CN103478146A - 一种伊枯草菌素a水剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素A水剂及其制备方法与应用。本发明所述的伊枯草菌素A水剂是樟树内生解淀粉芽孢杆菌CC09菌株发酵液离心所得的上清液，经大孔树脂吸附、浓缩所制备的活性浸膏与自来水、助剂按照一定配比所得的均一、稳定的溶液。本发明所述的伊枯草菌素A水剂具有油水两亲的表面活性、对热、碱稳定、贮存期长、杀菌谱广、不易产生抗药性、无副作用、生物安全和环境友好等特点，对土传植物根腐病和叶部白粉病等有很高的防效。

Description

一种伊枯草菌素A水剂及其制备方法与应用

一、技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素A水剂及其制备方法与应用。 

二、背景技术

人口与粮食问题是21世纪人类面临的重要挑战之一。世界主要粮食作物和经济作物每年因病害损失达20%(Oerke et al.2004)。中国的情况至少在10%～15%之间，如果完全不使用农药，正常年份的黄瓜损失约为

萝卜为40%、甘蓝为25%、苹果为30%、甜菜为24%(陈万义1998) 

然而，由于化学农药的大量使用和不正确使用，在获得较大经济社会效益的同时，也给农业生产带来了一系列问题，如3R问题，即害虫抗药性(Resistance)、残留(Residue)、害虫再猖獗(Resurgence)(金卫根2002)。另外，化学农药的生物毒性、研制新品种的费用昂贵以及环境相容性差等缺点也日趋严重(Leroux1996)。因此，开发研制更加安全、高效、环境友好的农药制剂已成为农药行业发展的必然趋势。 

相对于化学农药，生物农药最大的优势在于能克服化学农药对生态环境的污染和减少在农副产品中农药残留量，是提高我国农产品国际市场竞争力的关键因素之一。目前使用最多的生物农药是微生物农药，包括以菌体为有效成分的杀菌剂类以及以微生物代谢产物为有效成分的农用抗生素类（如井冈霉素、浏阳霉素等）。其中研究和应用较多的是芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。芽孢杆菌能够合成多种抗菌物质，如短肽和环脂肽，其中环脂肽（伊枯草菌素）是该类细菌最重要的杀菌成分之一。然而由于芽孢杆菌代谢产物中该类物质较少，目前尚无环脂肽类杀菌剂产品。 

本发明报道一种利用樟树内生菌解淀粉芽孢杆菌CC09代谢产物(Cai et al.2013)生产的新杀菌剂——伊枯草菌素A水剂及其在防治小麦白粉病中的应用。 

三、发明内容

本发明需要解决的问题是利用分离自樟树茎杆的内生菌，开发一种可以用于植物白粉病防治的髙效、安全、环境友好、可产业化生产的微生物农药制剂。本发明提供来源于解淀粉芽孢杆菌CC09的伊枯草菌素A水剂的制备工艺；提供伊枯草菌素A水剂在防治小麦白粉病中的应用及使用方法。 

本发明采用的细菌是内生细菌解淀粉芽孢杆菌CC09(Bacillus amyloliquefaciens CC09)(以下简称为CC09菌株)，该菌株已申请发明专利“一种防治植物病害的生防菌及其制备方法(专利授权号：ZL201110073773.9)”及“利用RNA聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体及制法和应用(专利授权号：ZL201110386416.8)“。 

本发明所述伊枯草菌素A水剂是CC09菌株发酵液经离心去除菌体后的上清液，经大孔树脂吸附浓缩后所得的浸膏与自来水和助剂按一定比例配制所得的稳定均一溶液，该溶液的抗菌活性物质为CC09菌株所产生的环脂肽类物质——伊枯草菌素A。 

本发明所述的伊枯草菌素A水剂具有广谱抗植物病原真菌作用，如尖孢镰刀菌、大豆炭疽、立枯丝核和链格孢菌等。盆栽防病实验证明，伊枯草菌素A水剂对小麦白粉病有很高的防效，并且该制剂具备工业化生产的基本要求。 

本发明所述的伊枯草菌素A水剂在防治黄瓜白粉病或大豆炭疽病或小麦白粉病或小麦赤霉病或葡萄白粉病多种植物真菌病害农药上具有巨大潜力。可制备成防治黄瓜白粉病或大豆炭疽病或小麦白粉病或小麦赤霉病或葡萄白粉病多种植物真菌病害的新生物农药。 

本发明所述的伊枯草菌素A水剂的制备方法如下： 

(1)CC09菌株发酵液离心去除菌体，所得上清液用X-5大孔树脂吸附浓缩，树脂与上清液的体积比为1：100，流速为4ml/min，洗脱溶剂为95%的乙醇，流速4ml/min，洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，即得含伊枯草菌素A的活性浸膏（以下简称活性浸膏）。 

(2)称取10g活性浸膏，溶解于适量水中，然后依次加入苯甲酸钠0.2g、正戊醇2.0ml、乙二醇2.0ml、纤维素钠1.0g和苯磺酸钠0.5g，使其终浓度分别为0.2%、2%、2%、1%和0.5%，补充水至100ml，再用2M的NaOH调节pH至8.5，即为伊枯草菌素A水剂，该水剂中伊枯草菌素A的含量为0.58mg/ml。贮存于棕色细口瓶中。 

本发明的优点及效果：CC09菌株为樟树内生细菌，具有发酵工艺简单、抗菌有效成分含量较高和环境安全的优势，而且具有广谱抗菌活性，可用于多种植物病害的防治，尤其对白粉病有较高的预防和治疗作用。 

四、具体实施方式

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。 

实施例一：伊枯草菌素A活性浸膏的制备方法 

种子培养基为LB培养基，挑取活化的CC09单菌落接种到4ml LB培养基(15ml试管）培养，37℃，120rpm恒温摇床培养18h。接种的种子液于250mlLB培养基摇瓶(1L)中，37℃，120rpm摇床培养48h，所得发酵液经12,000rpm离心5min去除菌体后，所得上清液用X-5大孔树脂吸附浓缩，树脂与上清液体积比为1：100，流速为4ml/min；洗脱溶剂为95%的乙醇，流速4ml/min，洗脱液用旋转蒸发仪80℃减压浓缩至干，即得棕色含有有效成分伊枯草菌素A的活性浸膏。 

实施例二：伊枯草菌素A水剂的制备方法 

实施例一所得活性浸膏用于伊枯草菌素A水剂的配制。称取10g活性浸膏，溶解于适量水中，然后依次加入苯甲酸钠0.2g、正戊醇2.0ml、乙二醇2.0ml、纤维素钠1.0g和苯磺酸钠0.5g，使其终浓度分别为0.2%、2%、2%、1%和0.5%，补充水至100ml，再用2M的NaOH调节pH至8.5，即为伊枯草菌素A水剂，贮存于棕色细口瓶中。 

实施例三：伊枯草菌素A水剂中有效成分含量分析 

伊枯草菌素A水剂中的有效成分采用高效液相色谱法分析，流动相为45%的乙腈溶液（含5mM乙酸铵），流速1ml/min。以购买自Sigma公司的伊枯草菌素A（iturin A）为标准品，制作标准曲线，定量分析不同浓度水剂中伊枯草菌素A的含量。实验结果证实含浸膏10%的伊枯草菌素A水剂中有效成分伊枯草菌素A的含量为0.58mg/ml。 

实施例四：伊枯草菌素A水剂预防小麦白粉病实验 

小麦一叶一心期喷施伊枯草菌素A水剂，每盆10株，2天后接种白粉病菌60盆。伊枯草菌素A水剂的喷施浓度梯度分别为稀释1000倍、2000倍、3000倍、4000倍和5000倍。清水作为对照（CK）；每个浓度喷施10盆小麦，每盆喷施10ml伊枯草菌素A水剂。喷施后5天、7天、9天、11天、13天、15天分别调查小麦叶片的病情指数及防治效果。 

病情指数及分级标准如下： 

0级：无病； 

1级：病斑面积占整片叶面积的5％以下； 

3级：病斑面积占整片叶面积的6％～15％； 

5级：病斑面积占整片叶面积的16％～25％； 

7级：病斑面积占整片叶面积的26％～50％； 

9级：病斑面积占整片叶面积的50％以上； 

病情指数=∑(各级病叶数×相对级数值)]×100/(调查总叶数×9) 

防治效果(％)=[CK病指数-PT病指数)/CK病指数]×100 

式中：CK病指数为空白对照病情指数；PT病指数为处理施药后病情指数。 

表1喷施伊枯草菌素A水剂不同天数后对小麦白粉病的预防作用 

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Claims (3)

1.一种伊枯草菌素A水剂，其特征是樟树内生解淀粉芽孢杆菌CC09菌株发酵液离心除去菌体后的上清液，经大孔树脂吸附浓缩所得的活性浸膏与自来水和助剂配制所得的稳定均一溶液，该溶液的抗菌活性物质为解淀粉芽孢杆菌CC09所产生的环脂肽类物质——伊枯草菌素A。

2.根据权利要求1所述的伊枯草菌素A水剂的制备方法，其特征是由以下步骤构成:

(1)解淀粉芽孢杆菌CC09发酵液离心去除菌体后的上清液，用X-5大孔树脂吸附浓缩制备活性浸膏，大孔树脂与上清液的体积比为1：100，流速为4ml/min，洗脱溶剂为95%的乙醇，流速4ml/min，洗脱液用旋转蒸发仪80℃减压浓缩至干，即得含伊枯草菌素A的活性浸膏；

(2)称取10g活性浸膏，溶解于适量水中，然后依次加入苯甲酸钠0.2g、正戊醇2.0ml、乙二醇2.0ml、纤维素钠1.0g和苯磺酸钠0.5g，使其终浓度分别为0.2%、2%、2%、1%和0.5%，补充水至100ml，再用2M的NaOH调节pH至8.5，即为伊枯草菌素A水剂，该水剂中伊枯草菌素A的含量为0.58mg/ml。贮存于棕色细口瓶中。

3.权利要求1所述的伊枯草菌素A水剂在制备防治白粉病农药中的应用。