CN109136144B

CN109136144B - 一种人参专用复合生物菌剂及生产制备方法

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Publication number: CN109136144B
Application number: CN201811056283.6A
Authority: CN
Inventors: 丁健
Original assignee: Tonghua Medicine High Tech Zone Nvzbe Biological Technology Co ltd
Current assignee: Tonghua Medicine High Tech Zone Nvzbe Biological Technology Co ltd
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2038-09-11
Also published as: CN109136144A

Abstract

一种人参专用复合生物菌剂及制备方法属于生物菌剂技术领域，采用A菌、B菌、C菌等三种复合有益菌群组成，菌种经过种子液培养，发酵培养之后混合得到菌剂。该菌剂不仅促进植物根系发达，生长枝繁叶茂，并且通过有益微生物的天然抗菌性和抗病性来保护植物免受病菌的侵害、增强植物的抗逆性，减少病虫害。因而可减少化学肥料与农药的使用和残留，能有效的修复环境、改良土壤、提高产量和增加品质。

Description

一种人参专用复合生物菌剂及生产制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物菌剂，即去除与预防人参红锈病复合生物菌剂。

背景技术

人参为五加科，属多年生草本植物，喜阴凉、湿润的气候，是名贵中药材。长期应用化肥与农药，导致土壤板结，通透性减弱，容易引发植物的多种病害。造成人参减产，已引起人们的广泛重视，尽管化学农药在防病有一定的效果，但长期使用不仅能使作物产生耐药性，而且还留有残留污染。生态环境日益恶化。

人参是极其珍贵的中药材，人参一直被称之百草之王，长白山人参是人参王国里的珍品。

近年来，由于在人参的种植及管理过程中长期不合理、不科学的使用农药与化肥，农残、重金属含量超标。人参品质下降，尤其是一些病害已经成为几乎成为普遍现象。人参红锈病是困扰广大人参种植户的顽症，红锈病不仅仅人参品相不好，有效成分含量下降，人参的营养成分与医学作用也减少许多。

红锈病的普遍性，促使广大参农及人参种植户努力寻求解决这一顽症的一切手段与方法，化学农药对人参地上部分的人参茎叶有一定的作用，对抑制红锈病几乎是无效，并且随着国家对高残留、高毒农药的限制使用及人们健康意识的逐渐加强，用化学方法解决红锈病已经走到尽头。

CN102701880A中公开了营养型参根防锈剂，取钙镁磷肥1.0～3.0重量份、碳酸氢钠2.0～5.0重量份、硼砂0.2～0.6重量份、碱式硫酸铜0.2～0.6重量份、硅酸钙2.0～4.0重量份、硅藻土1.0～3.0重量份、凹凸棒粘土粉5.0～10.0 重量份和水60.0～100.0重量份，制成蘸根剂。栽参前，将参苗全部根体放入蘸根剂中浸蘸10～20s，阴干至不粘手，然后栽参。该防锈剂能够降低水锈病的发生率，促进人参生长，但是组分复杂，并且不能持续长久。

CN1961676A公开了一种人参西洋参红皮病的防治方法，采用药液浸沾人参苗根部，然后再进行移栽；该药液为硫酸的铜盐或锌盐或钙盐的水溶液，其pH 值为5.5-7.0。同样的该方法不能持续性的治疗红皮病。

采用生物防治技术，不仅抑制与消除导致红锈病的病原菌，还可以减少化肥的施用量，活化土壤，分解被土壤固定的养分，分解土壤中矿物化的磷、钾、钙等营养素，从而提高植物对自然界中N、P、K吸收与利用；使能量立体化汇集，促进土壤团粒化，改善土壤结构，提高土壤的保水性和透气性能。同时在人参生长和繁殖过程中，可以产生植物生长素，刺激作物的有效生长；其次微生物的菌群在生长繁殖过程中能有效抑制有害微生物的繁殖；多种微生物菌群是复合体，是无毒、无害、经济、环保的新型有机活体微生物群落，是修复土壤、恢复自然、还原生态、生产健康有机产品的最佳选择。

但是在现有技术中还没有针对人参红锈病采用微生物菌剂进行防治的先例，因此，本领域技术人员针对人参红锈病的防治具有很大的改进空间和技术需求。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种能够改善土壤有机物质、营养均衡、肥效确切；并且可以防治病虫害的一种人参专用复合生物菌剂及生产制备方法。

本发明通过以下技术方案实现：

首先提供了本发明涉及的三株菌株，分别是：A菌：解淀粉芽孢杆菌 BNCC188030；B菌：枯草芽孢杆菌BNCC124558；C菌：淡紫拟青霉菌BNCC124489；均为商业上可以购买的菌株。

利用上述三个菌株制备生产的微生物菌剂，其活性成分为菌体和它的胞外代谢产物。上述微生物菌剂可以为液态制剂，也可以为固体粉剂。

本发明提出了一种人参专用复合生物菌剂，是将A菌、B菌混合制成人参专用复合生物菌剂，其中A菌、B菌、C菌使用比例为1L：1L：500g进行混合而后稀释使用。

本发明的技术解决方案是：一种人参专用复合生物菌剂及生产制备办法，其具体步骤如下；

(一)解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌剂的制备

采购A菌：解淀粉芽孢杆菌BNCC188030；B菌：枯草芽孢杆菌BNCC124558。

(1)菌种活化:将低温保存的BNCC188030和BNCC124558菌株接种LB平板培养基上，并在30-37℃下培养24小时；然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在30-37℃下培养24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液；

(2)种子液的制备：按照1-10％比例(体积百分比)向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在28-34℃下震荡培养12-16小时，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照3-10％比例(体积百分比)接入玉米粉豆饼粉培养基中，再在28-34℃、摇床转速为170-210rpm的条件下培养22-25小时，分别得到A菌和B菌的液体制剂；

其中所述的玉米粉豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖 2.5％-3.5％，玉米粉1.5％-2.5％，豆饼粉1.5％-2.5％，NaCl 0.1％-0.2％，CaCO₃ 0.2％-0.3％，KH₂P0₄ 0.01％-0.03％和MgS0₄7H₂0 0.02％-0.04％，其余为水。

上述制备方法中步骤(1)中所述的低温是指通常保存菌种所用温度，本领域技术人员根据常识可知。

上述制备方法中步骤(1)或(2)中所述的LB平板培养基、LB斜面培养基或 LB液体培养基的组成成份及其制备方法都是本领域技术人员熟知的，可按照通常的方法制备。

上述制备方法中所述的玉米粉豆饼粉培养基的制备方法，按照重量百分比称取各个组分，然后将它们混合，再加水至所需体积即可。

上述制备方法中所述的培养温度优选为30-32℃，摇床转速优选为210rpm，培养时间优选为22小时。

上述微生物菌剂，活菌数大于5x10⁹个/mL。

(二)淡紫拟青霉菌剂的制备

(1)制备淡紫拟青霉种子液：(1.1)在无菌操作台上将冻干管内的淡紫拟青霉菌BNCC124489接种接入到PDA培养基中培养3-7天得到淡紫拟青霉健康菌落，培养温度设定为25-30摄氏度。(1.2)将淡紫拟青霉健康菌落接入营养琼脂培养基中在20-30摄氏度条件下培养3-7天。(1.3)挑选发育健康菌种备用。 (1.4)将备用健康菌种接入到经过灭菌的液体培养基培养2-5天，获得淡紫拟青霉种子液，液体培养基的转速设定为120转/分钟-180转/分钟、温度设定为 30-37摄氏度。

淡紫拟青霉种子液的制备步骤(1.4)中的液体培养基按重量份计为：蔗糖 5-15份、氯化钠3-10份、牛肉膏5-15份、氯化钠3-8份、磷酸二氢钾0.2-1.0 份、三氯化铁0.01份、酵母膏1-4份、水1000份。

(2)将步骤(1)的种子液接入到固体增殖培养基中在无菌有氧条件下进行增殖培养，培养温度设定为30摄氏度，培养时间设定为7-10天。(3)将步骤⑵增殖培养后的培养基进行千燥，得到淡紫拟青霉原菌菌剂。

步骤⑵的固体增殖培养基按重量份计包含:麦麸50-100份、玉米芯粉10-40 份、红糖1-10份、豆饼5-20份、氯化钙1-3份、氯化钠1-3份、水10-50份。

可选择地，步骤(2)的固体增殖培养基设定为

使用方法：一亩地用1L A菌液，1L B菌液，500g C菌剂混合后用100倍的水混合，全株均匀喷施，并配合浇根；在人参生长期每隔15-25天喷施一次，每个生长期(6个月左右)至少施用3次；另外也可以用上述时间、与农家肥混合使用，效果更佳，水量根据具体情况加入。进行叶面喷施对保花、保果、防病有较好的效果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明能有效防治人参的红锈病。

2、本发明所述菌剂不仅能够克服了化学药物滥用带来的副作用，同时还能够提高人参的生物学指标，使得人参的生长速度得到显著提高。

3、本发明所述的菌剂有效、环保、不产生病原菌抗性，制备简单，成本低廉，应用前景良好。

4、本发明是去除与预防人参红锈病的首选，化学肥料的有效替代产品。由复合有益菌群组成避免单一菌群对单一元素有效。活菌含量高，(国家标准1 毫升含活菌2亿个，人参专用复合生物菌剂1毫升含活菌大于80亿个)；微生物能有效去除与预防人参红锈病，对红锈病病原菌有极大的去除与抑制作用。

下面将结合实施例、试验例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

实施例1菌剂的制备

(一)解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌剂的制备

(1)菌种活化:将低温保存的BNCC188030和BNCC124558菌株接种LB平板培养基上，并在30℃下培养24小时；然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在30℃下培养24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液；

(2)种子液的制备：按照3％比例(体积百分比)向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在34℃下震荡培养12-16小时，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照5％比例(体积百分比)接入玉米粉豆饼粉培养基中，再在34℃、摇床转速为210rpm的条件下培养22-25小时，分别得到A菌和B菌的液体制剂；上述微生物菌剂，活菌数分别为6.2x10⁹个/mL 和6.8x10⁹个/mL。

其中所述的玉米粉豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖 2.5％％，玉米粉2.5％，豆饼粉2.5％，NaCl 0.2％，CaCO₃ 0.3％，KH₂P0₄ 0.03％和 MgS0₄7H₂00.04％，其余为水。

(二)淡紫拟青霉菌剂的制备

(1)制备淡紫拟青霉种子液：(1.1)在无菌操作台上将冻干管内的淡紫拟青霉菌BNCC124489接种接入到PDA培养基中培养3-7天得到淡紫拟青霉健康菌落，培养温度设定为25-30摄氏度。(1.2)将淡紫拟青霉健康菌落接入营养琼脂培养基中在30摄氏度条件下培养7天。(1.3)挑选发育健康菌种备用。(1.4) 将备用健康菌种接入到经过灭菌的液体培养基培养3天，获得淡紫拟青霉种子液，液体培养基的转速设定为180转/分钟、温度设定为34摄氏度。

淡紫拟青霉种子液的制备步骤(1.4)中的液体培养基按重量份计为：蔗糖 15份、氯化钠10份、牛肉膏10份、氯化钠8份、磷酸二氢钾1.0份、三氯化铁0.01份、酵母膏4份、水1000份；

(2)将步骤(1)的种子液接入到固体增殖培养基中在无菌有氧条件下pH为7.0条件下进行增殖培养，培养温度设定为30摄氏度，培养时间设定为10天。

(3)将步骤⑵增殖培养后的培养基进行千燥，得到淡紫拟青霉原菌菌剂。

步骤⑵的固体增殖培养基按重量份计为:麦麸100份、玉米芯粉30份、红糖5份、豆饼10份、氯化钙3份、氯化钠3份、水40份。

实施例2田间小区试验

1、试验材料

人参试验田由集安清河镇人参种植基地提供，年生为1年生人参；用本发明一种人参专用复合生物菌剂(发酵液)预防与去除人参红锈病。

2、试验设计

对1年生生的人参进行喷施(将1L A菌液+1L B菌液+500g C菌剂用100倍的水混合对全株进行均匀喷施)、喷施+灌施(所述混合菌液用100倍的水混合均匀喷施并且利用地灌方式进行灌施)、清水对照。分别在生长期每隔30天施用一次，共施用3次。

3、田间试验调查结果

通过施人参专用复合生物菌剂，对人参发病率进行调查，试验设置了喷施、喷施加灌施和清水对照三种施用方式。试验表明，人参专用复合生物菌剂采用喷施和灌施对人参预防及去除人参红锈病效果最好，单独喷施的方式效果次之。施用人参专用复合生物菌剂调查结果见下表：

表一人参专用复合生物菌剂灌根对人参红锈病的影响：

从结果可以看出，采用本发明的菌剂进行喷施和或灌施在出苗率以及发病率上均具有较好的效果，而对照没有采用本发明菌剂的方法存在较高的发病率。

表二人参专用复合生物菌剂灌根对人参生长的实验结果：

其中P<0.01为有显著统计学差异。

从表二可以看出，采用了本发明的菌剂能够显著提高人参的根长以及根粗，并且参体的重量也显著得到提高，这充分的说明本发明的菌剂能够显著的提高人参的生物量，无论是人参长度，体积还是重量均有显著的改善。

将已经患有人参红锈病的3月期病苗100株采用喷施+灌施的方式进行治疗培养，二周治疗一次，每株100mL稀释液，四周后，其中89株病苗均康复，10 株病况已经显著改善。八周后，97株均康复，并且没有继续发病。这充分说明，本发明的菌剂具有较好的治疗效果，不用添加任何农药或者化学药物，实现了无污染的治疗人参病体。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种人参专用复合生物菌剂，是将A菌、B菌和C菌混合制成人参专用复合生物菌剂，其中，A菌：解淀粉芽孢杆菌BNCC188030；B菌：枯草芽孢杆菌BNCC124558；C菌为淡紫拟青霉菌BNCC124489，该菌剂能防治人参红锈病；所述菌剂的生产制备办法，其具体步骤如下；

(一)解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌剂的制备

采购A菌：解淀粉芽孢杆菌BNCC188030；B菌：枯草芽孢杆菌BNCC124558；

(1)菌种活化:将低温保存的BNCC188030和BNCC124558菌株分别接种LB平板培养基上，并在30-37℃下培养24小时；然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在30-37℃下培养24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液；

(2)种子液的制备：按照1-10％比例体积百分比向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在28-34℃下震荡培养12-16小时，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照3-10％比例体积百分比接入玉米粉豆饼粉培养基中，再在28-34℃、摇床转速为170-210rpm/min的条件下培养22-25小时，分别得到A菌和B菌的液体制剂；

其中所述的玉米粉豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.5％-3.5％，玉米粉1.5％-2.5％，豆饼粉1.5％-2.5％，NaCl 0.1％-0.2％，CaCO₃0.2％-0.3％，KH₂PO₄0.01％-0.03％和MgSO₄·7H₂0 0.02％-0.04％，其余为水；

(二)淡紫拟青霉菌剂的制备

(1)制备淡紫拟青霉种子液：(1.1)在无菌操作台上将冻干管内的淡紫拟青霉菌BNCC124489接种到PDA培养基中培养3-7天得到淡紫拟青霉健康菌落，培养温度设定为25-30摄氏度；(1.2)将淡紫拟青霉健康菌落接入营养琼脂培养基中在20-30摄氏度条件下培养3-7天；(1.3)挑选发育健康菌种备用；(1.4)将备用健康菌种接入到经过灭菌的液体培养基培养2-5天，获得淡紫拟青霉种子液，液体培养基的转速设定为120转/分钟-180转/分钟、温度设定为30-37摄氏度；

淡紫拟青霉种子液的制备步骤(1.4)中的液体培养基按重量份计为：蔗糖5-15份、氯化钠3-10份、牛肉膏5-15份、氯化钠3-8份、磷酸二氢钾0.2-1.0份、三氯化铁0.01份、酵母膏1-4份、水1000份；

(2)将步骤(1)的种子液接入到固体增殖培养基中在无菌有氧条件下进行增殖培养，培养温度设定为30摄氏度，培养时间设定为7-10天；(3)将步骤⑵增殖培养后的培养基进行干燥，得到淡紫拟青霉原菌菌剂；

步骤⑵的固体增殖培养基按重量份计:麦麸50-100份、玉米芯粉10-40份、红糖1-10份、豆饼5-20份、氯化钙1-3份、氯化钠1-3份、水10-50份；

将上述方法制备的到的1L A菌液，1L B菌液，500g C菌剂混合即可得到菌剂。

2.根据权利要求1所述的菌剂，其中细菌发酵培养过程中所述的培养温度为30-32℃，摇床转速为210rpm/min，培养时间为22小时。

3.权利要求1所述的菌剂在防治人参红锈病中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，使用方法为一亩地用1L A菌液，1L B菌液，500g C菌剂混合后用100倍的水混合，全株均匀喷施，并配合浇根；在人参生长期每隔15-25天喷施一次，每个生长期至少施用3次。