CN104961801B - 一种具有多靶点的抗菌多肽偶联物及其二聚物的合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗菌多肽偶联物Acr3‑NLS及其二聚物(Acr3‑NLS)2，属于药物化学领域。本发明的抗菌多肽偶联物Acr3‑NLS是将吖啶分子连接到核定位序列NLS的N末端而构建而成，而其二聚物(Acr3‑NLS)2是将Acr3‑NLS分子通过二硫键相连而构成。活性试验表明，抗菌多肽偶联物Acr3‑NLS及(Acr3‑NLS)2的抗菌活性比NLS显著提高，并且它们可以通过多靶点的作用机制抑杀细菌。而这种多靶点的作用机制可以使Acr3‑NLS及(Acr3‑NLS)2可抑杀传统抗生素耐药细菌，并且还可以使细菌不易对其产生耐药性。因此其作为活性成分在制备抗菌药物中具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种具有多靶点的抗菌多肽偶联物；本发明同时还涉及该抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
在人类发展的长河中，细菌感染曾经夺去无数人的生命。自从青霉素问世以来，大量的抗菌药物不断涌现，在细菌感染疾病的治疗中发挥了极大的作用。但是由于抗菌药物的不合理应用，导致细菌耐药频繁发生，甚至耐药倾向性产生的速度远远超出抗菌药物的研发速度。细菌耐药性已经成为全球严重的公共卫生问题。特别是“超级细菌”的出现，使人类面临无药可用的窘境。因此除了规范抗菌药物的使用外，迫切需要开发具有新作用机制并且不受传统耐药机制影响的抗菌药物。
吖啶分子是一个多芳香环化合物，其能够通过插入到DNA中而诱导细胞死亡。目前，已经有多种吖啶类似物被合成，并用于抗细菌、抗疟疾甚至是抗肿瘤研究[Actapoloniae pharmaceutica, 2012;69:3]。早在1912年，Ehrlich和Benda就把吖啶分子运用于抗菌领域。而在1917年，基于吖啶分子的抗菌药物便成功地上到临床研究[Journal ofAntimicrobial Chemotherapy, 2001;47:1]。但是，此后由于青霉素的兴起，占据了抗菌药的主要市场，吖啶类药物就逐渐的离开了人们的视线。但是近些年，由于耐药性细菌的广泛发生，吖啶类药物又引起了人们的广泛关注[The Open Medicinal Chemistry Journal,2011;5:11]。
核定位序列（NLS，PKKKRKV）是一段有7个氨基酸残基组成的多肽片段，NLS作为病毒SV40的T抗原的一个片段，因其具有转运细胞外活性物质进入细胞核的能力而为人们所熟知[Advanced Drug Delivery Reviews, 2007;59:698]。研究发现，尽管作用机制不清楚，但是NLS对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都表现出一定的抑制作用[Antimicrobialagents and chemotherapy, 2006;50:1118]。
迄今发现的抗生素基本上都是通过单一作用机制抑杀细菌，这就很容易导致细菌对这类药物产生耐药性。因此发展具有多靶点的抗生素药物对于治疗耐药细菌感染具有重要意义。另外，由于具有多个作用靶点，细菌也不容易对这类药物产生耐药性。
发明内容
为了发展不易受传统耐药机制影响的抗菌药物，针对现有技术中存在的问题，本发明的一个目的是提供一种具有多靶点的多肽偶联物抗菌药物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2；
本发明的另一个目的是提供了具有多靶点的多肽偶联物抗菌药物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2的合成方法；
本发明还提供一种以抗菌多肽偶联物为活性成分在制备抗菌药物中的应用。
一、具有多靶点的抗菌多肽偶联物及其合成
1、具有多靶点的抗菌多肽偶联物的结构
本发明具有多靶点的抗菌多肽偶联物，是基于吖啶分子Acr和核定位序列NLS构建的具抗菌多肽偶联物Acr3-NLS，其结构序列如下：
其中所用氨基酸都为L型氨基酸，P为脯氨酸，K为赖氨酸，R为精氨酸，V为缬氨酸，C为半胱氨酸。
2、具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成
本发明具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成，是在具有正电荷多肽序列Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Cys-NH2的N端引入侧链含有吖啶基团的赖氨酸（Lys(acridine)）。其具体合成步骤如下：
（1）含有吖啶基团氨基酸Fmoc-Lys(Acr)的合成
a．9-Phenoxyacridine的合成：氩气保护下，使苯酚、NaOH、9-氯吖啶以10:1.5:1的摩尔比，于95~105℃反应1.5~2h，加入NaOH溶液终止反应；然后在室温下静置10~12h，得到黄色沉淀；过滤，水洗，抽干，即得产物9-Phenoxyacridine；
b．Fmoc-Lys(Acr)的合成：氩气保护下，使Fmoc-Lys-OH、苯酚、9-phenoxyacrudine以1:12:2的摩尔比，于55~65℃反应~5h；用无水乙醚随沉淀，过滤，洗涤，即得产物Fmoc-Lys(Acr)；
（2）Acr3-NLS的固相合成：
a. 树脂预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂加入到二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；
b. 脱Fmoc保护：将预处理的树脂加入到脱保护试剂中，搅拌2min后抽干，重复使Fmoc基团完全脱除，然后用DMF 洗涤除净脱保护试剂；所述脱保护试剂为哌啶与DMF以1:4~1:5体积比的混合物；
c. 缩合：氩气保护下，将Fmoc保护氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀，然后加入脱Fmoc保护的树脂进行搅拌反应；通过茚检试剂检测反应程度，待反应完全后用DMF重复洗涤除去未反应的试剂；所述氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐、二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1:2；氨基酸与脱Fmoc保护的树脂的摩尔比为3:1~4:1；
d. 肽链的延长：重复b和c两个过程，按照设计要求将L型氨基酸脯氨酸，赖氨酸，精氨酸，缬氨酸，半胱氨酸及Fmoc-Lys(Acr)连接到树脂上，直至接肽完成为止；
e. 肽链从树脂上的切割：按照步骤b的方法将最后一个连接的氨基酸的 Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应1.5~3小时，收集切割试剂并减压旋干，用乙醚进行震荡沉淀，静置后先去除上清的乙醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相；水相经冷冻干燥，得白色固体粉末粗肽；所述切割剂是由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醚、水以82.5:5:5:2.5:5体积比的混混合物；切割剂的加入量为每克肽树脂加入10~25mL；
f. 粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度10~20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色的纯肽固体粉末即为Acr3-NLS产品。
上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成功合成了Acr3-NLS。Acr3-NLS的理化特征见表1。
二、多肽偶联物抗菌药物二聚物(Acr3-NLS)2及其合成
1、二聚物(Acr3-NLS)2的结构
本发明多肽偶联物抗菌药物二聚物(Acr3-NLS)2，是将两个多肽偶联物抗菌药物Acr3-NLS分子通过二硫键相连形成的二聚物(Acr3-NLS)2。其结构式如下：
其中所用氨基酸都为L型氨基酸，P为脯氨酸，K为赖氨酸，R为精氨酸，V为缬氨酸，C为半胱氨酸。
2、二聚物(Acr3-NLS)2的合成
（1）抗菌肽Acr3-NLS序列中半胱氨酸侧链巯基的活化：将二硫二吡啶溶于甲醇溶液中，将具有多靶点的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS溶于甲醇/水中，并加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10~16 h，利用C18反相高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Acr3-NLS；二硫二吡啶与具有多靶点的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS的摩尔比为10:1~15:1。
（2）抗菌多肽二聚物的合成：将巯基活化的Acr3-NLS与纯化的Acr3-NLS以1:1.2~1:1.6的摩尔比溶于甲醇/水中，反应10~16 h，通过HPLC进行纯化，得到二聚物(Acr3-NLS)2。
上述甲醇/水中，甲醇与水的体积比为1:1~1:10。
上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致，表明成功合成了Acr3-NLS二聚物(Acr3-NLS)2。二聚物(Acr3-NLS)2的理化特征见表1。
。
三、抗菌多肽偶联物的Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2的药物活性
1、抗菌活性检测实验
通过测定偶联物的最小抑菌浓度（MIC）来评价其抗菌活性。
具体的试验方法：采用肉汤微量稀释法检测偶联物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌活性。首先从平板上挑取一个菌落单克隆加入到5mlMH培养基中，37℃，180rpm/min过夜培养至菌液浓度达到108~109CFU/ml。第二天将菌液用MH培养基稀释到106 CFU/ml，并用MH培养液梯度稀释偶联物溶液。将100μl经二倍稀释的含有不同浓度的偶联物溶液加入到96孔板中，随后加入100μl稀释的菌液（106 CFU/ml）。混合均匀后将96孔板置于37℃培养箱中过夜培养18-20个小时。MIC即为肉眼可见的菌液无明显混浊状态下的肽的最低浓度。实验中以不加肽的菌液作为对照。本实验中每组数据做3次重复独立试验。
实验结果见表2。核定位序列NLS在我们最高检测浓度下并未表现出抗菌活性，而将吖啶分子连接到NLS的N末端之后得到的Acr3-NLS表现出显著的抗菌活性。将两个Acr3-NLS分子连接而得到的(Acr3-NLS)2的抗菌活性明显提高。总之，抗菌多肽偶联物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2具有理想的抗菌活性。
2、作用机制研究
（1）PI染色实验
碘化丙锭（PI）是一种可对DNA 进行染色的试剂，它的特点是只能进入到膜破坏的细胞内，因而PI染色实验可以用来检测药物对细胞膜的破坏。
具体试验方法：离心收集生长到对数期的细菌后用磷酸盐缓冲液漂洗并稀释成浓度为1×106CFU/ml的菌液。然后向菌液中加入药物使其终浓度为1倍MIC。37℃孵育不同时间，向菌液中加入PI溶液，然后用激光共聚焦显微镜（Zeiss710）观察拍照。
实验结果见图1。在图1中，我们可以看出大肠杆菌在与抗菌多肽偶联物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2孵育短时间内，PI染料可以进入到大肠杆菌内，说明大肠杆菌的细胞膜被破坏。这个试验说明抗菌多肽偶联物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2具有细胞膜破坏能力，它们可以通过破坏细胞膜而导致细菌死亡。
（2）扫描电镜实验（SEM）
扫描电镜实验（SEM）可以直观显示药物对细胞膜的损伤。
具体的试验方法：收集培养至对数期的大肠杆菌，漂洗两遍后将其重悬于PBS缓冲液配成浓度为5×108 CFU/ml的菌悬液。向菌悬液中加入肽溶液使药物的终浓度为1倍MIC，37℃孵育1h，然后将菌液以10,000rpm离心5min，之后加入3%的戊二醛固定。固定后向细胞中再加入2.5%的鞣酸溶液4℃放置2天。两天后向细胞中加入2%的四氧化锇再次固定2h，随后用乙醇溶液梯度洗脱并最后置于临界点干燥器中干燥(Ion Tech, Teddington)。干燥后将细胞喷金并用扫描电镜观察(JSM-6380Lv)。
实验结果见图2。如图2所示，与正常大肠杆菌表面相比，抗菌多肽偶联物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2作用之后的大肠杆菌表面不在光滑，很多细胞表面产生凸起小泡，这表明药物对大肠杆菌的膜产生了破坏作用。这个实验进一步证明抗菌多肽偶联物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2可以通过破坏细菌细胞膜而杀死细菌。
（3）激光共聚焦实验
激光共聚焦实验主要目的是观察药物是否进入到细菌细胞内。
具体的试验方法：用PBS将菌落稀释至5×105CFU/ml，向菌悬液中加入肽溶液使药物的终浓度为0.5倍MIC，37℃孵育1h，然后将菌液以1000rpm离心5min，用PBS清洗一遍，然后置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
实验结果见图3。如图3所示，抗菌多肽偶联物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2能够在低浓度下短时间内进入到细菌细胞内。
（4）琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
琼脂糖凝胶电泳阻滞实验用来检测药物同DNA的结合能力。
具体试验方法：将提取的大肠杆菌DNA同浓度分别与浓度为2、4、8、16和32μM的药物共同孵育30min，之后将孵育好的混合物加入到0.8%的琼脂糖凝胶上，以80v的电压跑30min，最后显色拍照。
实验结果见图4。如图4所示，含有吖啶分子的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2与DNA的结合能力比NLS显著增强，其中二聚物(Acr3-NLS)2具有最强的DNA结合能力。
综上所述，本发明通过将吖啶分子与NLS偶联而得到的抗菌多肽Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2表现出显著的抗菌活性。通过作用机制研究发现，Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2既可以通过直接破坏细胞膜而杀死细菌，也可以进入到细胞内通过结合到DNA上而抑制细菌增殖。直接破膜的作用机制可以使抗菌多肽Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2能够直接杀死对传统抗生素耐药的细菌。而这种多靶点的作用机制可以使细菌不易对Acr3-NLS及其二聚物(Acr3-NLS)2产生耐药性。因此，这类抗菌多肽偶联物在制备抗菌药物中具有很好的应用价值。
附图说明
图1 药物作用后大肠杆菌经碘化丙锭（PI）染色后的激光共聚焦图片。
图2通过扫描电镜对药物作用后的大肠杆菌表面观察。(A)对照， (B) Acr3-NLS，(C) and (Acr3-NLS)2。
图3 通过激光共聚焦显微镜观察药物在大肠杆菌中的穿膜活性。
图4通过凝胶电泳阻滞实验比较药物与DNA的结合活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明抗菌多肽偶联物做进一步说明。
实施例1、具有多靶点的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS的合成
（1）含有吖啶基团氨基酸Fmoc-Lys(Acr)的合成
a．9-phenoxyacrudine的合成：分别称取150mmol苯酚，22.5mmol NaOH，15mmol 9-氯吖啶，加入到100mL的圆底烧瓶中，加入大小适宜的磁子，用胶塞和橡胶带封住烧瓶口，将体系抽真空，并充上氩气保护。油浴加热，温度控制在100℃左右（反应需要通冷凝水回流）反应2h后，向烧瓶中加入100mL 2M的NaOH溶液终止反应的进行。然后在室温下静置过夜，有黄色沉淀产生。过滤，用水洗3~4次，抽干，即得到较为纯净的产物9-phenoxyacrudine，产率96.3%。反应式如下：
b．Fmoc-Lys(Acr)的合成：分别称取5mmol Fmoc-Lys-OH，60mmol苯酚，10mmol 9-phenoxyacrudine后加入到100mL的圆底烧瓶中，加入大小适宜的磁子，用胶塞和橡胶带封住烧瓶口，将体系抽真空，并充上氩气保护。油浴加热，温度控制在60℃左右，回流反应5h之后，加入80mL无水乙醚随即出现黄色沉淀，过滤，用无水乙醚反复洗涤3~4次，即得到纯净的产物Fmoc-Lys(Acr)，产率87.5%。反应式如下：
（2）抗菌多肽Acr3-NLS的固相合成：
a. 树脂预处理：将氨基摩尔量为0.4 mmol的Rink-Amide-MBHA树脂加入到反应器中，加入二氯甲烷并搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；
b. 脱F-moc保护：将预处理的树脂加入脱保护试剂（脱保护试剂为哌啶/DMF＝1:4（V/V））中，搅拌2min后抽干，重复4次，使Fmoc基团完全脱除，最后用DMF 洗涤除净脱保护试剂；
c. 缩合：依次将1.2 mol Fmoc基团保护的氨基酸、1.2 molN-羟基苯并三氮唑、1.2 mol O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入2.4mol二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后投入到反应器内，反应60min，整个反应过程用氩气保护。通过茚检试剂检测反应程度，最后用DMF重复洗涤除去未反应的试剂；
d. 肽链的延长：重复b和c两个过程，按照设计要求依次将L型氨基酸脯氨酸，赖氨酸，精氨酸，缬氨酸，半胱氨酸连接到树脂上；Fmoc-Lys(Acr)和其它氨基酸的缩合方法一样，直至接肽完成为止；
e. 肽链从树脂上的切割：按照步骤b的方法将最后一个连接的氨基酸Fmoc-Lys(Acr)的 Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入10~25mL的切割剂（三氟乙酸:苯酚:苯甲硫醚:1,2-乙二硫醚:水＝82.5:5:5:2.5:5（V/V）），于室温下切割反应1.5~3小时；收集切割试剂并减压旋干，将预先冷却的乙醚加入到烧瓶中用力震荡进行沉淀，静置后先去除上清的乙醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相，水相经冷冻干燥，得白色固体粉末粗肽，产率为85%；
f. 粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度10~20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的肽化合物；再利用反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末，即为Acr3-NLS产品。产率为48%。
经质谱和色谱分析检测，产品Acr3-NLS的理化特征见表1。
实施例2、抗菌多肽二聚物(Acr3-NLS)2的合成
（1）抗菌肽Acr3-NLS序列中半胱氨酸侧链巯基的活化：将0.4 mmol二硫二吡啶溶于2mL甲醇溶液中；将0.04 mmol Acr3-NLS溶于1mL甲醇/水（V/V=1:1~1:10），并滴加到上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10~16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Acr3-NLS；
（2）二聚物(Acr3-NLS)2的合成：将0.01 mmol巯基活化的Acr3-NLS与0.015 mmol未活化的Acr3-NLS溶于2 mL甲醇/水（V/V=1:1~1:10）中，反应10~16 h，通过HPLC进行纯化，得到二聚物(Acr3-NLS)2，产率为37.5%。
上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成功合成了二聚物(Acr3-NLS)2。产品(Acr3-NLS)2的理化特征见表1。
Claims (10)
1.一种具有多靶点的抗菌多肽偶联物，其结构如下：
。
2.如权利要求1 所述具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成，包括以下工艺步骤：
（1）含有吖啶基团氨基酸Fmoc-Lys(Acr)的合成
a．9-Phenoxyacridine的合成：氩气保护下，使苯酚、NaOH、9-氯吖啶以10:1.5:1的摩尔比，于95~105℃反应1.5~2h，加入NaOH溶液终止反应；然后在室温下静置10~12h，得到黄色沉淀；过滤，水洗，抽干，即得产物9-Phenoxyacridine；
b．Fmoc-Lys(Acr)的合成：氩气保护下，使Fmoc-Lys-OH、苯酚、9-phenoxyacrudine 以1:12:2的摩尔比，于55~65℃反应5h；用无水乙醚沉淀，过滤，洗涤，即得产物Fmoc-Lys(Acr)；
（2）Acr3-NLS的固相合成：
a. 树脂预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂加入到二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；
b. 脱Fmoc保护：将预处理的树脂加入到脱保护试剂中，搅拌2min后抽干，重复使Fmoc基团完全脱除，然后用DMF 洗涤除净脱保护试剂；
c. 缩合：氩气保护下，将Fmoc保护氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀，然后加入脱Fmoc保护的树脂进行搅拌反应；通过茚检试剂检测反应程度，待反应完全后用DMF重复洗涤除去未反应的试剂；
d. 肽链的延长：重复b和c两个过程，按照设计要求将L型氨基酸脯氨酸，赖氨酸，精氨酸，缬氨酸，半胱氨酸及Fmoc-Lys(Acr)连接到树脂上，直至接肽完成为止；
e. 肽链从树脂上的切割：按照步骤b的方法将最后一个连接的氨基酸的 Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应1.5~3小时，收集切割试剂并减压旋干，用乙醚进行震荡沉淀，静置后先去除上清的乙醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相；水相经冷冻干燥，得白色固体粉末粗肽；
f. 粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度10~20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色的纯肽固体粉末即为Acr3-NLS产品。
3.如权利要求1 所述具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成，其特征在于：步骤（2）b所述脱保护试剂为哌啶与DMF以1:4~1:5体积比的混合物。
4.如权利要求1 所述具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成，其特征在于：步骤（2）c所述氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐、二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1:2；氨基酸与脱Fmoc保护的树脂的摩尔比为3:1~4:1。
5.如权利要求1 所述具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成，其特征在于：步骤（2）e所述切割剂是由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醚、水以82.5:5:5:2.5:5体积比的混合物；切割剂的加入量为每克肽树脂加入10~25mL。
6.如权利要求1 所述具有多靶点的抗菌多肽偶联物作为活性成分在制备抗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌药物中的应用。
7.一种基于如权利要求1 所述具有多靶点的抗菌多肽偶联物构建的抗菌多肽二聚物(Acr3-NLS)2，其结构式如下：
。
8.如权利要求7所述抗菌多肽二聚物的合成方法，包括以下工艺步骤：
（1）抗菌肽Acr3-NLS序列中半胱氨酸侧链巯基的活化：将二硫二吡啶溶于甲醇溶液中，将具有多靶点的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS溶于甲醇/水中，并加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10~16 h，利用C18反相高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Acr3-NLS；二硫二吡啶与具有多靶点的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS的摩尔比为10:1~15:1；
（2）抗菌多肽二聚物的合成：将巯基活化的Acr3-NLS与纯化的Acr3-NLS以1:1.2~1:1.6的摩尔比溶于甲醇/水中，反应10~16 h，通过HPLC进行纯化，得到二聚物(Acr3-NLS)2。
9.如权利要求8所述抗菌多肽二聚物的合成方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中，所述甲醇/水中，甲醇与水的体积比为1:1~1:10。
10.如权利要求7所述抗菌多肽二聚物作为活性成分在制备抗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌药物中的应用。
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