TWI522110B - Novel antimicrobial peptides and their use - Google Patents
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Description
本發明係有關一種抗菌物質,特別係指一種新穎抗菌胜肽及其用途。
按,近年來抗生素係被濫用,使得許多細菌具有抗藥性,例如:於靜脈內導尿管中發現之金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus),約有一半以上對於青黴素有抗藥性。而具有抗藥性之細菌係得透過質體將抗-抗生素之基因給予下一代,導致傳統抗生素無法有效地殺死具有抗藥性之細菌,使得目前對於治療細菌引發之相關疾病遇到一嚴重問題。
為能避免傳統抗生素之缺失,目前許多研究係致力於開發抗微生物胜肽,用以協助生物體抵抗或撲殺外來之病體。更進一步來說,抗微生物胜肽相較於傳統微生物係具有下列優點:其一、具有廣泛及迅速抗菌之功效,並且有效劑量較小,不容易造成微生物之抗藥性;其二、得刺激生物體之免疫細胞,用以增加生物體對抗疾病之免疫力。
因此,目前已有將抗微生物胜肽用於製備成為藥物,舉例來說,Magainin(藥名Pexiganan)應用於治療糖尿病引發的足部潰瘍(diabetic foot ulcers)、Indolicidin(藥名MBI-549)應用於治療皮膚痤瘡(acne)。
雖然抗微生物胜肽種類眾多並且具有良好抗菌功效,惟,抗微生物胜肽之構形為線性時,其於生物體中可能會被酵素水解而失去活性。為能使抗微生物胜肽於生物體內較不易被酵素水解,進而提昇抗微生物胜肽對酵素之安定性,因而目前較多抗微生物胜肽之開發係以環形胜肽為主。不過即便透過構型之改變,使抗微生物胜肽於個體體內係保持良好之抗菌活性,但是,仍需提昇其對於人體之安全性,例如,造成溶血之副作用,始能有效並且安全地被應用於人體上。
據此,開發出一具有良好抗菌功效及安全性高之抗微生物胜肽,乃係目前研究人員最重要之課題。
本發明之主要目的係在於提供一種新穎抗菌胜肽,其係用以有效地對抗病原菌,並且避免使病原菌產生抗藥性。
本發明之另一目的係在於提供一種醫藥組合物,其係用以治療微生物引起之相關疾病,並且能夠降低對於人體之副作用。
本發明之又一目的係在於提供一種抗菌組合物,其係用以提供予生物體使用,用以對抗至少一微生物對於人體健康所產生之不良影響,達到提昇人體健康之功效。
為能達成上述目的,本發明實施例中係揭露一種新穎抗菌胜肽,其係能夠抑制微生物生長,並且具有低溶血性,而能降低對人體之副作用。
較佳地,該新穎抗菌胜肽之胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2。
較佳地,該新穎抗菌胜肽係以固相胜肽合成法所製成。
於本發明之另一實施例中所揭醫藥組合物,其係包含有效量上述任一新穎抗菌胜肽,以及至少一藥學上可接受之載體。藉由將本發明所揭醫藥組合物投予至個體,能夠治療由一微生物引起之疾病。
較佳地,該微生物係為大腸桿菌、金黃素葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)等。
本發明之又一實施例中所揭抗菌組合物,其係至少包含有效量之上述任一新穎抗菌胜肽。而藉由將該抗菌組合物提供予生物體使用,能夠有效抑制至少一微生物生長,達到提昇人體健康之功效。
較佳地,該微生物係為大腸桿菌、金黃素葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。
第一圖係為大腸桿菌之生長曲線圖。
第二圖係為金黃葡萄球菌之生長曲線圖。
第三圖係為綠膿桿菌之生長曲線圖。
本發明所揭新穎抗菌胜肽之胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2。由於該新穎抗菌胜肽具有良好抑制微生物生長之能力,並且具有低副作用,因此,能作為抗菌醫藥組合物之有效成份,或是作為抗菌組合物之活性成份。而如同本發明所屬技術領域且具通常知識者所周知者,該新穎抗菌生態系得以人工合成技術、基因轉殖技術或上述技術之組合所獲
得,例如固相胜肽合成法。
除非另有定義,於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之技術及科學名詞之意義,其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形,以本發明內容為準。
所謂所謂「人工合成方式」乙詞係為以本發明所屬技術領域且具通常知識者之周知技術,透過人工方式將胺基酸依序連接而成為一多胜肽,而人工合成法通常具有以下優點:可方便地於合成過程中改變多胜肽之一級結構、加入特殊的胺基酸、以及對多胜肽之末端進行修飾等。人工合成方式又可分為化學合成法以及胜肽合成儀,其中,化學合成法更可分為固相胜肽合成法及液相胜肽合成法。液相合成法必須於完成每一胺基酸之連接後,進行萃取操作。而固相合成法係將胜肽合成在如樹脂之固相支撐物上,再藉由化學裂解方式將胜肽自樹脂上裂解後,進行冷凍乾燥以得到胜肽之粗產物。相較於液相合成法需要額外進行層析純化等步驟,固相合成法僅須透過清洗及過濾等操作流程,即可將固相支撐物、反應試劑及產物分開,因此,固相胜肽合成法因為不需要純化中間產物,不僅具有較佳產率,且可大幅縮短反應時間,於長鏈多胜肽之合成上亦較具優勢,為目前較為廣為人所使用之胜肽合成方法。
所謂「基因轉殖技術」乙詞係指發明所屬技術領域且具通常知識者將用以表現特定多胜肽之核酸序列構築於一表現載體上,透過將該重組表現載體轉形至一宿主細胞中表現,而獲得特定多胜肽,其中,宿主細胞得為一微生物,例如:大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌等。
所謂「醫藥組合物」,其係包含有一有效劑量之活性成份,
以及藥學上可接受之載體或/及賦形劑,而該醫藥組合物得依據使用需求製備為適當之劑型,包含有針劑、錠劑、丸劑、散劑、液態、膠體、乳狀、懸浮液、栓劑等。
所謂「藥學上可接受之載體」,其係需與醫藥組合物之活性成份相容,較佳者係更得增加醫藥組合物之穩定性,並且不得對於個體有危險性。藥學上可接受之係得依據使用劑型而有所不同,包含有,但不限於,玉米澱粉、乳糖、纖維素、硬脂酸鎂、膠質氧化矽、麥芽糊精、水等。
所謂「賦形劑」,係指不具有藥理活性之成份,包含,但不限於,著色劑、風味劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、填充劑等。
以下,為能更進一步說明本發明之功效,將茲舉若干實例作詳細說明,惟,該等實例係為用以解說之例示,其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。
實例一:細菌培養
自財團法人食品工業發展研究所購買大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC25923)及綠膿桿菌(Pseudomon asaeruginosa,ATCC27853)三種菌株。
取上述各該菌株0.1-0.2mL,分別接種於洋菜膠培養基上,作畫線分離培養,用無菌L型玻棒均勻塗抹,進行培養一夜。將各該培養基上之單一菌落移轉至液態Lb培養基,於37℃培養箱中進行大量培養。培養隔夜,取含有各該菌株之菌液以無菌水進行不同比例稀釋,菌液與無菌水之比例為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及1:64,再以UV光譜儀測定於595nm下,不同比例稀釋液之光學密度值(OD595值),用以推算出菌
液中之菌數,並且製作出標準曲線。
根據上述步驟,分別獲得大腸桿菌、金黃素葡萄球菌及綠膿桿菌之生長曲線圖,如第一圖至第三圖所示,其中,大腸桿菌培養2小時後,光學密度值為0.712;金黃素葡萄球菌培養2小時後,光學密度值為0.762;綠膿桿菌培養2小時後,光學密度值為0.610。
實例二:固相胜肽合成法
本實例中係藉由Fmoc系化學之固相胜肽合成法加以合成胜肽。詳言之,將胜肽合成在樹脂支撐物(PAL Rink resin)上,裝置在反應針筒內,加入5毫升之二氯甲烷(dichloromethane,DCM)使該樹脂支撐物膨大,反應5分鐘,重複兩次,在加入5毫升之二甲基甲醯胺(Dimethylformamide,DMF)使該樹脂支撐物濕潤,反應5分鐘,重複兩次,而後加入5毫升且濃度為30%之哌啶/二甲基甲醯胺(Piperidine/DMF)混合反應15分鐘,重複兩次後,加入5毫升之二甲基甲醯胺,混合反應5分鐘,重複三次。取胺基酸0.25mmole與耦合試劑(HOBt:HBTU:DIEA=1:1:2)反應5分鐘後,再加入反應針筒內與Rink amide PAL resin混合反應2小時。待反應結束後,加入5毫升之二甲基甲醯胺潤洗5分鐘,以寧海準試驗(Ninhydrin test)測試耦合是否成功。
寧海準試驗之流程如下:取10μL之寧海準試劑(Ninhydrin)於試管中,並取少量之樹脂置於上述試管中,於95℃油浴中加熱5分鐘,若該樹脂支撐物呈現透明或黃色,表示耦合成功,即可使用二甲基甲醯胺洗滌後,再接下一個胺基酸,而倘若該樹脂支撐物呈現深藍色,則表示耦合可能失敗需重新耦合1次。
持續重複上述去保護基(de-protection)反應及耦合反應,直到所有的組成胺基酸被接在樹脂上。最後加入30%之哌啶/二甲基甲醯胺5毫升反應15分鐘,重複兩次後,加入5毫升之二甲基甲醯胺潤洗5分鐘,重複兩次,可得到去除胺基酸上N端之Fmoc保護基,最後以化學裂解法將完成合成之胜肽自樹脂上切下,經由減壓過濾後,取得濾液,純化得到線狀胜肽粗產物。
實例三:合成甲基化胜肽
首先,以固相胜肽合成法進行胜肽合成,將胜肽固定在樹脂支撐物上。而後,加入o-NBS-Cl(4eq)和三甲基吡啶(collidine)(10eq)於2毫升之N-甲基吡咯酮(N-Methyl-2-Pyrrolidone,NMP)之N端保護試劑及催化劑,反應15分鐘後,將樹脂以N-甲基吡咯酮清洗五次,即可得到N端具有o-NBS保護基團的胺基酸。而後將催化劑DBU(3eq)與1毫升之N-甲基吡咯酮混合後,進行預活化,再加入硫酸二甲酯(10eq)及1毫升之N-甲基吡咯酮之甲基化試劑,與帶有o-NBS保護基團之胺基酸進行甲基化反應,以得到Nd-Methyl-Nd-o-NBS-peptides。而後,配製去保護基試劑,其含有5eq之DBU及10eq之2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)並與2毫升N-甲基吡咯烷溶液進行混合,加入於反應管中,混合反應一小時,重複2次,將o-NBS保護基去除,得到N端被甲基化之胜肽(N-methylated peptides)。接著再以欲接上之胺基酸(3eq)、HATU(3eq)、HOAt(3eq)及DIEA(6eq)溶於4毫升N-甲基吡咯酮之耦合試劑中,進行胺基酸耦合反應。重複進行上述步驟,直到所有胺基酸都鍵結在樹脂上。最後需以裂解試劑三氟乙酸(TFA)去除側鏈保護基,並將胜肽從樹脂上切下,
搖晃反應數小時後,收集其濾液,純化得到甲基化胜肽之粗產物。
實例四:純化胜肽
將胜肽粗產物使用半製備管柱(semi-preparative column)以逆相高效能液相層析儀(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)確認其純度及滯留時間,並且經冷凍乾燥而得獲得純化後胜肽,其中,管柱為5μm之C18管柱;固定移動相流速為每分鐘4毫升;移動相溶劑之組成分別為溶劑A:4公升之蒸餾去離子水及0.05%之三氟乙酸,溶劑B:4公升之乙腈(acetonitrile)及0.05%之三氟乙酸;UV光源之波長為225nm。
實例五:鑑定胜肽分子量
以基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF)鑑定合成胜肽之分子量。
將待分析物與具有吸收雷射能量特性的基質溶液(CHCA),等比混合均勻,取約1μL之混合液置於樣品盤,待揮發性溶劑揮發後,基質和待分析物係於樣品盤上形成固體共結晶(cocrystal),該混合物係得送入質譜儀游離源內,並以脈衝式雷射照射,使該混合物於真空狀態下進行脫附游離,再以質量分析器測量其m/z比值,進而推算其質量。
實例六:製備胜肽
藉由實例二至五所述方法,製備如下表一所示胜肽。
表一:合成胜肽及其對應序列
實例七:抗菌測試
取實例一中之各該細菌,分別液態培養於2mL LB broth培養液至半對數生長期(mid-log phase)。根據法蘭氏濁度標準組(McFarland Standard)所示0.5之OD595值為0.08~0.09,菌數為1×108CFU/mL,因而用無菌水稀釋各該菌液,使其與法蘭氏濁度標準組0.5具有一樣之OD595值。再將菌數1×108CFU/mL稀釋成1×105CFU/mL,使最後各該菌液之濃度為5×105CFU/mL於MHB培養液(Mueller Hinton broth)。
取各該稀釋菌液199μL於96孔盤,分別加入實例六中之各該胜肽,劑量為1μL,於37℃培養箱培養16小時。使用微量盤分光光譜儀測量各該菌液與各該胜肽共同培養後之OD595值,並且,以未加入胜肽之菌液作為正調控組(positive control,PC),以無菌液之MHB培養液作為負調控組(negative control,NC),並且,以下列公式計算制定出各該胜肽對於各該細菌之最小抑制濃度(minimum unhibitory concentration,MIC90),其中,A表示吸光值之大小。測定結果如下表二所示。
MIC90≦[(A胜肽-A負調控組)/(A正調控組-A負調控組)]
再者,各取1μL與各該胜肽共同培養後之各該菌液塗抹於平盤培養基上,在37℃培養箱培養24小時,觀察其最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。如完全無菌,則將所使用試劑之濃度表
示為最小殺菌濃度。結果如下表三所示。
由表一及表二之結果可知,本發明所揭編碼為SEQ ID No.2之胜肽係具有抑制微生物生長之功效。
實例八:溶血性測試
將200μM之胜肽溶液分別與將0.2%之人類紅血球溶液以等體積相混合,使胜肽濃度為100μM,再於37℃下培養1小時,並且以酵素連結免疫吸附法判讀機(ELISA plate reader)於波長405nm下測定各該胜肽混合液之吸光值,再以下列公式計算出其溶血性,其中,Abs表示吸光值。測定結果如下表四所示。
[(Abs胜肽-Abs磷酸鹽緩衝液)/(AbsTriton X-100-Abs磷酸鹽緩衝液)]x 100
表四:各胜肽之溶血性
如同本發明所屬技術領域且具通常知識者所周知者,溶血性過高會使個體紅血球溶解而被破壞,導致個體出現貧血、疼痛等副作用,甚而出現較為嚴重危害生命。
由表二至表四之結果可知,雖然胜肽2係具有抗菌能力,並且,溶血性係顯著降低,顯示胜肽2對於人體副作用顯著降低。
據此,本發明所揭編碼為SEQ ID No.2之胜肽係具有低溶血性,而能達到降低由上述實例之結果可知,本發明所揭新穎抗菌胜肽係具有以下優點:
其一、本發明所揭新穎抗菌胜肽具有抑制多種病原菌之功效,是以,能應用於抗菌組合物或作為醫藥組合物中之有效成份,於生活中或臨床上發揮其抗菌功效。
其二、本發明之新穎抗菌胜肽能夠於發揮抗菌功效下,更得減少造成個體健康產生不良影響,具有較佳之安全性。
其三、本發明所揭新穎抗菌胜肽更得改善傳統抗生素之缺失,避免病原體對其產生抗藥性。
以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明,熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下,而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化,均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。
<110> 東海大學
<120> 新穎抗菌胜肽及其用途
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 1
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 2
Claims (6)
- 一種新穎抗菌胜肽,其胺基酸序列編碼係為SEQ ID No.2。
- 依據申請專利範圍第1項所述新穎抗菌胜肽,其係以固相胜肽合成法所製成。
- 一種醫藥組合物,其係至少包含一有效量之如申請專利範圍第1項所述新穎抗菌胜肽,以及一藥學上可接受之載體。
- 依據申請專利範圍第3項所述醫藥組合物,其中,該微生物係選自由大腸桿菌、金黃素葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)所組成之群。
- 一種抗菌組合物,其係至少包含有一如申請專利範圍第1項所述新穎抗菌胜肽。
- 依據申請專利範圍第5項所述抗菌醫藥組合物,其中,該微生物係選自由大腸桿菌、金黃素葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)所組成之群。
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Cited By (1)
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TWI782422B (zh) * | 2021-02-19 | 2022-11-01 | 台灣中油股份有限公司 | 一種胜肽組合物及其抗菌用途 |
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2014
- 2014-11-10 TW TW103138945A patent/TWI522110B/zh active
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