CN117209568B

CN117209568B - 一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽pf-ir及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117209568B
Application number: CN202311310505.3A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 朱永杰; 徐婉莹; 李博文
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2023-10-11
Filing date: 2023-10-11
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2043-10-11
Also published as: CN117209568A

Abstract

本发明公开一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF‑IR及其制备方法和应用，属于生物技术领域。抗菌肽PF‑IR的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。制备方法：将疏水性细胞穿透肽PF与阳离子性细胞穿透肽IR直接嵌合，设计得到具有穿透能力和抗菌活性的嵌合抗菌肽PF‑IR，然后通过固相合成法合成。本发明的抗菌肽PF‑IR对鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等多种具有胞内生存能力的细菌具有强效的抗菌活性，而且细胞毒性低。抗菌肽PF‑IR还能高效穿透巨噬细胞且有效降低细胞内的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的存活率，并通过破坏细菌膜杀死细菌，在抗胞内细菌感染方面具有极高的应用潜力。

Description

一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR及其制备方法和应用。

背景技术

沙门氏菌、单增李斯特菌、结核分歧杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌能够入侵哺乳动物细胞，并在细胞内逃避宿主防御系统而生存繁殖。目前，细胞内细菌感染的治疗主要依靠长期使用高剂量抗生素。然而，由于细胞膜的低通透性和外排泵等机制，许多抗生素不能穿透宿主细胞膜。此外，长期使用抗生素也会诱导细胞内细菌产生耐药性。因此，目前的许多抗生素治疗策略在将来可能变得无效。

抗菌肽是一类具有抗细菌、免疫调节等多种生物学活性的小分子多肽。抗菌肽主要通过膜破坏为主的多重抗菌机理杀灭细菌，因此不易使细菌产生耐药性，有望成为解决胞内细菌感染的候选药物。但大多数抗菌肽对哺乳动物细胞的穿透性较差，使其无法成为对抗胞内细菌的高效抗菌剂。而具有高效穿透能力的阳离子性细胞穿透肽和疏水性细胞穿透肽大部分却不具有抗菌活性。因此，将疏水性细胞穿透肽和阳离子性细胞穿透肽直接嵌合组成具有高效穿透能力和强效抗菌活性的抗菌肽是对抗细胞内细菌的重要策略。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR，解决了大多数抗菌肽和细胞穿透肽对细胞内细菌抑菌活性不佳的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述的嵌合抗菌肽PF-IR，其分子式如式(I)所示，

本发明还提供如上所述的一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR的制备方法，如下：选择疏水性细胞穿透肽PF与阳离子性细胞穿透肽IR分别提供抗菌活性所需的疏水性和正电荷，同时保留其高效的细胞穿透能力。将疏水性细胞穿透肽PF与阳离子性细胞穿透肽IR直接嵌合构成同时具备细胞穿透能力和抗菌活性的嵌合抗菌肽。由此设计得到的多肽其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。将得到的多肽采用固相化学合成法合成，经过质谱鉴定及反相高效液相色谱纯化，再经过抑菌活性测定、细胞毒性的测定和细胞穿透能力测定，最终命名为抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR。

本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR在制备治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。

进一步的，所述的应用，所述的革兰氏阴性菌为鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌或绿脓杆菌。

进一步的，所述的应用，所述的革兰氏阳性菌为单增李斯特菌、表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。

本发明具有如下优点及有益效果：本发明的嵌合抗菌肽PF-IR仅由13个氨基酸构成，序列短，成本较低。本发明的嵌合抗菌肽PF-IR对常见的鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等常见的胞内细菌具有很强的抗菌活性；对巨噬细胞几乎没有毒性；能够高效穿透巨噬细胞并且有效杀灭巨噬细胞内的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，此外主要通过破坏细菌膜发挥抗菌作用，具有抗细胞内细菌的巨大应用潜力。

附图说明

图1为嵌合抗菌肽PF-IR的质谱图。

图2为嵌合抗菌肽PF-IR的高效液相色谱图。

图3为嵌合抗菌肽PF-IR的细胞毒性。

图4为嵌合抗菌肽PF-IR的细胞穿透能力。

图5为嵌合抗菌肽PF-IR的胞内抗菌活性。

图6为扫描电子显微镜下嵌合抗菌肽PF-IR对鼠伤寒沙门氏菌14028的抗菌机理图。

图7为扫描电子显微镜下嵌合抗菌肽PF-IR对金黄色葡萄球菌29213的抗菌机理图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

嵌合抗菌肽的设计

选择疏水性细胞穿透肽PF与阳离子性细胞穿透肽IR分别提供抗菌活性所需的疏水性和正电荷，同时保留其高效的细胞穿透能力。将疏水性细胞穿透肽PF与阳离子性细胞穿透肽IR直接嵌合构成同时具备细胞穿透能力和抗菌活性的嵌合抗菌肽。由此设计得到的嵌合抗菌肽命名为PF-IR。

抗菌肽PF-IR的氨基酸序列如下：

Pro Phe Val Tyr Leu Ile Ile Arg Gln Arg Arg Arg Arg-NH₂

1 5 10 13

表1抗菌肽的氨基酸序列

嵌合抗菌肽PF-IR，其分子式如式(I)所示，

实施例2

固相化学合成法合成嵌合抗菌肽

一、固相合成：

1.树脂溶涨：将Fmoc-Arg(Pbf)-WangResin树脂放入反应管中，加DCM(15mL/g)，振荡30min。

2.接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH氨基酸和缩合剂Pybop，再加入3倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。

3.脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，5min，去掉，再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。

4.检测：(1)脱保护检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，树脂变深蓝色。(2)缩合检测：抽掉DMF溶液，取十几粒树脂，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，树脂变透明白色。

5.洗：DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

6.缩合：保护氨基酸Fmoc-Fmoc-Arg(Pbf)-OH三倍过量，Pybop三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA(3倍过量)，反应30min。

7.洗：DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

8.重复2-7步操作，从右到左依次连接序列中的主链氨基酸。

9.最后一个氨基酸连接后，脱去保护基。

10.收缩：DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，抽干10min。11.从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g)，TFA94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS1％。切割时间：120min。12.吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干，得到粗品。

二、纯化鉴定：

1.检测粗品MS：取少量粗品，溶解后使用LC-MS，确定分子量(如图1所示)与表1中的理论分子量基本一致后再进行纯化。

2.纯化：使用高效液相色谱仪分析多肽，然后使用高效液相色谱仪制备，得到纯度>95％的多肽(如图2所示)。

实施例3

嵌合抗菌肽的抑菌活性测定

采用标准微肉汤稀释法测定肽的最小抑菌浓度(MIC)。将对数期的细菌稀释至～2×10⁵CFU/mL。将50μl不同浓度的肽(肽的终浓度为1-128μM)和同等体积的细菌悬液添加到96孔板各孔中，同时设置阴性对照(仅培养基)和阳性对照(细菌和培养基)，然后将96孔板置于37℃恒温培养箱18～20小时。用酶标仪在492nm(OD₄₉₂)处测定吸光度值，确定最小抑菌浓度。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表2。

表2抗菌肽PF-IR的最小抑菌浓度(μM)

通过表2可以看出，嵌合抗菌肽PF-IR对于鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、表皮葡萄球菌等多种细菌均表现出很强的抑菌活性，最小抑菌浓度在1-4μM。

实施例4

嵌合抗菌肽的细胞毒性的测定

将小鼠巨噬细胞RAW 264.7稀释至～2×10⁵cells/mL，将50μL稀释后的细胞加入到96孔板1-11列孔中，并在含5％ CO₂的37℃细胞培养箱中继续培养至细胞完全贴壁生长。在新96孔板中，将1-10列孔中的多肽浓度分别稀释至128-0.5μM，体积为50μL。11列中加入50μL相应的细胞培养基，12列中加入100μL相应的细胞培养基。将上述新96孔板各孔中的肽转移至含有细胞的96孔板相应的孔中，在含有5％ CO₂的37℃细胞培养箱中培养4h。接下来，在每孔中加入25μL的MTT(0.5mg/mL)继续培养3h。最后，弃去上清，并向每个孔中加入150μL的DMSO以溶解甲瓒晶体。11列和12列分别为阳性对照和阴性对照。用酶标仪在波长为570nm处测定吸光度值。共进行3次独立重复试验。细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率(％)＝[(样品OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)/(阳性对照OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)]×100％

图3为嵌合抗菌肽PF-IR对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的细胞毒性，在4-64μM浓度范围内嵌合抗菌肽PF-IR处理后小鼠巨噬细胞RAW 264.7的存活率仍然保持在80％以上，表明抗菌肽PF-IR的细胞毒性低，具有良好的生物相容性。

实施例5

嵌合抗菌肽的细胞穿透能力测定

将小鼠巨噬细胞RAW 264.7稀释至～2×10⁵cells/mL，将1mL稀释后的细胞加入到24孔板，并在含5％ CO₂的37℃细胞培养箱中继续培养至细胞完全贴壁生长。然后加入FITC标记的嵌合抗菌肽PF-IR在37℃处理2h，加入0.4％的台盼蓝淬灭细胞外的荧光，然后用PBS洗2-3遍后收集细胞，随后用流式细胞仪分析细胞。

图4为嵌合抗菌肽PF-IR的细胞穿透能力，在16μM的浓度下嵌合抗菌肽PF-IR能穿透进入超过95％的小鼠巨噬细胞，表明其具有高效的细胞穿透能力。

实施例6

嵌合抗菌肽的胞内杀菌活性的测定

将小鼠巨噬细胞RAW 264.7稀释至～2×10⁵cells/mL，将1mL稀释后的细胞加入到24孔板，并在含5％ CO₂的37℃细胞培养箱中继续培养至细胞完全贴壁生长。然后将对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌14028或者金黄色葡萄球菌29213添加到24孔板(感染复数＝10)在37℃感染1h，加入庆大霉素(100μg/mL)继续在37℃孵育1h以彻底清除胞外细菌，然后用PBS洗2-3遍，再加入抗菌肽(对照加入PBS)在37℃处理4h，然后用PBS洗2-3遍，使用Triton X-100裂解细胞15min，之后稀释后涂布于MHA平板，在37℃培养箱过夜培养后计数。

图5为嵌合抗菌肽PF-IR的胞内抗菌活性，16μM的PF-IR对小鼠巨噬细胞内的鼠伤寒沙门氏菌14028和金黄色葡萄球菌29213的杀伤率约在90％以上，表明其具有优异的抗胞内细菌活性。

实施例7

抗菌肽抗菌机理

将鼠伤寒沙门氏菌14028或者金黄色葡萄球菌29213接种于MHB培养基中，37℃，220rpm过夜培养后，转移到新的MHB培养基中，直至达到指数生长阶段。将在指数生长阶段的细菌离心弃去MHB培养基，收集剩余细菌，用PBS(10mM，pH＝7.4)洗三次并用其重新悬浮细菌至OD₆₀₀＝0.2。将抗菌肽(对照未经抗菌肽处理)与细菌在37℃孵育1h，然后离心收集细菌，加入600μL戊二醛(2.5％)重悬菌体，在4℃过夜固定。用不同浓度的乙醇(50％，70％，90％和100％)对样品进行脱水处理。用1:1的乙醇和叔丁醇的混合液和叔丁醇分别置换15min。将样品用冷冻干燥仪干燥后，用导电胶布粘在样品板上，用镀膜仪在样品表面镀金属膜。最后用扫描电子显微镜采集图像。

图6和图7分别为嵌合抗菌肽PF-IR对鼠伤寒沙门氏菌14028、金黄色葡萄球菌29213的扫描电子显微镜图，与对照相比，经过嵌合抗菌肽PF-IR处理后的鼠伤寒沙门氏菌14028和金黄色葡萄球菌29213的菌膜都出现褶皱、凹陷、破裂，而未经处理的细菌膜表明光滑、无破损，说明嵌合抗菌肽PF-IR的抗菌机理是通过破坏细菌膜杀死细菌。

综上所述，嵌合抗菌肽PF-IR对常见的鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等常见的胞内细菌具有很强的抗菌活性，对巨噬细胞几乎没有毒性，能够高效穿透巨噬细胞并对巨噬细胞内的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有优异的杀菌效果，而且通过破坏细菌膜杀死细菌，具有极高的应用潜力。

Claims

1.一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，其C端采用-NH₂酰胺化。

2.根据权利要求1所述的一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR的制备方法，其特征在于，方法如下：选择疏水性细胞穿透肽PF与阳离子性细胞穿透肽IR分别提供抗菌活性所需的疏水性和正电荷，同时保留其高效的细胞穿透能力，直接嵌合构成多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其C端采用-NH₂酰胺化；将得到的多肽采用固相化学合成法合成，经过质谱鉴定及反相高效液相色谱纯化，再经过抑菌活性测定、细胞毒性的测定和细胞穿透能力测定，最终命名为抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR。

3.根据权利要求1所述的一种抗胞内细菌的嵌合抗菌肽PF-IR在制备治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的革兰氏阴性菌为鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌或绿脓杆菌。

5.根据权利要求3所述的应用，所述的革兰氏阳性菌为单增李斯特菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌或金黄色葡萄球菌。