CN113583090B - 具有抗菌活性的阿诺普林改造肽及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供系列具有强抗菌活性的阿诺普林改造肽，其氨基酸序列依次为序列表中SEQ ID No.2‑8。本发明还提供其制备方法和其在抑菌中的应用。本发明的系列阿诺普林改造肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抗菌活性，其氨基酸序列短、结构简单、合成方便、抗菌活性高，可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌引起的疾病的预防与治疗。在生理盐条件下以及血清条件下均对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抗菌活性，当与抗生素联合使用时，部分组合存在协同功效。本发明多肽ANP‑7的环状结构有利于提高多肽稳定性，且其抗菌活性优于相同氨基酸序列的直链结构阿诺普林。

Description

具有抗菌活性的阿诺普林改造肽及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于抗菌生物制剂技术领域，具体涉及具有强抗菌活性的阿诺普林改造肽及其合成方法和应用。
背景技术
传统抗生素耐药性的不断增长促进了抗菌肽的迅速发展。抗菌肽(AntimicrobialPeptides，AMP)是一类具有抗菌活性的多肽，来源种类丰富，作为抵御入侵病原体的第一道防线，在各种类生物中均可发现。
随着对抗菌肽研究的不断深入，天然抗菌肽中阳离子型抗菌肽由于其序列中富含精氨酸或赖氨酸，抗菌活性普遍较强，其作用机制为抗菌肽中阳离子氨基酸侧链的氨基或胍基等碱性基团与体内环境中氢离子相结合后，通过与负电性的细菌细胞膜的磷脂双分子层静电作用，肽链疏水端插入磷脂双分子层的疏水内部，负载于细菌细胞膜上干扰细菌细胞内外渗透压、裂解细菌的细胞膜结构，最终导致病原体的死亡。抗菌肽的正电性和氨基酸残基的疏水作用而引起的膜破坏是区别于传统抗生素的主要抗菌方式，因此不易产生细菌耐药性。此外，抗菌肽还依赖其二级结构发挥特定的抗菌作用。基于抗菌肽抗菌谱广、作用快速强效且不易引起细菌耐药性等优点，抗菌肽被认为是传统抗生素的理想替代品。因此开发一种安全有效的抗菌肽，用于替代抗生素在抗菌领域的应用，具有重要的应用价值。
天然抗菌肽阿诺普林(Anoplin，GLLKRIKTLL-NH2)作为在天然来源中发现的最短α-螺旋两亲性抗菌肽，由于简单而独特的结构和多样的生物活性，引起了研究者广泛的研究兴趣。近二十年的研究表明，阿诺普林主要通过离子通道与阴离子磷脂双分子膜的疏水端直接相互作用来发挥其功能，并具备选择性结合细菌DNA、抑制ATP合酶的能力。由于阿诺普林具有典型的非受体介导的膜机制，其比常规抗生素和化学疗法具有更特别的优越性，具有广泛的生物学活性，包括抗菌、肥大细胞脱粒、抗肿瘤、抗疟药、抗真菌药和抗炎活性。此外，阿诺普林具有结构简单易于合成、对哺乳动物红细胞不具备溶血活性等优点，其在化学操作，结构-活性关系研究，作用机理和医学应用方面均显示出优越性，作为一种新型的抗生素和抗癌药物具有巨大的潜力。
发明内容
本发明提供了一系列阿诺普林改造肽，该改造肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌活性。
本发明提供系列具有强抗菌活性的阿诺普林改造肽，所述阿诺普林改造肽为ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7，其氨基酸序列依次为序列表中SEQ IDNo.2-8。
本发明的系列改造肽是在阿诺普林(Anoplin，简称ANP)的基础上改造而成的。
ANP的氨基酸序列为GLLKRIKTLL-NH2。
本发明ANP-1改造肽的序列特征：长度为10个氨基酸构成，将序列中Arg5替换为阳离子氨基酸Lys5，具体序列：GLLKKIKTLL-NH2。
本发明ANP-2改造肽的序列特征：长度为10个氨基酸构成，将序列中Lys4和Lys7分别替换为阳离子氨基酸Arg4和Arg7，具体序列：GLLRRIRTLL-NH2。
本发明ANP-3改造肽的序列特征为：长度为11个氨基酸构成，在Anoplin的N末端引入1个Lys，具体序列：KGLLKRIKTLL-NH2。
本发明ANP-4改造肽的序列特征为：长度为12个氨基酸构成，在Anoplin的N末端引入2个Lys，具体序列：KKGLLKRIKTLL-NH2。
本发明ANP-5改造肽的序列特征为：长度为13个氨基酸构成，在Anoplin的N末端引入3个Lys，具体序列：KKKGLLKRIKTLL-NH2。
本发明ANP-6改造肽的序列特征为：长度为14个氨基酸构成，在Anoplin的N末端引入4个Lys，具体序列：KKKKGLLKRIKTLL-NH2。
本发明ANP-7改造肽的序列特征为：长度为22个氨基酸构成，其氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间形成二硫键，具体序列：LLTKIRKLLGCCGLLKRIKTLL-NH2。
本发明还提供系列具有强抗菌活性的阿诺普林改造肽的合成方法，步骤如下：
(1)ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6的合成
采用Fmoc经典固相合成法合成多肽，以MBHA树脂为载体，20％哌啶/DMF溶液洗脱Fmoc保护基团，以HBTU和HOBt作为肽链偶联剂，使肽链从C端向N端延伸，直至到达所需长度，随后通过0.95％TFA/水溶液切割肽链，DCM旋蒸浓缩肽液，RP-HPLC纯化分离，冻干得Anoplin改造肽ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5和ANP-6；
(2)ANP-7的合成
采用Fmoc经典固相合成法合成多肽，以MBHA树脂为载体，20％哌啶/DMF溶液洗脱Fmoc保护基团，以HBTU和HOBt作为肽链偶联剂，使肽链从C端向N端延伸，直至到达所需长度，通过0.95％TFA/水溶液切割肽链，DCM旋蒸浓缩肽液得ANP-7单链粗产物，随后用碘氧化法对单肽链进行二硫键的连接，浓缩得ANP-7粗产物，RP-HPLC纯化分离，冻干得Anoplin改造肽ANP-7。
本发明还提供一种药物组合物，包含上述系列阿诺普林改造肽中的一种或几种。
作为优选，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
作为优选，所述阿诺普林改造肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2、6或8。
作为优选，所述药物还包含抗生素，所述抗生素选自庆大霉素、万古霉素或多粘菌素B。
作为优选，所述药物组合物的有效成分为：氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2的阿诺普林改造肽和庆大霉素；或
所述药物组合物的有效成分为：氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2或SEQ IDNo.8的阿诺普林改造肽和万古霉素；或
所述药物组合物的有效成分为：氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2的阿诺普林改造肽和多粘菌素B。
本发明还提供上述的系列具有强抗菌活性的阿诺普林改造肽，或，上述的药物组合物在制备金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌抑制剂中的应用。
本发明还提供上述的系列具有强抗菌活性的阿诺普林改造肽，或，上述的药物组合物在制备预防和/或治疗金黄色葡萄球菌感染和大肠杆菌感染的药物中的应用。
本发明的系列阿诺普林改造肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抗菌活性，其氨基酸序列短、结构简单、合成方便、抗菌活性高，可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌引起的疾病的预防与治疗。在生理盐条件下以及血清条件下均对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抗菌活性，当与抗生素联合使用时，部分组合存在协同功效。本发明多肽ANP-7有利于提高多肽稳定性，且其抗菌活性优于未用二硫键连接的阿诺普林。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1-8依次为ANP、ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7的MS鉴定谱图。
图9-16依次为ANP、ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7的RP-HPLC分析谱图。
图17为阿诺普林系列改造肽对大肠杆菌抑菌率的变化趋势。
图18为阿诺普林系列改造肽对金黄色葡萄球菌抑菌率的变化趋势。
图19为不同浓度不同系列的阿诺普林改造肽培养18h后的抑菌情况。图中，1为ANP；2为ANP-1；3为ANP-5；4为ANP-7。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1氨基酸序列为ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7抗菌肽的合成
(1)预处理：根据MBHA取代值计算0.2mmoL产物所需用量，将0.55gMBHA树脂(取代值0.365mmol/g)与15mLDCM一同加入25mL固相合成器中，于室温下溶胀30min。树脂充分溶胀后，用真空泵隔膜泵抽滤干树脂，再加入适量DMF洗涤一次。
(2)肽链脱保护：在固相合成管中加入适量20％哌啶/DMF溶液摇床充分震荡30min(39℃，180rpm)。反应结束后DCM、DMF反复洗涤多次，除去残余哌啶溶液。随后利用Kaiser法检测暴露氨基酸，称取少量树脂于水合茚三酮溶液中加热1-2min，根据不同种类氨基酸树脂呈现不同颜色，显色即为完成脱保护，检测重复三次。
(3)肽链缩合反应：茚三酮检测显色后，即可依据肽链序列逐步连接氨基酸。氨基酸溶液配制方法为：分析天平称量3eq Fmoc-AA-OH和肽偶联试剂3eqHBTU、3eqHOBt，超声3min使其完全溶解于15mL sp.DMF。随后吸取5eq DIEA作为反应启动剂，与配制好的氨基酸溶液一同加入固相合成管内，摇床充分震荡反应3h(39℃，180rpm)。
反应结束后，Kaiser法检测连接效果，茚三酮检测不显色证明反应成功，该氨基酸连接于树脂上，即可进行下一步骤。
a、ANP-1肽链合成
反复进行(2)(3)步骤，根据ANP-1序列从C端至N端依次连接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，即可得到ANP-1。
b、ANP-2肽链合成
反复进行(2)(3)步骤，根据ANP-2序列从C端至N端依次连接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，即可得到ANP-2。
c、ANP-3肽链合成
反复进行(2)(3)步骤，根据ANP-3序列从C端至N端依次连接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，即可得到ANP-3。
d、ANP-4肽链合成
反复进行(2)(3)步骤，根据ANP-4序列从C端至N端依次连接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，即可得到ANP-4。
e、ANP-5肽链合成
反复进行(2)(3)步骤，根据ANP-5序列从C端至N端依次连接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，即可得到ANP-5。
f、ANP-6肽链合成
反复进行(2)(3)步骤，根据ANP-6序列从C端至N端依次连接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，即可得到ANP-6。
g、ANP-7单链肽链合成
反复进行(2)(3)步骤，根据ANP-7序列从C端至N端依次连接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH，即可得到ANP-7单链。
(4)肽链切割
全部氨基酸连接完成后，加入20％哌啶/DMF溶液加热震荡30min，茚三酮检测以确保脱去Fmoc保护基团后，反复洗净树脂至无哌啶溶液，即可将肽链从MBHA树脂上切割下来。切割步骤在通风橱进行，切割液的配制为TFA：H2O＝0.95:0.05。将切割液少量多次倒入固相合成管中使树脂转移至烧杯内，室温下磁力搅拌器上搅拌3h，再次倒入固相合成管中用DCM溶液反复清洗树脂，并将已切离树脂的多肽溶液抽滤至圆底烧瓶中，清洗至溶液无色即可。采用旋转蒸发方式将多肽溶液进行浓缩收集(水浴温度不超过39℃，防止多肽降解)，浓缩旋干圆底烧瓶中所有多肽溶液，瓶中倒入无水乙醚形成白色粉末粗肽，-4℃沉淀过夜，次日离心去除上清，即可得到粗肽产品。
(5)ANP-7中二硫键的形成
将步骤(4)中得到的ANP-7单链粗肽产物加少量水溶解，称取101mg I2到500mL锥形瓶中加入300mL 75％甲醇-水溶液中，缓慢滴加多肽溶液并搅拌30min。将锥形瓶中溶液转移到500mL茄形瓶中，在旋转蒸发器上进行减压蒸馏，即可得到ANP-7产物。
(6)抗菌肽的纯化及分析
抗菌肽制备的纯化采用制备液相进行纯化，色谱柱型号为SHIM-PACK，PRC-ODS尺寸：20mm×25cm，流动相A为0.1％TFA/乙腈溶液，流动相B为0.1％TFA/水溶液，单次进样量为2mL，收集220nm处出峰样品。
抗菌肽制备的分析采用HPLC进行液相分析，色谱柱型号为Diamonsil C18，流动相A为0.1％ TFA/乙腈溶液，流动相B为0.1％ TFA/水溶液，流动相使用前均进行洗脱处理，流速为1mL/min，单次进样量为10μL，检测220nm处出峰情况，待检测目标峰完毕收集目标样品，并采用旋转蒸发方式浓缩肽液至旋干，随后用去离子水溶解多肽样品，冷冻干燥获得产物。利用高液相色谱仪再次检测其220nm处吸收峰，并用面积归一化法计算粗肽产物纯度。
(7)抗菌肽分子量鉴定
抗菌肽的鉴定采用三重四级杆液质联用仪进行质谱鉴定，色谱柱为AgilentEclipsePlus C18 RRHD 1.8μM，流动相为50％甲酸/水溶液，单次样品进样量为10μL，样品经色谱柱分离后，全扫鉴定产物，利用质荷比计算验证产物分子质量，结果见表1。
表1阿诺普林系列抗菌肽的设计序列、产物纯度、电荷数、质荷比和分子质量表
Figure GDA0004167263370000071
本实验所合成的阿诺普林系列抗菌肽纯度均达到90％以上。利用质谱检测其质荷比求得分子质量，理论质荷比与实际质荷比一致，误差在合理范围内，鉴定结果表示合成正确。
图1-8依次为ANP、ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7的MS鉴定谱图。
图9-16依次为ANP、ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7的RP-HPLC分析谱图。
表2-表9依次为RP-HPLC的出峰分析。
表2
Figure GDA0004167263370000081
表3
Figure GDA0004167263370000082
表4
Figure GDA0004167263370000083
表5
Figure GDA0004167263370000084
表6
Figure GDA0004167263370000085
表7
Figure GDA0004167263370000086
表8
Figure GDA0004167263370000091
表9
Figure GDA0004167263370000092
实施例2实施例1制备的阿诺普林系列抗菌肽的最低抑菌浓度测定
本实验采用经典微量二倍稀释法测定阿诺普林系列抗菌肽的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，标准菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 25922。
培养标准菌株至对数生长期，用MH肉汤稀释菌液浓度为1×106CFU/mL。按照相应浓度配制抗菌肽溶液，用去离子水溶解实施例1中抗菌肽后过无菌滤膜二倍稀释法连续稀释配制成256μM、128μM、64μM、32μM、16μM、8μM、4μM、2μM的抗菌肽溶液。随后，将50μL菌液和50μL不同浓度的抗菌肽溶液分别加入96孔板中，平行三组，庆大霉素作为阳性对照，PBS作为阴性对照，37℃培养18h后观察菌株生长情况，将孔内观察到抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的最低抗菌肽浓度记为最低抑菌浓度，结果见表10。
表10阿诺普林系列抗菌肽的最低抑菌浓度
Figure GDA0004167263370000093
结果表明，除ANP-2对金黄色葡萄球菌不存在抗菌活性外(MIC值大于128μM即表明该药物无明显抑菌效果)，本发明的其余阿诺普林系列抗菌肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌效果：
(1)阳离子氨基酸替换：
ANP-1、ANP-2采用阳离子氨基酸精氨酸和赖氨酸对母肽阿诺普林的替换改造，发现母肽ANP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为64μM，赖氨酸替换肽ANP-1对大肠杆菌的MIC值为32μM，较母肽好，但对金黄色葡萄球菌的MIC值为64μM，呈现出和母肽一样的最低抑菌浓度。精氨酸替换肽ANP-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为128μM和256μM，抑菌效果低于母肽和ANP-1，说明与赖氨酸相比精氨酸的引入在一定程度提高了阿诺普林抗菌肽对革兰氏阴性菌的抗菌活性，但对革兰氏阳性菌的抗菌活性影响并不显著。
(2)肽链长度：
阿诺普林系列抗菌肽中的系列多肽ANP-3到ANP-6分别为在阿诺普林N端增加1至4个赖氨酸。发现除ANP-3与母肽抗菌活性相当外，ANP-4至ANP-6相较于母肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性均有所增强，且随着赖氨酸数量的增多，抑菌活性逐渐增强，其中ANP-5对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为8μM和4μM，抗菌活性较母肽分别提高8倍和16倍，ANP-6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为8μM，较母肽提高8倍。可以看出随着阿诺普林的N端赖氨酸数量的增加，抗菌活性显著增加。但当N端赖氨酸数量多于3个后，抗菌活性不再变化。由于ANP-5氨基酸序列长度比ANP-6短，且抗菌活性稍好于ANP-6，因此筛选ANP-5进行本序列后续抗菌机理研究。
(3)二硫键：
ANP-7与阿诺普林母肽相比，ANP-7对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性为母肽的4倍；说明在不改变阿诺普林母肽序列的基础上，通过引入二硫键，增加单位摩尔浓度中阿诺普林氨基酸序列个数有利于提高阿诺普林的抗菌活性。
实施例3实施例1制备的阿诺普林系列抗菌肽的抑菌率测定
为了进一步考察阿诺普林系列抗菌肽抗菌活性，选取金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠杆菌ATCC 25922作为实验标准菌株，采用比浊法通过测定相同时间内的菌浓度，计算抗菌肽的抑菌率，实验步骤如下：
将生长至对数生长期的标准菌液用MH肉汤稀释菌浓度至1×106CFU/mL。无菌水溶解粗肽产品，二倍稀释法连续稀释，配制浓度依次为256μM、128μM、64μM、32μM、16μM、8μM的多肽溶液。将50μL菌液和50μL不同浓度的多肽溶液分别加入96孔板中于37℃培养18h，在酶标仪中测量OD600下的吸光度，每组平行三次，以庆大霉素作为阳性对照，PBS作为阴性对照，该实验重复三次。抑菌率计算公式为：
抑菌率＝(A阴性对照-A实验组)/(A阴性对照-A阳性对照组)×100％
大肠杆菌抑菌率实验结果见表11、图17，金黄色葡萄球菌抑菌率试验结果见表12、图18，所有数据均采用单因素方差分析，并进行组间比较显著性差异，当P<0.05时，表示两组数据之间存在显著性差异，具有统计学分析意义；当P<0.01时，表示两组数据之间差异非常显著，具有统计学分析意义。当P≥0.05时，表示两组数据之间无明显差异，不具有统计学分析意义。
表11结果表明，通过比较不同系列抗菌肽分别在不同浓度下的抑菌活性，详细阐述系列抗菌肽在不同浓度条件下对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌率之间的抑菌效果差异。
(1)对大肠杆菌抑菌效果的比较
阿诺普林系列抗菌肽对大肠杆菌的抑菌率测定结果和抑菌趋势如表11和图17所示，所有抗菌肽在浓度大约128μM时，均表现出较好的抑菌活性，但随着抗菌肽浓度的下降，抗菌活性逐渐降低。
a、抗菌肽ANP-1和抗菌肽ANP-2在浓度大约64μM时与母肽ANP的抑菌率无明显区别(均在100％)，当浓度在32μM至8μM时，ANP-1和ANP-2的抑菌率随抗菌肽的浓度下降而降低，但与母肽比较无显著性差异，说明精氨酸和赖氨酸对于抗菌肽的生物活性改变不大；
b、随着N末端赖氨酸数量的增加，抑菌效果逐渐增强，且当抗菌肽浓度低于64μM时，抑菌效果随着抗菌肽浓度的下降显著下降，且呈现浓度依赖性。但N端赖氨酸数量增加到3个及以上时(ANP-5与ANP-6)，抗菌肽在实验浓度下均保持着与高浓度同样的抗菌效果，说明N末端增加赖氨酸，有利于增加抗菌肽的抑菌效果；
c、通过引入二硫键而将两条相同的母肽链接起来，及改造肽ANP-7，与母肽ANP相比，其抑菌率在各浓度下均强于母肽，猜测是二硫键的引入对抗菌肽的结构具有一定的稳定作用，同时增加了单位摩尔质量的母肽数量。
表11阿诺普林系列抗菌肽对大肠杆菌抑菌率的测定
Figure GDA0004167263370000111
Figure GDA0004167263370000121
备注：表格中**表示P<0.01，即两组数据之间差异非常显著，具有统计学分析意义；*表示P<0.05，即两组数据之间差异显著；无*标注表示P≥0.05，即两组数据之间无明显差异，不具有统计学分析意义。
如图17所示，通过对不同浓度阿诺普林系列抗菌肽对大肠杆菌抑菌率的比较，可以看出；ANP-5和ANP-6的抗菌率均接近100％，较母肽ANP提高了1倍，对大肠杆菌具有较好的抗菌活性；随着抗菌肽浓度的升高，ANP-5、ANP-6、ANP-7均显示出显著的抗菌活性，抑菌率接近为100％；当抗菌肽浓度高于64μM时，ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7对大肠杆菌的抗菌活性均达到95％以上，此结果和表11中最低抑菌浓度的结果一致，证明了阿诺普林改造肽具有抗菌活性，N-端修饰赖氨酸和通过引入二硫键增加单位摩尔质量的阿诺普林分子数量可以显著提高阿诺普林系列抗菌肽的抗菌活性。
图17为阿诺普林系列抗菌肽对大肠杆菌抑菌率的变化趋势。
(2)对金黄色葡萄球菌抑菌效果的比较
阿诺普林系列抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌率测定结果和抑菌趋势如表12、图18所示，所有抗菌肽在高浓度256μM和128μM时均呈现良好抗菌活性，但当浓度低于128μM时，随着抗菌肽浓度的降低抑菌率逐渐下降。
a、随着抗菌肽浓度的下降，抗菌肽ANP-1对金黄色葡萄球菌由98％降至80％，ANP-2对金黄色葡萄球菌的抑菌率由91％降为66％，ANP-1各浓度抑菌率大约为80％左右，与母肽相比改造肽各浓度的抑菌效果均较母肽下降。说明阿诺普林抗菌肽具有序列特异性；
b、阿诺普林N端增加赖氨酸数目的序列，随着赖氨酸个数的逐个递增，系列改造肽对金黄色葡萄球菌的抑菌率逐渐增加，其中ANP-5的抑菌效果最佳，实验组各浓度抑菌率均接近100％，而ANP-6对金黄色葡萄球菌的抑菌率则低于ANP-5，该结果进一步说明N端增加3个赖氨酸为阿诺普林N端结构改造的最适数量，继续增加N末端赖氨酸数量，则抗菌活性不会继续提高；
c、与阿诺普林母肽相比，ANP-7对金黄色葡萄球菌的抑菌效果没有显著提升，说明二硫键的形成对金黄色葡萄球菌的抗菌效果并不明显。
表12阿诺普林系列抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌率的测定
Figure GDA0004167263370000122
Figure GDA0004167263370000131
备注：表格中**表示P<0.01，即两组数据之间差异非常显著，具有统计学分析意义；*表示P<0.05，即两组数据之间差异显著；无*标注表示P≥0.05，即两组数据之间无明显差异，不具有统计学分析意义。
阿诺普林系列抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌率测定结果和抑菌趋势如图18所示，在图18中可明显观察到随着抗菌肽浓度的增高，其抑菌效果越强，其中抑菌率均呈现良好趋势的改造肽为ANP-5，其在最低浓度8μM时仍具有接近100％的完全抑菌率；ANP-1和ANP-2也展示了较为显著的区别，在8μM-256μM区间，ANP-1的抑菌效果均显著优于ANP-2，说明ANP-2对金黄色葡萄球菌抑菌能力低于大肠杆菌；结合图18，ANP-1在抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌时均展示良好的抗菌能力，因此我们选择ANP-1作为最优肽之一进行后续的抗菌研究；ANP-7的抑菌率和母肽ANP相近，猜测二硫键的引入没有使其对金黄色葡萄球菌的抗菌能力增强；因此后续抗菌实验选择最优肽ANP-1、ANP-5、ANP-7进行更深入的抗菌研究。
图18为阿诺普林系列抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌率的变化趋势。
实施例4实施例1中最优肽ANP-1、ANP-5、ANP-7的抑菌药敏考察
为了更直观考察阿诺普林系列抗菌肽抑菌效果，将金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 25922作为实验标准菌株，采用牛津杯法观察相同时间内相同浓度下、不同系列抗菌肽的抑菌圈大小，抑菌圈越大则证明该抗菌肽抑菌效果越好，具体实验步骤如下：
配制MH(A)固体培养基，参照SN标准配方配制，称量培养基36.5g，加入1000mL去离子水中，加热煮沸溶解后分装，于121℃灭菌15min备用。取出配制好的固体培养基，倒平板，每个平板用量约为30mL，平板表面需尽量平整光滑以保证牛津杯内抗菌肽溶液扩散均匀。待培养基凝固后，取100μL生长至对数生长期的菌液(106CFU/mL)均匀涂布，晾干后垂直放上牛津杯，在杯中加入各200μL ANP、ANP-1、ANP-5、ANP7抗菌肽溶液(256μM-64μM)，加满后培养基正面向上静置37℃培养18小时，观察比较其抑菌圈大小并记录，所得结果见图19。
阿诺普林系列抗菌肽中ANP-1、ANP-5、ANP-7按照同一浓度分别与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共培养18h，并观察其抑菌圈，具体结果如图19所示。在图19(上)中，抗菌肽ANP(1号)、ANP-1(2号)、ANP-5(3号)、ANP-7(4号)在64μM–256μM浓度下均有抑菌圈产生，证明其具有抑菌能力，比较给药浓度为128μM实验组的抑菌圈大小可得，ANP和ANP-5对大肠杆菌的抑菌能力比ANP-1和ANP-7高，该结果进一步验证了在合成的系列抗菌肽中ANP-5对大肠杆菌的抑菌效果最好。
图19(下)为不同系列阿诺普林抗菌肽ANP(1号)、ANP-1(2号)、ANP-5(3号)、ANP-7(4号)在64μM–256μM浓度下与金黄色葡萄球菌共培养18h后的抑菌情况，如图所示ANP系列肽均表现出良好的抑菌圈，在浓度256μM下，改造肽ANP-1、ANP-5和ANP-7对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径较ANP母肽大，证明金黄色葡萄球菌对改造肽更加敏感；经过结构改造后的抗菌肽具有不同程度的抑菌圈产生，该结果证明了经过结构改造，有利于提高阿诺普林母肽对革兰氏阳性菌的抑菌效果。
图19为不同浓度不同系列的抗菌肽培养18h后的抑菌情况。图中，1为ANP；2为ANP-1；3为ANP-5；4为ANP-7。
实施例5实施例1中最优肽ANP-1、ANP-5、ANP-7在不同培养条件下抗菌活性测定
为了考察阿诺普林系列抗菌肽在不同条件下的抗菌效果，将抗菌肽ANP-1、ANP-5、ANP-7培养于不同的生理环境并研究其抗菌活性，具体实验步骤如下：
(1)生理盐条件下抗菌活性的测定
选取金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 25922标准菌株作为实验菌株，培养至对数生长期后稀释菌落个数为106CFU/mL。用含154mM的氯化钠溶液对抗菌肽ANP、ANP-1、ANP-5、ANP-7进行二倍稀释，依次配制为128μM、64μM、32μM、16μM、8μM、4μM、2μM的抗菌肽溶液。随后，取50μL菌液和50μL抗菌肽溶液放入96孔板中，平行三组，37℃培养18h后观察菌落生长情况，将孔内可抑制微生物生长的最低抗菌肽浓度记为MIC值，该实验重复三次，结果见表13、表14。
(2)血清条件下抗菌活性的测定
选取金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 25922标准菌株作为实验菌株，培养至对数生长期后稀释菌落个数为106CFU/mL。配制抗菌肽ANP、ANP-1、ANP-5、ANP-7的溶液，将其进行二倍稀释，依次配制为128μM、64μM、32μM、16μM、8μM、4μM、2μM等浓度，加入10％FBS，并在37℃条件下培养1h，立即放置60℃水浴锅中灭活15min。随后，取50μL菌液和50μL抗菌肽溶液放入96孔板中，平行三组，37℃培养18h后观察菌落生长情况，将孔内可抑制微生物生长的最低抗菌肽浓度记为MIC值，该实验重复三次，结果见表13、表14。
表13阿诺普林系列抗菌肽在不同生理条件下对大肠杆菌的MIC值
Figure GDA0004167263370000151
在表13为ANP-1、ANP-5、ANP-7在不同生理环境下对大肠杆菌的最低抑菌浓度MIC值变化情况，在154mM的NaCl生理环境下，ANP-1、ANP-5、ANP-7对大肠杆菌的最低抑菌浓度变化情况。结果显示154mM的NaCl生理环境下，ANP-1、ANP-5、ANP-7对大肠杆菌的最低抑菌浓度提高0.5-1倍，母肽抗菌效果提高4倍，说明154mM NaCl中的钠离子对该三个抗菌肽抗菌活性的影响较小，其中ANP-1和ANP-7对大肠杆菌ATCC 25922的最低抑菌浓度无明显变化，该结果说明改造肽在阳离子环境中基本维持其原有抗菌活性。
ANP-1、ANP-5、ANP-7在10％ FBS生理环境下对大肠杆菌最低抑菌浓度MIC值倍数变化范围也在0.5-1之间，说明10％ FBS生理环境对该三个抗菌肽影响较小，ANP-5在10％FBS生理环境下的最低抑菌浓度无变化，说明该环境对ANP-5抗菌作用无影响，ANP-1在10％FBS生理环境下抗菌能力提高1倍，ANP-7则下降1倍，而母肽抑菌效果变为原来的4倍，该结果进一步说明与母肽相比，改造后的多肽在生理条件下较母肽更为稳定。
表14为ANP-1、ANP-5、ANP-7在不同生理环境下对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度MIC值变化情况，如表14所示154mM NaCl培养条件下，母肽和ANP-1最小抑菌浓度没有明显变化，ANP-5和ANP-7抑菌效果分别变为初始值的0.125倍和0.5倍。10％FBS时，母肽抑菌效果变为初始值的4倍，ANP-1变为原来的2倍，ANP-5和ANP-7分别下降为初始值的0.25倍和0.5倍。说明对母肽序列上的阳离子氨基酸替换在提高抗菌活性的同时提高了抗菌肽的稳定性，而对母肽N端的改造有利于提高母肽的抗菌活性，但对不同生理条件下的稳定性有一定程度的影响。
表14阿诺普林系列抗菌肽在不同生理条件下对金黄色葡萄球菌的MIC值
Figure GDA0004167263370000152
Figure GDA0004167263370000161
实施例6实施例1中最优肽ANP-1、ANP-5、ANP-7联合用药抗菌效果评价
通过前期对阿诺普林系列抗菌肽的抗菌活性考察，筛选出具备抗菌活性良好的ANP-1、ANP-5、ANP-7以及母肽ANP进行立抗生素的联合抗菌活性考察，选用三种具有不同作用机制的传统抗生素进行与阿诺普林系列抗菌肽的联合抗菌：(1)庆大霉素，其作用机制是作用于细菌体内的核糖体，从而抑制细菌蛋白质合成，并破坏细菌细胞膜的完整性。(2)多粘菌素B，其作用机制为与革兰氏阴性菌外膜脂多糖相互作用，导致细菌细胞裂解死亡。(3)万古霉素，作为一种糖肽类抗生素，可通过抑制细菌细胞壁的合成，从而导致细胞的裂解死亡。本实验采用棋盘微量稀释法测定与抗生素联用后对标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC 25922的抗菌活性。具体实验步骤如下：
采用二倍稀释法依次配制浓度为：多肽溶液4×MIC、2×MIC、1×MIC的抗菌肽溶液和抗生素溶液。稀释培养至对数生长期的标准菌株菌液，使其菌落个数为106CFU/mL。取100μL菌液、50μL的多肽溶液和50μL的抗生素溶液依次放入96孔板中，平行三组，庆大霉素作为阳性对照，PBS作为阴性对照，37℃培养18h后观察菌株生长情况，将孔内可用肉眼观察到抑制微生物生长的最低抗菌肽浓度记为MIC值，根据抑菌浓度指数FICI评价联合用药效果，该实验重复三次，结果见表15、16。
FICI＝(药物A联合MIC值)/(药物A独立MIC值)+(药物B联合MIC值)/(药物B独立MIC值)。
当FICI≤0.5时，表示抗菌肽与传统抗生素之间存在协同作用，当0.5<FICI≤1时，表示抗菌肽与传统抗生素之间存在增效作用，当1<FICI≤4时，表示抗菌肽与传统抗生素之间无明显作用，当FICI≥4时，表示抗菌肽与传统抗生素之间存在明显的拮抗作用。
表15阿诺普林系列抗菌肽与抗生素联合用药抑制大肠杆菌的药效考察
Figure GDA0004167263370000162
备注：a.FICI≤0.5表示具有协同作用；b.0.5<FICI≤1表示增效作用；c.1<FICI<4表示无明显影响；d.FICI≥4表示具有拮抗作用。
(1)表15结果为阿诺普林系列抗菌肽分别与庆大霉素、万古霉素和多粘菌素B联合使用比较其对大肠杆菌的抑制作用的差异，可得结果如下：
a、庆大霉素与ANP母肽联合应用显示出较为明显的增效作用。改造后的ANP-1与庆大霉素联合应用显示出较强的协同作用。ANP-5和ANP-7组则无明显相互作用关系。猜测ANP和ANP-1的抗菌作用机理可能与庆大霉素阻碍细菌蛋白质合成的作用方式相符合，可考虑其在临床中进行联合使用；
b、万古霉素与ANP母肽联合应用具有明显的协同作用，改造后的ANP-1和ANP-7与万古霉素联合使用分别显示了较好的增效作用，猜测其抗菌机理可能与万古霉素协同抑制细菌细胞壁的合成，从而导致大肠杆菌细胞的裂解死亡。
c、多粘菌素B与4种抗菌肽联合应用FICI值均在1-4之间，说明多粘菌素B对抗菌肽的抗菌作用无明显影响。
(2)表16结果为阿诺普林系列抗菌肽分别与庆大霉素、万古霉素和多粘菌素B联合使用比较其对金黄色葡萄球菌的抑制作用的差异，可得结果如下：
a、庆大霉素与ANP母肽、ANP-1、ANP-5的联合应用均无明显影响。改造后的ANP-7与庆大霉素联合应用显示出拮抗作用，猜测是ANP-7二硫键的引入导致其与母肽ANP抗菌作用发生差异。
b、万古霉素组中，所有抗菌肽的联合用药效果均为无影响。
c、多粘菌素B组中，ANP、ANP-1与多粘菌素B的联合用药产生增效作用，ANP-5与ANP-7的联合用药则表现为拮抗作用，猜测ANP-1中赖氨酸的替换没有影响ANP母肽的抗菌作用，后续将进一步进行的考察。
表16阿诺普林系列抗菌肽与抗生素联合用药抑制金黄色葡萄球菌的药效考察
Figure GDA0004167263370000171
备注：a.FICI≤0.5表示具有协同作用；b.0.5<FICI≤1表示增效作用；c.1<FICI<4表示无明显影响；d.FICI≥4表示具有拮抗作用。
综上所述，本发明是对天然抗菌肽阿诺普林进行改造设计，并合成了ANP-1、ANP-2、ANP-3、ANP-4、ANP-5、ANP-6、ANP-7等具有强抗菌活性的阿诺普林改造肽。抗菌实验研究结果表明，本发明改造肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有显著的抗菌效果，其氨基酸序列短、结构简单、合成方便、抗菌活性高，在临床抗菌药物开发中具有良好的应用前景。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003271947900000011
Figure IDA0003271947900000021

Claims (8)

1.系列具有抗菌活性的阿诺普林改造肽，其特征在于：所述阿诺普林改造肽为ANP-4、ANP-5、ANP-6，其氨基酸序列依次为序列表中SEQ ID No.5-7。
2.一种药物组合物，包含权利要求1所述系列阿诺普林改造肽中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于：所述阿诺普林改造肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.6。
5.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于：所述药物还包含庆大霉素。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述药物还包含庆大霉素。
7.权利要求1所述的系列具有抗菌活性的阿诺普林改造肽，或，权利要求2-6所述的药物组合物在制备金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌抑制剂中的应用。
8.权利要求1所述的系列具有抗菌活性的阿诺普林改造肽，或，权利要求2-6所述的药物组合物在制备预防和/或治疗金黄色葡萄球菌感染和大肠杆菌感染的药物中的应用。
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