CN105219779B - 红螯螯虾抗脂多糖因子及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

红螯螯虾抗脂多糖因子及其制备方法与应用，涉及红螯螯虾。所述红螯螯虾抗脂多糖因子命名为Cq‑ALF。所述红螯螯虾抗脂多糖因子Cq‑ALF的制备方法包括以下步骤：1)构建Cq‑ALF重组表达载体；2)将步骤1)所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即Cq‑ALF。所述红螯螯虾抗脂多糖因子Cq‑ALF对多种病原菌和对虾白斑综合征病毒具有明显的抑杀活性，因此红螯螯虾抗脂多糖因子Cq‑ALF可在制备抗微生物药物和饲料添加剂中应用。

Description

红螯螯虾抗脂多糖因子及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及红螯螯虾，尤其是涉及红螯螯虾抗脂多糖因子及其制备方法与应用。

背景技术

红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)又名澳洲淡水龙虾，来源于澳大利亚，是世界最名贵的淡水经济虾种之一。红螯螯虾由于食性很广，生长快，肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，自1992年引进我国后，颇受消费者欢迎。但在养殖过程中该虾也经常受病害影响，提高其抗病力是目前研究的重点。

与脊椎动物相比，作为无脊椎动物一员的甲壳动物只能通过先天免疫系统抵御外界病原微生物的侵染^[1]，而先天免疫系统由细胞免疫和体液免疫组成。在体液免疫中，一些具有免疫功能的效应分子参与免疫反应，如抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)、凝集素和补体系统蛋白等^[2]，其中抗菌肽是体液免疫的重要的效应分子。抗菌肽是一种具有广谱抗菌活性的小分子多肽，广泛存在于生物体内^[3]，目前从甲壳动物中鉴别的抗菌肽主要包括：虾青素(Penaeidin)^[4,5,6]，甲壳肽(Crustin)^[7,8,9]，溶菌酶(Lysozyme)和抗脂多糖因子(ALF)^[10,11,12]等。抗脂多糖因子是水生甲壳动物重要的免疫因子，对抗脂多糖因子的研究有助于深入探索无脊椎动物免疫防御机制，并且将抗脂多糖因子作为饲料添加剂在水产养殖业具有广阔的应用前景。

体外重组表达抗脂多糖因子不仅在研究红螯螯虾免疫防御机制方面具有重要意义，而且为研发抗病原微生物药物提供参考依据。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的在于提供红螯螯虾抗脂多糖因子的基因序列。

本发明的第二目的在于提供红螯螯虾抗脂多糖因子的氨基酸序列。

本发明的第三目的在于提供红螯螯虾抗脂多糖因子的制备方法。

本发明的第四目的在于提供红螯螯虾抗脂多糖因子的应用。

所述红螯螯虾抗脂多糖因子命名为Cq-ALF。

所述红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF的基因序列为：

所述红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF的氨基酸序列为：

所述红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF的制备方法包括以下步骤：

1)构建Cq-ALF重组表达载体；

2)将步骤1)所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即Cq-ALF。

在步骤1)中，所述表达载体可选用pPICZaA等。

在步骤2)中，所述宿主细胞可选用毕赤酵母等。

在步骤3)中，所述表达产物可先进行透析，再进行亲和层析。

所述红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF对多种病原菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)具有明显的抑杀活性，因此红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF可在制备抗微生物药物和作为水产养殖业中防治病害的饲料添加剂中应用。

本发明在分离得到Cq-ALF的基础上，根据Cq-ALF基因序列特征成功构建重组表达载体并在毕赤酵母系统中表达并纯化获得重组Cq-ALF蛋白，该重组蛋白具有广谱抗菌活性和较强的抗WSSV活性。研究结果表明，Cq-ALF是一种重要的先天免疫因子，可能广泛参与了红螯螯虾抗微生物感染反应，因此，重组基因工程产品Cq-ALF在抗微生物感染的新药开发中具有非常诱人的应用前景。

附图说明

图1为pPICZaA-Cq-ALF真核表达载体构建图。

图2为SDS-PAGE分析pPICZaA-Cq-ALF重组毕赤酵母克隆子甲醇诱导表达的电泳图谱。M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1为诱导表达的菌液上清，可见约13KD的诱导表达蛋白条带。

图3为SDS-PAGE分析pPICZaA-Cq-ALF重组毕赤酵母甲醇诱导表达产物纯化的电泳图谱。M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1为表达的Cq-ALF重组蛋白，有两个条带，一条约为13KD的明显的蛋白条带，另一条约为11KD的较弱的蛋白条带。

图4为Cq-ALF的质谱鉴定图。经质谱鉴定，约13KD和11KD的蛋白条带均为Cq-ALF。

图5为WSSV与重组蛋白Cq-ALF共孵30min透射电镜观察图。a是不经处理的WSSV，b是牛血清白蛋白BSA与WSSV共孵后的WSSV，c、d分别是20μM和40μM的Cq-ALF重组蛋白与WSSV共孵后的WSSV。电镜结果显示，Cq-ALF重组蛋白可以显著破坏病毒囊膜。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF真核重组表达载体的构建

根据pPICZaA载体多克隆位点，设计扩增编码红螯螯虾Cq-ALF(cDNA)基因ORF的特异性上游引物F1和下游引物R1。在上游引物F1的5′端添加EcoR I酶切位点；在下游引物R1的5′端添加XbaI酶切位点、终止密码子和编码His-tag的碱基。

上游引物F1：5′-CCGGAATTC CAGATTACAGAGGCTCTGG-3′，下游引物R1：5′-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGGTGAGTTTTCAAAAAATCTGTTGC-3′。

扩增Cq-ALF的编码区片段。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸7min。

利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物，回收的PCR产物经EcoR I和XbaI酶切后纯化回收，与EcoR I和XbaI双酶切线性化pPICZaA载体连接，构建好毕赤酵母表达重组载体pPICZaA-Cq-ALF，测序鉴定读码框准确无误。

pPICZaA-Cq-ALF载体构建图参见图1。

实施例2pPICZaA-Cq-ALF重组质粒在毕赤酵母GS115中的诱导表达

测序正确质粒pPICZaA-Cq-ALF经BamHⅠ酶切线性化，以电击法转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，并用甲醇诱导表达。

结果显示，与诱导前相比，pPICZaA-Cq-ALF重组质粒转化的毕赤酵母GS115诱导后具有明显的重组蛋白的诱导表达，蛋白条带13kDa左右(参见图2)。

实施例3pPICZaA-Cq-ALF重组质粒在毕赤酵母GS115中甲醇诱导后的表达产物纯化

利用亲和层析法纯化Cq-ALF重组蛋白，大量诱导表达阳性重组毕赤酵母GS115菌株后，通过离心(4℃，12000rpm离心30min)去除菌体收集培养基上清1L，于透析液(50mM磷酸盐缓冲液，50mM NaCl)透析三次(每次透析12h)，得到上柱样品。随后采用金属鏊合层析柱对透析后的蛋白进行亲和层析。收集溶液D洗脱峰组分，经SDS-PAGE电泳分析(参见图3)，显示两个条带，一条约13KDa，另一条约11KDa，经质谱鉴定，两条蛋白条带均为红螯螯虾ALF蛋白(参见图4)，1可能是真核表达过程中的糖基化等蛋白修饰作用导致约13KDa蛋白条带的产生。

实施例4Cq-ALF重组蛋白抗菌活性鉴定

Cq-ALF重组蛋白抗菌活性的测定：蛋白样品经0.22μm滤膜过滤除菌后，以BSA为标准品应用Bradford法绘制蛋白浓度标准曲线，根据公式可计算出Cq-ALF重组蛋白的浓度。将Cq-ALF蛋白倍比稀释为1.375μM、2.75μM、5.5μM、11μM、22μM、44μM。在96孔微量培养板上进行MIC(Minimum Inhibitory Concentration，最低抑菌浓度)的测定。首先取菌悬液，在MH或2216E平板上划线，于28℃培养箱中培养24h，再挑取单克隆接种于MH或2216E斜面，继续培养过夜达到中期对数生长阶段；用DPBS(1.58mM NaH₂PO₄，8.42mM Na₂HPO₄，pH 7.2～7.4)清洗斜面培养物，调整菌浓度至6×10⁵CFU/ml备用，每种被测菌按照以下操作设置空白对照组、阳性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，每种菌重复3次。

ⅰ阳性对照组：加入50μl DPBS和50μl菌悬液；

ⅱ空白对照组：加入50μl待测蛋白样品和50μl DPBS；

ⅲ样品实验组：加入50μl待测各浓度蛋白样品和50μl菌悬液；

细菌于28℃培养24～48h后观察MIC结果，判定标准为该浓度细菌数少于或等于阳性对照中的一半。

利用测定以上各孔培养物的MIC，分别吸取培养物6μl，移种在MH或2216E培养基上，经孵育过夜，判定Cq-ALF重组蛋白对细菌的MBC(Minimum BactericidalConcentration，最低杀菌浓度)，即杀死某种细菌的最低药物浓度。

结果显示，Cq-ALF重组蛋白对受试菌：E.coli检鉴株、荧光假单胞菌、弗氏志贺氏菌、E.coli Mc 1061、藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌，谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌(均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)均具有抑杀活性(参见表1)。

表1

实施例5Cq-ALF重组蛋白抗病毒活性鉴定

Cq-ALF重组蛋白抗WSSV活性鉴定：将目的蛋白稀释至20μM和40μM，与WSSV混匀；孵育30min后，在透射电镜下观察WSSV。空白对照组为无蛋白共孵的WSSV，阴性对照组为20μM牛血清白蛋白BSA与WSSV共孵后的WSSV，实验组为20μM和40μM Cq-ALF与WSSV共孵后的WSSV。结果显示，相比于空白对照组和阴性对照组，实验组中WSSV囊膜脱落严重，在目前研究中WSSV囊膜是WSSV侵染细胞的关键，因此说明Cq-ALF具有一定的抗WSSV活性。

本发明旨在获得红螯螯虾抗病原微生物的Cq-ALF基因工程表达产品，并对其抗菌、抗病毒活性进行鉴定，以期开发抗病原微生物的新药物。本发明获得了红螯螯虾Cq-ALF基因工程表达重组质粒pPICZaA-Cq-ALF，并在毕赤酵母成功重组表达获重组蛋白Cq-ALF基因工程产品，确认了Cq-ALF的广谱抗菌活性和抗WSSV活性，为其作为抗病原微生物新药物的开发或应用于饲料添加剂奠定了良好的前期基础。

本发明根据红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF基因序列特征，构建真核表达载体、转化毕赤酵母诱导表达并纯化获得Cq-ALF重组蛋白，从而鉴定重组蛋白抗微生物活性。研究发现Cq-ALF重组蛋白具有抗病原微生物活性：对多种病原菌均具有明显抑杀作用，并且具有抗对虾白斑综合征病毒WSSV活性。

Claims (8)

1.红螯螯虾抗脂多糖因子，其特征在于命名为Cq-ALF，红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF的基因序列为：

2.如权利要求1所述红螯螯虾抗脂多糖因子，其特征在于红螯螯虾抗脂多糖因子Cq-ALF的氨基酸序列为：

3.如权利要求1所述红螯螯虾抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建红螯螯虾抗脂多糖因子重组表达载体；

2)将步骤1)所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即红螯螯虾抗脂多糖因子。

4.如权利要求3所述红螯螯虾抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表达载体选用pPICZaA。

5.如权利要求3所述红螯螯虾抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述宿主细胞选用毕赤酵母。

6.如权利要求3所述红螯螯虾抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述表达产物先进行透析，再进行亲和层析。

7.如权利要求1所述红螯螯虾抗脂多糖因子在制备抗微生物药物中应用。

8.如权利要求1所述红螯螯虾抗脂多糖因子在制备饲料添加剂中应用。