CN108611388A - 一种提高解淀粉芽孢杆菌q-426环脂肽类抗生素产量的方法 - Google Patents

一种提高解淀粉芽孢杆菌q-426环脂肽类抗生素产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种提高解淀粉芽孢杆菌Q‑426环脂肽类抗生素产量的方法。主要技术方案如下：(一)采用Fmoc固相法合成Pre‑ComX P10；(二)制备信号分子ComX P10；(三)解淀粉芽孢杆菌Q‑426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComX P10；所述的解淀粉芽孢杆菌是发明人在辽宁省大连市的堆肥中分离得到，经传统和分子生物学方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。本发明在生物体系外采用化学合成的方法大量得到Pre‑ComX P10，添加到解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，通过人工调控提高解淀粉芽孢杆菌脂肽类抗生素的产量。

Description

一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法。
背景技术
自1943年青霉素被发现并应用于临床治疗以来，为人类治疗和战胜感染性的疾病起到了重要的作用。近年来，随着人类在疾病治疗过程中抗生素的滥用以及动物饲料中过度添加抗生素，出现了多种耐药性超级致病菌，现有的抗生素已无法控制耐药性超级病原菌的感染，对人类健康造成了极大的危险。据相关资料报道，由于抗生素药品滥用而产生的“超级耐药性细菌”到2050年每年将威胁百万中国人的生命安全，此外还将为中国造成20万亿美元的损失。
环脂肽是由微生物发酵产生的一类双亲性化合物，其一端由多个氨基酸组成的肽环形成亲水基，另一端由脂肪烃链形成亲油基。它们具有独特的化学结构和生理功能。环脂肽类化合物主要由革兰氏阳性芽孢杆菌代谢产生，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗支原体、降低胆固醇等生物活性。由于环脂肽化合物具有广谱抗菌活性，其抗菌机理不同于目前上市的任何一类抗生素，临床上表现出高效、低毒、不易产耐药性的特点，使其在医药领域具有良好的应用前景。但是，由于发酵液中同时存在多种环脂肽及其同系物，且每种环脂肽的含量较低，因此大量获得高纯度的产品难度很大。目前，仅放线菌来源的环脂肽化合物达托霉素的开发较为成功，2003年9月首次在美国上市，用于万古霉素抗性的粪肠球菌及对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的治疗。
研究表明，解淀粉芽孢杆菌中的ComP/ComA双组份信号调控系统对其环脂肽类化合物的分泌具有重要的调节作用。该系统属于典型的群体感应系统(Quorum SensingSystem，QS)如附图1所示，ComX信号分子的前体Pre-ComX经ComQ蛋白作用异戊烯基化后，形成成熟的ComX分子并被分泌到胞外；当其浓度累积到一定阈值时，即可与细胞膜上的受体组氨酸激酶蛋白ComP结合，使其发生自磷酸化；磷酸化的ComP将磷酸基团转移至转录调控因子ComA，被磷酸化的ComA与srfA操纵子的启动子结合，进一步激活该操纵子的转录。ComX信息素的前体物质是整个信号通路的基础，该物质为5-15个氨基酸残基组成的多肽分子。如能在生物体外采用化学合成的方法大量得到Pre-ComX，则有望实现人工调控解淀粉芽孢杆菌脂肽类抗生素的产量。
发明内容
本发明提供了一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法。通过Fomc固相合成法，人工合成具有10个氨基酸残基的直链前体肽Pre-ComX P10，将其与ComQ蛋白作用后，得到ComP/ComA双组份信号转导系统的信号分子ComX P10。将信号分子ComX P10与解淀粉芽孢杆菌Q-426共同培养，人工增强该菌ComP/ComA信号转导通路的信号强度，从而促进其环脂肽类抗生素的产量。
本发明的技术方案如下：一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，包括如下步骤：
(一)采用Fmoc固相法合成Pre-ComX P10，所述Pre-ComX P10的氨基酸序列为YKWDGGFSIV；
(二)制备信号分子ComX P10；
(三)解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComX P10；
所述的解淀粉芽孢杆菌是发明人在辽宁省大连市的堆肥中分离得到，经传统和分子生物学方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
所述的解淀粉芽孢杆菌Q-426已于2010年9月17日提交保藏，具体保藏信息如下：
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC；
保藏单位地址：中国武汉武汉大学；
保藏日期：2010年9月17日；
保藏编号：CCTCC NO.M 2010237。
所述的解淀粉芽孢杆菌Q-426(Bacillus amyloliquefaciens)的形态特征为：菌体呈短杆状，具有运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，Gram染色阳性。在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。
所述ComX P10的化学式为：
所述Pre-ComX P10的化学式为：H2N-VISFGGDWKY-COOH。
进一步的，所述步骤(一)的具体过程为：
以Fomc保护酪氨酸取代的2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，利用Fomc固相合成法，按顺序依次连接9个Fomc保护的氨基酸，以冷冻的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的混合液为裂解液，将Pre-ComX P10从2-CTC树脂上切割下来；
所述的氨基酸分别为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Val-OH；
所述三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的体积比为95：4：1。
进一步的，所述步骤(二)的具体过程为：将Pre-ComX P10与香叶基焦磷酸铵、ComQ在缓冲体系中反应生成ComX P10；
所述ComQ的制备方法如下：利用化学转化法将重组质粒转入重组大肠杆菌BL21(E.coli BL21(RIL))感受态细胞，并于含有氨苄霉素的LB固体培养基上过夜培养，当OD600在0.6-1.2之间时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，30℃培养8h后收集菌体，将收集的菌体用缓冲液悬浮后进行超声破碎，以13000rpm转速离心50min，得到上清液，将上清液依次经金属离子螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤层析后，得到ComQ蛋白。
进一步的，所述步骤(三)中：向发酵培养液中添加ComX P10后培养72h。
本发明的有益效果如下：本发明在生物体外采用化学合成的方法大量得到Pre-ComX P10，添加到解淀粉芽孢杆菌的发酵过程中，通过人工调控提高了解淀粉芽孢杆菌脂肽类抗生素的产量。
附图说明
图1为ComP/ComA群体感应系统图。
图2为Pre-ComX P10的质谱图。
图3为Pre-ComX P10的质谱图。
图4为解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽粗提物抑菌实验结果；
其中：A、实例一，B、实例二，C、实例三。
图5为环脂肽液相色谱图；
其中：A、实例一，B、实例二，C、实例三。
图6为实例一平行试验液相色谱图。
图7为实例二平行试验液相色谱图。
图8为实例三平行试验液相色谱图。
图9为环脂肽产量对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，若无特殊说明，本发明所用原料及设备均为本领域的常规技术。
实施例1
一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，包括如下步骤：
(一)采用Fmoc固相法合成Pre-ComX P10
以Fomc保护酪氨酸取代的2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，利用Fomc固相合成法，按顺序依次连接9个Fomc保护的氨基酸，以冷冻的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的混合液为裂解液，将Pre-ComX P10从2-CTC树脂上切割下来；所述的氨基酸分别为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Val-OH；所述三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的体积比为95：4：1。
应用反向半制备色谱纯化得到纯品Pre-Com P10，纯度达到99％。其液相色谱图见图2，分子量见图3。
(二)制备信号分子ComX P10
将Pre-ComX P10与香叶基焦磷酸铵、ComQ在缓冲体系中反应生成ComX P10；所述的缓冲体系为N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸/氢氧化钠(pH7.5，5μmol/L氯化镁，10μmol/L氯化锌)；反应温度为35-37℃；反应时间为3-7小时。反应方程式如下：
该反应式中1代表缓冲体系。
(三)解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComX P10
将解淀粉芽孢杆菌Q-426在牛肉膏蛋白胨固体培养基上活化，37℃过夜培养。挑取单菌落接于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃、200rpm过夜培养，得到种子液。
实例一
将种子液以1％接种量接种于300ml液体培养基，37℃、180rpm摇床将菌体培养至对数生长期，填加按步骤2制备的反应液50ul(信号分子ComX P10)，继续培养72h。
实例二
将种子液以1％接种量接种于300ml液体培养基，37℃、180rpm摇床将菌体培养至对数生长期，填加按步骤(二)方法制备的反应液50ul(缓冲溶液+ComQ+GPP，不含Pre-ComXP10)，继续培养72h。
实例三
将种子液以1％接种量接种于300ml液体培养基37℃，180rpm摇床将菌体培养至对数生长期，填加按步骤2方法制备的反应液50ul(只含缓冲溶液，不含Pre-ComX P10、ComQ和GPP)，继续培养72h。
(四)制备环脂肽粗品
实例一、实例二和实例三得到的发酵液均显黄绿色，且有较多泡沫。
从三组发酵液中提取环脂肽粗品的方法相同，具体步骤如下：
(1)将发酵液在6000rpm离心15min，取上清，用6mol/L浓盐酸将其pH调至2.0，4℃静置过夜(出现黄色沉淀)；
(2)6000rpm离心15min，取沉淀，用20mLpH为1.8的超纯水洗涤该沉淀3次；
(3)将重悬后的酸水沉淀物转移到50mL离心管，离心后以30mL甲醇重悬沉淀；
(4)重悬物转移至三角瓶中，37℃、180rpm抽提3h，12000rpm离心5min，上清液移至圆底烧瓶，将沉淀以25mL甲醇重悬；
(5)重复步骤(4)，同转速再离心一次，合并两次的上清液，将上清液42℃旋蒸浓缩至贴壁；
(6)加5mL超纯水冲洗圆底烧瓶壁上的环脂肽，缓慢旋转震荡，使其充分溶解于水中，将pH调至7.0，12000rpm离心5min，上清液过膜，得到环脂肽粗品。
(五)环脂肽粗品抑菌结果对照
将从实例一、实例二和实例三中提取的环脂肽粗品，分别进行抑菌实验。具体步骤如下：
(1)称取环脂肽粗品2mg溶解于200μl，50％乙腈溶液中；
(2)将混合液分别通过0.22μm有机滤膜除菌，备用；
(3)在温度为40℃左右倾倒固体培养基约15ml，待其凝固后，选取位置放置牛津杯；
(4)再次倾倒含有1％接种量的固体培养基15ml。静置待其凝固后，在牛津杯中添加环脂肽粗提液；
(5)置于4℃冰箱中，待环脂肽粗提液自由扩散完全后，放入37℃恒温培养箱培养24h，观察抑菌情况。
通过对比三组环脂肽粗提物的抑菌实验结果可知，解淀粉芽孢杆菌Q-426与人工合成的ComX信息素作用后，其环脂肽粗品的抑菌能力明显增强。实例一的抑菌圈直径最大，为15.44mm，见附图4。
(六)环脂肽粗品纯化得到环脂肽
将从实例一、实例二和实例三中提取的环脂肽粗品分别进行纯化，具体步骤如下：
(1)大孔强酸型阳离子树脂吸附纯化
向填有经预处理的HD-8树脂并已充分平衡的层析柱中加入5％BV即500μL的环脂肽水溶粗提品，用50％甲醇以3BV/h即0.5mL/min的流速冲洗树脂。冲洗过程中，当柱子流出端出现白色浑浊状流出液时开始收集，当流出液变澄清透明时停止收集与冲洗。将收集的白色浑浊流出液经42℃旋转蒸发除去甲醇，pH调至2.0，12,000rpm离心5min除去上清，用5％BV即500μL的超纯水溶解，经0.22μm醋酸纤维素膜过滤保存于4℃。
(2)色谱层析树脂吸附纯化
向一定量(10mL)已预处理的HZ-20ss树脂中加入5％BV即500μL的经HD-8处理过环脂肽水溶样品，4℃，100rpm静态吸附8h，将吸附样品的树脂进行装柱。用5BV即50mL的50％甲醇以6BV/h即1mL/min的流速冲洗柱子，再用12BV即120mL的90％甲醇以3BV/h即0.5mL/min的流速洗脱环脂肽，收集洗脱液。将洗脱液经42℃旋转蒸发除去甲醇，用5％BV即500μL的超纯水溶解，经0.22μm醋酸纤维素膜过滤保存于4℃。
(七)环脂肽的液相检测
对从实例一、实例二和实例三中纯化得到的环脂肽进行分析。具体色谱条件如下：
检测波长220nm；流动相A：水(0.1％三氟乙酸，TFA)；流动相B：80％乙腈(0.1％TFA)；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；洗脱时间40min，洗脱流程：0-40min，流动相A以50-13％比例，流动相B以50-87％比例梯度洗脱；色谱柱：ZorbaxSB-C18反相柱，5μm，4.6×250mm。色谱图见图5-8。
通过对比三组环脂肽液相分析结果可得到如下结论：
解淀粉芽孢杆菌产生的环脂肽主要有7种组分，分别为化合物a(色谱峰1)，化合物b(色谱峰2)，化合物c(色谱峰3)，化合物d(色谱峰4)，化合物e(色谱峰5)，化合物f(色谱峰6)，和化合物g(色谱峰7)。对比实例一、实例二和实例三的环脂肽产量附图9可知，在实例一中，解淀粉芽孢杆菌Q-426与人工合成的ComX P10作用后，其环脂肽类抗生素的产量明显提高。与实例三相比，总产量提高3.33倍，与实例二相比，总产量提高1.87倍。

Claims (4)

1.一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(一)采用Fmoc固相法合成Pre-ComX P10，所述Pre-ComX P10的氨基酸序列为YKWDGGFSIV；
(二)制备信号分子ComX P10；
(三)解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComX P10；
所述解淀粉芽孢杆菌Q-426保藏编号为CCTCC NO.M 2010237；
所述ComX P10的化学式为：
所述Pre-ComX P10的化学式为：H2N-VISFGGDWKY-COOH。
2.如权利要求1所述的提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，其特征在于，所述步骤(一)的具体过程为：
以Fomc保护酪氨酸取代的2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，利用Fomc固相合成法，按顺序依次连接9个Fomc保护的氨基酸，以冷冻的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的混合液为裂解液，将Pre-ComX P10从2-CTC树脂上切割下来；
所述的氨基酸分别为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Val-OH；
所述三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、间甲酚的体积比为95：4：1。
3.如权利要求1所述的提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，其特征在于，所述步骤(二)的具体过程为：将Pre-ComX P10与香叶基焦磷酸铵、ComQ在缓冲体系中反应生成ComX P10；
所述ComQ的制备方法如下：利用化学转化法将重组质粒转入重组大肠杆菌BL21感受态细胞中，并于含有氨苄霉素的LB固体培养基上过夜培养，当OD600在0.6-1.2之间时，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导，30℃培养8h后收集菌体，将收集的菌体用缓冲液悬浮后进行超声破碎，以13000rpm转速离心50min，得到上清液，将上清液依次经金属离子螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤层析后，得到ComQ蛋白。
4.如权利要求1所述的提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法，其特征在于，所述步骤(三)中：向发酵培养液中添加ComX P10后培养72h。
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