CN103621795A - 一种杂合抗菌肽作为饲料添加剂的应用 - Google Patents

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钱坤
周国庆
文良柱
沈子龙
葛海霞
孙来玉
肖莉
张海洋
徐秀芳
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本发明属于生物技术领域，尤其是所设计的抗菌肽基因重组于酵母中制备饲料添加剂技术。一种杂合抗菌肽作为饲料添加剂的应用，该杂合抗菌肽的一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，将该杂合抗菌肽基因重组到pRHZ-41L载体上；将重组载体转化到裂殖酵母中，MAA固体培养基上培养5天，从固体培养基上挑取单菌落接种到液体EMM培养基中培养3天后，再扩大化培养工程菌；工程菌大规模发酵后，过滤除培养基，烘干后加入饲料或饮用水中。利用裂殖酵母直接表达抗菌肽，再直接制备成饲料添加剂，省去了蛋白质分离纯化过程，降低了生产成本，可以增加畜禽的抵抗力，减少抗生素的使用。

Description

一种杂合抗菌肽作为饲料添加剂的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是所设计的抗菌肽基因重组于酵母中制备饲料添加剂技术。 
背景技术
抗菌肽（antibacterialpeptide）是一类分子量较小的多肽，它们大多数是由13-45个氨基酸组成，有些抗菌肽全部由L-氨基酸组成，有些抗菌肽分子中则同时包含了L-氨基酸和D-氨基酸，分子量一般为几千道尔顿，常带正电荷，1980年Hultmark等首先在天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中分离得到一种杀菌肽,并将其命名为cecropin。抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性，水溶性好，耐高温，是一种比较理想的抗生素代用品，特别是其主要抑菌机制是破坏细胞膜的稳定性，难以产生耐药性，而且抗菌肽一般是小肽，可以被动物完全消化，不存在残留性的问题，所以，抗菌肽无论是作为饲料添加剂，兽药还是人药，都是抗生素的理想代用品。 
死亡素（Thanatin）是昆虫抗菌肽中最广谱的抗菌肽，它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌有抗菌作用，但是对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。 
蜂毒素(Melittin)是意大利蜂(Apismellifera)毒液的主要活性成分，由Habermanm等首先从蜂毒中分离出来的一种抗菌肽，具抗 菌、消炎、抗辐射、抗关节炎、抗肿瘤、抗艾滋病以及对心血管等方面的作用特别是可以抗金黄色葡萄球菌，但是蜂毒素有很强的溶血性，限制了临床上的进一步使用。 
裂殖酵母（S.pombe），是子囊菌真核单细胞生物，由于其分裂繁殖是细胞从中间分裂，具有许多与高等真核细胞相似的特性，人们已经完成了对其基因组的测序工作，裂殖酵母细胞有3条染色体，约13.8Mb，4900个基因，43％的基因有内含子，平均基因大小3Kb和3个外显子。裂殖酵母细胞形态为长杆状，单倍体长12-14μm，宽约3.5μm，双倍体长约24μm，宽约5μm；1-2x109个单倍体细胞干重约0.5g；平均每个细胞含蛋白10皮克，RNA3皮克。 
发明内容
本发明的目的是在裂殖酵母中表达一种人工设计的抗菌肽，并用酵母直接制备成饲料添加剂，所设计的抗菌肽具备死亡素的广谱抗菌和蜂毒素的抗金黄色葡萄球菌特点，同时无蜂毒素溶血性较强的弱点。 
实现上述发明的技术解决方案是：一种杂合抗菌肽作为饲料添加剂的应用，其特征在于：该杂合抗菌肽的一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，将该杂合抗菌肽基因重组到pRHZ-41L载体上；将重组载体转化到裂殖酵母中，MAA固体培养基上培养5天，从固体培养基上挑取单菌落接种到液体EMM培养基中培养3天后，再扩大化培养工程菌；工程菌大规模发酵后，过滤除培养基，烘干后加入饲料或饮用水中。 
本发明的主要有益效果有： 
（1）利用裂殖酵母直接表达抗菌肽，再直接制备成饲料添加剂，省去了蛋白质分离纯化过程，降低了生产成本； 
（2）酵母作为饲料添加剂，具有补充蛋白、提高畜禽免疫力的左右，本发明在酵母细胞内重组了抗菌肽基因并表达出活性抗菌肽，这种酵母可以增加畜禽的抵抗力，减少抗生素的使用； 
（3）所设计的新抗菌肽，同时具备死亡素和蜂毒素的优点，不抗菌谱广且能抗金黄色葡萄球菌，没有蜂毒素溶血性强的弱点，适用范围广。 
附图说明
图1为重组表达载体的构建过程。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。 
实施例1： 
（1）抗菌肽的设计 
根据蜂毒素一级结构：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ和死亡素一级结构：GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，设计出新的抗菌肽：N-末端为蜂毒素的12-26号位氨基酸，并突变成GLPLLISWIKRKRQQ9（斜体氨基酸为突变氨基酸）；C-末端为完整的死亡素，中间用AGP连接后，所设计的抗菌肽一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM（氨基酸简写规则：甘氨酸G，丝氨酸S，丙氨酸A，苏氨酸T，缬氨酸V，异亮氨酸I， 亮氨酸L，酪氨酸Y，苯丙氨酸F，组氨酸H，脯氨酸P，天冬氨酸D，甲硫氨酸M，谷氨酸E，色氨酸W，赖氨酸K，半胱氨酸C，精氨酸R）。 
（2）重组表达载体的构建 
构建过程见图1。 
1）设计引物三段引物： 
引物1：5-CTCGAGATGGGTCTTCCTCTTCTTATTTCTTGGATTAAGCGTA 
AGCGTCAACAAGCTGG 
引物2：5－AAGCGTCAACAAGCTGGTCCTGGTTCTAAGAAGCCTGTTC 
CTATTATTTACTGCAACCG 
引物3：3－GGATAATAAATGACGTTGGCAGCATGACCATTCACGGTTG 
CATACATTATTCCTAGG 
2）PCR反应 
按照表1的反应体系进行PCR反应，反应产物连接在PMD-18载体上（图1中的PMD-18MT）并保存于大肠杆菌DH5α中。 
表1PCR反应体系1 
Figure 2013106316643100002DEST_PATH_IMAGE002
3）重组表达载体的构建 
提取PMD-18MTE质粒，XhoI和BamHI双酶切质粒过夜，琼脂糖凝胶电泳酶切产物，染色后，切割目的条带，凝胶回收试剂盒纯化目的片段。 
pRHZ-41L质粒用XhoI和BamHI双酶切过夜，电泳，切割目的条带后，凝胶回收试剂盒纯化目的片段。 
两种纯化的DNA片段，用连接酶22℃连接过夜，连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。 
（3）工程菌的构建与表达 
提取质粒(图1中pRHZ-41L-MT)，并转化到感受态裂殖酵母中，涂布的MB固体培养基平板5后，挑取一个单菌落，用EMM液体培养基培养2后，1％的接种量转接到新鲜的EMM液体培养基中，振荡培养至平台期。 
（4）表达产物的活性鉴定 
工程菌发酵结束后，离心收集菌体，高压细胞破碎仪破碎菌体，离心留上清液，得到粗提物，按照管碟法实验步骤，结果表明粗提取对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有体外抑菌活性。 
（5）添加剂的制备与使用 
添加剂的制备：保藏的工程菌种，划线于EMM固体培养基培养3-5天后，挑取生长良好的单菌落，接种在液体EMM培养基中，30℃震荡培养3天后，10%的接种量转接至新鲜培养基培养2天后，再接种到发酵罐中发酵3天；发酵结束后，放罐，培养物用纱布或者滤布过滤除去培养基，50-60℃干燥后，得到抗菌肽酵母饲料添加剂干粉。 
添加剂的使用：鸡等禽类按照2-4%的量将酵母干粉添加到饲料中，猪等牲畜按照0.5-1%的量将酵母干粉添加到饲料中；也可以根据禽畜日粮的量计算出相应的添加量，将酵母干粉直接加入到饮用水中。 

Claims (1)

1.一种杂合抗菌肽作为饲料添加剂的应用，其特征在于：该杂合抗菌肽的一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，将该杂合抗菌肽基因重组到pRHZ-41L载体上；将重组载体转化到裂殖酵母中，MAA固体培养基上培养5天，从固体培养基上挑取单菌落接种到液体EMM培养基中培养3天后，再扩大化培养工程菌；工程菌大规模发酵后，过滤除培养基，烘干后加入饲料或饮用水中。
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