CN102220255A - 一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组抗菌肽工程菌的制备方法及其应用，属于生物基因工程技术领域，包括抗菌肽基因的扩增，基因克隆，啤酒酵母转化，重组蛋白的高效表达和纯化。本发明的重组抗菌肽为猪源抗菌肽Cathelicidins家族PAMP-36，其蛋白含有如序列工D No.2所示的短肽。本发明制得的重组抗菌肽可用于生产饲料添加剂、兽药、防腐剂，以及用于制备革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌，真菌或病毒感染引发的疾病的药物。

Description

一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用

【技术领域】

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说涉及一种重组抗菌肽，其基因工程菌制备方法及应用。

【背景技术】

目前，抗菌肽(antimicrobial/antibacterial peptides，AMP/ABP)已成为免疫学和分子生物学研究的热点。抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子短肽的总称，是生物先天性免疫的重要组成部分，广泛存在于各种细菌，植物，动物以及人体中。抗菌肽具有高效，广谱抗微生物的活性特点，使其对革兰氏阳性，阴性细菌存在较强的杀伤作用，此外还具有杀真菌，原虫，抗病毒活性，杀伤肿瘤细胞等特点。

近年来，由于人类对抗生素的过度滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，不断困扰着畜牧养殖业并引发食品安全问题。抗菌肽这一非专一性免疫应答产物，对于外界各种病原体均可产生免疫应答，而不存在某一特定的抗原物质，也不易导致病原菌产生耐药性。因此抗菌肽的问世推动了新型抗菌药物的开发研制。

目前已经从猪体内发现了12种以上不同的抗菌肽，这些抗菌肽具有不同的螺旋结构，分子量相对较小(小于10kDa)，但对多种微生物有广谱杀灭作用。根据抗菌肽前体的基因结构、氨基酸序列特征，可将猪源抗菌肽分为4类：防御素(Defensins)超家族、Cathelicidins家族、Cecropins家族和NK-lysin。Cathelicidins和防御素是到目前为止在哺乳动物中所发现的两个最大群体的抗菌肽家族。

20世纪90年代，在进行bactenecin5cDNA克隆时发现Cathelicidins与抗菌肽具有共同的结构特征，即N末端都含有一个Cathelin区域，所以在1995年将其命名为Cathelicidins。研究证明编码Cathelicidins基因有4个外显子和3个内含子。前体区含有123～144个氨基酸残基，包括一个29～30个残基的信号肽和一个长约94～144个氨基酸残基的Cathelin前段。C末端区域含有长12～97个氨基酸残基的成熟肽段。前体区具有高度的同源性，猪种内同源性达100％。Cathelin前段的C端区域有4个固定的半胱氨酸，形成2个二硫键。这些基因的5′端旁侧序列含有几个调控模体，包括参与炎症反应和急性期应答的核因子(nuclear factor，NF)，如核因子白介素-6(NF-interleukin-6)、核因子KB(NF-KB)、白介素-6应答元素(interleukin-6 response element)、急性期应答因子(acute phase-response factor，APRF)和γ干扰素应答元素(γ-interferon response elements，γIRE)的位点。Cathelicidins以前肽原的形式存在，其N端为信号肽，C端是带阳离子的成熟肽段，另有带阴离子的Cathelin前段，可能用于中和阳离子肽段，使它在胞内运输、贮存时保持无活性的前肽状态，以避免细胞毒性。在多数情况下，这些抗菌肽的Cathelin区域被蛋白水解酶水解，释放出一级结构高度不同的阳离子抗菌肽。尽管Cathelicidins前肽原确切功能还不清楚，但研究者揣测这些分子有特异的生物学功能，而不仅仅是抗菌肽的贮存形式。

目前，已经至少从8种哺乳动物包括猪、水牛、兔等体内发现了30多种Cathelicidins。猪的Cathelicidins家族包括PR-39、Protegrins1～5、PMAP-23，36，37。它们都起源于骨髓细胞，组成性的以前肽(Propeptides)形式储存在周边PMNs(中性粒细胞)颗粒中。当PMNs激活和脱颗粒时，内源性弹性蛋白酶把成熟肽从前肽中切割出来。在一些情况下，这些肽通过C端酰胺化进一步修饰。

PMAP-36(porcine myloid antimicrobial peptide，PMAP)属于猪髓源性抗菌肽，对其结构预测和圆二色谱分析表明PMAP-36具有两亲性α螺旋结构。体外试验表明合成的抗菌肽具有很强的抗菌活性。PMAP-36的杀菌活性为10～50μmol/l且高于100μmol/l时也未发现溶解红细胞的作用。

由于从天然来源制备PMAP-36低效耗时，纯化抗菌肽产量极低，且费时费力，分离纯化困难，从而导致生产成本过高，不便于大规模生产使用。而化学合成抗菌肽成本高，且制备过程中常需要添加毒性有机物，不能满足安全、绿色饲料添加剂的生产要求。本发明采用分子生物学与基因工程的手段来克服上述难题，研制开发高效的重组抗菌肽。

【发明内容】

本发明旨在提供一种重组抗菌肽PMAP-36的基因工程菌的制备方法，该方法获得的抗菌肽表达量高，成本低，具有高效活性，易于实现产业化。

本发明所述的一种重组抗菌肽PMAP-36的基因工程菌的制备方法，其操作步骤为：

A：PMAP-36基因的获得

参照 

LS(Invitrogen)试剂盒说明书，从母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA。

人工合成含有限制性内切酶酶切位点的引物，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位点，合成的下游引物中引入HindIII酶切位点。其合成的引物序列为：

S1：5′-CCGAGATCTATGGAGACCCAGAGGGCCAGCC-3′

F1：5′-GGGTTCGAATTACCCACAACCCAAGGGTATTG-3′

在该合成的引物的存在下，用RT-PCR方法扩增抗菌肽PMAP-36基因，步骤为：

1)cDNA第一链的合成

①在0.2mL微量PCR管中，加入总RNA 1-5μg，在管中加20μM F1 1μL，补充适量的DEPC H₂O使总体积达11μL，轻轻混匀、离心。

②65℃加热10min，立即将微量PCR管插入冰浴中至少1min。

③然后加入下列试剂的混合物：

5×cDNA synthesis buffer     4μL

RNase OUT^TM                  1μL

10mM dNTPmix                 2μL

0.1MDTT                      1μL

Thermoscript                 1μL

轻轻混匀，离心，在60℃水浴中孵育90min。

④于85℃加热15min以终止反应。

⑤将管插入冰中，加入RNase H 1μL，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

2)cDNA第二链扩增

①取0.2mLPCR管，依次加入下列试剂：

Pre-Mix      25μL

第一链cDNA   4μL

S1(20μM)    1μL

F1(20μM)    1μL

ddH₂O        19μL

②PCR反应在Biometra Tgradient Thermocycler上进行，PCR扩增参数如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个循环，最后72℃总延伸10min，并于16℃保温。

B：基因克隆并转化大肠杆菌

回收PCR产物，用T4连接酶与PMD18-T载体连接，按照下列反应体系进行连接：向PCR管中依次加入约300ng的DNA回收产物，约50ng PMD18-T载体，5μL连接缓冲液，补充ddH₂O至10μL，4℃连接过夜。

取5μL连接产物加入到100μL大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10感受态细胞中，涂布于LB琼脂培养基平板，37℃培养12-16小时。挑取阳性菌落，37℃，225rpm培养12小时，用碱裂解法提取质粒，进行双酶切和PCR鉴定。最后进行基因测序。最终获得阳性重组质粒T-PMAP36。

C：转化酿酒酵母

扩增并抽提重组T-PMAP36质粒，分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/α。回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒PVT-PMAP36，用电转的方法转入酿酒酵母S78，获得阳性转化子S78-PMAP36。

D：扩大培养，表达蛋白

挑取高效阳性转化子S78-PMAP36，在YPD(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)液体培养基中扩大培养，当OD₆₀₀＝2-6时，收集菌液，离心取上清。用CM-cellulose23柱层析，收集纯化样品并冷冻干燥，SDS-PAGE鉴定表达的PMAP-36蛋白。

本发明的有益效果在于：

1.本发明采用的表达系统安全，表达量高，稳定性好，表达的产物具备高效的抗菌活性。

2.该载体系统突破了目前制约抗菌肽和生物活性多肽大规模应用的诸多障碍(如抗菌肽对宿主菌本身的毒性、多肽表达量低及易降解等)，且操作简单。表达的抗菌肽蛋白为组成型分泌表达，细胞培养过程无需额外添加有毒诱导剂，绿色安全。

3.通过本发明基因工程方法生产的重组PMAP-36，较之天然提取或化学合成的方法，显著降低生产成本，适于大规模生产。

本发明制得的重组抗菌肽，可替代动物日粮中的传统抗生素，改善消化道微生物系统、提供营养因子、激活动物免疫力、提高动物的生产性能；还可用于农作物病害防治、食品保鲜、防腐以及医药产品。

附图说明

图1：PMAP-36RT-PCR结果图，M：DNA DL2000 Marker；1：RT-PCR结果；

图2：酿酒酵母重组表达质粒PVT-PMAP-36的构建图；

图3：重组菌S78-PMAP-36PCR鉴定，双酶切鉴定图；M：DNADL10000Marker；1：PCR鉴定；2：XbaI和HindIII双酶切鉴定。

图4：母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-3对IgG水平的影响；

图5：母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-36对初乳中总蛋白水平的影响；

【具体实施方式】

以下的实施例可使本领域的专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：PMAP-36基因的获得和克隆构建

1.PMAP-36基因的获得

参照 

LS(Invitrogen)试剂盒说明书，从母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA。具体步骤为：

1)取母猪股骨骨髓，加少许ddH2O研磨。取小量样品于EP管中，加入900μL的TRIzol试剂，用枪将其混匀，15～30℃条件下静置5min。

2)加入200μL的氯仿至EP管中，剧烈摇动15s，混匀，15～30℃静置2～15min。

3)4℃，12000g离心15min。

4)取无色水相(上层溶液)至新EP管中，加入预冷的异丙醇0.5ml，混匀，-20℃放置10min以上，使核酸充分沉淀，下层有机相丢弃。

5)于4℃，12000g，离心10min沉淀RNA。

6)弃上清，在沉淀中加入1mL75％的预冷的乙醇，涡旋。

7)4℃，7500g离心10min。

8)弃上清，沉淀在无RNase环境中室温下自然干燥。

9)用20～30μL DEPC水(或RNase Free ddH₂O)溶解RNA，使RNA终浓度约为1μg/μL，-20℃保存备用。

2.RT-PCR

1)cDNA第一链的合成：

①在0.2mL微量PCR管中，加入总RNA 1-5μg，在管中加20μM F1 1μL，补充适量的DEPC H₂O使总体积达11μL，轻轻混匀、离心。

②65℃加热10min，立即将微量PCR管插入冰浴中至少1min。

③然后加入下列试剂的混合物：

5×cDNA synthesis buffer    4μL

RNase OUT^TM                 1μL

10mM dNTPmix                2μL

0.1MDTT                     1μL

Thermoscript    1μL

轻轻混匀，离心，在60℃水浴中孵育90min。

④于85℃加热15min以终止反应。

⑤将管插入冰中，加入RNase H 1μL，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

2)cDNA第二链扩增

①取0.2mLPCR管，依次加入下列试剂：

Pre-Mix        25μL

第一链cDNA     4μL

S1(20μM)      1μL

F1(20μM)      1μL

ddH₂O          19μL

②PCR反应在Biometra Tgradient Thermocycler上进行，PCR扩增参数如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸，延伸时间依各个片段长度而变，约为每1kb延伸1min，进行30个循环，最后72℃总延伸10min，并于16℃保温。

3.重组PMAP-36克隆构建

将PCR基因产物连入T载体，反应总体系为10μl：T载体(PMD18-T Simple Vector)0.5μl，Solution I 5μl，PCR基因回收产物4.5μl。以上产物于4℃条件下连接过夜后转入大肠杆菌E.coli TOP10感受态中，利用T载体自身带有的抗氨苄青霉素(Amp)的特性进行筛选，挑取阳性单菌落克隆进行菌落PCR验证。将PCR初步验证正确的阳性克隆进行细胞培养，抽提质粒，测序验证抗菌肽基因序列的正确性。

实施例2：重组工程菌的构建和表达

1.酿酒酵母表达载体的构建

将阳性重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/α用XbaI和HindIII进行酶切。双酶切反应体系如下：

将双酶切后的产物进行回收，抗菌肽基因与载体按5～10∶1的摩尔量混合，并加入1μl的T4 DNA连接酶和2μl的10×连接缓冲液，16℃水浴中连接反应过夜，构建重组质粒pVT-PMAP-36。

取80μl酵母细胞感受态与5～10μl重组质粒(约10μl)混合均匀，转入到冰预冷的0.2cm电转槽中，将混合液在冰上放置5min；1500V，5ms电击，然后加入1ml恢复培养液，于30℃培养箱中培养2h；将培养液涂布于筛选培养基(SCR)中，30℃培养至单菌落出现。挑取阳性克隆进行培养，提取质粒进行双酶切及PCR鉴定，鉴定阳性转化子S78-PMAP-36(见附图3)。

实施例3

1.母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-36显著提高母猪初乳IgG水平

IgG，、IgA和IgM是母猪初乳中主要的免疫球蛋白成分。对母猪产后0、6、12小时的初乳进行检测，发现IgG，、IgA和IgM水平均于产后0小时为最高，随着时间的延长逐渐降低。在饮食中添加了重组抗菌肽PMAP-36蛋白之后，母猪初乳中IgG水平在0、6、12小时分别上升了75％，28.6％和43.4％(图4，A)。母猪初乳中IgM的水平在0、6、12小时分别上升了8.82％，35.4％和36.1％(图4，B)。IgA的水平则没有明显的变化(图4，C)。

2.母猪饮食中添加重组抗菌肽PMAP-36可以提高初乳中总蛋白的水平

免疫球蛋白是母猪初乳中主要的蛋白成分，占初乳中蛋白总量的60％左右。在上述结果的基础上，对初乳中蛋白总量的变化进行了进一步的检测。结果显示，母猪初乳中蛋白水平在产后0小时为最高，达200mg/ml以上，随着时间的延长逐渐降低。在母猪饮食中添加了抗菌肽PMAP-36之后，母猪初乳中总蛋白水平在0小时和6小时分别上升了21.6％and 33.7％(图5)。

序列表

编码PMAP-36抗菌肽多核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，具体如下：

(1)序列特征：

长度：528bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

分子类型：DNA

最初来源：猪

序列描述：SEQ IDNO.1

1   Atggagaccc agagggccag cctgtgcctg gggcgctggt cactgtg

61  gcttctgctg ctgggactcg tggtgccctc ggccagcgcc caggccctca gctacaggga

121 ggccgtgctt cgtgctgtgg atcgcctcaa cgagcagtcc tcggaagcta atctctaccg

181 cctcctggag ctggaccagc cgcccaaggc cgacgaggac ccgggcaccc cgaaacctgt

241 gagcttcacg gtgaaggaga ctgtgtgtcc caggcctacc tggcggcccc cggagctgtg

301 tgacttcaag gagaacgggc gggtgaagca gtgtgtgggg acagtcacct tgaacccatc

361 caatgaccca ctggacatca actgtgatga gatccagagt gttggacgat ttagacggtt

421 gcgtaagaag acccgaaaac gtttgaagaa gatcgggaag gttttgaagt ggattcctcc

481 cattgtcggc tcaataccct tgggttgtgg gtaaatggtg tgaccatgga agaaccctaa

 

本发明的PMAP-36抗菌肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，具体如下：

(2)序列特征：

长度：166aa

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：肽

最初来源：猪(Sus scrofa)

序列描述：SEQ ID NO.2

METQRASLCL  GRWSLWLLLL  GLVVPSASAQ  ALSYREAVLR  AVDRLNEQSS

EANLYRLLEL  DQPPKADEDP  GTPKPVSFTV  KETVCPRPTW  RPPELCDFKE

NGRVKQCVGT  VTLNPSNDPL  DINCDEIQSV  GRFRRLRKKT  RKRLKKIGKV

LKWIPPIVGS  IPLGCG

Claims (7)

1.重组抗菌肽PMAP-36的工程菌以及产物的制备方法，其特征在于其操作步骤为：

A.PMAP-36基因的获得和扩增：参照

LS(Invitrogen)试剂盒说明书，从母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA。在人工合成引物的存在下，通过RT-PCR获得编码PMAP-36的基因片段。

B.基因克隆和转化大肠杆菌：回收PCR产物，用T4连接酶与PMD18-T载体连接。转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经抗性培养基筛选后，获得具有正确编码序列的PMAP-36基因。

C.酿酒酵母表达载体构建和转化：分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/α。回收酶切产物，用T₄DNA连接酶连接，构建重组表达质粒PVT-PMAP36，用电转的方法转入酿酒酵母S78，获得阳性转化子S78-PMAP36。

D.将工程菌扩大培养，纯化蛋白：

2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤A中，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位点，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位点。其合成的引物序列为：

S1：5′-CCGAGATCTATGGAGACCCAGAGGGCCAGCC-3′

F1：5′-GGGTTCGAATTACCCACAACCCAAGGGTATTG-3′

3.如权利要求1所述，其特征在于步骤B中的抗性培养基含有氨苄青霉素。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于在酵母表达载体的多克隆位点间插入抗菌肽PMAP-36基因，其表达框为ADH1-MFα-抗菌肽PMAP-36-TT，其中ADH1为启动子，α是α因子信号肽序列，TT是终止子。

5.如权利要求1所述，其特征在于步骤C中电转的步骤为：将80μl酵母细胞感受态细胞与5～10μl重组质粒PVT-PMAP36混合均匀，转入到冰预冷的0.2cm电转槽中，将混合液在冰上放置5min；1500V，5ms电击，然后加入1ml恢复培养液，于30℃培养箱中培养2h；将培养液涂布于筛选培养基(SCR)中，30℃培养至单菌落出现。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤D中工程菌的纯化，具体步骤为：挑取高效阳性转化子S78-PMAP36，在YPD(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)液体培养基中扩大培养，当OD₆₀₀＝2-6时，收集菌液，离心取上清。用CM-cellulose23柱层析，收集蛋白组分，冷冻干燥，获得重组PMAP36蛋白。

7.权利要求4～6任选一项的方法在生产制备抗菌肽饲料添加剂、食品保鲜、农作物病害防治以及医药产品中的应用。

Images