１０〜１５の割合で生成するが、ｐＨ９以上においては、α−サイクロデキストリンの生成が抑制され、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンを主成分として生産し、その生成比は、通常、０〜３：８０〜８５：１０〜２０である。
【００１１】
（ｂ） 作用ｐＨ及び最適ｐＨ：作用ｐＨが４〜１２であり、１％可溶性澱粉、１０ｍＭ酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液の下で、４０℃で３０分測定した場合の最適ｐＨは６〜７であり、かつｐＨ５〜１０において、最高活性の９０％以上の活性を示す（図１に示す。）。
【００１２】
（ｃ） 作用温度及び最適温度：作用温度の上限が８０℃であり、かつ１％可溶性澱粉、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０）下で１０分間反応させたときの最適温度は６５℃にある（図２に示す。）。
【００１３】
（ｄ） ｐＨ安定性：１０ｍＭ酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液の下、２５℃で３時間処理したとき、ｐＨ５〜１０において安定である（図３に示す。）。
【００１４】
（ｅ） 熱安定性：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０）の下で１０分間加熱する場合、５０℃まで安定であるが、６０℃で８０％失活する。５ｍＭのカルジウムイオンの存在下では６０℃で１０分間加熱しても９０％以上残存する（図４に示す。）。
【００１５】
（ｆ） 分子量：アクリルアミド電気泳動法により求めた分子量が４３，０００である。
【００１６】
（ｇ） 安定化：Ｃａ２＋の存在下で熱安定化される。
【００１７】
（ｈ） 阻害剤：Ｈｇ２＋、Ａｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋等の存在下により活性が阻害される。
【００１８】
（ｉ） 精製法：培養上澄から、６０％硫安沈殿、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィーとセファデックスゲル濾過クロマトグラフィーにより、電気泳動的に均一まで精製することができる。
【００１９】
（ｊ） 活性測定法：２％可溶性澱粉を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１１．０）０．２ｍｌに、適量の酵素液を加え、全量を水で０．４ｍｌとし、５０℃で１０分間反応させた。反応後、ヨウ素−ヨウ化カリウム−ＨＣｌ溶液［（Ｉ２ ０．００５ｇ ； ＫＩ ０．０５ｇ ； ０．１Ｍ ＨＣｌ １０ｍｌ）に水を加えて、全量１００ｍｌとしたもの］を２ｍｌ加え、室温で１５分間放置後、６６０ｎｍで比色する。この条件で、１分間に青色の１％を減少させる酵素量を１単位とする。
【００２０】
これまで、サイクロデキストリンを生成する多くの微生物が発見されてきた。生成されるサイクロデキストリンの種類は、微生物の種類により異なり、例えば、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｍｓ）の酵素は比較的α−サイクロデキストリンを多く生産する（α：β：γ＝１３．３：２．３：１）。そして、ある種の細菌、例えば、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）は比較的β−サイクロデキストリンを多く生産する（α：β：γ＝１．０：７．０：１．０）。又、好アルカリ性細菌が生産する、例えば、バチルス Ｎｏ．３８−２株のＣＧＴａｓｅは、最適ｐＨが５．５とｐＨ８．５にあり、β−サイクロデキストリンを生産する〔発酵と工業 ３７（２） １５０−１６１ （１９７９）〕。
【００２１】
然るに、本発明において例示菌として使用するバチルス・エスピーＹＴ−１株の生産するＣＧＴａｓｅは、ｐＨ５〜１０の広いｐＨ域で安定であるが、最適ｐＨが６〜７にあり、ｐＨ６〜８で反応したとき、通常、α−サイクロデキストリンを２０〜３０％、β−サイクロデキストリンを６０〜７０％、そして、γ−サイクロデキストリンを１０〜１５％の割合で生成する。一方、ｐＨ９以上で反応したときは、α−サイクロデキストリンの生成が抑制され、空洞の大きいβ−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンが主成分として生産される。その割合は、α−サイクロデキストリンが０〜３％、β−サイクロデキストリンが８０〜８５％そして、γ−サイクロデキストリンが１０〜２０％である（表１を参照）。しかし、最高収量は、ほぼ同じ５０〜６０％である。
【００２２】
本菌を培養して本発明のＣＧＴａｓｅを生産するには、窒素源として、大豆粕、コーン・スティープ・リカー、肉エキス、ペプトン、ミルクカゼイン、酵母エキスなどの有機窒素源が使用される。中でも、大豆タンパク、大豆粕（脱脂大豆）、コーン・ルティーブ・リカーなどは良好な窒素源である。この他、必要に応じ、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が使用される。炭素源としては、通常、澱粉又は液化澱粉、可溶性澱粉、デキストリンなどの澱粉派生物が使用される。
【００２３】
以上の窒素源と炭素源の他に、リン酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などが補足原料として使用される。特に、リン酸塩、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどの添加は効果があり、リン酸塩として、例えば、Ｋ２ＨＰＯ４は０．０５〜０．３％、マグネシウム塩として、例えば、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは０．０１〜０．３％、カルシウム塩として、例えば、ＣａＣｌ２は０．０１〜０．１％程度添加される。ＣＧＴａｓｅは菌体外に生産されるので、培養後、濾過又は遠心分離により、除菌し、酵素を回収する。
【００２４】
ＣＧＴａｓｅの高アルカリ性下の洗剤中での耐性試験は、市販の洗剤、例えば、ライオン社製ママローヤル（商品名：界面活性剤を３０％含有）を使用し、界面活性剤として例えば４５０ｐｐｍを含むｐＨ１０又はｐＨ１１の溶液中で、４０℃又は５０℃で試験した。
以下、実施例により本発明の内容を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これら実施例に限定されるものでない。
【００２５】
【実施例】
実施例１
コーン・スティープ・リカー ２％（固形分として）、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２％、ＣａＣｌ２ １×１０−３Ｍからなる培地２００ｍｌを１リットル容三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分殺菌後、バチルス・エスピーＹＴ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８７７）を接種し、３０℃で２２５回転／分で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離して得た上澄液のＣＧＴａｓｅ活性は、１８４単位／ｍｌ培地であった。
【００２６】
培養上澄に、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように加え、生成した沈殿を回収後、透析して後、２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で緩衝化させたＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６８カラムに供給し、ＫＣｌ濃度を０〜１Ｍまでリニヤーに変えて溶出した。ＣＧＴａｓｅ区分を回収し、濃縮、透析後、次いで、セファデックスＧ−１５０カラムでゲル濾過を行った。得られた精製酵素は２９６０単位／Ａ２８０であり、電気泳動的に均一であった。
【００２７】
実施例２
実施例２と同様にし、培養して得られた上澄液２００ｍｌに硫安を６０％飽和になるよう加えて沈殿物を得、水で透析した酵素液を用い、澱粉からのサイクロデキストリンの生産試験を行った。
【００２８】
ポテト澱粉１００ｍｇ、０．４ Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７〜１０）１．３ｍｌ、０．１Ｍ ＣａＣｌ２ ０．５ｍｌ、ＣＧＴａｓｅ １．２５単位、全量を水で１０ｍｌとし、５０℃で反応を行った。経時的に一定量を採り、高速液体クロマトグラフィーにより各サイクロデキストリン量を測定した。得られた結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
尚、表中でＣＤはサイクロデキストリンを表す。表１から明らかなように、本酵素は、試験したｐＨ７〜１０の広いｐＨ域でサイクロデキストリンを効率的に生成し、特に、ｐＨ９以上の反応ではα−ＣＤの生成が抑制され、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンが主体に生産された。
【００３１】
実施例３
本実施例においては、本発明のＣＧＴａｓｅの洗剤溶液中での安定性について試験した。
【００３２】
０．４Ｍ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液１．０ｍｌ、実施例１及び２に従い調製したＣＧＴａｓｅ ０．３ｍｌ（３８１単位）、使用規格２倍濃度の液体洗剤〔ライオン（株）製：商品名ママローヤル、界面活性剤（α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテルなど）３０％含有〕３ｍｌを加え、水で全量６．０ｍｌ（界面活性剤濃度４５０ｐｐｍ）とし、ｐＨ５．０、７．０と１０に調製し、３５℃で放置した。経時的に一定量を採取し、残存活性を測定した。得られた結果を図５に示す。
【００３３】
図中で−○−はｐＨ１０の場合を示し、−□−はｐＨ５の場合を示し、そして−●−はｐＨ７の場合を示している。
【００３４】
図から明らかなように、本酵素は、界面活性剤に対して安定であり、接触１４０時間後も５０％以上の活性を保持した。そして、本酵素はｐＨ５及びｐＨ７よりもｐＨ１０においてより安定であった。
【００３５】
実施例４
本実施例においては、食器に付着した澱粉質の汚れを想定して、洗剤に含まれるＣＧＴａｓｅによる澱粉質汚れの除去試験を行った。
【００３６】
ガラス版に糊化もち米澱粉（約３０ｍｇ）を塗布し、乾燥したものを、種々の濃度のＣＧＴａｓｅを含む、実施例４で使用した液体洗剤に入れ、ｐＨ１０とｐＨ１１、及び４０℃と５０℃で浸漬した。１５分後、各上澄を採取し、ｐＨを５．０に調製して後、１００倍に希釈した市販（ノボ社製造販売）のバチルス属α−アミラーゼ（ターマミル ６Ｌ）とアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ各０．０５ｍｌを加え、６０℃で、１５分反応した。そして、生成した還元糖をソモギー・ネルソン法により定量した。得られた結果を図６及び図７に示す。
【００３７】
図６はｐＨ１０で処理した場合を示し、図７はｐＨ１１で処理した場合を示している。横軸の酵素量は本発明のＣＧＴａｓｅの存在量（×２５単位）を示し、縦軸は澱粉が分解されて可溶化された量の相対値（％）を示している。
図中で−●−は５０℃の場合を、−○−は４０℃の場合を示している。いずれの場合も、洗剤に含まれるＣＧＴａｓｅにより澱粉が分解可溶化（デキストリン化）された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明はバチルス属細菌が生産し、ｐＨ９以上において、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンを生成するＣＧＴａｓｅに関する。該酵素はアルカリで安定であり洗浄剤成分として有効に利用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＣＧＴａｓｅの最適ｐＨを示す。図中で−●−酢酸緩衝液を使用した場合を示し、−○−はリン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４又はＮａＯＨ−Ｎａ２ＨＰＯ４）を使用した場合を示す。
【図２】本発明のＣＧＴａｓｅの最適温度を示す。
【図３】本発明のＣＧＴａｓｅのｐＨ安定性を示す。図中で−●−は酢酸緩衝液、−○−はリン酸緩衝液を使用した場合を示す。
【図４】本発明のＣＧＴａｓｅの温度安定性を示している。図中で−○−はカルシウムイオンが存在しない場合を示し、−●−は５ｍＭのＣａＣｌ２が存在する場合を示す。
【図５】本発明のＣＧＴａｓｅの洗剤中でのｐＨ安定性を示す。図中で−○−はｐＨ１０の場合を示し、−□−はｐＨ５の場合を示し、そして−●−はｐＨ７の場合を示す。
【図６】洗剤に添加された本発明のＣＧＴａｓｅによる澱粉質汚れのｐＨ１０で処理した場合の分解可溶化作用を示す。図中で−●−は５０℃の場合を示し、−○−は４０℃の場合を示す。
【図７】洗剤に添加された本発明のＣＧＴａｓｅによる澱粉質汚れのｐＨ１１で処理した場合の分解可溶化作用を示す。図中で−●−は５０℃の場合を示し、−○−は４０℃の場合を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９、以下ＣＧＴａｓｅという）、その製造法に関する。更に詳しくは、ＣＧＴａｓｅ生産能を有するバチルス属に属する菌を培養し、培養物中に耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを産生せしめ、これを採取するＣＧＴａｓｅの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイクロデキストリンはグルコースが６、７又は８個などからなる環状オリゴ糖の総称であり、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のバチルス属細菌、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等の細菌などの生産するＣＧＴａｓｅにより澱粉から生産される。又、ある種の好アルカリ性菌、例えば、好アルカリ性バチルス Ｎｏ．３８−２は、ｐＨ５．５とｐＨ８．５に最適ｐＨをもつＣＧＴａｓｅを生産し、澱粉からβ−サイクロデキストリンを生産する。これらの微生物の生産するＣＧＴａｓｅについては、例えば、発酵と工業 ３６（３） １７６−１８３ （１９７８）， 醸造 ８０（７） ４３４−４４０ （１９８５），（株）学会出版センター発行「好アルカリ性微生物」 １０１−１１０ （１９８２）等に詳しくまとめられている。
【０００３】
上記の各種ＣＧＴａｓｅを澱粉に作用させて生成したサイクロデキストリンは各種の有機化合物を包蔵し、不安定物質の安定化、芳香の保持、悪臭物質の消臭、苦みの除去、乳化促進、起泡性改善等の作用が知られ、医薬、食品分野に使用されている。例えば、サイクロデキストリンを洗浄剤に配合し、その起泡性を改善したり（特開昭６３−６８５２０、特開平２−３４６９３、特開平３−１７２３９７）、香料の持続効果を図ったり（特開平１−１８５３９９）する方法が知られている。
【０００４】
【課題が解決しようとする課題】
本発明の目的は、より耐アルカリ性で、かつ効率的にサイクロデキストリンを生成するＣＧＴａｓｅを生産する微生物を、広く自然界に求めてスクリーニングして見いだすことであり、当該菌株から得られる耐アルカリ性のＣＧＴａｓｅは洗浄剤などの用途に新たな道を開くものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は広く自然界に耐アルカリ性のＣＧＴａｓｅ生産菌を求めた結果、土壌より分離したバチルス・エスピーＹＴ−１株の生産するＣＧＴａｓｅが、最適ｐＨは６付近にあるが、ｐＨ５−１２の広いｐＨ域で安定で、ｐＨ４〜１２の広いｐＨ域でサイクロデキストリンを合成する性質を有し、特に、ｐＨ５〜１０においても、至適ｐＨの活性の９０％以上の活性を有する耐アルカリ性の性質を有し、更にｐＨ９以上ではα−サイクロデキストリンの生成は抑制され、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンを主成分として生産することを認めた。
【０００６】
このように、本酵素が、ｐＨ９以上のアルカリ性下で、澱粉質から生産するサイクロデキストリンは、空洞の大きいβ−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンが主成分となるため、このＣＧＴａｓｅを洗剤とともに使用すれば、食器等の澱粉質等の汚れの分解除去の他に、生成したサイクロデキストリンの消臭などのマスキング効果も顕著に発揮され、又、起泡性の改善と汚れの乳化促進などによる洗滌効果向上等、洗剤成分として極めて有用であることを認めた。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
本発明において例示菌として使用されるバチルス・エスピーＹＴ−１株は、以上の目的のために、自然界から分離した多数の微生物の中から選び出されたものである。バチルス・エスピーＹＴ−１の菌学的性質は下記の通りである。なお本菌は工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３８７７として寄託されている。
【０００８】
（１） 形態：桿菌（幅０．８〜１．０μｍ、長さ３．０〜４．０μｍ）
（２） 胞子：卵形で菌体を膨張させる。径０．９〜１．２μｍ、菌端または中央に形成する。
（３） グラム染色：陰性
（４） 運動性：＋
（５） オキシダーゼ：＋
（６） カタラーゼ反応：＋
（７） インドール：−
（８） ＶＰ：−
（９） ＶＰ培地におけるｐＨ：７．８
（１０） リトマスミルク反応：−
（１１） メチレンブルー還元：−
（１２） チロシン分解：−
（１３） 食塩（５，７，１０％）生育：−
（１４） 尿素の分解：−
（１５） クエン酸塩利用（ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：−
（１６） ＯＦ反応：−
（１７） 酸素に対する態度：好気性
（１８） ブドウ糖の分解：−
（１９） エスクリンの分解：＋
（２０） 硝酸塩還元：±
（２１） マッコンキー生育：−
（２２） 澱粉の分解：＋
（２３） ゼラチン：＋
（２４） ツイン８０：−
（２５） ＤＮａｓｅ：＋
（２６） フェニルアラニン：−
（２７） エッグヨーク：−
（２８） カゼイン：＋（但し１８日）
（２９） 生育温度（℃）：１０〜４１（最適３２〜３６）
（３０） 生育ｐＨ：７．２〜１１．５（最適８．０〜９．０）
（３１） 食塩生育（％）：０〜１
（３２） 栄養要求：
ビオチン ±
ナイアシン −
サイアミン −
葉酸 −
トリプトファン −
（３３） 糖から酸の産生（フェノールレッド半流動培地−２１日）：
マンニット ＋
サッカロース −
キシロース −
ソルビット −
サリシン ＋
アラビノース −
グリセリン −
ダルシット −
グルコース −
マルトース −
マンノース −
ラクトース −
【０００９】
以上の菌学的性質について、
▲１▼ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． ２（１９８６）， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｕ．Ｓ．Ａ、
▲２▼ Ｎ． Ｒ． Ｓｍｉｔｈ， Ｒ． Ｅ． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｆ． Ｅ． Ｃｌａｒｋ（１９５２）Ａｅｒｏｂｉｃ Ｓｐｏｒｅｆｏｒｍｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ． Ａｇｒ． Ｍｏｎｏｇｒａｇｈ、
▲３▼ Ｒ． Ｅ． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｗ． Ｃ． Ｈａｙｎｅｓ， Ｃ． Ｈ． Ｐａｎｇ．（１９７３）Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ． Ａｇｒ． Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ．４２７ Ｕｎｉｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ． Ｃ．
等を参照して同定した。本菌は２％食塩に生育せず、その他の性状においても極めてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓに類似するが、澱粉を分解し、チロシンを分解しないことから当該菌と同定できなかった。もちろん糖の資化性等からＢａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ等に相当しないことより、本菌をバチルス・エスピーＹＴ−１と命名した。
【００１０】
本菌の生産するＣＧＴａｓｅの酵素的性質の概要を以下に示す。
（ａ） 作用及び基質特異性：澱粉を分解してα−、β−及びγ−サイクロデキストリン合成する。これらサイクロデキストリンの生成比は、ｐＨ７〜８において、通常、２０〜３０：６０〜７０：１０〜１５の割合で生成するが、ｐＨ９以上においては、α−サイクロデキストリンの生成が抑制され、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンを主成分として生産し、その生成比は、通常、０〜３：８０〜８５：１０〜２０である。
【００１１】
（ｂ） 作用ｐＨ及び最適ｐＨ：作用ｐＨが４〜１２であり、１％可溶性澱粉、１０ｍＭ酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液の下で、４０℃で３０分測定した場合の最適ｐＨは６〜７であり、かつｐＨ５〜１０において、最高活性の９０％以上の活性を示す（図１に示す。）。
【００１２】
（ｃ） 作用温度及び最適温度：作用温度の上限が８０℃であり、かつ１％可溶性澱粉、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０）下で１０分間反応させたときの最適温度は６５℃にある（図２に示す。）。
【００１３】
（ｄ） ｐＨ安定性：１０ｍＭ酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液の下、２５℃で３時間処理したとき、ｐＨ５〜１０において安定である（図３に示す。）。
【００１４】
（ｅ） 熱安定性：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０）の下で１０分間加熱する場合、５０℃まで安定であるが、６０℃で８０％失活する。５ｍＭのカルジウムイオンの存在下では６０℃で１０分間加熱しても９０％以上残存する（図４に示す。）。
【００１５】
（ｆ） 分子量：アクリルアミド電気泳動法により求めた分子量が４３，０００である。
【００１６】
（ｇ） 安定化：Ｃａ２＋の存在下で熱安定化される。
【００１７】
（ｈ） 阻害剤：Ｈｇ２＋、Ａｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋等の存在下により活性が阻害される。
【００１８】
（ｉ） 精製法：培養上澄から、６０％硫安沈殿、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィーとセファデックスゲル濾過クロマトグラフィーにより、電気泳動的に均一まで精製することができる。
【００１９】
（ｊ） 活性測定法：２％可溶性澱粉を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１１．０）０．２ｍｌに、適量の酵素液を加え、全量を水で０．４ｍｌとし、５０℃で１０分間反応させた。反応後、ヨウ素−ヨウ化カリウム−ＨＣｌ溶液［（Ｉ２ ０．００５ｇ ； ＫＩ ０．０５ｇ ； ０．１Ｍ ＨＣｌ １０ｍｌ）に水を加えて、全量１００ｍｌとしたもの］を２ｍｌ加え、室温で１５分間放置後、６６０ｎｍで比色する。この条件で、１分間に青色の１％を減少させる酵素量を１単位とする。
【００２０】
これまで、サイクロデキストリンを生成する多くの微生物が発見されてきた。生成されるサイクロデキストリンの種類は、微生物の種類により異なり、例えば、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｍｓ）の酵素は比較的α−サイクロデキストリンを多く生産する（α：β：γ＝１３．３：２．３：１）。そして、ある種の細菌、例えば、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）は比較的β−サイクロデキストリンを多く生産する（α：β：γ＝１．０：７．０：１．０）。又、好アルカリ性細菌が生産する、例えば、バチルス Ｎｏ．３８−２株のＣＧＴａｓｅは、最適ｐＨが５．５とｐＨ８．５にあり、β−サイクロデキストリンを生産する〔発酵と工業 ３７（２） １５０−１６１ （１９７９）〕。
【００２１】
然るに、本発明において例示菌として使用するバチルス・エスピーＹＴ−１株の生産するＣＧＴａｓｅは、ｐＨ５〜１０の広いｐＨ域で安定であるが、最適ｐＨが６〜７にあり、ｐＨ６〜８で反応したとき、通常、α−サイクロデキストリンを２０〜３０％、β−サイクロデキストリンを６０〜７０％、そして、γ−サイクロデキストリンを１０〜１５％の割合で生成する。一方、ｐＨ９以上で反応したときは、α−サイクロデキストリンの生成が抑制され、空洞の大きいβ−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンが主成分として生産される。その割合は、α−サイクロデキストリンが０〜３％、β−サイクロデキストリンが８０〜８５％そして、γ−サイクロデキストリンが１０〜２０％である（表１を参照）。しかし、最高収量は、ほぼ同じ５０〜６０％である。
【００２２】
本菌を培養して本発明のＣＧＴａｓｅを生産するには、窒素源として、大豆粕、コーン・スティープ・リカー、肉エキス、ペプトン、ミルクカゼイン、酵母エキスなどの有機窒素源が使用される。中でも、大豆タンパク、大豆粕（脱脂大豆）、コーン・ルティーブ・リカーなどは良好な窒素源である。この他、必要に応じ、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が使用される。炭素源としては、通常、澱粉又は液化澱粉、可溶性澱粉、デキストリンなどの澱粉派生物が使用される。
【００２３】
以上の窒素源と炭素源の他に、リン酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などが補足原料として使用される。特に、リン酸塩、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどの添加は効果があり、リン酸塩として、例えば、Ｋ２ＨＰＯ４は０．０５〜０．３％、マグネシウム塩として、例えば、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは０．０１〜０．３％、カルシウム塩として、例えば、ＣａＣｌ２は０．０１〜０．１％程度添加される。ＣＧＴａｓｅは菌体外に生産されるので、培養後、濾過又は遠心分離により、除菌し、酵素を回収する。
【００２４】
ＣＧＴａｓｅの高アルカリ性下の洗剤中での耐性試験は、市販の洗剤、例えば、ライオン社製ママローヤル（商品名：界面活性剤を３０％含有）を使用し、界面活性剤として例えば４５０ｐｐｍを含むｐＨ１０又はｐＨ１１の溶液中で、４０℃又は５０℃で試験した。
以下、実施例により本発明の内容を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これら実施例に限定されるものでない。
【００２５】
【実施例】
実施例１
コーン・スティープ・リカー ２％（固形分として）、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２％、ＣａＣｌ２ １×１０−３Ｍからなる培地２００ｍｌを１リットル容三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分殺菌後、バチルス・エスピーＹＴ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８７７）を接種し、３０℃で２２５回転／分で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離して得た上澄液のＣＧＴａｓｅ活性は、１８４単位／ｍｌ培地であった。
【００２６】
培養上澄に、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように加え、生成した沈殿を回収後、透析して後、２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で緩衝化させたＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６８カラムに供給し、ＫＣｌ濃度を０〜１Ｍまでリニヤーに変えて溶出した。ＣＧＴａｓｅ区分を回収し、濃縮、透析後、次いで、セファデックスＧ−１５０カラムでゲル濾過を行った。得られた精製酵素は２９６０単位／Ａ２８０であり、電気泳動的に均一であった。
【００２７】
実施例２
実施例２と同様にし、培養して得られた上澄液２００ｍｌに硫安を６０％飽和になるよう加えて沈殿物を得、水で透析した酵素液を用い、澱粉からのサイクロデキストリンの生産試験を行った。
【００２８】
ポテト澱粉１００ｍｇ、０．４ Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７〜１０）１．３ｍｌ、０．１Ｍ ＣａＣｌ２ ０．５ｍｌ、ＣＧＴａｓｅ １．２５単位、全量を水で１０ｍｌとし、５０℃で反応を行った。経時的に一定量を採り、高速液体クロマトグラフィーにより各サイクロデキストリン量を測定した。得られた結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
尚、表中でＣＤはサイクロデキストリンを表す。表１から明らかなように、本酵素は、試験したｐＨ７〜１０の広いｐＨ域でサイクロデキストリンを効率的に生成し、特に、ｐＨ９以上の反応ではα−ＣＤの生成が抑制され、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンが主体に生産された。
【００３１】
実施例３
本実施例においては、本発明のＣＧＴａｓｅの洗剤溶液中での安定性について試験した。
【００３２】
０．４Ｍ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液１．０ｍｌ、実施例１及び２に従い調製したＣＧＴａｓｅ ０．３ｍｌ（３８１単位）、使用規格２倍濃度の液体洗剤〔ライオン（株）製：商品名ママローヤル、界面活性剤（α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテルなど）３０％含有〕３ｍｌを加え、水で全量６．０ｍｌ（界面活性剤濃度４５０ｐｐｍ）とし、ｐＨ５．０、７．０と１０に調製し、３５℃で放置した。経時的に一定量を採取し、残存活性を測定した。得られた結果を図５に示す。
【００３３】
図中で−○−はｐＨ１０の場合を示し、−□−はｐＨ５の場合を示し、そして−●−はｐＨ７の場合を示している。
【００３４】
図から明らかなように、本酵素は、界面活性剤に対して安定であり、接触１４０時間後も５０％以上の活性を保持した。そして、本酵素はｐＨ５及びｐＨ７よりもｐＨ１０においてより安定であった。
【００３５】
実施例４
本実施例においては、食器に付着した澱粉質の汚れを想定して、洗剤に含まれるＣＧＴａｓｅによる澱粉質汚れの除去試験を行った。
【００３６】
ガラス版に糊化もち米澱粉（約３０ｍｇ）を塗布し、乾燥したものを、種々の濃度のＣＧＴａｓｅを含む、実施例４で使用した液体洗剤に入れ、ｐＨ１０とｐＨ１１、及び４０℃と５０℃で浸漬した。１５分後、各上澄を採取し、ｐＨを５．０に調製して後、１００倍に希釈した市販（ノボ社製造販売）のバチルス属α−アミラーゼ（ターマミル ６Ｌ）とアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ各０．０５ｍｌを加え、６０℃で、１５分反応した。そして、生成した還元糖をソモギー・ネルソン法により定量した。得られた結果を図６及び図７に示す。
【００３７】
図６はｐＨ１０で処理した場合を示し、図７はｐＨ１１で処理した場合を示している。横軸の酵素量は本発明のＣＧＴａｓｅの存在量（×２５単位）を示し、縦軸は澱粉が分解されて可溶化された量の相対値（％）を示している。
図中で−●−は５０℃の場合を、−○−は４０℃の場合を示している。いずれの場合も、洗剤に含まれるＣＧＴａｓｅにより澱粉が分解可溶化（デキストリン化）された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明はバチルス属細菌が生産し、ｐＨ９以上において、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキストリンを生成するＣＧＴａｓｅに関する。該酵素はアルカリで安定であり洗浄剤成分として有効に利用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＣＧＴａｓｅの最適ｐＨを示す。図中で−●−酢酸緩衝液を使用した場合を示し、−○−はリン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４又はＮａＯＨ−Ｎａ２ＨＰＯ４）を使用した場合を示す。
【図２】本発明のＣＧＴａｓｅの最適温度を示す。
【図３】本発明のＣＧＴａｓｅのｐＨ安定性を示す。図中で−●−は酢酸緩衝液、−○−はリン酸緩衝液を使用した場合を示す。
【図４】本発明のＣＧＴａｓｅの温度安定性を示している。図中で−○−はカルシウムイオンが存在しない場合を示し、−●−は５ｍＭのＣａＣｌ２が存在する場合を示す。
【図５】本発明のＣＧＴａｓｅの洗剤中でのｐＨ安定性を示す。図中で−○−はｐＨ１０の場合を示し、−□−はｐＨ５の場合を示し、そして−●−はｐＨ７の場合を示す。
【図６】洗剤に添加された本発明のＣＧＴａｓｅによる澱粉質汚れのｐＨ１０で処理した場合の分解可溶化作用を示す。図中で−●−は５０℃の場合を示し、−○−は４０℃の場合を示す。
【図７】洗剤に添加された本発明のＣＧＴａｓｅによる澱粉質汚れのｐＨ１１で処理した場合の分解可溶化作用を示す。図中で−●−は５０℃の場合を示し、−○−は４０℃の場合を示す。
Claims (3)
- 少なくとも以下の理化学的性質を持つサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ。
ａ）作用：澱粉を分解してα−、β−及びγ−サイクロデキストリンを合成する。
ｂ）至適pH：pH６付近（１%可溶性澱粉、10mM酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液、40℃,30分）
ｃ）作用 pH の範囲： pH ４〜１２であり、かつ pH ５〜１０において至適活性の９０％以上の活性を有する。
ｄ）至適温度：６５℃付近[1%可溶性澱粉、10mM リン酸緩衝液(pH10)、10分]
ｅ）熱安定性：５０℃までは安定であるが、６０℃で８０％失活する。 (10mM リン酸緩衝液 (pH10) の下で、 10 分間加熱処理 )
ｆ）pH安定性：pH５〜１０(10mM酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液、25℃,３時間)
ｇ）分子量：約４３,０００（アクリルアミド電気泳動法）
ｈ）阻害剤：Hg2+、Ag+、Cu2+、Ni2+、Fe2+により阻害される。 - バチルスに属し、少なくとも以下の理化学的性質を持つサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物中にサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを産生せしめ、これを採取することを特徴とするサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造法。
ａ）作用：澱粉を分解してα−、β−及びγ−サイクロデキストリンを合成する。
ｂ）至適pH：pH６付近（１%可溶性澱粉、10mM酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液、40℃,30分）
ｃ）作用pHの範囲：pH４〜１２であり、かつ pH ５〜１０において至適活性の９０％以上の活性を有する。
ｄ）至適温度：６５℃付近[1%可溶性澱粉、10mM リン酸緩衝液(pH10)、10分]
ｅ）熱安定性：５０℃までは安定であるが、６０℃で８０％失活する。 (10mM リン酸緩衝液 (pH10) の下で、 10 分間加熱処理 )
ｆ）pH安定性：pH５〜１０(10mM酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液、25℃,３時間)
ｇ）分子量：約４３,０００（アクリルアミド電気泳動法）
ｈ）阻害剤：Hg2+、Ag+、Cu2+、Ni2+、Fe2+により阻害される。 - 微生物がバチルス・：エスピーＹＴ−１(FERM P-13877)である請求項２記載のサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造法。
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