CN110330553B - 一种抗菌肽vl25-1的突变体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽VL25‑1的突变体，所述突变体的氨基酸序列是将抗菌肽VL25‑1中的第1或第7个氨基酸中的至少一个替换成精氨酸。上述抗菌肽VL25‑1的突变体可应用于抗菌剂的制备中。所述抗菌剂优选为用于抵抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染的抗菌药物。本发明方案结构的抗菌肽不仅对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、白色念球菌等多种细菌或真菌具有明显的抑制作用，而且具有较低的溶血活性、稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。

Description

一种抗菌肽VL25-1的突变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗菌肽VL25-1的突变体及其制备方法与应用。

背景技术

抗生素作为一类重要的临床用药，自被应用以来已拯救了无数人的生命，然而近年来，由于药物滥用药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，越来越多的国家开始寻求抗生素替代品。抗菌肽因具有广泛的抗菌作用，独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊的作用机理，已成为最具潜力的抗生素替代品之一，同时在新型食品、药品、护肤品以及化妆品防腐剂中的应用也越来越广泛，具有良好的发展前景。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的一类小分子活性多肽，由基因编码，核糖体合成，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。抗菌肽广泛存在于各种生物体内，从细菌到高等哺乳动物体内都普遍存在。与传统的抗生素相比，AMPs作为一类生物活性小分子，具有抗细菌、真菌、病毒、原虫及抑癌活性等多种杀菌作用，对人和动物安全无毒、无副作用。此外，抗菌肽还可以作为药物传递载体、抗肿瘤剂、免疫调节剂以及信号分子等。

抗菌肽的相关研究最早可以追溯到1975年，当时瑞典科学家G.Bomam等在惜古比天才蛹中注入大肠杆菌，之后在其血液淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质，即抗菌肽Ceropins。经过40几年的研究，目前已从动物、植物、细菌和病毒中发现了超过2500种抗菌肽。

尽管天然抗菌肽具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足。相当一部分天然的抗菌肽抑菌活性较低、稳定性较差、毒性较高，或者导致真核细胞发生溶血等；另外，部分抗菌肽对耐药菌的抑制效果差，而通过对天然抗菌肽进行改造或全新合成得到的人工抗菌肽可以在很大程度上改善上述缺点中的部分甚至全部，以适应不同应用需求。目前，人工抗菌肽虽已有数千种，但仍难以满足实际应用的要求。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种抑菌活性较高且对耐药菌有效的抗菌肽VL25-1的突变体。

本发明要解决的第二个技术问题是：提供一种上述抗菌肽VL25-1的突变体的制备方法。

本发明要解决的第三个技术问题是：提供一种上述抗菌肽VL25-1的突变体的应用。

为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案为：一种抗菌肽VL25-1的突变体，所述突变体的氨基酸序列是将抗菌肽VL25-1中的第1或第7个氨基酸中的至少一个替换成精氨酸。

进一步地，所述突变体的氨基酸序列如Seq ID No.1～3中的任一项所示或所述突变体为与Seq ID No.1～3中的任一项中具有67％以上同一性的多肽。

为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案为：一种抗菌肽VL25-1的突变体的制备方法，采用芴甲氧羰基多肽固相合成法制备所述抗菌肽VL25-1的突变体，包括以下步骤：

S1、将芴甲氧羰基(Fmoc)-L-Leu-OH氨基酸引入到2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)后，脱去芴甲氧羰基保护基；

S2、按照上述突变体的氨基酸序列从右到左逐一将芴甲氧羰基保护的氨基酸偶联到树脂上并依次脱去芴甲氧羰基保护基，得到肽链树脂；

S3、加入切割液对肽链树脂进行裂解，得到抗菌肽VL25-1的突变体粗品，所述粗品再经高效液相色谱分离纯化、冻干精制得到所述抗菌肽VL25-1的突变体。

进一步地，每次脱保护后都通过茚三酮检测法检测终点。

进一步地，所述切割液包括以下组分：三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)94.5％；水2.5％；2-巯基乙醇(2-Hydroxy-1-ethanethiol，EDT)2.5％；三异丙基硅烷(Triisopropylsilane，TIS)1％。

优选地，步骤S3中，高效液相色谱分离过程采用梯度洗脱，洗脱的流动相分别为水和乙腈，洗脱梯度为：0～40min乙腈的体积分数由5％提升到75％。

进一步地，所述步骤S3中，加入切割液对肽链树脂进行裂解，反应完成后氮吹至液体体积减少90％以上，再用乙醚层析后用乙醚洗涤，然后常温下挥发至干燥，得到抗菌肽VL25-1的突变体粗品。

为解决上述第三个技术问题，本发明的技术方案为：上述抗菌肽VL25-1在抗菌剂的制备中的应用。

优选地，所述抗菌剂为用于抵抗耐药菌感染的抗菌药物。

优选地，所述抗菌剂为用于抵抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染的抗菌药物。

本发明的有益效果在于：本发明方案的突变体以抗菌肽VL25-1为基础进行改造设计，巧妙地将第1和第7个氨基酸中的一个或两个替换为精氨酸，得到系列新的抑菌活性高且对耐药菌有效的抗菌肽结构；本发明方案结构的抗菌肽不仅对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、白色念球菌等多种细菌或真菌具有明显的抑制作用，而且具有较低的溶血活性、稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

本发明实施例为：抗菌肽VL25-1的突变体，该突变体为抗菌肽VL25-2、RL25-1或RL25-2，序列特征：长度为25，类型为氨基酸序列，链型为直链，人工合成。其中，VL25-2的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，具体序列为：

Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Arg-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys；其中，所述抗菌肽VL25-2的分子量为3114.85Da，等电点为11.60。

RL25-1的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示，具体序列为：

Arg-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Asp-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys；所述抗菌肽RL25-1的分子量为3130.81Da，等电点为11.10。

RL25-2的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示，具体序列为：

Arg-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Arg-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys；所述抗菌肽RL25-2的分子量为3171.90Da，等电点为11.85。

上述突变体的制备方法，包括以下步骤：

1)树脂溶涨：称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)树脂，将树脂放入反应管中，按15ml/g的比例加入二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)，振荡30min；

2)接第一个氨基酸：去除溶剂后加入3倍摩尔量过量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺(N，N-Diisopropylethylamine，DIEA)，最后加入少量N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)溶解，振荡1h，用DMF和DCM交替清洗6遍。

3)脱保护：加15ml 20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min后去掉再加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min后进行操作步骤4)。

4)检测：抽掉哌啶溶液，取十余粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

5)洗：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。

6)缩合：保护氨基酸Fmoc-L-Leu-OH三倍过量，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate，HBTU)三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min。

7)洗：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。

8)重复步骤2)至6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。

9)最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。

10)从树脂上切割多肽：配制切割液(三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)94.5％；水2.5％；2-巯基乙醇(2-Hydroxy-1-ethanethiol，EDT)2.5％；三异丙基硅烷(Triisopropylsilane，TIS)1％)，将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10ml/g，恒温震荡，时间：120min。

11)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干，即得粗品肽；

12)用HPLC纯化多肽：

(1)取粗品肽200mg放入器皿中，用2-5ml 50％的乙腈水溶液溶清(可超声2min)，用0.45μm滤膜过滤溶解液。

(2)粗品分析：取3μl用HPLC分析粗品，流动相为水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％，结束比例水5％，乙腈95％。

(3)纯化精制：将溶解好的样品，做进样准备。将仪器平衡10min后，设置起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。

(4)鉴定：对将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。

13)将纯化后的溶液冻干，得到成品。

14)将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存备用。

本实施例抗菌肽VL25-2、RL25-1、RL25-2产品是采用自动多肽合成仪按照多肽固相合成，最终得到的抗菌肽VL25-2、RL25-1、RL25-2经高效液相色谱分析，其纯度≥98％，经质谱分析分子量与理论值一致。

对本发明方案制得的抗菌肽的抑菌性能进行验证，具体操作如下：

1、抗菌肽VL25-1、VL25-2、RL25-1、RL25-2最小抑菌浓度(minimal inhibitconcentration，MIC)的测定：

分别将市购的大肠杆菌(ATCC8739)、铜绿假单胞菌(CMCC10104)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和白色念珠菌(ATCC10231)培养至对数期，用2×液体MHB培养基稀释至5×10⁵CFU/ml。在96孔板中依次加入稀释成梯度的抗菌肽母液50μl，向各孔中加入已稀释好的菌液50μl，混匀后于37℃静置培养16小时，震荡后测定600nm处的光吸收值，以100μg/ml氨苄青霉素做阳性对照。结果判定：取检测不到细菌生长的孔作为最小抑菌浓度，结果如下表1所示：

表1抗菌肽对各细菌的MIC值(μM)

从上表可以看出，与VL25-1相比，改造后的抗菌肽VL25-2、RL25-1、RL25-2对革兰氏阴性和阳性菌的抑菌效果都有明显的提高，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，具有较好的研究开发价值。

2、抗菌肽VL25-1、VL25-2、RL25-1、RL25-2的溶血活性检测：

1)采集新鲜的大鼠血液，待静置分层，去除上层血清，加入生理盐水，用吸管轻轻吹散管底的红细胞，1000rpm离心5min，用吸管小心吸取上层生理盐水并弃去，直至上清液没有红色。

2)取底部压实的红细胞2滴，加入2.0ml的等渗PBS重悬红细胞，配置成4％血红细胞悬液。

3)实验组：加入50μl不同浓度并用等渗PBS溶解的抗菌肽，然后加入50μl配置好的4％血红细胞悬液。

4)阳性对照：每一个孔加入50μl 0.2％的tritonX-100，50μl配置好的4％血红细胞悬液。

阴性对照：每一个孔加入50μl等渗PBS，50μl配置好的4％血红细胞悬液。

5)37℃孵育1h后，1000g离心96孔板5min后，从各孔吸取50μl上清到96孔板中，415nm波长测定A值，计算溶血百分比＝[(A_样品-A_阴性)/(A_阳性-A_阴性)]×100。

结果表明，在325.13μM的浓度下，抗菌肽VL25-1对红细胞的溶血率仅0.83％；在321.00μM的浓度下，抗菌肽VL25-2对红细胞的溶血率仅4.65％；在159.70μM的浓度下，抗菌肽RL25-1对红细胞的溶血率仅1.66％；在157.50μM的浓度下，抗菌肽RL25-2对红细胞的溶血率仅8.7％，说明本发明抗菌肽VL25-1、VL25-2、RL25-1、RL25-2对红细胞的毒性很低，抗菌肽的安全性较高。

3、抗菌肽VL25-1、VL25-2、RL25-1、RL25-2对临床分离耐药菌株的抑菌活性测定：

采用上述MIC值测定方法，分别测定VL25-1、VL25-2、RL25-1、RL25-2对四个不同病人分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的抑菌活性，结果如下表2所示：

表2抗菌肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌效果

从上表可以看出，与VL25-1相比，改造后的抗菌肽VL25-2、RL25-1、RL25-2对不同病人来源的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株都有明显的抑菌效果，具有良好的抗生素替代品药物研究开发价值。

采用上述MIC值测定方法，分别测定VL25-1、VL25-2、RL25-1、RL25-2对水产养殖致病菌副溶血弧菌与哈氏弧菌菌株在盐浓度分别为0.5％与1％时的抑菌活性，结果如下表3所示：

表3抗菌肽对副溶血弧菌与哈氏弧菌的抑菌效果

从上表可以看出，与VL25-1相比，改造后的抗菌肽VL25-2、RL25-1、RL25-2对水产养殖致病菌副溶血弧菌与哈氏弧菌菌株都有较好的抑菌效果，且抑菌效果不受盐浓度影响，具有良好的抗生素替代品药物研究开发价值。

综上所述，本发明抗菌肽不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、耐药菌及真菌都具有较好的抗菌作用。因此，本发明序列结构的抗菌肽突变体在抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、耐药菌及真菌药物制备中具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 遵义医科大学珠海校区

<120> 一种抗菌肽VL25-1的突变体及其制备方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Leu Asn Arg Leu Phe Arg Lys Ile Arg Gln Val Ile Arg Lys Phe

1 5 10 15

Glu Lys Gly Ile Lys Glu Lys Ser Lys

20 25

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Leu Asn Arg Leu Phe Asp Lys Ile Arg Gln Val Ile Arg Lys Phe

1 5 10 15

Glu Lys Gly Ile Lys Glu Lys Ser Lys

20 25

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Leu Asn Arg Leu Phe Arg Lys Ile Arg Gln Val Ile Arg Lys Phe

1 5 10 15

Glu Lys Gly Ile Lys Glu Lys Ser Lys

20 25

Claims (9)

1.一种抗菌肽VL25-1的突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列是将抗菌肽VL25-1中的第1或第7个氨基酸中的至少一个替换成精氨酸；所述突变体的氨基酸序列如Seq ID No.1～3中的任一项所示。

2.一种如权利要求1所述的抗菌肽VL25-1的突变体的制备方法，采用芴甲氧羰基多肽固相合成法制备所述抗菌肽VL25-1的突变体，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将Fmoc-L-Leu-OH氨基酸引入到2-Chlorotrityl Chloride Resin后，脱去Fmoc保护基；

S2、按照如权利要求1所述的突变体的氨基酸序列从右至左逐一将芴甲氧羰基保护的氨基酸偶联到树脂上并依次脱去Fmoc保护基，得到肽链树脂；

S3、加入切割液对肽链树脂进行裂解，得到抗菌肽VL25-1的突变体粗品，所述粗品再经高效液相色谱分离纯化、冻干精制得到所述抗菌肽VL25-1的突变体。

3.根据权利要求2所述的抗菌肽VL25-1的突变体的制备方法，其特征在于：每次脱保护后都通过茚三酮检测法检测终点。

4.根据权利要求2所述的抗菌肽VL25-1的突变体的制备方法，其特征在于：所述切割液包括以下组分：TFA 94.5％；水2.5％；EDT2.5％；TIS 1％。

5.根据权利要求2所述的抗菌肽VL25-1的突变体的制备方法，其特征在于：步骤S3中，高效液相色谱分离过程采用梯度洗脱，洗脱的流动相分别为水和乙腈，洗脱梯度为：0～40min乙腈的体积分数由5％提升到75％。

6.根据权利要求2所述的抗菌肽VL25-1的突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，加入切割液对肽链树脂进行裂解，反应完成后氮吹至液体体积减少90％以上，再用乙醚层析后用乙醚洗涤，然后常温下挥发至干燥，得到抗菌肽VL25-1的突变体粗品。

7.一种如权利要求1所述的抗菌肽VL25-1的突变体在抗菌剂的制备中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗菌剂为用于抵抗耐药菌感染的抗菌药物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗菌剂为用于抵抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染的抗菌药物。