CN110283253B

CN110283253B - 一种猪源衍生杂合抗菌肽mdp-2及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110283253B
Application number: CN201910629136.1A
Authority: CN
Inventors: 马清泉; 孟庆维; 李锋; 陈志辉; 单安山; 朱佳良
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110283253A

Abstract

本发明提供一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP‑2及其制备方法和应用，其序列如序列表SEQ ID No.2所示。本发明根据抗菌肽PMAP‑23或PMAP‑36的氨基酸组成特点和分布，将天然抗菌肽进行截短和残基替换，得到猪源衍生肽；将衍生肽与髓样分化蛋白‑2的脂多糖绑定序列相互连接，以进一步增强衍生肽的细菌靶定能力，最后获得氨基酸长度从20至24不等的4条衍生杂合肽；然后合成多肽；进行纯化、鉴定；最后，通过最小抑菌浓度和溶血试验测定衍生抗菌肽的抑菌活性和细胞毒性，筛选具有较理想活性的多肽。本发明的有益效果：该多肽属于天然衍生物，安全性较好，具有广谱抗菌活性和低毒性；制备方法和技术成熟，合成成本低。

Description

一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2及其制备方法和应用。

背景技术

自上个世纪抗生素发明以来，其在动物养殖生产中占据着重要的地位，为预防和治疗畜禽疾病、保证畜禽健康发挥重要的作用。但随着抗生素的不断应用，许多问题也逐渐显现；尤其是不规范使用和滥用导致超级细菌的出现，耐药性细菌使得畜牧产业陷入恐慌，同时停药期不当也使得畜产品品质下降、药物残留不达标，影响了消费者健康和食品安全。继上个世纪末瑞典等国家开始逐渐禁用某些抗生素，现在许多国家纷纷出台政策限制抗生素的饲用，这就为抗生素的替代提出了新的挑战和课题。人们纷纷寻找抗生素替代物，其中益生菌、中草药、抗菌肽等备受关注；其中抗菌肽是动物机体天然免疫的重要组成部分，天然无毒且拥有独特的不同于传统抗生素的物理破膜杀菌机制脱颖而出。天然抗菌肽具有疏水性和正净电荷的特点，氨基酸残基长度从十以下到几十不等。

猪源抗菌肽种类较多，其中髓源抗菌肽PMAP-23和PMAP-36研究较为广泛。但是，这两种抗菌肽的抗菌活性和细菌靶定能力还不强，且还具有一定的细胞毒性等问题，因此限制了它们在实际生产中的应用。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2，其序列如序列表SEQ ID No.2所示，该衍生杂合肽源自猪防御肽，属于天然抗菌肽的衍生物，安全性较好，具有广谱抗菌活性和低毒性。

本发明的另外一个目的在于提供一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2的制备方法，制备方法和技术成熟，合成成本低，方法步骤如下：

(1)根据cathelicidin家族抗菌肽PMAP-23或PMAP-36的氨基酸组成特点和分布，将天然抗菌肽进行截短和残基替换，得到猪源衍生肽；将猪源衍生肽与髓样分化蛋白-2的脂多糖绑定序列FSKGKYKCV相互连接，以进一步增强猪源衍生肽的细菌靶定能力，最后获得氨基酸长度从20至24不等的4条猪源衍生杂合肽MDP-1，MDP-2，MDP-3和MDP-4，其序列分别如序列表SEQ ID No.1-4所示；

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成这几条多肽；

(3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备；

(4)采用美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度的方法，发现猪源衍生杂合肽MDP-2的最小抑菌浓度平均达到4μM，相比于其它猪源衍生杂合肽的抑菌活性强，通过最小溶血浓度测定多肽的细胞毒性，发现4条多肽在256μM浓度均没有细胞毒性，猪源衍生杂合肽MDP-2的治疗指数最高达到了128，综合抑菌活性和溶血活性，从而选取猪源衍生杂合肽MDP-2。

本发明的另外一个目的在于提供如上所述的猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

本发明的优点及有益效果：该衍生杂合肽源自猪防御肽，属于天然抗菌肽的衍生物，安全性较好，具有广谱抗菌活性和低毒性；该多肽由24个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。髓样分化蛋白-2(MD-2)是Toll样受体与脂多糖(LPS)联系的桥梁，作为天然免疫识别的重要调控分子，在脂多糖信号转导过程中扮演重要角色，是炎症性疾病治疗的新靶点。因此，本发明通过PMAP-23或PMAP-36的截取获得衍生肽，将猪源衍生肽与髓样分化蛋白-2的脂多糖绑定序列FSKGKYKCV相互连接，从而进一步完善这两种cathelicidin家族抗菌肽的生物学活性，提升细菌靶定能力和抑菌活性的同时降低溶血活性，为未来的生产应用奠定基础。

附图说明

图1为抗菌肽MDP-1的质谱图。

图2为抗菌肽MDP-2的质谱图。

图3为抗菌肽MDP-3的质谱图。

图4为抗菌肽MDP-4的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：猪源衍生杂合抗菌肽的设计

通过NCBI获取猪源抗菌肽PMAP-23和PMAP-36的氨基酸全序列，根据氨基酸组成和排布特点，将PMAP-23和PMAP-36进行截短和氨基酸替换，得到4条肽衍生物；髓样分化蛋白-2的脂多糖绑定序列FSKGKYKCV相互连接，以获得氨基酸长度从20至24不等的4条衍生肽MDP-1，MDP-2，MDP-3，MDP-4。如表1所示。

表1猪源衍生杂合抗菌肽的氨基酸序列和分子量

实施例2：猪源衍生杂合抗菌肽的设计的合成

将表1所示4条多肽使用多肽合成仪合成，选用固相有机合成，采用Fmoc保护合成法，合成方向从C端到N端逐一进行，具体步骤如下：

(1)选取已经和C端第一个氨基酸连接的Wang树脂，即Fmoc-A(trt)-Wang(9-芴甲氧羧基-三甲基-A，其中A为C端第一个氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应20min，洗涤树脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固体悬浮物即是脱保护的A-Wang。用印三酮检测剂检查A-Wang脱保护的质量。

(2)将Fmoc-B(trt)-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-B，B为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)与上述得到的脱保护的Wang树脂进行缩合反应；然后再脱去Fmoc基团。按照这个程序依次从C端到N端逐个延伸，直至将整个肽链合成完毕，当最后一个氨基酸脱保护后，用DMF洗涤8次，再用乙醇和二氯甲烷(DCM)交叉洗涤8次。将三氟乙酸(TFA)：三异丙基氯硅烷(TIS)：水＝95：2.5：2.5(体积比)进行混合，配制成为切割试剂与上述得到的多肽20℃下反应2h，把多肽从树脂上切割下来。旋转蒸发仪蒸发TFA，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚沉淀多肽3h，析出白色粉末状固体。真空干燥，得到粗品多肽。

(3)将上述粗品多肽使用90％乙腈水溶液溶解，使用制备色谱柱进行纯化，分析型色谱柱检测纯度。半制备型高效液相色谱仪为Waters Delta Prep 4000，制备色谱柱为Waters X-Bridge C₁₈、5μm反相柱。洗脱液A为含有0.1％TFA的水溶液，B为含有0.1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm，洗脱方式为30％B～65％B的线性浓度梯度洗脱，流速为30mL/min。收集纯度高于95％的馏分，并冷冻干燥。分析型高效液相色谱仪为Agilent 1100，分析型色谱柱为SepaxGP-C₁₈反相柱(4.6mm×150mm,5μm)，洗脱液A液为0.1％TFA的水溶液，B液为含0.1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。洗脱方式为50％B～75％B的线性浓度梯度洗脱，流速为1.0mL/min。

(4)多肽的质谱鉴定：将上述得到的多肽经过电喷射质谱法分析，质谱图中显示的分子量与理论分子量一致。如附图1-4所示。使用高效液相色谱进行纯化，使得抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：猪源衍生杂合抗菌肽的抑菌活性测定

采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法，同时针对抗菌肽的阳离子性的特征，以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为多肽稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。具体步骤如下：

(1)菌体的准备：取冻存于-20℃的待测菌，划线接种于MH(A)培养基中孵育。挑取单菌落，接种于10mL MH(B)培养基中，37℃、200rpm过夜培养。然后再将过夜菌体接种于新鲜的培养基中，培养1～2h，直至菌体处于对数生长期，使其OD₆₀₀＝0.4，用MH(B)将所得菌液的菌落数调整为大约10⁵CFU/mL左右；

(2)多肽的准备：将多肽的浓度调整为256μM，吸取100μL加入到96孔板的第1列孔内，其它孔中加入50μL MH肉汤培养基，然后将第1号孔中的多肽溶液吸出50μL，加入第2号孔内，依次类推倍比稀释至第10号孔，吸出50μL弃去；

(3)接种菌：用加样枪取上述调整好的50μL菌液依次加到96孔板的前11列孔中，最终接种细菌浓度为每孔5×104CFU/mL。将96孔板置微型振荡器上振荡1min，使各孔内液体混匀，微孔板加盖以减少孵育过程中的蒸发，并于37℃下孵育20～24h。其中设定阳性对照组为第11孔：即只加50μL MH肉汤培养基和50μL菌液；阴性对照为第12孔无菌对照组：即只加100μL MH肉汤培养基。这时从第1孔到第10孔抗菌肽的浓度将依次递减；

(4)结果判断：无菌对照孔在整个试验过程中应始终保持清亮，表明整个试验是无菌操作。与生长对照孔中细菌生长特性(如微孔内肉汤呈混浊状、孔底出现沉淀等)相比较进行判断，无肉眼可见生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的MIC值。

通过表2的结果可以看出，猪源衍生杂合抗菌肽对细菌的最小抑菌浓度从2μM到64μM不等，其中MDP-2的抑菌活性最强，GM值达到4μM，抑菌活性远强于MDP-1，MDP-3，MDP-4等衍生杂合肽。

表2猪源衍生杂合抗菌肽的抑菌活性

备注：GM：代表最小抑菌浓度的几何平均数。

实施例4：猪源衍生杂合抗菌肽的溶血活性和治疗指数

对于多肽溶血活性的测定，具体试验步骤如下：

(1)使用肝素钠抗凝管采集新鲜的人血液1mL，4℃保存备用；

(2)将上述的血液1000×g离心5min，弃除上清，收集红细胞；

(3)将收集到的红细胞用PBS缓冲溶液洗涤三遍，在1000×g条件下离心5min，弃上清，收集红细胞，最后用约10mL左右的PBS缓冲溶液重悬细胞；

(4)多肽的稀释：向排列好的每排12个EP管的第1号管内加入90μL PBS缓冲溶液，其余管中都加入50μL PBS缓冲溶液，再向第1号管内加入10μL待测肽母液，然后将第1号管中的多肽溶液混匀吸出50μL，加到第2号管内，依次倍比稀释至第10号后，吸出50μL弃去；

(5)取50μL上述准备好的红细胞悬液分别加入到含有不同浓度抗菌肽溶液的EP管中，在37℃培养箱内恒温孵育1h。其中，第11孔加50μL PBS和50μL红细胞悬液作为阴性对照，第12孔加50μL 0.1％Triton X-100和50μL红细胞悬液作为阳性对照；

(6)l h后取出EP管，在4℃条件下1000×g离心5min；

(7)吸取上述离心溶液的上清，平行转移到一个洁净的96孔板对应的孔中，用酶标仪在570nm(OD_570nm)处测定光吸收值。

从表3的结果可以看出，4个猪源衍生杂合抗菌肽在最大测定浓度256μM时没有发现溶血活性，证明4种杂合肽的溶血毒性无或较弱。通过治疗指数判断，即：最小溶血浓度(MHC)与最小抑菌浓度几何平均数(GM)的比值，可以看出MDP-2的治疗指数达到128，远高于其它衍生肽，因此MDP-2具有最优的杀灭细菌同时兼顾较弱的溶血毒性，具有较理想的应用前景。

表3猪源衍生杂合抗菌肽的溶血活性和治疗指数

备注：“--”代表在最大测定浓度256μM时，没有发现对红细胞的溶血活性。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Phe Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Cys Val Pro Gln Lys Pro Lys Phe Val

1 5 10 15

Thr Val Trp Val Arg

20

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Cys Val Pro Gln Lys Pro Arg Ile Ile

1 5 10 15

Arg Leu Leu Trp Arg Val Arg Arg

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Cys Val Pro Gln Lys Pro Ile Gly Lys

1 5 10 15

Val Leu Lys Trp Ile

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Phe Ser Lys Gly Lys Tyr Lys Cys Val Gly Gly Gly Ile Gly Lys Val

1 5 10 15

Leu Lys Trp Ile

20

Claims

1.一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2，其特征在于：其序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2制备方法，其特征在于，方法步骤如下：

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成这几条多肽；

(4)采用美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度的方法，发现猪源衍生杂合肽MDP-2的最小抑菌浓度平均达到4μM，相比于其他猪源衍生杂合肽的抑菌活性强，通过最小溶血浓度测定多肽的细胞毒性，发现4条多肽在256μM浓度均没有细胞毒性，猪源衍生杂合肽MDP-2的治疗指数最高达到了128，综合抑菌活性和溶血活性，从而选取猪源衍生杂合肽MDP-2。

3.如权利要求1所述的一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2在制备治疗金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或/和伤寒沙门氏菌感染性疾病药物中的应用。