CN103214583A - 细菌素lacticin Q的分泌表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细菌素lacticin Q的分泌表达方法。将lacticin Q与SUMO融合基因SUMO-lacticin Q克隆入pWB980，转入枯草芽孢杆菌，使融合蛋白SUMO-lacticin Q分泌表达于培养基中，分离纯化融合蛋白SUMO-lacticin Q，酶切释放lacticin Q并进一步纯化获得lacticin Q。经活性检测证实，获得的重组蛋自具有良好的抗菌活性，其抗菌活性与天然lacticin Q活性相当。本发明不仅简化了lacticin Q的分离纯化过程，而且大大提高了lacticin Q产量。

Description

细菌素lacticin Q的分泌表达方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及细菌素lacticin Q的分泌表达方法。

背景技术

细菌素是由某些细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质，是一种微生物源抗菌肽，产生菌对其细菌素具有自身免疫性，即不引起自杀。细菌素在医药、饲料抗生素替代品、食品生物防腐、植物生物防治方面具有广阔前景。

目前人们发现的细菌素有几百种，但真正应用的寥寥无几，nisin是一种在食品应用中得到批准的细菌素，1953年，nisin最先在英国推向市场，1969年，nisin被联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）确认为安全、高效、可靠的食品防腐剂，随后得到50多个国家认可。细菌素lacticin Q是由分离于玉米的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）QU5产生，由53个氨基酸组成，其氨基酸序列为：MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAID

WVVSKIKQIL GIK，不含N端前导肽或信号序列等外延序列，N端起始蛋氨酸甲酰化。细菌素lacticin Q在pH2～10，100℃处理15min仍保持稳定，121℃高压灭菌15min仍保持25%活性，而nisin在中性和碱性条件下会大量失活。因此，与nisin相比，细菌素lacticin Q有更广泛的pH稳定性，并且lacticin Q对部分指示菌株（如Enterococcusfaecalis JCM5803T,Enterococcus mundtii QU2等）显示出更低的MICs（最低抑菌浓度），同时能更快诱导产生ATP流出物，具有更高效的抑菌特性。由此可见，细菌素lacticin Q比nisin性能更好，lacticin Q的开发和利用不仅能丰富细菌素产品，而且具有更广阔的应用前景，对健康养殖和食品安全等具有重要意义。

细菌素重组表达的主要限制在于其作为一种抗菌肽，具有对宿主细胞的杀伤作用和对宿主酶的敏感性。对于这种困难毒性蛋白，融合表达可以降低毒性，增强目的蛋白稳定性，提高蛋白表达和纯化。通常，在常见的融合标签中，His6几乎没有提高蛋白表达量的作用，MBP（Maltose Binding Protein，麦芽糖结合蛋白）对蛋白表达量只有微小左右，对难以表达的蛋白没有作用，GST（Glutathione-S-Transferase，谷胱甘肽硫转移酶）对目的蛋白表达有一定的作用，但重组蛋白通常存在于包涵体中。TRX（Thioredoxin，硫氧还蛋白）、SUMO（Small Ubiquitin-related Modifier，小分子泛素样修饰蛋白）及NUS A（N utilization substance A，N利用质A）能够显著提高蛋白表达量，但TRX不能提高困难蛋白（难以表达的蛋白）的可溶性，SUMO和NUS A能够显著提高融合蛋白的可溶性，但只有SUMO的切割具有特异性，使目的蛋白具有天然N端，且有更高的效率。

许多研究发现将SUMO与目的蛋白融合能够有效提高目的蛋白表达量，帮助目的蛋白折叠，增加可溶性，简化纯化过程，经SUMO酶切获得天然N端目的蛋白。SUMO（小分子泛素样蛋白）由约100个氨基酸组成，是继泛素后研究比较透彻的一个类泛素蛋白，尽管其氨基酸序列与泛素只有18%的相似性，但结构测定发现两者具有相同的三级结构，即由β折叠包裹α螺旋形成的紧密球状折叠。同时，SUMO与靶标蛋白的结合和泛素相似，是一个高度调控的动态过程。泛素具有分子伴侣特征，与目的蛋白融合表达能够提高其产量和帮助纯化，研究发现SUMO在提高蛋白表达纯化方面与泛素也具有相同的功能。

但是去泛素化酶是一个不稳定的酶，难以分离纯化和重组表达，而且酶和底物通常需要1:1的比例混合才能有效酶切，严重的限制了泛素用于融合表达。而SUMO酶已经被广泛研究，SUMO酶可用于重组表达SUMO融合蛋白切割，而且可被人工表达。同时SUMO酶活性非常强，切割具有特异性，相对于传统的融合蛋白切割酶具有显著优势。基因融合技术通常需要在融合标签与目的蛋白之间设定特定的剪切位点，以便相应的酶识别，但在融合蛋白表达后进行表达标签的切割以释放目的蛋白时，酶切后会导致多余的氨基酸残留，比如凝血酶识别氨基酸序列LVPRGS中的精氨酸，导致目的蛋白N端增加GS两个氨基酸残基。同时可能因为融合蛋白形成的空间结构使切割位点被遮蔽导致无效切割，或者在目的蛋白内部发生切割，导致目的蛋白无法获得天然N端和缺失部分片段。而SUMO酶识别SUMO的三级结构，因此不会发生误切现象，使释放的目的蛋白具有天然的N端，这对于蛋白结构和功能研究非常重要，尤其是对于lacticin Q等抗菌肽及多肽的研究，因为其N末端氨基酸可能对只有几十个氨基酸组成的多肽活性具有直接影响。

因为SUMO具有如此优良的分子伴侣特征，因此许多研究者已经使用SUMO融合技术进行目的蛋白的表达，但之前的研究基本是在大肠杆菌中进行胞内表达，虽然取得了很好的效果，但是胞内表达不利于蛋白纯化，因为目的蛋白纯化时需要首先进行细胞破碎，增加了产品工序和生产成本，同时，胞内的有限空间限制了目的蛋白的积累从而限制了目的蛋白的表达量，胞内的酶也比胞外丰富，容易导致蛋白降解，另外，胞内氧化性更弱的空间也不利于二硫键的形成。

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌研究的模式菌株，有一千多年的应用历史，是现代工业酶制剂生产中常用的重要菌种，该菌能够结合和摄取DNA，使其被用做宿主菌，表达外源蛋白，并展现良好的应用前景。其单层膜结构和高效分泌通道也有利于外源蛋白的高效表达，研究者在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌进行人干扰素α1(hIFNα1)和杂交hIFNα1/2基因表达，结果大部分IFNα产生于大肠杆菌壁膜间隙，而大约99%IFNα分泌到重组枯草芽孢杆菌胞外培养基中。迄今，大量的原核和真核基因已经在枯草芽孢杆菌中成功的表达，有的已应用于工业生产。

枯草芽孢杆菌作为表达宿主有以下优点：(a)枯草芽孢杆菌是非致病菌和美国食品和药品管理局认定的公认安全（GRAS，generallyregarded as safe）菌种，使用时对人畜无毒，不污染环境，有良好的安全记录；(b)枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁机构与大肠杆菌有所不同，它只有一层细胞壁，当分泌蛋白跨过细胞膜之后，直接释放到培养基中。此外，枯草芽孢杆菌不产生革兰氏阴性细菌细胞壁组分所含的热源性脂多糖（内毒素）等类似的杂质，简化了下游目的蛋白的纯化步骤，降低了蛋白纯化成本；(c)不具有密码子偏好性，方便直接表达不同来源的目的蛋白；（d）枯草芽孢杆菌是除大肠杆菌外，遗传学和生理学背景研究最为详尽的原核生物，关于枯草芽孢杆菌转录、翻译、蛋白折叠、分泌机制、遗传操作和大规模发酵等研究都较多，相关信息较丰富，有利于遗传改造构建重组菌和大规模的生产发酵；(e)枯草芽孢杆菌可以在简单的培养基上快速实现高密度生长，有利于产物的高效表达和经济生产；(f)枯草芽孢杆菌具有高效蛋白分泌能力，拥有一套包含信号肽和分子伴侣在内的高效分泌系统，可分泌天然构象和生物活性的真核蛋白。

lacticin Q作为一种细菌素，其大量制备是其应用的主要瓶颈。目前人们主要通过野生菌种筛选培养获得细菌素，但野生菌细菌素分离纯化困难，不利于规模化生产和应用。细菌素是通过核糖体途径合成的蛋白质类物质，许多研究者进行了细菌素基因工程技术研究，取得了许多重要成果，但仍须进一步提高产量和简化分离纯化过程。因此，获得细菌素的高效表达纯化方法从而快捷有效的制备细菌素具有重要的现实和经济意义。

发明内容

为了解决现有的技术问题，本发明的目的是提供一种细菌素lacticin Q的分泌表达方法。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种融合蛋白SUMO-lacticin Q，其氨基酸序列如SEQ No:2所示。

本发明还提供了一种编码融合蛋白SUMO-lacticin Q的融合基因，其特征在于，所述融合基因是通过人工合成lacticin Q基因序列，TA克隆入质粒pET SUMO所得。

具体地，融合基因的核苷酸序列如SEQ No:1所示。

本发明还提供了含有上述融合基因的表达载体。

优选地，所述表达载体为pWB980/SUMO-lacticin Q。

本发明还提供了含有上述表达载体的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600/pWB980/SUMO-lacticin Q。

应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏好，合成相应的核苷酸序列，并将其克隆到适当的表达载体中，并转化相应的宿主细胞。

本发明还提供了一种融合蛋白SUMO-lacticin Q的重组表达方法，步骤如下：

（1）以引物对扩增SUMO-lacticin Q融合基因；

（2）将步骤（1）扩增得到的融合基因连接到表达载体中；

（3）将步骤（2）得到的表达载体转化宿主细胞，培养表达。

本发明还提供了一种lacticin Q的生产方法，步骤如下：

（1）培养转化后的宿主细胞，分泌表达融合蛋白SUMO-lacticinQ：将转化后枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，将筛选的阳性重组菌WB600/pWB980/SUMO-lacticin Q单菌落接种到LB培养基中，37℃振荡培养8～16h。然后按1～5%比例转接到新鲜LB培养基中，37℃振荡培养18～30h使融合蛋白SUMO-lacticin Q分泌表达于培养基中，经分析，融合蛋白SUMO-lacticin Q占上清总蛋白21%以上；

（2）分离纯化融合蛋白SUMO-lacticin Q：离心收集培养物上清，0.22um滤器过滤后进行Ni-NTA琼脂糖亲和层析，再经洗涤、洗脱，即得融合蛋白SUMO-lacticin Q；

（3）利用SUMO蛋白酶切除融合蛋白SUMO-lacticin Q的SUMO部分：将SUMO蛋白酶加入分离纯化后的融合蛋白SUMO-lacticin Q，在适当的条件下进行酶切反应，反应终止后，进行Tricine-SDS-PAGE检测。

（4）纯化lacticin Q重组蛋白：酶切后的混合液再次进行Ni-NTA琼脂糖亲和层析，经洗涤、洗脱、脱盐、冻干，即得纯化后的lacticinQ重组蛋白，再经Tricine-SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析，证实蛋白纯度。

本发明最后还提供了按照上述生产方法得到的重组蛋白lacticinQ。

本发明以分子伴侣SUMO作为融合标签，使融合蛋白SUMO-lacticin Q在枯草芽孢杆菌胞外表达，并利用SUMO蛋白酶获得lacticin Q，具有以下有益效果：

将lacticin Q与SUMO融合，屏蔽了lacticin Q毒性，使其顺利表达，从而提高了表达量。枯草芽孢杆菌单层膜结构和高效分泌通道也有利于外源蛋白的高效表达，最终融合蛋白占上清蛋白21%以上，lacticinQ产量可达153mg/L以上。

将目的蛋白分泌到胞外，直接收集上清即可进行目的蛋白的分离纯化，从而简化了分离纯化程序。若进行胞内表达，细胞破碎过程不仅使分离纯化繁琐，而且极大的限制了蛋白的大量制备。同时，融合蛋白SUMO-lacticin Q含有His标签，使用亲和层析柱一步即可获得高纯度SUMO-lacticin Q，酶切后SUMO标签部分、SUMO蛋白酶都含有His标签，经过第二轮亲和层析即获得高纯度重组细菌素lacticin Q。

SUMO蛋白酶识别SUMO三级结构，能够高效、特异性的切除SUMO，释放具有天然N端氨基酸的目的蛋白。N端氨基酸对于某些蛋白尤其是较小分子量的多肽类的结构和活性极其重要，传统基因融合技术需要在融合标签与目的蛋白之间设定特定的剪切位点，以便相应的酶如Thrombin、Factor Xa或TEV蛋白酶识别，但在融合蛋白表达后进行表达标签的切割以释放目的蛋白时，酶切后会导致多余的氨基酸残留，如凝血酶识别LVPRGS中的精氨酸，导致目的蛋白N端增加GS两个氨基酸残基。同时可能因为融合蛋白形成的空间结构使切割位点被遮蔽导致无效切割，或者在目的蛋白内部发生切割，导致目的蛋白无法获得天然N端或缺失部分片段。而SUMO蛋白酶不仅切割效率高，而且具有特异性，有利于天然N端重组蛋白制备。

本发明综合应用SUMO融合技术和枯草芽孢杆菌的高效表达特性，在枯草芽孢杆菌中分泌表达细菌素lacticin Q，不仅简化了蛋白的分离纯化过程，而且大大提高了目的蛋白产量。使其能够大量制备，从而应用于生产。

附图说明

图1为SUMO-lacticin Q融合蛋白分离纯化图，其中：M为Marker；1是空质粒对照；2、3为重组枯草芽孢杆菌表达上清；4为纯化的SUMO-lacticin Q融合蛋白；

图2为SUMO-lacticin Q融合蛋白的酶切及分离纯化图，其中：M为Marker；1为SUMO-lacticin Q融合蛋白；2为SUMO-lacticin Q融合蛋白酶切；3为重组蛋白lacticin Q；

图3为重组蛋白lacticin Q的质谱分析图；

图4为重组蛋白lacticin Q抑菌活性检测图，其中：1为重组蛋白lacticin Q；2为PBS。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1SUMO-lacticin Q融合基因的构建

根据lacticin Q氨基酸序列合成其基因序列（如序列表SEQ IDNO.1中345-504所示），装入T载体，转化大肠杆菌DH5α。利用软件Premier5.0设计引物P1（如序列表SEQ ID NO.3所示）、P2（如序列表SEQ ID NO.4所示）扩增lacticin Q基因。

PCR反应体系：

反应程序:95℃变性5min;95℃变性30Sec;55℃退火30Sec;72℃延伸1min,25个循环，最后72℃延伸8min。2%琼脂糖凝胶电泳切割目的条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收。

由于通过Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物两端含有突出的A碱基，而载体pET SUMO已线性化且含有突出的T碱基，故直接将纯化的PCR产物与pET SUMO载体连接，即“TA克隆”，连接产物转化E.coliMach1^TM-T1^R，涂布20μg/mL卡那霉素LB平板，过夜培养后挑取单菌落划线接种，再次挑取单菌落进行PCR和测序验证。

实施例2表达质粒构建

1)PCR扩增SUMO-lacticin Q融合基因

根据SUMO-lacticin Q融合基因序列及pWB980克隆位点设计引物P3（如序列表SEQ ID NO.5所示）、P4（如序列表SEQ ID NO.6所示）从质粒pET SUMO-lacticin Q扩增含有His标签的SUMO-lacticin Q融合蛋白基因编码序列（如序列表SEQ ID NO.1所示），其中引物P3引入HindIII位点，引物P4引入XbaI位点，以便将融合基因克隆入pWB980质粒。

PCR反应体系：

反应程序:95℃变性5min;95℃变性30Sec;49.5℃退火30Sec;72℃延伸1min,20个循环，最后72℃延伸8min。2%琼脂糖凝胶电泳切割目的条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收。

2)构建pWB980/SUMO-lacticin Q表达质粒

用HindIII和XbaI对回收的DNA片段和pWB980同时进行双酶切，酶切混合液琼脂糖凝胶电泳，切割SUMO-lacticin Q和pWB980条带用DNA琼脂糖凝胶提取试剂盒回收，洗脱液洗脱目的片段，将SUMO-lacticin Q和pWB980用solution I进行连接，连接产物电击转化WB600(1.8kV,4.7ms)，涂布20μg/mL卡那霉素LB平板，过夜培养后挑取单菌落划线接种，再次挑取单菌落进行PCR和测序验证。

实施例3重组lacticin Q的获得

1)分泌表达

将筛选的阳性重组菌WB600/pWB980/SUMO-lacticin Q单菌落，接种到LB培养基中，37℃、150rpm振荡培养12h。然后按4%比例转接到新鲜LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养36h分泌表达SUMO-lacticin Q于培养基中，Tricine-SDS-PAGE分析表达效果（图1），SUMO-lacticin Q占上清总蛋白21%以上。

Tricine-SDS-PAGE分析

浓缩胶与分离胶的配置按下表进行

待胶凝固后在样品中加入四分之一体积5xloading buffer，煮沸5min，冷却后上样电泳。

浓缩胶电压60V，分离胶电压120V。

电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250,25%异丙醇，8%醋酸）进行染色，以测定样品中各分离蛋白的分子量；

2)SUMO-lacticin Q纯化

离心上述枯草芽孢杆菌发酵液，收集上清，用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行融合蛋白的纯化。用pH7.4的PBS缓冲液平衡4个床体积，流速为2mL/min，将10mL上清液0.22um滤器过滤，上样，流速为1mL/min，用pH7.4的PBS缓冲液再洗3个床体积，流速为2mL/min，用分别含10,50,100mM咪唑的pH7.4PBS缓冲液洗脱杂蛋白，流速为2mL/min，再以含300mM咪唑的pH7.4PBS缓冲液洗脱融合蛋白，Tricine-SDS-PAGE检测纯化效果（图1）。

3)酶切SUMO-lacticin Q融合蛋白

用SUMO蛋白酶酶切SUMO-lacticin Q融合蛋白释放lacticinQ，每5μg融合蛋白加入1U的SUMO蛋白酶，反应体系中加入十分之一体积的10×SUMO酶切缓冲液(500mM Tris-HCl,pH8.0,2%Igepal(NP-40),1.5M NaCl,10mM DTT)，30℃反应2h后进行Tricine-SDS-PAGE检测（图2）。

4)纯化重组lacticin Q

酶切样品再次上样Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱，收集穿透液，透析去除咪唑，冻干样品，进行Tricine-SDS-PAGE检测纯度（图2）。

实施例4重组lacticin Q特性分析

1)重组细菌素MALDI-TOF/TOF质谱分子量检测

取0.5μL重组细菌素lacticin Q纯化样品，与基质按1:3混合点于靶上，自然晾干后，利用AB4700MALDI-TOF/TOF质谱仪扫描重组细菌素分子量。质谱条件：离子源加速电压为20kV，N₂激光器，激光波长337nm，激光频率200Hz，离子延迟提取时间（Pulse ionextraction，PIE）330ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用peptideⅡ standard kit（Bruker）离子峰校正（m/z1000-m/z7000）。检测结果通过Data Explorer V4.5软件进行分析（图3）。

2)抑菌活性分析方法

在灭菌平板中倒入20mL NA（营养琼脂）固体培养基（成分为：蛋白胨10克、牛肉膏5克、氯化钠5克、琼脂15克、蒸馏水1000mL，pH7.0）制成营养琼脂平板。然后，将过夜培养的指示菌金黄色葡萄球菌ATCC12600（中国普通微生物菌种保藏管理中心，China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC）菌液用无菌生理盐水稀释至10⁶cfu/ml左右，取200μL涂布于制备好的营养琼脂平板中。将牛津杯轻轻放置于平板上，加入100μL重组细菌素Lacticin Q，并以同体积PBS为阴性对照，37℃培养12h观察抑菌圈（图4）。

3)重组细菌素最小抑菌浓度（MIC）的检测

微量稀释法测定重组细菌素对Staphylococcus aureus ATCC12600、Enterococcus hirae ATCC10541、Listeria innocua ATCC33090最小抑菌浓度。具体操作步骤：将处于对数生长期的指示菌接种到96孔细胞培养板上，每孔接种10⁵个细胞（90μL）。将经纯化的重组细菌素配制成系列浓度梯度溶液，各取10μL分别加入培养孔中，混匀，每组重复3个孔，设只加培养基的孔为阴性对照。37℃培养箱孵育12h后取出，用酶标仪测定600nm处OD值，以在小孔内OD值无变化的最低重组细菌素浓度为MIC。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种融合蛋白SUMO-lacticin Q，其特征在于，融合蛋白SUMO-lacticin Q的氨基酸序列如SEQ No:2所示。

2.一种编码融合蛋白SUMO-lacticin Q的融合基因，其特征在于，所述融合基因是通过人工合成lacticin Q基因序列，TA克隆入质粒pETSUMO所得。

3.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于，融合基因的核苷酸序列如SEQ No:1所示。

4.含有权利要求2或3所述融合基因的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pWB980/SUMO-lacticin Q。

6.含有权利要求4或5所述表达载体的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600/pWB980/SUMO-lacticin Q。

8.一种融合蛋白SUMO-lacticin Q的重组表达方法，其特征在于，所述重组表达方法的步骤如下：

（1）以引物对扩增SUMO-lacticin Q融合基因；

（2）将步骤（1）扩增得到的融合基因连接到表达载体中；

（3）将步骤（2）得到的表达载体转化宿主细胞，培养表达。

9.一种lacticin Q的生产方法，其特征在于，所述生产方法的步骤如下：

（1）培养转化后的宿主细胞，分泌表达融合蛋白SUMO-lacticinQ；

（2）分离纯化融合蛋白SUMO-lacticin Q；

（3）利用SUMO蛋白酶切除融合蛋白SUMO-lacticin Q的SUMO部分；

（4）纯化lacticin Q重组蛋白。

10.按照权利要求9所述方法得到的重组蛋白lacticin Q。

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