CN112690290A - 一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法,涉及植物生长促进剂制备的技术领域,包括:①将此植物根际促生菌剂接种至NB培养基,培养后作为一级种子发酵液并存放于种子罐中;②将种子罐中的发酵液抽取至二级发酵罐进行二级培养;③将二级发酵罐中的发酵液抽取至三级发酵罐进行三级培养;④在三级培养期间,定期抽样检测菌数活性、转孢情况、pH值以及伊枯草菌素浓度等参数,直至伊枯草菌素达到300ppm、转孢率在80%以上、草芽孢杆菌营养细胞浓度达到10^9 cfu/ml以上即停止发酵;⑤将菌液进行喷雾干燥,干燥后进行包装。本发明中的枯草芽孢杆菌植物根际促生菌剂具有取材广泛、易于培养的特点,其可促进植物生长、释放土壤养分及提高肥料吸收率。

Description

一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法
技术领域
本发明涉及植物生长促进剂制备的技术领域,具体涉及一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法。
背景技术
磷素在植物营养中扮演重要的角色,参与许多植物的生化反应,在酵素代谢的磷酸化反应、遗传上、细胞分生及分裂组织发育上都扮演不可或缺的重要角色,是植物生长所需的巨量元素之一。然而磷在土壤里移动能力低,容易被钙、铁、铝等元素结合成无机态,进而被固定在土壤中,无法被植物吸收。土壤中无机态磷越高,植物利用率越低,一般磷肥施用到地里后,其被吸收率也仅有10-20%。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种病原真菌,能够广泛对多种作物造成危害,茄链格孢菌(Alternaria solani)也是一种致病性真菌,能够广泛对茄科及十字花科及叶菜造成危害,为农业生产和贮运农产品带来造成重大损失,这些病害每年造成农业损失高达数十亿美元。以往这些病害是使用传统化学农药来进行杀菌抑制,然而随着病菌的耐药性越来越强,过量使用传统农药对环境以及农产品进入食物链后的人体健康造成的危害也越来越明显。
此外,近年来由于气候异常,因此植物对于极端气候环境的胁迫性影响越来越重要。
植物根际周围中有一类重要的微生物菌群,叫做植物根际促生菌(Plant GrowthPromoting Rhizobacteria,简称PGPR),PGPR是一群定植于植物根际、与植物根系密切相关的根际细菌,能够与根际微生物结合而形成了一种共生的状态,能够增加植株根系的吸收面积,进而促进植物生长及其对养分的吸收和利用、抑制植物有害的微生物及调节促进植物生长等。同时,植物根际促生菌能够产生多种有机酸,将无机态磷给溶解出,使其成为有机态,释出磷酸根给予植物吸收。此外,植物根际促生菌可以提高植物的抗非生物胁迫力,提高植物抗逆境性,如耐温、耐寒、抗涝等特性,减少因为气候异常影响所造成的损失。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种,在自然环境中分布极广,也是目前已鉴定出的其中一类主要PGPR菌种。它能够分泌吲哚乙酸、吲哚丁酸等物质调节促进植物生长,还具有高溶磷活性,能够促进释放土壤养分,还能分泌伊枯草菌素,抑制多种植物有害菌,是一种多功能的微生物菌株。因此,掌握这种植物根际促生菌剂的制备显得极为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法,以解决现有技术中导致的上述缺陷。
一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:将此植物根际促生菌剂接种至含10-20克的NB培养基,pH值控制在7.4±0.2,经液态摇瓶培养20-36小时,直至每毫升枯草芽孢杆菌营养细胞浓度达到10^8 cfu/ml以上,作为一级种子发酵液并存放于种子罐中,维持罐压0.03-0.05MPa;
步骤二:二级发酵培养:以接种量5-10%的体积量,将种子罐中的发酵液抽取至二级发酵罐进行二级培养,培养基中含有葡萄糖2%、糖蜜0.5%、酵母抽出物0.3 %、蛋白胨0.5%、豆粉3%以及磷酸二氢钾0.1%,培养液量为罐体体积的65%,发酵培养时通入无菌空气,通气量控制在1:0.3-1.0vvm,转速控制在150-200 rpm,pH值控制在6.5-7.5,维持罐压0.03-0.05MPa,温度控制在30-37℃,培养48-72小时;
步骤三:三级发酵培养:以接种量5-10%的体积量,将二级发酵罐中的发酵液抽取至三级发酵罐进行三级培养,培养基中含有葡萄糖0.5%、蔗糖1%、麦芽糊精1%、大豆蛋白2%、磷酸二氢钾0.3%以及硫酸镁0.3%,并将初始pH值控制在6.5,发酵培养时通入无菌空气,通气量控制在1:1.0-2.0 vvm,转速控制在300-500rpm,pH值控制在6.0以上,维持罐压0.03-0.05MPa温度控制在30-37℃;
步骤四:在三级培养期间,定期抽样检测菌数活性、转孢情况、pH值以及伊枯草菌素浓度等参数,直至伊枯草菌素达到300ppm、转孢率在80%以上、草芽孢杆菌营养细胞浓度达到10^9 cfu/ml以上即停止发酵;
步骤五:将菌液进行喷雾干燥,干燥完成后,包装成成品,完成制备。
优选的,在喷雾干燥前先添加30%的海藻糖、蔗糖、玉米淀粉复合型喷雾干燥保护剂。
优选的,在使用时以成品的0.2%兑水,在定植前后、植物生长期间或病害发生初期,通过灌根、叶面喷洒或者与栽培基质混合等方式施用。
本发明的优点:本发明中的植物根际促生菌剂是以枯草芽孢杆菌株经液态培养发酵,确认每毫升发酵液营养细胞浓度至10^9 cfu/ml以上,次生代谢物伊枯草菌素浓度高于300ppm,转孢率在80%以上,后以喷雾干燥方式,搜集菌体及其代谢物,制成植物根际促生菌剂,使用到地里,可以调节促进植物生长、启发植物抗病性、抑制土壤有害菌、释放土壤养分及提高肥料吸收率。此外,本申请所筛选出的植物根际促生菌株,其溶磷活性可高达2552.6µg g-1 day-1,能够大幅提升磷肥的利用率,解决磷肥利用率不佳的问题,同时,具有抑制植株病菌生长,调节植物免疫抗体的能力,启发植物非生物胁迫能力,在减少植物病菌所造成的危害同时,能够维护自然生态平衡,是一种极具潜力的多功能植物调节菌株。
附图说明
图1为在盐分逆境下的植物促生菌对植物根系的促生作用照片。
图2为在高温逆境下的植物促生菌对植物根系的促生作用照片。
图3为植物促生菌对植物侧根数的促进作用照片。
图4为植物促生菌的溶磷活性照片。
图5为植物促生菌于PDA+P的平板培养基上对尖孢镰刀菌的拮抗效果照片,A为实验组 B为控制组。
图6为植物促生菌于PDA+P的平板培养基上对茄链格孢菌的拮抗效果照片,A为实验组 B为控制组。
图7为枯草芽孢杆菌菌落生长形态照片。
图8为枯草芽孢杆菌的显微照片。
图9为枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列截图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。
如图1至图9所示,一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:将此植物根际促生菌剂接种至含10-20克的NB培养基,pH值控制在7.4±0.2,经液态摇瓶培养20-36小时,直至每毫升枯草芽孢杆菌营养细胞浓度达到10^8 cfu/ml以上,作为一级种子发酵液并存放于种子罐中,维持罐压0.03-0.05MPa;
步骤二:二级发酵培养:以接种量5-10%的体积量,将种子罐中的发酵液抽取至二级发酵罐进行二级培养,培养基中含有葡萄糖2%、糖蜜0.5%、酵母抽出物0.3 %、蛋白胨0.5%、豆粉3%以及磷酸二氢钾0.1%,培养液量为罐体体积的65%,发酵培养时通入无菌空气,通气量控制在1:0.3-1.0vvm,转速控制在150-200 rpm,pH值控制在6.5-7.5,维持罐压0.03-0.05MPa,温度控制在30-37℃,培养48-72小时;
步骤三:三级发酵培养:以接种量5-10%的体积量,将二级发酵罐中的发酵液抽取至三级发酵罐进行三级培养,培养基中含有葡萄糖0.5%、蔗糖1%、麦芽糊精1%、大豆蛋白2%、磷酸二氢钾0.3%以及硫酸镁0.3%,并将初始pH值控制在6.5,发酵培养时通入无菌空气,通气量控制在1:1.0-2.0 vvm,转速控制在300-500rpm,pH值控制在6.0以上,维持罐压0.03-0.05MPa温度控制在30-37℃;
步骤四:在三级培养期间,定期抽样检测菌数活性、转孢情况、pH值以及伊枯草菌素浓度等参数,直至伊枯草菌素达到300ppm、转孢率在80%以上、草芽孢杆菌营养细胞浓度达到10^9 cfu/ml以上即停止发酵;
步骤五:将菌液进行喷雾干燥,干燥完成后,包装成成品,完成制备。
在本实施例中,在喷雾干燥前先添加30%的海藻糖、蔗糖、玉米淀粉复合型喷雾干燥保护剂,以提高菌种在高温喷雾环境下的存活率。
在本实施例中,在使用时以成品的0.2%兑水,在定植前后、植物生长期间或病害发生初期,通过灌根、叶面喷洒或者与栽培基质混合等方式施用,能够促进调节植物生长、启发植物非生物胁迫以及免疫抗病力,强化植株生长势。
在本实施例中,这种植物根际促生菌剂是以枯草芽孢杆菌株经液态培养发酵,确认每毫升发酵液营养细胞浓度至10^9 cfu/ml以上,次生代谢物伊枯草菌素浓度高于300ppm,转孢率在80%以上,后以喷雾干燥方式,搜集菌体及其代谢物,制成植物根际促生菌剂,使用到地里,可以调节促进植物生长、启发植物抗病性、抑制土壤有害菌、释放土壤养分及提高肥料吸收率。此外,本申请所筛选出的植物根际促生菌株,其溶磷活性可高达2552.6µg g-1 day-1,能够大幅提升磷肥的利用率,解决磷肥利用率不佳的问题,同时,具有抑制植株病菌生长,调节植物免疫抗体的能力,启发植物非生物胁迫能力,在减少植物病菌所造成的危害同时,能够维护自然生态平衡,是一种极具潜力的多功能植物调节菌株。
因此,上述公开的实施方案,就各方面而言,都只是举例说明,并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:将此植物根际促生菌剂接种至含10-20克的NB培养基,pH值控制在7.4±0.2,经液态摇瓶培养20-36小时,直至每毫升枯草芽孢杆菌营养细胞浓度达到10^8 cfu/ml以上,作为一级种子发酵液并存放于种子罐中,维持罐压0.03-0.05MPa;
步骤二:二级发酵培养:以接种量5-10%的体积量,将种子罐中的发酵液抽取至二级发酵罐进行二级培养,培养基中含有葡萄糖2%、糖蜜0.5%、酵母抽出物0.3 %、蛋白胨0.5%、豆粉3%以及磷酸二氢钾0.1%,培养液量为罐体体积的65%,发酵培养时通入无菌空气,通气量控制在1:0.3-1.0vvm,转速控制在150-200 rpm,pH值控制在6.5-7.5,维持罐压0.03-0.05MPa,温度控制在30-37℃,培养48-72小时;
步骤三:三级发酵培养:以接种量5-10%的体积量,将二级发酵罐中的发酵液抽取至三级发酵罐进行三级培养,培养基中含有葡萄糖0.5%、蔗糖1%、麦芽糊精1%、大豆蛋白2% 、磷酸二氢钾0.3%以及硫酸镁0.3%,并将初始pH值控制在6.5,发酵培养时通入无菌空气,通气量控制在1:1.0-2.0 vvm,转速控制在300-500rpm,pH值控制在6.0以上,维持罐压0.03-0.05MPa温度控制在30-37℃;
步骤四:在三级培养期间,定期抽样检测菌数活性、转孢情况、pH值以及伊枯草菌素浓度等参数,直至伊枯草菌素达到300ppm、转孢率在80%以上、草芽孢杆菌营养细胞浓度达到10^9 cfu/ml以上即停止发酵;
步骤五:将菌液进行喷雾干燥,干燥完成后,包装成成品,完成制备。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的制备方法,其特征在于:在喷雾干燥前先添加30%的海藻糖、蔗糖、玉米淀粉复合型喷雾干燥保护剂。
3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌植物生长促进剂的使用方法,其特征在于:在使用时以成品的0.2%兑水,在定植前后、植物生长期间或病害发生初期,通过灌根、叶面喷洒或者与栽培基质混合等方式施用。
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