CN113773993A - 一种伊枯草菌素a的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然有机化合物应用领域，具体涉及一种伊枯草菌素A的新用途。具体技术方案为：伊枯草菌素A在促芽孢杆菌生长、提高芽孢杆菌生物活性、促进芽孢杆菌定殖中的应用。根据本发明，本领域技术人员可根据业内已有技术，开发各类含伊枯草菌素A的、以提升芽孢杆菌菌剂定殖能力为目标的微生物农药(特别是生防菌剂)、菌肥、菌肥添加剂、饲料用发酵菌剂、消化道调理活菌药物、重金属污染活菌修复剂等，从而解决现有芽孢杆菌菌剂定殖效果不佳导致的环境适应性差、生物活性不稳定的问题。

Description

一种伊枯草菌素A的新用途
技术领域
本发明属于天然有机化合物应用领域，具体涉及一种伊枯草菌素A的新用途。
背景技术
芽孢杆菌属(Bacillus)细菌是一大类广泛分布的革兰氏阳性杆状好氧细菌，通常具有易于保存、代谢产物丰富、活性较强等特点，在农业、工业、医药、环保等领域具有重要应用。芽孢杆菌菌剂是以芽孢杆菌活菌或活芽孢为主要活性成分的生物制剂，在植物病虫害防控、植物促生长、土壤解矿增肥、堆肥腐熟发酵、发酵饲料生产、肠道益生药物开发、重金属污染治理修复等领域均有大量商业化应用。然而，现有芽孢杆菌菌剂在非最佳培养环境中的定殖能力较弱，这也极大地影响了芽孢杆菌菌剂的推广和使用。
定殖是指在存在土著微生物的情况下，接种到基质环境中的菌株在相应环境定居并繁殖的能力。强大的定殖能力可以使生防菌提前占据病原微生物侵入植物的位点，成为优势菌种，在遇到病原微生物或病原昆虫时，可与其相互作用，有效阻止病原物侵入寄主植物；可以使根际促生微生物迅速适应新环境，与植物根系良性互作，发挥改善土壤肥力、防控土传病害等作用；可以提升土壤改良微生物在土壤环境中的存活能力和代谢能力，增强土壤改良效率；可以使堆肥腐熟菌在堆肥环境中快速增殖，占领生态位，抑制不良腐败菌生长，加快堆肥腐熟进度，降低由杂菌带来的毒素、恶臭、病害等风险；使发酵饲料生产周期缩短，提高有效益生活菌浓度和益生抗病因子含量，增加受饲喂动物消化道益生菌有效浓度和生态占比；可以增强药用肠道益生菌对痢疾杆菌、沙门氏菌等致病微生物的竞争力，延长药效维持周期，提高药物治疗效果；可以增强污染治理微生物对有毒环境的抗性，提高其环境适应性，利于其在定殖后通过溶解、沉淀、吸附、富集、生物转化等方式修复重金属污染。综上，在使用环境中的定殖能力强弱直接决定了芽孢杆菌菌剂的使用效果。
伊枯草菌素A是由少数芽孢杆菌发酵合成的伊枯草菌素家族脂肽类化合物，由14～17个碳原子的脂肪酸链和七肽环组成。其具有强烈的抗真菌活性，抑菌谱广、抑菌能力强、低毒安全、不易引起耐药性；在现有技术中，被广泛用作生物农药。本课题组的前期研究也表明：伊枯草菌素A能同时破坏真菌细胞壁的合成和细胞膜的通透性，从而抑制病原真菌生长乃至致死。现有研究显示，自然界中仅枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的小部分菌株具备伊枯草菌素A合成能力，且自然菌株发酵合成伊枯草菌素A的能力普遍较低。
截止目前，关于伊枯草菌素A的对微生物生理活性研究均显示其能强烈抑制真菌(如图1所示：伊枯草菌素A对酿酒酵母(左)和草莓灰霉(右)的抑制效果；图中数字为伊枯草菌素A浓度，单位μg/mL)，高浓度下具有一定的细菌抑制活性(如图2所示：伊枯草菌素A对大肠杆菌的抑制效果；图中数字为伊枯草菌素A浓度，单位μg/mL)。尚未出现有关于伊枯草菌素A通过诱导细菌特定基因表达，改变胞间基质分泌、界面成膜性等细胞行为性状，增强某些细菌的定殖生长能力相关研究报道，更未出现利用伊枯草菌素A制备以提升目标细菌定殖能力为目标的微生物农药(特别是生防菌剂)、菌肥、菌肥添加剂、饲料用发酵菌剂、消化道调理活菌药物、重金属污染活菌修复剂等芽孢杆菌菌剂及其促定殖剂相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种伊枯草菌素A的新用途；将其用作以提升芽孢杆菌菌剂定殖能力为目标的微生物农药(特别是生防菌剂)，菌肥，菌肥添加剂，饲料用发酵菌剂，消化道调理活菌药物、重金属污染活菌修复剂等芽孢杆菌菌剂组分或促定殖剂使用，提高芽孢杆菌菌剂在使用环境中的适应能力和定殖效率，从而芽孢杆菌菌剂的生物活性，而非直接作为抗菌生物农药使用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：伊枯草菌素A在促芽孢杆菌生长中的应用。
相应的，伊枯草菌素A在提高芽孢杆菌生物活性中的应用。
相应的，伊枯草菌素A在促进芽孢杆菌定殖中的应用。
优选的，将所述伊枯草菌素A制备为粉剂、水剂、油剂中的一种后进行应用。
优选的，将伊枯草菌素A与芽孢杆菌混合后，用于浸种，或种子包被，或植物蘸根,或与种子混匀后再种植种子，或施肥，或堆肥，或发酵饲料，或灌喂动物，或注入待修复污染环境。
优选的，使用伊枯草菌素A和芽孢杆菌菌剂进行浸种，或种子包被，或植物蘸根,或与种子混匀后再种植种子，或植株灌根，或施肥，或堆肥，或发酵饲料，或灌喂动物，或注入待修复污染环境的方式，先使用伊枯草菌素A再使用芽孢杆菌，或先使用芽孢杆菌后使用伊枯草菌素A。
优选的，伊枯草菌素A在制备含有芽孢杆菌的微生物农药、菌肥、菌肥添加剂、饲料用发酵菌剂、消化道调理活菌药物、重金属污染活菌修复剂、促芽孢杆菌定殖剂中的应用。
优选的，所述伊枯草菌素A的使用浓度为0.1mg/kg～5000mg/kg。
本发明具有以下有益效果：
细菌定殖与细胞增殖能力、运动能力、生物膜成膜能力、菌落菌苔形态及胞外基质分泌等相关细胞生理性状有关，这些生理行为由多基因、多信号协同调控。发明人研究发现：伊枯草菌素A可以对芽孢杆菌属细菌中群体感应系统、胞外基质分泌、运动能力增强、产芽孢相关等基因的表达进行调控，从而使受调控细菌产生特定生理性状，以大幅提高其在使用环境中的定殖能力，从而提高芽孢杆菌菌剂对不同环境的适应性和发挥生物活性的效率。
经过大量前期试验后，发明人课题组发现，将特定浓度范围的伊枯草菌素A作为促定殖剂，确实可有效、明显提升相关细菌的定殖能力和生物活性。目前已验证有效的细菌包括：部分具备伊枯草菌素A合成能力的菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，和不具备伊枯草菌素A合成能力的菌株：多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、莫哈韦氏芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)等。
以该诱导能力为基础，本领域技术人员可根据业内已有技术，开发各类含伊枯草菌素A的、以提升芽孢杆菌菌剂定殖能力为目标的微生物农药(特别是生防菌剂)、菌肥、菌肥添加剂、饲料用发酵菌剂、消化道调理活菌药物、重金属污染活菌修复剂等，解决现有芽孢杆菌菌剂定殖效果不佳导致的环境适应性差，生物活性不稳定问题。
附图说明
图1为不同浓度的伊枯草菌素A对酿酒酵母(左)和草莓灰霉(右)的抑制效果示意图；
图2为不同浓度的伊枯草菌素A对大肠杆菌的抑制效果示意图；
图3为实施例一中伊枯草菌素A促植物生防细菌枯草芽孢杆菌定殖效果展示对比图；
图4为实施例二中伊枯草菌素A促植物生防细菌多粘芽孢杆菌定殖效果展示对比图；
图5为不同浓度的伊枯草菌素A对各芽孢杆菌定殖效果影响示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种伊枯草菌素A的新应用。本发明所述伊枯草菌素A为环脂肽化合物，其化合物通式如下：
Figure BDA0003268110990000051
其中，侧链R代表C11、C12、C13、C14的支链或直链烷基；位置1-7的氨基酸残基分别为天冬酰胺、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬酰胺、丝氨酸残基。
本发明实施例中所用伊枯草菌素A为Sigma标品级试剂。本发明在芽孢杆菌菌剂使用前或使用时或使用后，将伊枯草菌素A作为芽孢杆菌菌剂组分之一进行使用，对芽孢杆菌进行诱导。
伊枯草菌素A的具体应用方法为：将伊枯草菌素A与活菌剂常用辅料(溶剂、膨润土、乳化剂等)混合、稀释至使用浓度，与芽孢杆菌菌剂混合并接种至使用环境，或在芽孢杆菌菌剂使用前或使用后施用至使用环境。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：伊枯草菌素A在促进番茄根际微生物定殖中的应用
将200g伊枯草菌素A溶解于乙醇并定容至1L，制备为伊枯草菌素A含量为20％(w/v)乙醇溶液。将该乙醇溶液与795g膨润土和5g吐温60混合均匀，真空干燥除去溶剂(乙醇)后，使用气流粉碎机粉碎后制得伊枯草菌素A含量为20％(w/w)可湿性粉剂。用200倍体积于可湿性粉剂的80℃热水分散稀释可湿性粉剂，配制成伊枯草菌素A浓度1000mg/L的使用溶液。
用配制好的使用溶液，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生防菌剂按照菌剂说明书施用浓度要求进行稀释分散(生防菌剂为绿恒丰牌，规格为有效活菌数≥1012cfu/g)，80℃静置孵育诱导10分钟，获得菌剂悬液。将菌剂悬液充分搅拌重悬，灌根佳迪番茄50日龄幼苗，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：用不含伊枯草菌素A的等量由膨润土配置的溶液稀释生防菌剂，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水灌根。每组实验面积0.5亩，重复3次。每组灌根试剂用量均为：600L/亩。
20天后，使用16S rRNA高通量测序法，测量番茄幼苗根部表面与根际土壤中单位质量基质中枯草芽孢杆菌16S rRNA丰度值，并根据核酸丰度值计算有效活菌数(即定殖效果)。清水对照组的两个部位有效活菌数均低于103cfu/g。相比菌剂处理组，菌剂+促定殖剂处理组根部表面的有效活菌数从66.1×105cfu/g提高至312.0×105cfu/g，定殖效果提高372％，根际土壤中的有效活菌数从22.1×105cfu/g提高至72.0×105cfu/g，定殖效果提高226％。具体结果如图3所示。
实施例二：伊枯草菌素A在促进油菜根际微生物定殖中的应用
将400g伊枯草菌素A、50g农药乳化剂500号和550g乙醇均匀混合，制备伊枯草菌素A含量为40％(w/w)的油分散剂。用水将多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)生防菌剂按照菌剂说明书施用浓度要求进行稀释分散，生防菌剂来自北海业盛旺生物科技有限公司的多粘类芽孢杆菌(可湿性粉剂，多粘芽孢杆菌有效活菌数≥50亿/克)。随后喷施油研10号40日龄油菜叶面并灌根，生防菌剂用量为每亩100g。将所述油分散剂用1000倍室温水稀释分散，配制成伊枯草菌素A浓度400mg/L的使用溶液。
在施用生防菌剂1天后，用使用溶液对油菜覆盖喷施并灌根，喷施量50L/亩，灌根量600L/亩，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：用等量不含伊枯草菌素A的由农药乳化剂500和乙醇配置的使用溶液，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水喷施灌根。每组实验面积0.5亩，重复3次。
25天后使用菌落计数法，测得油菜叶片表面与根际土壤中的多粘芽孢杆菌有效活菌数，清水对照组的两个部位有效活菌数均低于103cfu/g。相比菌剂处理组，菌剂+促定殖剂处理组的叶片表面有效活菌量从7.3×105cfu/g增加至16.8×105cfu/g，提高131％；根际土壤中有效活菌量从25.9×105cfu/g增加至150.5×105cfu/g，提高482％。具体结果如图4所示。
实施例三：伊枯草菌素A在制备羊药用添加剂中的应用
将50g伊枯草菌素A溶解于乙醇并定容至100mL，配置为伊枯草菌素A浓度为50％(w/v)的乙醇溶液。将该溶液与945g膨润土和5g吐温60混合均匀，真空干燥除去溶剂(乙醇)后，使用气流粉碎机粉碎，制得伊枯草菌素A含量为5％(w/w)的可湿性粉剂。将可湿性粉剂用水稀释至伊枯草菌素浓度为2000mg/L，得使用溶液。用使用溶液将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)活菌剂按照1:10进行稀释，活菌剂来东北制药公司的整肠生地衣芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌有效活菌数≥10亿/克)。4℃孵育诱导600分钟，获得菌液。用所述菌液灌喂患急性痢疾12月龄波尔多羊，每日3次，连用3日作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：用等量不含伊枯草菌素A的由水、膨润土配置的使用溶液稀释地衣芽孢杆菌，获得菌液，其余条件相同，灌喂波尔多羊。设置清水对照组：仅使用等量清水灌喂波尔多羊。每组实验设置5个重复。
用药5天后，使用16S rRNA高通量测序法测得羊粪中地衣芽孢杆菌的16S rRNA丰度值，并根据核酸丰度值计算有效活菌数(即定殖效果)。清水对照组的两个部位有效活菌数均低于104cfu/g。相比菌剂处理组，菌剂+促定殖剂处理组羊粪中的有效活菌数从0.78×107cfu/g提高至1.60×107cfu/g，定殖效果提高105％。
实施例四：伊枯草菌素A在土壤改良中的应用
将10mg伊枯草菌素A溶解于10L水中，制备伊枯草菌素A含量为1mg/L的水剂。将水剂用10倍体积的室温水稀释分散，配制成伊枯草菌素A浓度0.1mg/L的使用溶液。于红颜草莓移栽种植前1个月灌注于大田中，灌注量600L/亩。
将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)微生物肥料菌剂按照菌剂说明书施用浓度要求用水进行稀释分散，微生物肥料菌剂来自北京中农良方生物科技有限公司的解淀粉芽孢杆菌(颗粒剂，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数≥2亿/克)。在施用伊枯草菌素A使用溶液后1天，使用稀释后的微生物肥料菌剂灌注大田，灌注量600L/亩，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：使用等量纯净水代替使用溶液，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水灌注大田。每组实验面积0.5亩，重复3次。
20天后使用菌落计数法测定大田土壤中解淀粉芽孢杆菌有效活菌数。清水对照组有效活菌数均低于103cfu/g。与菌剂处理组相比，菌剂+促定殖剂处理组土壤中的活菌量从3.7×106cfu/g提高至6.8×106cfu/g，提高84％。移植草莓20天后测定：与菌剂处理组相比，菌剂+促定殖剂处理组根际土壤中活菌量从57.1×106cfu/g提高至206.1×106cfu/g，提高261％。
实施例五：伊枯草菌素A在制备牛用饲料中的应用
将200g伊枯草菌素A溶解于乙醇并定容至1L，制备为伊枯草菌素A含量为20％(w/v)乙醇溶液。将该乙醇溶液与795g膨润土和5g吐温60混合均匀，真空干燥除去溶剂(乙醇)后，使用气流粉碎机粉碎后制得伊枯草菌素A含量为20％(w/w)可湿性粉剂。用200倍体积于可湿性粉剂的80℃热水分散稀释可湿性粉剂，配制成伊枯草菌素A浓度1000mg/L的使用溶液。
用配制好的使用溶液，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)饲料用菌剂按照菌剂说明书施用浓度要求进行稀释分散(购自北海亦强生物技术有限公司，枯草芽孢杆菌，可湿性粉剂，活菌量为1000亿/克)，80℃静置孵育诱导10分钟，获得菌剂悬液。将菌剂悬液充分搅拌重悬，按接种量1％(L/kg)与花生秧花生饼粕复合饲料混合发酵，发酵温度30℃，发酵72小时，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：用不含伊枯草菌素A的等量由膨润土配置的溶液稀释生防菌剂，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水。每组实验饲料200公斤，重复3次。发酵后饲料拌入3倍质量的新鲜精料，饲喂18月龄健康西杂牛，连续喂养10天，每组用牛6头。
发酵结束后，使用16S rRNA高通量测序法，测量发酵饲料中枯草芽孢杆菌16SrRNA丰度值，并根据核酸丰度值计算有效活菌数(即定殖效果)。清水对照组的两个部位有效活菌数均低于105cfu/g。相比菌剂处理组，菌剂+促定殖剂处理组发酵饲料中的有效活菌数从72.1×107cfu/g提高至116.3×107cfu/g，定殖效果提高61.3％。相比菌剂处理组，菌剂+促定殖剂处理组黄牛粪便中的有效活菌数从42.5×106cfu/g提高至71.1×106cfu/g，定殖效果提高67.3％。
实施例六：伊枯草菌素A在制备污水处理剂中的应用
将950g伊枯草菌素A和50g柠檬酸钠混合均匀，使用气流粉碎机粉碎后制得伊枯草菌素A含量为950g/kg的粉剂。取10g粉剂，与1kg蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)重金属修复用活菌剂混合均匀，获得活化菌剂。将活化菌剂以100倍水稀释后，按待处理水体体积的1％注入镉离子污染水坑作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：菌剂中不含由伊枯草菌素A制备的粉剂，其余条件相同。设置膨润土对照组：仅使用菌剂和伊枯草菌素A之外的其他组分和等量膨润土制备。每组实验面积约0.1亩，重复3次。
菌剂加入60天后，使用16s rRNA高通量测序法，测得污水与坑底淤泥蜡样芽胞杆菌有效活菌数。清水对照组的两个部位有效活菌数均低于103cfu/g。与菌剂处理组相比，菌剂+促定殖剂处理组污水中活菌数从1.3×105cfu/mL提高至4.1×105cfu/mL，提高214％；底部淤泥中活菌数从49.5×105cfu/g提高至240.6×105cfu/g，提高386％。
实施例六：伊枯草菌素A在动物粪便堆肥中的应用
将100g伊枯草菌素A溶解于乙醇并定容至500mL，制备为伊枯草菌素A浓度为20％(w/v)的乙醇溶液。将该溶液与895g膨润土和5g吐温60混合均匀，真空干燥除去溶剂(乙醇)后，使用气流粉碎机粉碎，制得伊枯草菌素A含量为10％(w/w)的可湿性粉剂。将可湿性粉剂用温水稀释至伊枯草菌素A浓度为400mg/L，获得使用溶液。用使用溶液将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)微生物肥料菌剂稀释分散至有效活菌浓度1～2×108cfu/mL，25℃孵育诱导180分钟，获得菌液。微生物肥料菌剂来自北海业盛旺生物科技有限公司的巨大芽孢杆菌(可湿性粉剂，巨大芽孢杆菌有效活菌数≥100亿/克)。
将牛粪、鸡粪、羊粪、秸秆按质量比约2:2：1:1混合，以5％接种量(v/w，L/kg)接种诱导后的巨大芽孢杆菌菌液，堆肥发酵15天，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：用等量温水替代使用溶液稀释分散巨大芽孢杆菌，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水处理堆肥。每组实验堆肥2吨，重复3次。
发酵15天后，使用16s rRNA高通量测序法，测得堆肥中巨大芽孢杆菌16s rRNA丰度值，并根据核酸丰度值计算有效活菌数(即定殖效果)。清水对照组堆肥中有效活菌数低于104cfu/g。与菌剂处理组相比，菌剂+促定殖剂处理组堆肥中的有效活菌数从23.2×107cfu/g提高至63.3×107cfu/g，定殖效果提高173％。
实施例七：伊枯草菌素A在促进茄子根际微生物定殖中的应用
将300g伊枯草菌素A、50g农药乳化剂600号、100g二甲基亚砜(DMSO)和550g乙醇均匀混合，制备伊枯草菌素A浓度为30％(w/w)的乳油分散剂。
将侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)微生物肥料菌剂用水按照说明书要求稀释分散(购自北海亦强生物技术有限公司，侧孢芽孢杆菌，可湿性粉剂，活菌量为100亿/克)，并对京茄10号20日龄茄子幼苗进行灌根处理。将乳油分散剂用1000倍室温水稀释分散，配制成伊枯草菌素A浓度为300mg/L的使用溶液。在菌剂施用后1天，用使用溶液覆盖灌根茄子幼苗，灌根量500L/亩，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：制备不含伊枯草菌素A的乳油分散剂，并用1000倍水稀释为使用溶液，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水灌根处理。每组实验面积0.5亩，重复3次。
25天后，使用菌落计数法，测得茄子根部表面与根际土壤中侧孢芽孢杆菌的有效活菌数。清水对照组的两个部位有效活菌数均低于104cfu/g。与菌剂处理组相比，菌剂+促定殖剂处理组的根部表面活菌数从3.6×105cfu/g提高至18.0×105cfu/g，提高401％；根际土壤中活菌数从1.2×105cfu/g提高至5.1×105cfu/g，提高322％。
实施例八：伊枯草菌素A在促进大豆拌种中的应用
将600g伊枯草菌素A溶解于乙醇并定容至3L。将该溶液与398g凹凸棒石粉和2g十二烷基磺酸钠(SDS)混合均匀，真空干燥除去溶剂后，使用气流粉碎机粉碎后制得伊枯草菌素A含量为60％(w/w)的可湿性粉剂。将粉剂、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)生防菌剂(购自台湾兴农股份有限公司，可湿性粉剂，芽孢含量≥100亿/克)、大豆种子按质量比1:10:2000混合均匀后，播种种植，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：不使用粉剂，只使用复合生防菌剂与大豆种子混匀，其余条件相同。设置凹凸棒石粉对照组：仅使用0.02％凹凸棒石粉与大豆种子混合后播种。每组实验面积0.5亩，重复3次。
待大豆出芽25天左右，至大豆植株平均株高20cm时，使用16S rRNA高通量测序法，测得大豆植株根部坚强芽孢杆菌的16S rRNA丰度值，并根据核酸丰度值计算有效活菌数(即定殖效果)。凹凸棒石粉对照组坚强芽孢杆菌在不同部位有效活菌数均低于103cfu/g。与菌剂处理组相比，菌剂+促定殖剂处理组的根部表面有效活菌数从8.3×105cfu/g提高至27.5×105cfu/g，定殖效率提高231％；根际土壤中有效活菌数从3.3×105cfu/g提高至8.1×105cfu/g，定殖效率提高144％。
实施例九：伊枯草菌素A在促进油菜根际微生物定殖中的应用(伊枯草菌素A与芽孢杆菌分开使用)
将400g伊枯草菌素A、50g农药乳化剂500号和550g乙醇均匀混合，制备伊枯草菌素A含量为40％(w/w)的油分散剂。用水将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)生防菌剂按照菌剂说明书施用浓度要求进行稀释分散，生防菌剂来自山东秀邦生物科技有限公司的苏云金芽孢杆菌(悬浮剂，苏云金芽孢杆菌≥8000IU/微升)。随后喷施油研10号40日龄油菜叶面并灌根。将所述油分散剂用1000倍室温水稀释分散，配制成伊枯草菌素A浓度400mg/L的使用溶液。
在施用生防菌剂1天后，用使用溶液对油菜覆盖喷施并灌根，喷施量50L/亩，灌根量600L/亩，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：用等量不含伊枯草菌素A的由农药乳化剂500和乙醇配置的使用溶液，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水喷施灌根。每组实验面积0.5亩，重复3次。
25天后使用菌落计数法，测得油菜叶片表面与根际土壤中的苏云金芽孢杆菌有效活菌数，清水对照组的两个部位有效活菌数均低于103cfu/g。相比菌剂处理组，菌剂+促定殖剂处理组的叶片表面有效活菌量从5.3×105cfu/g增加至11.9×105cfu/g，提高125％；根际土壤中有效活菌量从20.9×105cfu/g增加至75.5×105cfu/g，提高261％。
实施例十：伊枯草菌素A在促进番茄根际微生物定殖中的应用(伊枯草菌素A与芽孢杆菌分开使用)
将200g伊枯草菌素A溶解于乙醇并定容至1L，制备为伊枯草菌素A含量为20％(w/v)乙醇溶液。将该乙醇溶液与795g膨润土和5g吐温60混合均匀，真空干燥除去溶剂(乙醇)后，使用气流粉碎机粉碎后制得伊枯草菌素A含量为20％(w/w)可湿性粉剂。用200倍体积于可湿性粉剂的80℃热水分散稀释可湿性粉剂，配制成伊枯草菌素A浓度1000mg/L的使用溶液。
用配制好的使用溶液，将萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、莫哈韦氏芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)生防菌剂(有效活菌数≥1012cfu/g)按照活菌比例1:1混合后稀释至108cfu/g，80℃静置孵育诱导10分钟，获得菌剂悬液。将菌剂悬液充分搅拌重悬，灌根佳迪番茄50日龄幼苗，作为菌剂+促定殖剂处理组。同时设置菌剂处理组：用不含伊枯草菌素A的等量由膨润土配置的溶液稀释生防菌剂，其余条件相同。设置清水对照组：仅使用等量清水灌根。每组实验面积0.5亩，重复3次。每组灌根试剂用量均为：600L/亩。
20天后，使用16S rRNA高通量测序法，测量番茄幼苗根部表面与根际土壤中单位质量基质中萎缩芽孢杆菌与莫哈韦氏芽孢杆菌16S rRNA丰度值，并根据核酸丰度值计算有效活菌数(即定殖效果)。清水对照组的两个部位两种生防菌有效活菌数均低于103cfu/g。相比菌剂处理组，菌剂+促定殖剂处理组根部表面的萎缩芽孢杆菌有效活菌数从16.3×105cfu/g提高至22.0×105cfu/g，定殖效果提高35％，莫哈韦氏芽孢杆菌有效活菌数从18.1×105cfu/g提高至38.6×105cfu/g，定殖效果提高113％，根际土壤中的有效萎缩芽孢杆菌有效活菌数从26.1×105cfu/g提高至95.1×105cfu/g，定殖效果提高264％，莫哈韦氏芽孢杆菌有效活菌数从36.1×105cfu/g提高至112.0×105cfu/g，定殖效果提高210％。
实施例十一：伊枯草菌素A在促进各芽孢杆菌定殖效率对比
将各类芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)固体斜面菌种接种至新鲜BGM液体培养基中，25℃、150rpm振荡培养18小时，分别获得液体种子。制备含不同浓度(0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)伊枯草菌素A的BGM液体培养基，注入无菌96孔板，每孔180μL。再分别将液体菌种按每孔20μ分别接种，25℃下静置培养48小时。小心移除孔板中液体，保留气液界面生物膜，用无菌水洗涤三次。将生物膜充分干燥后，每孔加入200μL的1％结晶紫染液，室温染色10分钟后移除液体，用无菌水洗涤三次。加入200μL的丙酮/乙醇脱色液(1:4，v/v)浸泡10分钟。吸取150μL脱色液至新96孔板，使用酶标仪测定各样孔在590nm处吸光值。该吸光值代表对应样品中菌在气液界面生物膜定殖效率(各菌均以自身在不含伊枯草菌素A的CK对照条件下的吸光值为100％计算)，结果如图5所示。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.伊枯草菌素A在促芽孢杆菌生长中的应用。
2.伊枯草菌素A在提高芽孢杆菌生物活性中的应用。
3.伊枯草菌素A在促进芽孢杆菌定殖中的应用。
4.根据权利要求1～3任意一项所述伊枯草菌素A的应用，其特征在于：将所述伊枯草菌素A制备为粉剂、水剂、油剂中的一种后进行应用。
5.根据权利要求1～3任意一项所述伊枯草菌素A的应用，其特征在于：将伊枯草菌素A与芽孢杆菌混合后，用于浸种，或种子包被，或植物蘸根,或与种子混匀后再种植种子，或施肥，或堆肥，或发酵饲料，或灌喂动物，或注入待修复的环境。
6.根据权利要求1～3任意一项所述伊枯草菌素A的应用，其特征在于：使用伊枯草菌素A和芽孢杆菌菌剂进行浸种，或种子包被，或植物蘸根,或与种子混匀后再种植种子，或植株灌根，或施肥，或堆肥，或发酵饲料，或灌喂动物，或注入待修复污染环境的方式，先使用伊枯草菌素A再使用芽孢杆菌，或先使用芽孢杆菌后使用伊枯草菌素A。
7.根据权利要求1～3任意一项所述伊枯草菌素A的应用，其特征在于：伊枯草菌素A在制备含有芽孢杆菌的微生物农药、菌肥、菌肥添加剂、饲料用发酵菌剂、消化道调理活菌药物、重金属污染活菌修复剂、促芽孢杆菌定殖剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述伊枯草菌素A的使用浓度为0.1mg/kg～5000mg/kg。
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