CN114920803B - 一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap‑CRKP及其制备方法和应用。其序列如下：C8‑K(C8)‑K(C8)GGGCRKPCRKP‑NH2，C8为正辛酸；其制备方法：利用抗酶解肽序列单元结合正辛酸及赖氨酸侧链形成分枝状抗菌大分子，设计出具有高抗菌活性，低毒性和高稳定性的分枝状抗真菌肽。本发明的抗酶解分枝状抗真菌肽Cap‑CRKP不但对白色念珠菌表现出高效的抑菌活性，而且对和耐氟康唑白色念珠菌耐药菌有高效的抑制作用，同时具有很低的溶血毒性，高浓度的蛋白酶对分枝状抗真菌肽Cap‑CRKP的降解程度很弱，本发明设计出的抗酶解分枝状抗真菌肽Cap‑CRKP具有较高的替代抗生素的发展潜力。

Description

一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP及其制备方法和应用。
背景技术
真菌感染或真菌病已成为人类健康的严重威胁，据估计，真菌疾病影响全球超过10亿人，其中1.5亿人患严重感染。目前只有几类抗真菌药物可用，但通常具有高毒性和副作用。然而不恰当的治疗和抗生素的过度使用导致了多种抗生素耐药菌的不断出现，侵袭性真菌感染的高死亡率、所需的长期治疗、窄谱活性以及由于不同药物之间类似的作用机制而产生的交叉耐药性，耐药病原真菌的迅速出现已经严重威胁到人类健康，因此，迫切需要人们寻找低毒性、低耐药性的安全替代品。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是人类、动物和植物等多种物种先天免疫系统不可或缺的组成部分，是机体抵御外来攻击的第一道防线，对细菌、病毒和真菌具有广泛的抗菌和免疫调节活性。并且由于其不同于抗生素的作用机制，使其不易产生耐药性，抗菌肽成为最有潜力替代抗生素的物质之一。
虽然抗菌肽具有高抗菌活性、低毒性及独特得杀菌机制等诸多优点，但是大多数的抗菌肽有许多待解决的问题，例如稳定性差，容易被酶解，同时不具备靶向性，因此破解这些问题成为抗菌肽应用的关键。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP，具有抗酶解和抗真菌的能力，为治疗真菌感染性疾病提供新得药物选择。
本发明所采用的技术方案如下：一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP，其序列如下：C8-K(C8)-K(C8)GGGCRKPCRKP-NH2，C8为正辛酸，
其结构式为：
本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP的制备方法，如下：将半胱氨酸Cys和赖氨酸Lys分别放置在精氨酸Arg的N端和C端，并且在赖氨酸Lys的C端连接脯氨酸Pro，形成空间位阻以避免蛋白酶对赖氨酸Lys和精氨酸Arg的酶解，在利用两个赖氨酸Lys的氨基和R基上的两个-NH2分别作为分枝状大分子的主链和分支链正辛酸的链接位点，设计出具有一个主链两个侧链正辛酸的分枝状抗真菌肽，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG将抗酶解序列与三个正辛酸链接，为其发挥抗菌活性提供疏水性和自组装的疏水驱动力，最后将C端进行下酰胺化，得到一种分枝状的多肽，将所述的多肽使用固相化学合成法进行合成，再经过体外抑菌活性检测、溶血活性检测、抗酶解检测，最后命名为抗真菌肽Cap-CRKP。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP在制备治疗真菌感染性疾病的药物中的应用。
进一步的，如上所述的真菌为白色念珠菌。
进一步的，如上所述的真菌为耐氟康唑白色念珠菌。
本发明的优点及有益效果：本发明通过利用赖氨酸的侧链将抗酶解序列与三个正辛酸连接起来，形成有空间位阻的抗酶解分枝状抗菌肽，肽链之间的空间位阻与合理规避酶切位点的抗酶解单元可以进一步提高抗菌肽的稳定性。对得到抗酶解分枝状抗菌肽Cap-CRKP进行抗菌活性、溶血活性和抗蛋白酶水解能力检测，发现抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP不但对白色念珠菌有明显的抑制作用，对耐药菌耐氟康唑白色念珠菌有高效的抑制作用，同时具有很低的溶血毒性；并且能抵挡住高浓度的胰蛋白酶、糜蛋白酶和蛋白酶K的降解，因而，综合来看，抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP是一种具有较高实际应用潜力的抗菌肽。
附图说明
图1为抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP的质谱图。
图2为抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP高效液相色谱图。
图3为抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP的溶血活性图。
图4为抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP与2mg和0.5mg的糜蛋白酶反应结果。
图5为抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP与2mg和0.5mg的蛋白酶K反应结果。
图6为抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP与0.5mg的胰蛋白酶反应结果。
图7为抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP与2mg的胰蛋白酶反应结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
分枝状抗真菌肽的设计：
分枝状抗真菌肽Cap-CRKP的氨基酸序列为：
C8-Lys(C8)-Lys(C8)GlyGlyGlyCysArgLysProCysArgLysPro-NH2
本设计利用的是合理规避酶切位点的原则，避免胰蛋白酶，糜蛋白酶等蛋白酶的酶切，将半胱氨酸Cys和赖氨酸Lys分别放置在精氨酸Arg的N端和C端，并且在赖氨酸Lys的C端连接脯氨酸Pro，形成空间位阻以避免蛋白酶对赖氨酸Lys和精氨酸Arg的酶解，在利用两个赖氨酸Lys氨基和R基上的两个-NH2分别作为分枝状大分子的主链和分支链正辛酸的链接位点，设计出具有一个主链两个侧链正辛酸的分枝状抗真菌肽。进一步使用柔性氨基酸连接体GGG将抗酶解序列与三个正辛酸链接，为其发挥抗菌活性提供疏水性和自组装的疏水驱动力，最后将C端进行下酰胺化，命名为Cap-CRKP。抗菌肽的序列如表1所示。
表1抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP的主要参数
Cap-CRKP为分枝状多肽，正电荷数为5，分子量为1792.37。
其结构式为：
实施例2
将上述分枝状多肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：
1、多肽主链的制备从C端到N端逐一进行，首先进行树脂活化，从C端An开始根据要求所做的量来称取树脂Fmoc-An-Resin并放入反应柱浸泡30分钟
2、脱保护：树脂浸泡30分钟后，抽掉溶液，然后脱保护，用哌啶进行脱保护反应30分钟。
3、称料：在脱保护30分钟内，根据所做的量，算出每步需要的氨基酸，缩合剂，NMM的反应的量，然后进行称量下一步氨基酸Fmoc-An-1
4、洗脱保护：脱保护30分钟后，抽掉哌啶然后用DMF洗6遍，洗完6遍检测脱保护颜色，并记录。
5、加料：洗完脱保护，检测完，按照每条肽的顺序，依次加入称量好的料，然后加入少许反应液，然后加入碱NMM.调气均匀，用DCM冲掉反应柱内壁上黏住的树脂，然后记录反应时间，反应30分钟。
6、检测：反应三十分钟后，抽掉反应液，用DMF洗3遍后检测，检查否反应完全。
7、检测已连上后，即重复2～6步骤，连接下一个氨基酸，如果检测未过的，用DCM浸泡起来，然后不脱保护，继续连接本步的氨基酸，直到连上为止。
8、使用水合肼脱去Fmoc-Lys(Dde)-OH侧链Dde保护基团，重复步骤1，完成支链正辛酸链接。
9、在上述得到的多肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成
10、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
11、将上述冻干样品取少量样进行超声溶解，溶解完成后取20微升样品。放分析型高效液相色谱仪分析，梯度为10-100，时间是0～25分钟，A泵是100％乙腈加0.1％TFA，B泵100％水加0.1％TFA,进样分析，搜取目标峰以后把质谱确定是否正确，确定目标峰以后给出相应的梯度进行制备，制备型液相色谱仪的流动相和分析的相同时间也相同在目标峰出来后进行质谱确认，确认好质谱后给出相应的梯度进行分析。质谱图中显示的分子量(见附图1)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％(见附图2)。
实施例3
对制备完成的抗酶解分枝状抗真菌肽通过体外抑菌活性、溶血活性检测；
1、抗菌活性的测定：在酵母提取物蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂平板上培养真菌菌落，挑取真菌单菌落，调至OD600＝0.4，然后将上述真菌溶液重悬于含吗啉丙烷磺酸(MOPS)作为缓冲的RPMI1640溶液中。将50μl含有不同浓度Cap-CRKP的BSA分别加入到96孔板中，将重悬后的真菌溶液加入上述的96孔板中，每孔50μl。Cap-CRKP的终浓度为0.125至64μM。在30℃温育48小时后，用酶标仪在492nm(OD＝492nm)处测定光吸收值,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP的抑菌活性(μM))
通过表2可以看出，抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP对于白色念珠菌和耐氟康唑白色念珠菌表现出高效的抑菌活性。
2、溶血活性的测定：取新鲜人血液用PBS(PH＝7.4)稀释10倍后离心，1000g离心5min，获取人新鲜红细胞(hRBCs)，再用PBS离心洗涤三次。并重新悬浮在PBS中，取50μL洗涤后的hRBCs与50μL含不同肽浓度的PBS溶液在96孔板中等体积混合，0.1％Triton X-100作为阳性对照，洗涤后的hRBCs作为阴性对照，在37℃培养箱内恒温孵育1h，然后将平板在4℃下以1000离心5分钟，抽取上层清液50μl至新的96孔板中，在570nm处测量其吸光度值。每组取平均值，并比较分析溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率是抗菌肽的浓度。
溶血率(％)＝[(样品OD570—阴性对照OD570)/(阳性对照OD570—阴性对照OD570)]×100％
多肽溶血活性检测结果见附图3。溶血率越低，表明多肽越安全。通过附图3可以看出，抗酶解分枝状抗菌肽Cap-CRKP在64μM以下的浓度检测范围内没有明显的溶血活性。溶血活性远高于抑菌活性，表明抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP具有极高的实际应用潜力。
实施例4
对制备完成的抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP通过蛋白酶抗性检测；
蛋白酶抗性：为了检验抗菌肽对抗蛋白酶水解的能力，我们将浓度为64μM的抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP与不同类型蛋白酶进行孵育。在37℃条件下，用2mg和0.5mg的胰蛋白酶、糜蛋白酶和蛋白酶K溶液分别处理抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP，在37℃下培养1、2、4和8h。然后利用SDS-PAGE试验评估肽的蛋白酶稳定性。对照组为没有经过蛋白酶处理的组别，测试结果见附图4-7。
通过附图4-7可以看出，糜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K对Cap-CRKP均没有明显影响，这表明全新设计的抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP具有优异的抵抗高浓度蛋白酶水解的能力。
综合结果显示，抗酶解单元与多个脂肪酸相连形成的抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP，对白色念珠菌和耐氟康唑白色念珠菌表现出高效的抑菌活性，最小抑菌浓度可达微摩尔级别。同时Cap-CRKP具有极低的溶血毒性和极高的蛋白酶稳定性，表明全新设计出的抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP具有较高的替代抗生素治疗真菌及耐药真菌感染得的潜力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP, 其特征在于：其序列如下：
C8-K(C8) -K(C8)GGGCRKPCRKP-NH2 ，C8为正辛酸，
其结构式为：
。
2.根据权利要求1所述的一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP的制备方法，其特征在于，方法如下：将半胱氨酸Cys和赖氨酸Lys分别放置在精氨酸Arg的N端和C端，并且在赖氨酸Lys的C端连接脯氨酸Pro，形成空间位阻以避免蛋白酶对赖氨酸Lys和精氨酸Arg的酶解，在利用两个赖氨酸Lys的氨基和R基上的两个-NH2分别作为分枝状大分子的主链和分支链正辛酸的链接位点，设计出具有一个主链两个侧链正辛酸的分枝状抗真菌肽，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG将抗酶解序列与三个正辛酸链接，为其发挥抗菌活性提供疏水性和自组装的疏水驱动力，最后将C端进行下酰胺化，得到一种分枝状的多肽，将所述的多肽使用固相化学合成法进行合成，再经过体外抑菌活性检测、溶血活性检测、抗酶解检测，最后命名为抗真菌肽Cap-CRKP。
3.根据权利要求1所述的一种抗酶解分枝状抗真菌肽Cap-CRKP在制备治疗念珠菌感染性疾病的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的念珠菌为白色念珠菌。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的念珠菌为耐氟康唑白色念珠菌。
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