CN109553677A - 基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽w8及其制备方法和应用 - Google Patents

基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽w8及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8及其制备方法和应用，衍生肽W8的序列如SEQ ID No.1所示。制备方法如下：依据两栖类蛙源抗菌肽，设计出抗菌肽P8，其序列如下：AARIILRPRFR，以该序列为基础，对8号位脯氨酸辅以氨基酸Trp，设计出衍生肽W8，其序列如下：AARIILRWRFR。该衍生肽W8在制备治疗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌感染性疾病药物中的应用。抗菌肽W8的抑菌活性明显强于Kunitzin‑RE,且具备Kunitzin‑RE所不具备的显著的广谱抑菌活性，W8提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性。

Description

基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素作为饲料添加剂的应用要追溯到1943年，美国人首先发现一些抗生素发酵残渣能促进猪的生长。1949年美国人Cunha和Stokstad首次应用青霉素在动物中进行系统的对比实验，结果证实应用抗生素对动物有较好的防病和促生长作用。1950年美国食品和药物管理局正式批准青霉素等抗生素在饲料中应用。因为具有促进动物的生长，提高增重率；提高动物的繁殖性能；提高成活率，减少发病；提高饲料的利用率，节约成本等作用，抗生素作为一种非营养性的饲料添加剂而得到迅速、广泛的应用。抗生素的应用在带给人们极大利益的同时，它的滥用也给人类带来了越来越大的麻烦。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗菌物是解决抗药性问题的一条有效途径。
抗菌肽是动物机体抵御外界微生物侵害及清除体内突变细胞的一类小分子多肽，具有广谱抗菌、无毒性、无耐药性、无残留与无污染等优点，而且其热稳定性好，添加剂量小，完全符合畜产品安全的需要，适合在饲料生产过程中使用，极具有作为新一代饲料添加剂的潜质。而且抗菌肽的抑菌机理与抗生素不同，抗菌肽是通过破坏细菌的细胞膜使细胞内溶物外泄从而杀死细胞，所以细菌不易产生耐药性。更为重要的是,抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，只作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。据上述原因抗菌肽完全有可能取代抗生素而成为一类新型、高效、低毒、无残留的抗菌物质，具有广阔的应用前景。但是天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，大部分天然抗菌肽存在抗菌活性不强、抗菌谱相对较窄、合成成本较高、部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性、在具有对病原微生物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用和对蛋白酶敏感等不足。因此如何提高其活性和最大程度降低其毒性成为抗菌肽分子改造的目的，也是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。所以，通过改造抗菌肽使其具有更高的抑菌活性，降低其毒性已成为现在研究的热点。
发明内容
基于以上不足之处，本发明公开一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8及其制备方法和应用；抗菌肽W8展示出强大广谱抗菌活性，包括针对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌等常见致病菌；对于哺乳动物细胞，抗菌肽W8表现出极低的细胞毒性，生物安全性优良。
本发明的目的通过如下技术实现：一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8，其序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8的制备方法，如下：在两栖类蛙源抗菌肽Kunitzin-RE的序列上将-CKAAFC-序列截除，并将3，7，9号位氨基酸使用正电荷氨基酸-精氨酸进行替换，设计出抗菌肽P8，其序列如下：AARIILRPRFR，以该序列为基础，对8号位脯氨酸辅以氨基酸Trp，设计出衍生肽W8，其序列如下：AARIILRWRFR。
2、如上所述的一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8在制备治疗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌感染性疾病药物中的应用。
本发明具有如下优点及有益效果：本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现W8对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌等多种常见治病菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，是一类极具有临床应用价值的广谱抗菌肽。综上所述，W8是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
本抗菌肽W8的抑菌活性明显强于Kunitzin-RE,且具备Kunitzin-RE所不具备的显著的广谱抑菌活性，同时，与Kunitzin-RE相比，衍生肽W8具有更低溶血能力及细胞毒性，抗菌肽W8提高了在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，展现出更为优秀的生物安全性。与此同时，在模拟的体内的盐离子浓度下，抗菌肽W8仍然维系着较强的杀菌能力，保持着良好的稳定性。证明其在临床医疗中，具有良好的治疗潜力。
附图说明
图1为抗菌肽W8的质谱图；
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：抗菌肽的设计
在天然存在的两栖类蛙源抗菌肽Kunitzin-RE的序列基础上(AAKIILNPKFRCKAAFC)将-CKAAFC-序列截除，并将3，7，9号位氨基酸使用正电荷氨基酸-精氨酸进行替换设计出抗菌肽P8(AARIILRPRFR)；以该模板为基础，对8号位脯氨酸辅氨基酸Trp，设计出一突变肽，该肽的氨基酸序列如表1中W8所示。
表1衍生肽的氨基酸序列
P8和W8的电荷数均为+4，疏水值分别为0.399和0.538，疏水力矩分别为0.211和0.275。将P8，W8俩条肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。通过该方法在提高W8抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。
实施例2：固相化学合成法合成W8抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
图1中样本信息参数如下：
流动相的比例：50％水/50％甲醇
阻断温度：200
序列：AARIILRWRFR-NH2
修饰：C-末端酰胺化
理论值：1572.85
检测值：1572.00
实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性
通过表2可以看出，W8具有强效的广谱抑菌活性，且抑菌能力要明显胜于Kunitzin-RE和P8，表明W8具有成为新一代抗菌药物的潜力。
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。
表3抗菌肽溶血活性的测定
通过表3可以看出,Kunitzin-RE在肽浓度达到32μM时即会造成红细胞溶血，而P8和W8在检测范围内均未表现出溶血活性。
3、盐离子稳定性的测定
将待测的抗菌肽用含有不同生理浓度的盐离子肽稀释液稀释，其盐离子浓度分别为150mM NaCl，4.5mM KCl，2.5mM CaCl2，1mM MgCl2，8μM ZnCl2，6μM NH4Cl，和4μM FeCl3。然后将抗菌肽与待测菌液一起在37℃下培养，并按照关于抗菌肽抗菌活性的测定步骤所述的测定模式，测定抗菌肽的最小杀菌浓度；以未经盐离子处理组作为对照组，检测抗菌肽对不同盐浓度的稳定性。检测结果见表4。
表4抗菌肽盐离子稳定性测定
通过表4可以看出,Kunitzin-RE与P8在生理浓度的盐离子中，抗菌肽的抑菌活性均受到较大影响，甚至丧失。而W8在生理盐离子浓度中仍然保持优秀的抑菌活性。
以上结果显示，肽链长度过长，导致其溶血活性显著提高。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，W8具有较高的治疗指数，同时由表4可知，W8抗菌肽在正常的生理浓度中依然保持强大的杀菌能力，上述证明设计得到的W8具有较高的替代抗生素的发展潜力。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Ala Ala Arg Ile Ile Leu Arg Trp Arg Phe Arg
1 5 10

Claims (3)

1.一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8的制备方法，其特征在于，方法如下：在两栖类蛙源抗菌肽Kunitzin-RE的序列上将-CKAAFC-序列截除，并将3，7，9号位氨基酸使用正电荷氨基酸-精氨酸进行替换，设计出抗菌肽P8，其序列如下：AARIILRPRFR，以该序列为基础，对8号位脯氨酸辅以氨基酸Trp，设计出衍生肽W8，其序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽W8在制备治疗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌感染性疾病药物中的应用。
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