CN111533786A

CN111533786A - 色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

Info

Publication number: CN111533786A
Application number: CN202010234599.0A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 邵长轩; 来振衡
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111533786B

Abstract

本发明提供一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法。抗菌肽WRLPG，其序列如SEQ ID No.1所示。制备方法以β‑发卡两亲肽排布为基础，设计出含色氨酸精氨酸跨链交互作用和PG转角单元的抗菌肽模板XWYRYPGXWYRY‑NH₂，X＝R，Y＝L。本抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。本抗菌肽在不含半胱氨酸对形成的二硫键条件下，形成稳定的β‑发卡结构，氨基酸序列长度仅有12，且在保持较高抑菌活性的基础上具有良好的生物安全性，治疗指数达到90.78。具有较高的替代抗生素的发展潜力。

Description

色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法。

背景技术

随着微生物对传统抗生素的抵抗力的增强，对新的抗微生物感染药物的需求日益迫切。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)在从昆虫到植物再到动物的各种生物中广泛发现，是先天免疫的重要组成部分，显示出广谱的抗菌活性，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，病毒和真菌。与抑制特定生物合成途径(如细胞壁或蛋白质合成)的常规抗生素不同，大多数两亲性AMPs通过物理破坏微生物膜脂质双层而发挥其活性，并诱导细胞质成分渗漏，从而导致细胞死亡。这些特性使AMPs被认为是常规抗生素的潜在替代品。

α-螺旋和β-折叠是抗菌肽中常见的两个主要二级结构。α-螺旋折叠AMPs通常通过阳离子和疏水氨基酸的两亲排列来设计或根据经验进行修饰，以形成完美的两亲螺旋结构。然而，最近的研究表明，α-螺旋完美的两亲性常常导致杀菌活性和细胞毒性同时增加。β-发夹结构是β-折叠结构的基本和简化形式，由两条平行链和一个β-转角组成。在细菌膜的条件下，疏水氨基酸或带正电荷的残基排列在片层的两侧，以形成类似于α-螺旋的两亲结构。一些研究表明，与具有相等电荷和疏水性的α-螺旋对应物相比，β-折叠肽具有更高的选择性。但与此相矛盾的地方在于，天然的β-折叠或β-发夹结构肽都含有1-4对不等的半胱氨酸形成二硫键以固定折叠或发卡结构。这些二硫键的存在不仅增加序列长度造成毒性过高，同时在目前化学合成的实施中，合成难度和合成成本都比较高，严重影响多肽快捷廉价的制备。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及其制备方法，利用色氨酸的芳香族侧链与精氨酸的正电性形成多肽分子内跨链的cation-π作用，以取代半胱氨酸形成的二硫键，同时缩短多肽序列长度，提供足够的正电荷和疏水性以形成β-发夹的两亲结构，解决β-发夹结构抗菌肽序列过长、合成困难、合成成本高的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WRLPG，所述的抗菌肽WRLPG以PG为转角单元，通过色氨酸精氨酸跨链交互作用形成β发卡结构的力，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

如上所述的一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WRLPG的制备方法，技术特点如下：以β-发卡两亲肽排布为基础，设计出含色氨酸、精氨酸跨链交互作用和PG转角单元的抗菌肽模板XWYRYPGXWYRY-NH₂，当X＝R，Y＝L时，抗菌肽命名为WRLPG，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的在于提供如上所述的一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WRLPG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

本发明的有益效果及优点：通过本方法制备的抗菌肽，序列长度短，合成技术便捷，在不含半胱氨酸对形成的二硫键条件下，形成稳定的β-发卡结构，氨基酸序列长度仅有12，且在保持较高抑菌活性的基础上具有良好的生物安全性。对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现WRLPG对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等多种菌株有高效的抑制作用，在检测范围内未表现出溶血活性，其治疗指数达到90.78。综上所述，WRLPG是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽的三维结构投影图。

图2为抗菌肽WRLPG的高效液相色谱图；

图3为抗菌肽WRLPG的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

抗菌肽WRLPG的氨基酸序列为：

Arg Trp Leu Arg Leu Pro Gly Arg Trp Leu Arg Leu-NH₂

1 5 10 12

以β-发卡两亲肽排布为基础，通过色氨酸精氨酸为跨链交互作用作为辅助PG转角单元形成β发卡结构的力，设计出模板XWYRYPGXWYRY-NH₂，X为正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸，当X＝R，Y＝L时，抗菌肽命名为WRLPG。抗菌肽的序列如表1所示。

表1衍生肽的氨基酸序列

WRLPG的序列长度为12，转角单元为PG单元，将肽的C端酰胺化以提高一个正电荷，电荷数为+5。该方法使多肽在不含半胱氨酸对形成的二硫键条件下，形成稳定的β-发卡结构(图1)，具有高效抑菌活性的同时具有较低的溶血活性。

实施例2

固相化学合成法合成WRLPG抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图2、3所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定

1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。细菌在220rpm恒定摇动下于37℃孵育过夜，然后转移至新的MHB直至生长的对数期。将50μL细菌培养物(～10⁶CFU/mL)添加到50μL含有不同浓度抗菌肽的BSA中，在37℃下孵育～18h。在18h孵育结束时观察并测量492nm的光密度，在视觉和分光光度法下未观察到微生物生长的抗菌肽浓度为MIC。含微生物细胞的肉汤用作阴性对照，未接种的肉汤用作阳性对照。测试进行3次重复，每个重复两个平行。

检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，WRLPG对于革兰氏阴性和阳性菌均表现出较高的抑菌活性。

2、溶血活性的测定：健康人的新鲜血液1mL，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μL PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性的测定

通过表3可以看出，WRLPG在检测范围内未表现出溶血活性，其治疗指数达到90.78。

以上结果显示，以色氨酸精氨酸为跨链交互作用，以PG为转角单元设计出的抗菌肽WRLPG具有较高的治疗指数，表明其具有较强的替代抗生素的潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Trp Leu Arg Leu Pro Gly Arg Trp Leu Arg Leu

1 5 10

Claims

1.一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WRLPG，其特征在于，所述的抗菌肽WRLPG以PG为转角单元，通过色氨酸精氨酸跨链交互作用形成β发卡结构的力，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WRLPG的制备方法，其特征在于，以β-发卡两亲肽排布为基础，得到含色氨酸、精氨酸跨链交互作用和PG转角单元的抗菌肽模板XWYRYPGXWYRY-NH₂，当X＝R，Y＝L时，抗菌肽命名为WRLPG，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WRLPG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。