CN102199196B - 一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用，可以解决现有技术存在的结构复杂、抗菌能力不足且抗菌谱不够广的问题。所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。本发明根据cecropinA和magainins的杀菌特点，自行设计了一种新型抗菌肽氨基酸序列。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后制成粉剂、液体等抗菌肽制剂。基因工程抗菌肽制剂可作为畜禽饲料添加剂或用于畜禽疾病的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生问题，而且由于耐药菌株和新的致病亚型菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。所以开发新的抗菌药物成为一个越来越重大的研究课题。
抗菌肽( Antibacterial peptide，ABP) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide)，是生物体经诱导产生的一类具有多种生物活性的小分子多肽，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分, 具有广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点。天蚕素A是较早从惜古比天蚕中分离的抗菌肽，具有广谱的杀菌能力，耐高温且对真核细胞无毒副作用，其N端碱性很强，形成双亲a螺旋结构，N端序列对于其活性具有重要作用。由于天蚕素A由37个氨基酸残基组成，在体内应用时能引起免疫反应等问题，所以它不是发展为药物的理想候选者。Magainins 是1987 年由Zasloff 从非洲爪蟾的皮肤中分离出来的一类碱性无半胱氨酸的多肽，具有广谱抗性、亲水脂特性，有较低的溶血活性，不同于裂解肽Melittin和Bomhinin，后者具有高效的细胞溶血作用。一些其他种类的抗菌肽如防卫素和蜂毒素等，它们不是结构过于复杂，就是抗菌能力不足，或者是对真核细胞有毒性。
随着对抗菌肽结构、功能与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。本发明既是基于上述已知抗菌肽的优点人工设计的一种新型抗菌肽。
发明内容
本发明提供了一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用，可以解决现有技术存在的结构复杂、抗菌能力不足且抗菌谱不够广的问题。
本发明根据cecropin A和magainins的杀菌特点，自行设计了一种新型抗菌肽氨基酸序列。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后制成粉剂、液体等抗菌肽制剂。基因工程抗菌肽制剂可作为畜禽饲料添加剂或用于畜禽疾病的预防和治疗。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种基因工程抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。
可见本发明的抗菌肽序列结构简单，而且是一种杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。
进一步地，上述基因工程抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据cecropin A和magainin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区，引物扩增长度为250bp，
P1 : 5' —— AAGTGGAAATTGTTCAAGAA —— 3'
P2 : 5’ —— GCAAATGGCAT'TCTGACATCC ——3' ；
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2 为引物进行PCR反应, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增出250bp的条带重组子定为阳性转化子；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时，取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值为5-6，培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%，48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。
进一步地，经上述制备方法得到的高产抗菌肽的阳性重组子（重组毕赤酵母菌株），其高密度、高效表达的发酵罐生产工艺。
所述的基因工程抗菌肽用于制备抗菌肽制剂，具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入发酵罐，在28-30℃，500-1500r/min，pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM（1L发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h；
发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽半成品衍生的基因工程抗菌肽制剂。
更进一步地，上述基因工程抗菌肽作为畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗。
本发明设计的新型抗菌肽与国内外同类产品相比，生产工艺简单，生产成本低，抑菌能力强，且抗菌谱广，极具市场前景。
附图说明
图1 是重组酵母的PCR鉴定电泳照片，泳道M是DL2000 marker，泳道1是阳性转化子；
图2 是不同诱导时间新型抗菌肽对金黄色葡萄球菌Cowanl的抑菌活性；
在图2中，C:同体积的空载体重组酵母的诱导表达上清； 0、1（24h）、2（48h）、3（72h）、4（96h）、5（120h）：不同诱导时间对其抑菌能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种基因工程抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。
实施例1
新型抗菌肽的制备方法
1）新型抗菌肽基因的设计与合成
根据GenBank中Cecropin A和Magainin II的氨基酸序列，对天蚕素A部分即杂合肽的N端没有进行任何变动，保持了原天蚕素A的天然a螺旋结构，在铰链区域内选用了Cecropin A的铰链区AGP作为可变区的氨基酸组成。并将Magainin N端近C端的非极性氨基酸丙氨酸A替换成带正电荷极性氨基酸赖氨酸K，以便在不影响其a螺旋结构的基础上，增强C端的正电荷数，使抗菌肽更容易更牢固的吸附在细菌细胞膜的表面。同时为了保证抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N。最后设计的杂合抗菌肽的氨基酸序列为：
KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN
对设计新型抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成新型抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。另设计合成一对引物，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于新型抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区，引物扩增长度约为250bp。
P1 : 5' —— AAGTGGAAATTGTTCAAGAA —— 3'
P2 : 5’ —— GCAAATGGCAT'TCTGACATCC ——3'
2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。
3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA。以P1、P2 为引物进行PCR反应, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，能扩增出大约250bp的条带重组子定为阳性转化子。
4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6。培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%。48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。
实施例2
新型抗菌肽10L规模发酵罐生产和制剂制备
1）抗菌肽将筛选得到的阳性重组子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入10L发酵罐（实装培养基6L），温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM（1L发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。
2）发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。
3）新型抗菌肽制剂
抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。
上述基因工程抗菌肽作为畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110>青岛康地恩药业有限公司，青岛宝依特生物制药有限公司
<120> 一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170>
<210> 1
<211> 21
<212> aa
<213> 人工序列
<220>
<221> Linker
<222> 9,10,11
<223> Ala-Lys
<222> 17
<224> Asn
<222> 21
<400>1
KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN
Claims (3)
1.一种基因工程抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽为如下氨基酸序列：KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。
2.一种权利要求1所述的基因工程抗菌肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据cecropin A和magainin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区，引物扩增长度为250bp，
P1 : 5' —— AAGTGGAAATTGTTCAAGAA —— 3'
P2 : 5’ —— GCAAATGGCAT'TCTGACATCC ——3' ；
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2 为引物进行PCR反应, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增出250bp的条带重组子定为阳性转化子；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时，取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值为5-6，培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%，48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。
3.权利要求1所述的基因工程抗菌肽用于制备抗菌肽制剂的应用，具体制备工艺如下：将权利要求2步骤（3）中筛选得到的阳性转化子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入发酵罐，在28-30℃，500-1500r/min，pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM，溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h；
发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽半成品衍生的基因工程抗菌肽制剂。
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