CN102924583B

CN102924583B - 一种Hydramacin-1抗菌肽突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN102924583B
Application number: CN 201210458580
Authority: CN
Inventors: 徐建华
Original assignee: SHAOXING HUATAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Feng Pengbo
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2012-11-13
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-11-13
Also published as: CN102924583A

Abstract

本发明涉及一种野生型的抗菌肽Hydramacin-1蛋白突变体及其制备方法。通过对天然抗菌肽Hydramacin-1活性中心的查找，在确定活性中心的基础上，对第八个氨基酸苏氨酸以天冬氨酸或其他氨基酸进行了替换，结果证明此突变体T8D具有更优良的抗菌性。本发明还公开了一种利用酵母表达该突变体蛋白的方法，方法简单，表达出的蛋白具有较高的抗菌活性，可以应用在生物制药、养殖业、食品工业、饲料工业等领域，具有广泛的应用前景和经济意义。

Description

一种Hydramacin-1抗菌肽突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体的说涉及一种大乳头水螅野生型Hydramacin-1基因突变体，其编码的重组蛋白及其制备方法。

背景技术

青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策,并由此发展了大量的β-内酰胺类抗生素和其他各种抗菌素,对保护人类健康作出了巨大贡献。然而，这些抗菌素药物的有益作用也带来了一些不利的后果。例如，用于治疗肺结核的链霉素具有耳毒性和引起前庭功能障碍。青霉素可能导致某些过敏体质患者的过敏反应。尤其是随着这些传统抗生素的广泛和大量使用,致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康(Hildreth CJ,BurkeAE,Glass RM.2009.Inappropriate use of antibiotics.JAMA.302:816)，例如目前在医院中，治疗由耐甲氧西林葡萄球菌，或者由耐万古霉素的肠球菌，难辨梭状芽孢杆菌引起的细菌感染非常困难（Matlow,A.and S.Morris.2009.Control ofantibiotic-resistant bacteria in the office and clinic.Canadian Medical Association.180:10）。医院内尤其是发展中国家的医院内，病人的连续感染非常普遍。这意味着除了对病人的更大危险，病人还需要更长，更昂贵的治疗疗程。

寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。

抗菌肽是生物体内产生，具有抗菌活性的小分子多肽的总称,分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个在惜古比天蚕蛹(Hyatophora cecropia)发现抗菌肽的是瑞典科学家Boman HG[Boman HG,Nilsson I,Rasmuson B.1972.Inducibleantibacterial defence system in Drosophila.Nature.237(5352):232-235]。他们通过注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导产生了具有抗菌活性的多肽，Cecropins[Steiner H,Hultmark D,

A,Bennich H,Boman HG.1981.Sequence and specificityof two antibacterial proteins involved in insect immunity.Nature.292(5820):246-8]。经过多年的研究，特别是近年来随着分子生物学的深入发展，各国的科学家已经分离和鉴定了超过1300多种不同来源的抗菌肽。

水螅是一种腔肠动物，种类很多,大多雌雄同体，通常进行无性生殖，夏初或秋末进行有性生殖。水螅生活在水流缓慢，水质清洁、水草茂盛的池塘和溪流中，大多栖息在水草和其它物体上，靠用触手捕捉游过身旁的小动物为食，水螅的全基因组测序也已于2010年完成[Chapman JA et al.2010.The dynamic genome of Hydra.Nature464(7288):592-596]。测序结果显示，水螅基因数目与人类基因相似，二者也分享了诸多相同基因。令科学家们惊讶的是，水螅也存在与人类亨廷顿舞蹈症以及阿尔茨海默氏症相关的基因，这表明，水螅将来可能成为研究这两种疾病的模型。

德国基尔大学研究人员在淡水水螅中发现了一种新的有潜力的杀菌剂hydramacin-1(Jung S,Dingley AJ,Augustin R,Anton-Erxleben F,Stanisak M,Gelhaus C,Gutsmann T,Hammer MU,Podschun R,Bonvin AM,Leippe M,Bosch TC,

J.2009.Hydramacin-1,structure and antibacterial activity of aprotein from the basal metazoan Hydra.J BiolChem.284:1896-1905)。现有抗菌肽根据其结构可分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾中分离到的Magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。但Hydramacin蛋白与现有5类抗菌肽在结构上没有共同点，只有与其它三个先前从水蛭和蝎子中分离的蛋白质具有同源性，从而促使创造一个新的抗菌肽类"macin"。

自从发现抗菌肽以来，已对抗菌肽的作用机理进行了大量研究。目前一般认为,Cecropin类抗菌肽作用于细胞膜，在膜上形成跨膜的离子通道，破坏了膜的完整性，造成细胞内容物泄漏，从而杀死细胞。虽然对于抗菌肽破坏膜的完整性，使细胞内外屏障丧失，从而杀死细菌这一观点已得到基本统一的认识，但对其具体作用过程、是否存在特异性的膜受体、有无其它因子协同等问题尚不十分清楚，存在不同看法。不同抗菌肽的作用机制也可能不一样，尚有待进一步研究。一系列实验室研究证明Hydramacin可黏附到细菌表面并把周围细菌聚集到一起，然后破坏细菌膜,杀死许多革兰氏阳性和阴性菌，包括临床耐药菌，如产酸克雷伯氏菌（导致医院内感染的常见菌）。最新对Macin族的蛋白发现它们除了杀死细菌外，还具有神经细胞修复功能[Jung S,

FD,Hung CW,Tholey A,Boidin-Wichlacz C,Haeusgen W,Gelhaus C,Desel C,Podschun R,Waetzig V,TasiemskiA,Leippe M,

J.2012.Macin family of antimicrobialproteins combines antimicrobial and nerve repair activities.J Biol Chem.287(17):14246-58]。Xu等于2010报道三角帆蚌受到葡萄球菌和双岐杆菌感染后，三角帆蚌的macin蛋白（Hctheromacin）含量急剧升高，之后慢慢回复到正常，显示三角帆蚌机体受损伤或病原微生物入侵时,能迅速产生抗菌肽来杀伤入侵者。Hctheromacin含有大约61个氨基酸残基和10个半胱氨酸残基[Xu Q,Wang G,Yuan H,Chai Y,Xiao Z.2010.cDNA sequence andexpression analysis of an antimicrobial peptide,theromacin,in the triangle-shell pearl mussel Hyriopsiscumingii.Comparative Biochemistry and Physiology.Part B,Biochemistry&Molecualr Biology.157(1):119-26]。

除了hydramacin-1以外，水螅还存在其他抗菌肽。Augustin等报道水螅中的arminin具有抗多种细菌的功能[Augustin R,Anton-Erxleben F,Jungnickel S,Hemmrich G,Spudy B,PodschunR,Bosch TC.2009.Activity of the novel peptide arminin againstmulti-resistant human pathogens shows the considerablepotential of phylogenetically ancient organisms as drugsources.Antimicrob Agents Chemother.53(12):5245-50].Arminin经过蛋白酶处理后，带正电的C-端arminin1A（31个氨基酸残基）展品有力和广谱活性，对细菌包括多重抗药性的人类致病株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株具有很强的抗菌能力，其最小杀菌浓度，0.4uM到0.8uM。超微结构观察表明，通过破坏细菌的细胞壁，杀死细菌。值得注意的是，arminin1A是一种选择性的抗菌剂，不影响人体红细胞的膜。由于其对人类极具威胁性的多重抗药性菌株的抗菌功能，arminin是一个很有前途的新的抗菌素类模板。

macin蛋白也可能广泛存在于其它海洋生物中。通过分析水螅和紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）中Hydramacin的氨基酸序列，发现它们不仅具有很大的同源性，而且具有氨基端和羧基端信号肽（中国专利申请号：201110075383.5；发明人：陈磊磊;王春琳;赵建民;母昌考；名称：紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法；申请(专利权)人：宁波大学；公开号：CN102206646A）。

抗菌肽要成为药物首先需要解决来源问题。抗菌肽在动物体内含量极微，非常稀有。从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，由于成本较高，因此，开展抗菌肽基因工程研究具有重要意义。

目前，已进入临床应用的基因工程药物多数是采用原核表达系统生产的。原核系统具有三个比较明显的弱点。1）不具有真核系统的基因表达调控机制和蛋白质翻译后加工修饰能力，其产物往往成没有活性的包涵体，须经过变形和复性等处理才能应用；2）宿主细胞毒性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性抑制大肠杆菌的繁殖，影响抗菌肽的进一步表达；3）容易被降解。由于不能用原核表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表达，将给表达产物的后处理带来很大麻烦。因此，国内外的研究者多采用真核表达系统进行抗菌肽基因工程研究。

近年来，以酵母为基因工程受体菌的研究引起人们的重视，酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。自1978年Hinnen等首先试验酵母转化成功后，已有人干扰素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等数十种外源基因在酵母中获得表达。国内研究者大量研究表明，利用酵母表达抗菌肽是一条可行的道路，如能在表达产率上得到进一步提高，将为抗菌肽早日进入临床应用奠定良好的基础。

抗菌肽在酵母菌中的表达最为成功的是柞蚕抗菌肽D和绿蝇抗菌肽(Pang SZ,Oberhaus SM,Rasmussen JL,Knipple DC,Bloomquist JR,Dean DH,Bowman KD,Sanford JC.1992.Expressionof a gene encoding a scorpion insectotoxin peptide in yeast,bacteria and plants.Gene.116:165-72)。1992年Reichhart等将绿蝇防御素A基因与酵母菌基因启动子构建了酵母表达载体，分泌培养基中含1ug/ml防御素A，经改造加工后可达2-2.5ug/ml培养基水平[Reichhart J M,Petit I,Legrain M,et al.1992.Expressionand secretion in yeast of active insect defesin,an inducibleantibacterial peptide from the fleshfly Pormia terranova.Invert Peprod Dev,21(1):15-24]。Hong等将人皮肤抗菌肽LL-37与酵母表达载体pGAPZ-E重组构建了表达载体，转染毕赤酵母X-33，甲醇诱导表达，分泌表达了人皮肤抗菌肽LL-37，产物纯化后经藤黄微球菌测试具有抗菌活性[Hong IP,Lee SJ,Kim YS,Choi SG.2007.Recombinant expression of human cathelicidin(hCAP18/LL-37)inPichia pastoris.Biotechnol Lett.29(1):73-8]。尹娜等则根据毕赤酵母密码子的偏爱性，人工合成抗菌肽Cecropin D并克隆到酵母载体pPIC9K，重组表达质粒转化至毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达，获得蛋白表达条带，而且表达产物对部分革兰氏阳性和阴性菌具有抑菌活性[尹娜，李鸿钧，彭楣等。2008。抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达，纯化及活性鉴定。中国生物制品学杂志。21（3）：185-189]。为了达到较高的表达水平，基因构建中采用不同的方法包括顺式串联目的基因，复合目的基因和其他基因等均已作了尝试并取得较佳的结果，为进一步进行高效表达打下了基础[王婷婷，金小宝，朱家勇等。2006。顺式串联家蝇抗菌肽Attacin基因真核表达载体的构建。中国热带医学。6（3）：390-391；Jin F,Xu X,Wang L,ZhangW,Gu D.2006.Expression of recombinant hybrid peptidececropinA(1-8)-magainin2(1-12)in Pichia pastoris:purification and characterization.Protein ExprPurif.50(2):147-56；牛明福，李翔，曹瑞兵等。2007。复合抗菌肽PL在毕赤酵母中的分泌表达及其活性研究。生物工程学报。23（3）：418-422]。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种从大乳头水螅制备Hydramacin-1抗菌肽和突变体的方法，其制备方法简单，表达出的蛋白具有较高的抗菌活性，可以应用在生物制药、食品工业、饲料工业、养殖业等领域，具有广泛的应用前景和经济意义。

野生型的Hydramacin-1蛋白全长具有84个氨基酸残基，其中前端24个氨基酸残基为信号肽，后端60个氨基酸残基为成熟的具有抗菌功能Hydramacin-1（Jung S.et al.2009.Hydramacin-1,structure and antibacterial activity of a protein from thebasal metazoan Hydra.J Biol Chem.284:1896-1905)，其成熟的Hydramacin-1序列为:QIVDCWETWSRCTKWSQGGTGTLWKSCNDRCKELGRKRGQCEEKPSRCPLSKKAWTCICY。以下Hydramacin-1均指成熟，不含有信号肽，具有60个氨基酸残基的多肽。

发明人通过对天然抗菌肽Hydramacin-1的活性中心的查找，意外发现在确定活性中心的基础上，将Hydramacin-1蛋白第八个氨基酸苏氨酸（T）替换成天冬氨酸（D）、谷氨酸(E)或丝氨酸(S)时，所获的Hydramacin-1突变体抗菌活性比野生型的Hydramacin-1要增强10%以上。

因此，本发明的一个目的是提供一种Hydramacin-1抗菌肽突变体，所述突变体具有如Seq ID No.10所述的氨基酸序列，其中所述的第八个氨基酸X₁为天冬氨酸（D）、谷氨酸(E)或丝氨酸(S)，优选为天冬氨酸。当X₁为天冬氨酸时，所述的Hydramacin-1抗菌肽突变体具有如Seq ID No.8所述的氨基酸序列。

本发明还提供了编码上述Hydramacin-1抗菌肽突变体蛋白的基因序列，所述的基因序列具有如Seq ID No.9所述的核苷酸序列，其中第22-24位的核苷酸为N₁N₂N₃分别编码天冬氨酸（D）、谷氨酸(E)或丝氨酸(S)的密码子。当编码天冬氨酸时，所述的突变体基因具有如Seq ID No.7所述的核苷酸序列。

本发明还提供了一种制备Hydramacin-1抗菌肽突变体蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）、在Hydramacin-1抗菌肽突变体基因的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上；

（2）、将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

（3）、高密度发酵重组酵母菌，诱导表达后离心收集发酵上清液，经分离纯化获得重组Hydramacin-1抗菌肽突变体蛋白。

上述方法步骤（1）中，Hydramacin-1抗菌肽或者其突变体基因可人工合成，也可通过PCR方法构建。根据全球公共序列数据库GenBank记载序列号为DQ449931.1的野生型抗菌肽Hydramacin-1（Hm-1基因）的核苷酸序列为模板，对其密码子进行毕赤酵母优化，其优化后成熟Hm-1的cDNA序列如SEQ ID No.2所示。分别在抗菌肽Hm-1的两端引入限制性酶切位点，如XhoI/XbaI酶切位点，优选在前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入限制性内切酶XbaI的酶切位点，并在限制性内切酶XbaI的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。XhoI所导致的两个氨基酸（LE）和引入的两个碱性氨基酸（KR）密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的Hm-1基因cDNA序列（SEQ ID No.1）进行化学合成。该克隆基因的重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，在表达时切去前端的4个氨基酸得到野生型抗菌肽Hydramacin-1蛋白（SEQ ID No.4）。

同样的，Hydramacin-1抗菌肽突变体基因（T8X基因，SEQ IDNo.9）可依类似方法构建。可分别在抗菌肽突变体T8X两端引入限制性酶切位点，如XhoI/XbaI酶切位点，优选在前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入入限制性内切酶XbaI的酶切位点，并在限制性内切酶XbaI的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。XhoI所导致的两个氨基酸（LE）和引入的两个碱性氨基酸（KR）密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的T8X基因如T8D（SEQ IDNo.5）的cDNA序列进行化学合成。该克隆基因的重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示。

构建好Hydramacin-1抗菌肽或者其突变体基因后，可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D₂，pPIC9，pHIL-S₁（Invitrogen Corp.San Diego.California.USA），动物细胞表达载体pSVK3、pMSG（Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA）等。优选的方法是将编码本发明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表达载体pPICZ-α-A，该质粒为酵母整合型质粒，带有醇氧化酶操纵子（AOX1）5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从Invitrogen Corp.San Diego.California.USA构得，优选的启动子为AOX1。

在一个优选的实施例中，对抗菌肽基因和酵母表达载体pPICZ-α-A进行双酶切，优选用限制性内切酶XhoI和限制性内切酶XbaI分别对抗菌肽基因和酵母表达载体pPICZ-α-A进行双酶切，将酶切后的抗菌肽基因与酵母表达载体pPICZ-α-A进行连接，将连接后的产物转入大肠杆菌DH5α内，形成重组质粒，利用限制性酶切酶SacI将重组质粒线性化，将线性化的重组质粒转入巴斯德毕赤酵母X-33菌内，形成阳性重组子，后对阳性酵母重组子进行诱导表达，得到表达后的抗菌肽Hm-1和突变体T8D。

载体可经转化或转染至原核生物或真核生物宿主。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。

表达目标蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等。目标蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是酵母MFα信号肽。编码目标蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，优选为酵母菌，如酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母等，更优选为用毕赤酵母生产本发明的Hydramacin-1抗菌肽或者其突变体。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体（或细胞）生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体（或细胞）的生长，第二阶段主要用于合成产物。

将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵,通过甲醇诱导。将经甲醇诱导后的培养液离心，收集上清液。可以用各种蛋白分离的方法分离纯化蛋白，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

在一个优选的实施例中，将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵,通过甲醇诱导,表达大量细胞外的可溶性抗菌肽Hm-1和突变体T8D等重组蛋白。将阳性酵母重组子接种入5ml YPD培养基中,30℃,250转/分钟振荡培养24小时,按1%接菌量取0.5ml上述培养的菌液接入50ml三角烧瓶的BMGY培养基中,30℃,250转/分钟振荡培养30小时,离心上述均液,收集均体,一并转入50ml三角烧瓶的BMMY培养基中,加入0.5%甲醇,30℃,250转/分钟振荡培养,每24小时,补加0.5%甲醇一次,诱导表达直至5天。经离心收集上清,得发酵液。

发酵产生的Hm-1和突变体T8D等重组蛋白可经盐析,层析纯化而获得。收集发酵液,加入90%饱和度的硫酸铵,4℃,过夜后离心,沉淀。使用G-25脱盐,收集蛋白主峰,稀释溶解于含10mM磷酸缓冲液。

在一个优选的实施例中，通过实验证明所获的Hydramacin-1抗菌肽突变体比野生型的Hydramacin-1抗菌肽突变体具有更高的生物学活性。将待试菌在脑心浸液肉汤中在37℃培养2-3小时。然后将细胞用补充有1％的胰蛋白胨的磷酸钠缓冲液（10mM，pH7.4）洗涤3次，并调节至10⁴-10⁵个细胞/ml的细胞数。从所制备的细胞悬浮液，取出100μl并与溶解在10mM磷酸钠，pH 7.4的抗菌肽混合，37℃温育。最终抗菌肽的浓度0.0125至100ug/ml。培养2小时后，对菌落形成单位进行了测定。阴性对照为无抗菌肽的补充1％胰蛋白胨的磷酸盐缓冲液（10mM，pH7.4）。所有菌株的抗菌活性通过最小杀菌浓度（MBC）进行了测试（>99.9杀死率）。与Hm-1相比，突变体T8D具有最佳的抗菌性（表1）。

附图说明

图1为pPICZα-抗菌肽Hm-1或者其突变体的构建过程;

图2为表达产物突变体T8D抗菌肽的SDS-PAGE凝胶电泳图。图中标号：样品槽1为蛋白分子量标准品（KD），自上而下依次为：71，50,35,16,8；样品槽2为卵清溶菌酶，分子量为14.3KD，1.0ug;样品槽3为酵母经甲醇诱导后的培养液（36ul)。

具体实施方式

实施例 Hydramacin-1抗菌肽突变体的制备及生物活性测定

1.抗菌肽Hm-1基因的设计和合成

根据全球公共序列数据库GenBank记载序列号为DQ449931.1，编码成熟抗菌肽Hydramacin-1的核苷酸序列为模板，分别在抗菌肽Hm-1前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入限制性内切酶XbaI的酶切位点，并在限制性内切酶XbaI的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。XhoI所导致的两个氨基酸（LE）和引入的两个碱性氨基酸（KR）密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的Hm-1基因cDNA序列（SEQ ID No.1）进行化学合成（上海生工生物公司）。该克隆基因的重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，在表达时切去前端的4个氨基酸得到野生型抗菌肽Hydramacin-1蛋白（SEQ ID No.4）。

2、抗菌肽突变体T8D基因的设计和合成

以GenBank记载序列号为DQ449931.1，编码成熟抗菌肽Hydramacin-1的核苷酸序列为模板，通过对天然抗菌肽Hydramacin-1的活性中心的查找，在确定活性中心的基础上，对其第八个氨基酸进行替换T8D。分别在抗菌肽突变体T8D前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入入限制性内切酶XbaI的酶切位点，并在限制性内切酶XbaI的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。XhoI所导致的两个氨基酸（LE）和引入的两个碱性氨基酸（KR）密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的T8D基因cDNA序列（SEQ IDNo.5）进行化学合成。该克隆基因的重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，在表达时切去前端的4个氨基酸得到抗菌肽突变体T8D蛋白（SEQ ID No.8）。

3、抗菌肽Hm-1和突变体T8D基因的酶切和回收

化学合成的抗菌肽Hm-1和突变体T8D DNA片段的两端引入XhoI和XbaI的酶切位点并已经克隆至pUC57质粒上。在转化至大肠杆菌感受态的DH5α细胞后,挑取阳性克隆,提取含有抗菌肽序列的pUC57质粒,在37℃用XhoI和XbaI双酶切,凝胶回收此DNA片段，备用。

4、酵母表达载体pPICZ-α-A酶切、回收

在0.5ml离心管中加入2μg酵母表达载体pPICZ-α-A、3.0μl限制性内切酶XhoI、3.0μ1限制性内切酶XbaI、10μ1限制性内切酶缓冲液，加去离子水至100μl，混合均匀，将混合物放入37℃水浴锅中，反应4小时，取出备用。用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收纯化，将回收纯化后的酵切酵母表达载体pPICZ-α-A，存储于-20℃条件下，备用。

5、抗菌肽Hm-1和突变体T8D基因与酵母表达载体pPICZ-α-A的连接

为了使表达的融合蛋白能分泌到酵母胞外,选择pPICZ-α-A作为载体,在该载体克隆位点的XhoI和XbaI,插入抗菌肽T8D基因。将经过XhoI/XbaI双酶切的抗菌肽基因和pPICZ-α-A质粒通过T4DNA联结酶催化连接进行连接（图1）。

连接体系的配制：在0.5ml离心管中加入0.1μg酶切酵母表达载体pPICZ-α-A、0.1μg酶切抗菌肽DNA片段、1.0μ1 T4 DNA连接酶缓冲液(10倍)、1.0μ1 T4 DNA连接酶混合均匀，后将0.5ml离心管放在16℃条件下，放置12小时，形成混合物备用。连接产物转化至感受态的大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒。

6、毕赤酵母工程菌的构建和诱导表达

将筛选的重组质粒委托上海生工生物公司测序,测序正确的质粒经SacI线性化后,电转入毕赤酵母X-33。经过100,500,1000μg/ml博莱霉素的筛选,SDS-PAGE凝胶电泳分析筛选出表达量最高的菌株。接种入5ml YPD培养基(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,葡萄糖10g/L)中,30℃,250转/分钟振荡培养24小时,按1%接菌量取0.5ml上述培养的菌液接入50ml/500ml三角烧瓶的BMGY培养基中(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,pH 6.0的0.1M磷酸钠缓冲液,1.34%YNB,4x10^-5%生物素,甘油10g/L),30℃,250转/分钟振荡培养30小时,离心上述均液,收集均体,一并转入50ml/500ml三角烧瓶的BMMY培养基中(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,pH 6.0的0.1M磷酸钠缓冲液,1.34%YNB,4x10^-5%生物素),加入0.5%甲醇,30℃,250转/分钟振荡培养,每24小时,补加0.5%甲醇一次,诱导表达直至5天。经离心收集上清,得发酵液。SDS-PAGE电泳分析显示突变体T8D工程菌株产生最高蛋白,约占总分泌蛋白的55%(图2)。该工程菌经过诱导培养4天后其抗菌肽在发酵液中的总量为13.9mg/L。图2中:样品槽1为蛋白分子量标准品（KD），自上而下依次为：71，50,35,16,8；样品槽2为卵清溶菌酶，分子量为14.3KD，1.0ug;样品槽3为酵母经甲醇诱导后的培养液（36ul)。考虑到发酵罐中可拥有更佳培养条件，可进行高密度发酵，其重组蛋白产量可达3-10倍。

7、表达蛋白的纯化和抗菌活性测试

收集发酵液,加入90%饱和度的硫酸铵,4℃,过夜后离心,沉淀。使用G-25脱盐,收集蛋白主峰,稀释溶解于含10mM磷酸缓冲液。将待试菌在脑心浸液肉汤中在37℃培养2-3小时。然后将细胞用补充有1％的胰蛋白胨的磷酸钠缓冲液（10mM，pH7.4）洗涤3次，并调节至10⁴-10⁵个细胞/ml的细胞数。从所制备的细胞悬浮液，取出100μl并与溶解在10mM磷酸钠，pH 7.4的抗菌肽混合，37℃温育。最终抗菌肽的浓度0.0125至100ug/ml。培养2小时后，对菌落形成单位进行了测定。阴性对照为无抗菌肽的补充1％胰蛋白胨的磷酸盐缓冲液（10mM，pH7.4）。所有菌株的抗菌活性通过最小杀菌浓度（MBC）进行了测试（>99.9杀死率）。通过对革兰氏阴性（E.coli ATCC25922;Klebsiella pneumoniae ATCC13883和革兰氏阳性细菌(Staphylococcus hemolyticus ATCC 29970)的测试,结果表明与对照比,重组蛋白无论是抗菌肽Hm-1(MBC在0.72uM和1.6uM之间)或者是突变体T8D(MBC在0.51uM和1.2uM之间),都具有良好的抗菌效果。但突变体T8D的抗菌效果要比天然的Hm-1高25%或以上%(p<0.05)。其他突变体T8E和T8S虽然其抗菌性比T8D的差，但仍比野生型Hm-1为佳（表1）。

表1.野生型抗菌肽HM-1和突变体的抗菌活性

注：MBC：最小杀菌浓度,即>99.9杀死率；括号内%数字为各突变体与野生型抗菌肽比，更佳的抗菌效率。

Claims

1.一种Hydramacin-1抗菌肽突变体，所述突变体的氨基酸序列与SeqID No.10所述一致，其中所述的第八个氨基酸X₁为天冬氨酸（D）、谷氨酸(E)或丝氨酸(S)。

2.根据权利要求1所述的Hydramacin-1抗菌肽突变体，其特征在于：所述序列中第八个氨基酸X₁为天冬氨酸（D），该突变体的氨基酸序列与Seq ID No.8所述一致。

3.编码如权利要求1所述的Hydramacin-1抗菌肽突变体的基因，所述的基因序列与Seq ID No.9所述的核苷酸序列一致，其中第22-24位的核苷酸N₁N₂N₃为分别编码天冬氨酸（D）、谷氨酸(E)或丝氨酸(S)的密码子。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述的基因序列中第22-24位的核苷酸N₁N₂N₃为编码天冬氨酸（D）的密码子，该基因序列与Seq ID No.7所述的核苷酸序列一致。

5.带有如权利要求3-4任一项所述基因序列的载体。

6.根据权利要求5所述的载体，所述的载体选自酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D₂、pPIC9或pHIL-S₁，动物细胞表达载体pSVK3或pMSG。

7.根据权利要求6所述的载体，所述的载体为酵母表达载体pPICZ-α-A。

8.一种宿主，其由权利要求5所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

9.根据权利要求8所述的宿主，其为酵母、哺乳动物细胞或细菌。

10.根据权利要求9所述的宿主，其为酵母。

11.根据权利要求10所述的宿主，其特征在于：所述的酵母菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母。

12.根据权利要求11所述的宿主，其特征在于：所述的酵母菌为毕赤酵母。

13.一种制备如权利要求1所述Hydramacin-1抗菌肽突变体蛋白的方法，包括如下步骤：

（1）、在Hydramacin-1抗菌肽突变体基因的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上;

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，在Hydramacin-1抗菌肽突变体基因两端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，在Hydramacin-1抗菌肽突变体基因前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入限制性内切酶XbaI的酶切位点，并在限制性内切酶XbaI的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，所述的载体选自酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D₂、pPIC9或pHIL-S₁。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，所述的载体为酵母表达载体pPICZ-α-A。

18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中，所述的酵母菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母。

19.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中，所述的酵母菌为毕赤酵母。

20.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3）中，高密度发酵重组酵母菌可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体或细胞的生长，第二阶段主要用于诱导表达目标产物。

21.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3）中，分离纯化方法可选自盐析、沉淀、超滤或液相层析技术及这些技术的组合。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3）中，液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水或反相层析技术。