CN115960171A - 高稳定性Trp-pocket跨链交互型β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种Trp‑pocket跨链交互型高稳定性β‑发卡抗菌肽WpLFPG及制备方法和应用。该抗菌肽序列如SEQ ID No.1所示。本发明以Pro‑Gly作转角单元，利用Trp残基在β‑发卡抗菌肽的一个表面上形成一个pocket结构，以此设计出了XWRWRPGXKXYR‑NH₂的β‑发卡模板，当X＝F，Y＝L时，抗菌肽命名为WpLFPG；并公开了该抗菌肽在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中应用。该抗菌肽对多种细菌具有极强的抑菌活性和可忽略不计的溶血，治疗指数达到123.08，此外，在多种生理环境和极端条件下具有较高的稳定性，该抗菌肽具有较强替代抗生素的潜力。

Description

高稳定性Trp-pocket跨链交互型β-发卡抗菌肽及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高稳定性Trp-pocket跨链交互型型β-发卡抗菌肽及制备方法和应用。

背景技术

由于人们高剂量、无限制地使用抗生素，导致了大量的耐药性细菌出现并进行传播和繁殖。所以迫切需要开发新的抗微生物感染药物来降低耐药菌带来的影响。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一类具有广谱抗菌活性(包括细菌和真菌)且结构多样的短肽。大多数AMPs属于阳离子肽，其发挥抗菌活性主要通过与细菌细胞膜阴离子成分发生静电吸附作用并破坏细胞膜，使细胞质成分泄露，进而导致细胞死亡。这种特殊的作用机制使细菌不易对AMPs产生抗药性，也使AMPs具备了替代抗生素的潜力。

目前，AMPs的研发和应用还存在构效关系不明确、在盐离子和血清等生理条件下稳定性差等问题。在过去对AMPs的研究中，α-螺旋结构AMPs是被研究最广泛的一种结构。α-螺旋一般为右手螺旋结构，依靠氢键来维持稳定性，既具有亲水性又具有亲脂性，这种两亲性也是其能够杀菌的关键所在。β-折叠结构则由正电性残基和疏水性残基折线式交叉排布，由单个或多个二硫键跨链连接，形成类似于α-螺旋的两亲结构。β-发卡是简化的β-折叠形式，由一个β-转角和两条反向平行的侧链组成。但由于二硫键在实际合成过程中较为繁琐且成本高昂而未被广泛研究。而且，复杂且冗长的多肽序列结构还会带来严重的系统毒性，因此需要基于蛋白质工程和AMPs结构功能参数来进一步简化β-发卡AMPs设计，以期收获高效安全、稳定可靠、价格低廉的AMPs产品。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种高稳定性Trp-pocket跨链交互型β-发卡抗菌肽，以解决β-发卡抗菌肽合成复杂、成本高昂、稳定性差以及毒性高的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种高稳定性Trp-pocket跨链交互型β-发卡抗菌肽WpLFPG，所述的抗菌肽WpLFPG以PG为转角单元，使用两个Trp通过Cation-π作用与Lys形成稳定β-发卡结构的力，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的是提供如上所述的一种高稳定性Trp-pocket跨链交互型β-发卡抗菌肽WpLFPG的制备方法，如下：在单侧链的两个非氢键位点放置两个Trp残基，在另一侧链靠近转角的非氢键位点放置Lys，使其通过Cation-π作用结合在β-发卡抗菌肽的一个表面，形成色氨酸口袋结构，并由此设计得到了得到XWRWRPGXKXYR-NH₂的β-发卡模板，当X＝F，Y＝L时，得到该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，然后采用固相化学合成法合成该多肽，对该多肽进行抑菌活性检测、细胞毒性检测以及溶血活性检测，最后命名为抗菌肽WpLFPG。

本发明的另一目的在于提供如上所述一种Trp-pocket型β-发卡抗菌肽WpLFPG在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中应用。

本发明的原理：在单侧链的两个非氢键位点放置两个Trp残基，在另一侧链靠近转角的非氢键位点放置Lys，使其通过Cation-π作用结合在β-发卡抗菌肽的一个表面，形成色氨酸口袋结构，此设计可以极大地稳定β-发卡构象，即使没有二硫键，也足以推动β-发卡抗菌肽的形成，并且采用两个Trp和三个Phe提供疏水性，抗菌肽的C端酰胺化增加一个正电荷,以这种方法设计的抗菌肽具有稳定的β-发卡结构，并且在具有高效的抑菌活性和较低的溶血活性的同时还具有极好的稳定性。

本发明的有益效果及优点：本发明的抗菌肽WpLFPG，序列长度短，结构稳定，不含难以合成且易被游离的硫醇基团反应裂解的二硫键，合成成本低廉。对合成的抗菌肽进行抗菌、溶血及稳定性活性检测，发现抗菌肽WpLFPG对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、粪肠球菌等多种菌株表现出很好的抑制作用，对十种细菌的最小抑菌浓度的几何平均数达到了4.16μM，并且具有很低的溶血活性，同时，WpLFPG在高浓度血清、生理盐离子浓度、极酸极碱条件下依旧保持优异的稳定性。综上所述，WpLFPG是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽WpLFPG的高效液相色谱图；

图2为抗菌肽WpLFPG的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

多肽的设计

多肽WpLFPG的氨基酸序列为：

基于β发卡结构的排布原则，在一条侧链的非氢键位点固定了两个Trp，在另一条侧链对应的非氢键位点固定对应的Lys，以PG为转角单元，设计出Trp-pocket型β-发卡抗菌肽模板XWRWRPGXKXYR-NH₂，当X＝F，Y＝L时，多肽命名为WpLFPG,，其氨基酸序列如表1所示。

表1多肽WpLFPG的氨基酸序列

其分子式如式(Ⅰ)所示：

多肽WpLFPG序列长度为12个氨基酸，转角单元为PG单元，两个Trp和三个Phe提供疏水性，抗菌肽的C端酰胺化增加一个正电荷，电荷数为+5。以这种方法设计的抗菌肽具有稳定的β-发卡结构，并且在具有高效的抑菌活性和较低的溶血活性的同时还具有极好的稳定性。

实施例2

固相化学合成法合成多肽WpLFPG

1、AMPs的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％ B～40％ B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的AMPs经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％(如图1所示)。

实施例3

抗菌肽WpLFPG抗菌活性测定

1、抗菌活性的测定：测定抗菌肽最小抑菌浓度所用方法是肉汤稀释法。将细菌放置在37℃、220rpm摇床中恒定摇动孵育过夜，第二天转移至新的MHB直至生长的对数期。用0.2％BSA(含0.01％乙酸)利用倍比稀释法稀释肽溶液，取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁶CFU/mL)于各孔中。含有菌液不含肽的作为阳性对照，不含菌液也不含肽的作为阴性对照。在37℃下孵育18h。在18h孵育结束时用酶标仪观察并测量492nm的光密度，在视觉和分光光度法下均未观察到微生物生长的抗菌肽浓度为抗菌肽的最小抑菌浓度。检测结果如表2所示。

表2抗菌肽WpLFPG的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，抗菌肽WpLFPG对于革兰氏阳性菌和阴性菌均表现出较高的抑菌活性。

2、溶血活性的测定：抽取身体健康人血液1mL，3000～3500rpm、4℃离心10min，弃去上清液，收集下层红细胞，使用无菌PBS溶液(pH＝7.4)清洗3遍后，用10倍体积的PBS溶液重悬红细胞，之后取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，放置37℃培养箱内恒温孵育1h。用0.1％Triton X-100处理的红细胞悬浮液用作阳性对照，未处理的红细胞悬浮液用作阴性对照。离心(3000～3500rpm、4℃)10min抽取上清液转移到新的无菌96孔板中。溶血率计算公式如下：溶血率(％)＝[(处理样品的OD₅₇₀–阴性对照的OD₅₇₀)/(阳性对照的OD₅₇₀–阴性对照的OD₅₇₀)]×100％。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果如表3所示。

表3抗菌肽WpLFPG溶血活性的测定

如表3所示，肽WpLFPG在检测范围内均未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到123.08。

3、稳定性的测定：将每种浓度(150×10^-3M NaCl，4.5×10^-3M KCl，6×10^-6MNH₄Cl，1×10^-3M MgCl₂，2×10^-3M CaCl₂，8×10^-6M ZnCl₂，4×10^-6M FeCl₃)的盐溶于BSA溶液中，之后步骤与抗菌活性的测定方法一致。评估血清、酸、碱对抗菌活性的影响，将肽与不同浓度血清(100％，50％)和不同pH(pH＝2、12)共同孵育4小时后测定抗菌活性。检测结果如表4所示。

表4抗菌肽WpLFPG在生理盐浓度、血清和不同pH条件下对大肠杆菌25922和金黄色葡萄球菌29213的抑菌活性(μM)

根据表4结果可以看出，抗菌肽WpLFPG在生理浓度的盐粒子水平下、50％和100％血清和极酸极碱环境中依旧保持良好的抑菌活性。

综合以上所有结果，以Pro-Gly作转角单元，利用Trp残基在β-发卡抗菌肽的一个表面上形成一个pocket结构设计出的抗菌肽WpLFPG具有较高的治疗指数，表明其具有较强的替代抗生素的潜力。

Claims (3)

1.一种Trp-pocket跨链交互型高稳定性β-发卡抗菌肽WpLFPG，其特征在于：所述抗菌肽WpLFPG以PG为转角单元，使用两个色氨酸通过Cation-π作用与赖氨酸形成稳定β-发夹结构的力，所述抗菌肽WpLFPG的C端采用-NH₂酰胺化，所述抗菌肽WpLFPG氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种Trp-pocket跨链交互型高稳定性β-发卡抗菌肽WpLFPG的制备方法，其特征在于，方法如下：在单侧链的两个非氢键位点放置两个Trp残基，在另一侧链靠近转角的非氢键位点放置Lys，使其通过Cation-π作用结合在β-发卡抗菌肽的一个表面，形成色氨酸口袋结构，并由此设计得到了得到XWRWRPGXKXYR-NH₂的β-发卡模板，当X＝F，Y＝L时，得到该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，然后采用固相化学合成法合成该多肽，对该多肽进行抑菌活性检测、细胞毒性检测以及溶血活性检测，最后命名为抗菌肽WpLFPG。

3.根据权利要求1所述的一种Trp-pocket跨链交互型高稳定性β-发卡抗菌肽WpLFPG在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中应用。

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