CN110305890A - 一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用 - Google Patents

一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110305890A
CN110305890A CN201910589799.5A CN201910589799A CN110305890A CN 110305890 A CN110305890 A CN 110305890A CN 201910589799 A CN201910589799 A CN 201910589799A CN 110305890 A CN110305890 A CN 110305890A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibacterial peptide
antibacterial
formic acid
kinds
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910589799.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王莲哲
洪军
谢朝晖
柳静
胡建业
刘俊红
时宁
任亚彬
左晓洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University of Urban Construction
Original Assignee
Henan University of Urban Construction
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University of Urban Construction filed Critical Henan University of Urban Construction
Priority to CN201910589799.5A priority Critical patent/CN110305890A/zh
Publication of CN110305890A publication Critical patent/CN110305890A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用，通过将5种不同的广谱抗菌肽串联，中间插入甲酸切割位点，构建到酵母分泌性表达载体pPIC9k中，并经酶切线性化后转化毕赤酵母感受态细胞获得。重组工程菌插入氨基酸序列特点，所有氨基酸用毕赤酵母偏好性密码子进行替换，以保证在毕赤酵母中的最优表达。插入序列为5种不同的广谱抗菌肽串联表达，中间插入甲酸切割位点。本发明根据毕赤酵母的密码子偏爱性对5种新型抗菌肽进行优化并串连，然后构建真核重组表达载体，达到5种不同抗菌肽在毕赤酵母中的串联表达，提高发酵产物的表达量及活性。

Description

一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptidesAMPS)是一类具有抗微生物活性的小分子多肽，一般由12-50个氨基酸组成，分子量在2000-7000左右，多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，是机体天然免疫系统的重要组成部分。抗菌肽具有广谱抗菌活性，可杀灭革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞等，可以快速查杀靶标。并且大部分抗菌肽是纯天然的，毒副作用小，因此其迅速成为潜在的治疗药物，在医疗，健康食品等领域有广泛的应用。
目前，抗菌肽的生产方式主要有提取法、化学合成和基因工程法。与提取法、化学合成法相比，基于基因工程技术的微生物发酵法因能耗低，污染少，成本低而更具有优越性，因而被广泛研究。由于抗菌肽对细菌有杀伤作用，用原核表达系统直接表达抗菌肽存在很多问题，因此，国内外的研究者多采用真核表达系统进行抗菌肽基因工程研究。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统具有生长速度快、表达量高、能对外源蛋白进行正确加工及修饰、可实现高密度发酵等优点，因此被广泛用于医药领域和学术研究。目前，已有包括抗菌肽在内的500多种外源蛋白在毕赤酵母中成功表达。尽管抗菌肽的真核表达已有研究报道，但是大多是表达单一的抗菌肽，且高效表达是该研究的瓶颈问题，本发明通过构建高效酵母表达工程菌，实现5种新型抗菌肽的高效串联表达，并通过切割为单体抗菌肽，实现新型抗菌肽的高效表达及应用。
发明内容
本发明的目的在于提出了一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用。根据毕赤酵母的密码子偏爱性对5种新型抗菌肽进行优化并串连，然后构建真核重组表达载体，实现5种不同抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达，并通过筛选及发酵条件优化提高发酵产物的表达量及活性。
其技术方案如下：
一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法，包括以下步骤：
步骤1.串联表达抗菌肽基因序列设计
通过文献查阅法筛选到5个广谱高效低毒的抗菌肽，抗菌肽数据库编号分别为AP02901，AP02785，AP02847，AP02786，AP02898。根据抗菌肽的氨基酸序列，利用毕赤酵母偏爱性密码优化其核苷酸序列，不同抗菌肽之间以甲酸切割位点相连，5个抗菌肽进行序列串联，最后首尾两端分别加入酶切位点，串联表达设计顺序为EcoR I+ATG+kex2+抗菌肽AP02901+甲酸切割位点+抗菌肽AP02785+甲酸切割位点+抗菌肽AP02847+甲酸切割位点+抗菌肽AP02786+甲酸切割位点+抗菌肽AP02898+甲酸切割位点+终止子+Not I，具体序列如SEQ：ID：NO:1所示；
翻译的蛋白序列如SEQ：ID：NO:2所示，委托武汉金开瑞生物科技公司进行基因合成；
5个抗菌肽单体氨基酸序列分别为：
AP02901如SEQ：ID：NO:3所示；
AP02785如SEQ：ID：NO:4所示；
AP02847如SEQ：ID：NO:5所示；
AP02786如SEQ：ID：NO:6所示；
AP02898如SEQ：ID：NO:7所示；
步骤2.载体构建
利用限制性酶切将串联表达框通过酶切位点EcoR I和Not I与毕赤酵母表达载体pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，氨苄抗性筛选，结合菌落PCR鉴定及测序鉴定重组表达载体。
步骤3.酵母转化
线性化重组质粒电击法转化进毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布MD平板筛选，30℃培养2-3天。
步骤4.转化子筛选鉴定
将MD平板上的转化子转接到G418平板上筛选多拷贝子，筛选浓度3mg/ml。挑取筛选后的多拷贝子，通过提取转化子的基因组进行PCR反应，筛选阳性菌。得到表达串联重组抗菌肽的酵母工程菌；
步骤5.串联重组抗菌肽的诱导表达及高效表达工程菌的筛选
挑选将经过G418筛选及PCR鉴定的重组菌20个，分别用1-20号进行编号。于25mLBMGY液体培养基中，30℃、220r/min培养18h；将培养液置于预先灭菌的离心管中，6000rpm离心10min，收集沉淀，后转接到100ml BMMY液体培养基中，每24h加一次甲醇，甲醇终浓度为1％，分别在24、48、72、96、120h取样，12000r/min离心2min，取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测表达蛋白，并通过灰度分析，检测纯化后的串联重组抗菌肽含量，筛选出高效表达工程菌菌株。
本发明的目的也在于提供上述基因工程菌在制备新型抗菌肽的中的应用。
为此，本发明的目的还在于提供一种制备抗菌肽的方法，采用上述基因工程菌生产抗菌肽，步骤如下：
步骤1.切割单体
发酵上清液用甲酸进行化学切割，以获得5种抗菌肽单体。切割甲酸浓度为50％，切割温度37℃，切割时间36h。切割后的样品直接冷冻干燥，随后加无菌水溶解后再次冻干，重复3次，尽可能去除样品中的甲酸。最后一次样品用PBS溶解，溶解后的抗菌肽单体采用Tricine-SDS-PAGE检测，并分析抗菌肽单体含量。
步骤2.平板抑菌实验
平板抑菌实验检测抗菌肽的抑菌效果。在LB培养基上分别涂布200ul培养过夜的大肠杆菌ATCC25922(E.coli ATCC25922)菌液及金黄色葡萄球菌ATCC25923(S.aureuATCC25923)菌液制得革兰式阴性、阳性菌抑菌平板。用打孔法添加切割前和切割后的抗菌肽100μL(定量至1mmol/L)，37℃恒温培养12h，分析抑菌活性及最小抑菌浓度。
步骤3.发酵条件优化
将筛选到的高效表达菌株活化后接种至BMGY培养基中，30℃、220r/min培养18h进行菌体富集；随后转接于BMMY培养基中进行诱导重组抗菌肽的表达。分别对诱导过程中发酵液起始OD值，培养温度，转速，甲醇添加浓度，诱导时间等条件进行优化，得到最优的培养温度28℃、pH5.5，摇床转速为180-220rpm，诱导起始浓度OD值0.5，甲醇添加量1.5％，诱导时间的第72-96h，重组抗菌肽产物的积累量最高，抑菌活性最强。蛋白表达量可达81mg/L，是优化前的1.93倍。
本发明所述新型5种抗菌肽在提高其发酵表达量过程中的应用。
本发明的有益效果为：
1.构建的酵母工程菌，实现了5种新型抗菌肽的串联分泌表达，通过化学切割，抑菌活性显著提高。切割前由于5种抗菌肽的串联表达空间结构的相互影响，抑制了其抑菌活性，因此对酵母菌没有毒害作用。工程菌生长繁殖迅速、不具致病性、不会产生毒素、安全可靠、能成功表达出重组5种新型抗菌肽，经过切割后有很强的抑菌活性。
2.该工程菌制备方法具有简单快速高效，产物分泌表达到培养基中，方便下游的分离纯化。经过发酵条件优化，抗菌肽表达量比未经优化增加了1.93倍。具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1是重组表达载体阳性转化子菌落PCR鉴定；
图2是分泌表达抗菌肽对金黄色葡萄球菌平板抑菌实验；
图3是分泌表达抗菌肽对大肠杆菌平板抑菌实验。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
酵母菌株GS115和分泌表达载体pPIC9K均购买自Invitrogen公司。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手段。
实施例1：串联表达抗菌肽基因序列设计
通过文献查阅法筛选到5个广谱高效低毒的抗菌肽，抗菌肽数据库编号分别为AP02901，AP02785，AP02847，AP02786，AP02898。根据抗菌肽的氨基酸序列，利用毕赤酵母偏爱性密码优化其核苷酸序列，不同抗菌肽之间以甲酸切割位点相连，5个抗菌肽进行序列串联，最后首尾两端分别加入酶切位点。串联表达设计顺序为EcoR I+ATG+kex2+抗菌肽AP02901+甲酸切割位点+抗菌肽AP02785+甲酸切割位点+抗菌肽AP02847+甲酸切割位点+抗菌肽AP02786+甲酸切割位点+抗菌肽AP02898+甲酸切割位点+终止子+Not I。核苷酸序列委托武汉金开瑞生物科技公司合成。
实施例2：5种抗菌肽串联表达酵母工程菌构建
利用限制性酶切将串联表达框通过酶切位点EcoR I和Not I与毕赤酵母表达载体pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在氨苄抗性的LB平板上筛选，结合菌落PCR鉴定及测序鉴定重组表达载体。
从测序成功的大肠杆菌中提取重组质粒，用SalI进行酶切线性化，并电转毕赤酵母(GS115)感受态中。酵母感受态制备及电击转化法参考Invitrogen操作手册。转化后菌液涂布MD平板筛选，30℃培养2-3天。
将MD平板上的转化子转接到G418平板上筛选多拷贝子。挑取浓度为3mg/ml G418平板上筛选的多拷贝转化子，用酵母DNA提取试剂盒提取筛选后的酵母菌株基因组DNA，进行PCR反应，鉴定外源基因整合情况。得到表达串联重组抗菌肽的酵母工程菌。
挑选将经过G418筛选及PCR鉴定的重组菌20个，分别于25mLBMGY液体培养基中，30℃、220r/min培养18h；将培养液置于预先灭菌的离心管中，6000rpm离心10min，收集沉淀，后转接到100ml BMMY液体培养基中，每24h加一次甲醇，甲醇终浓度为1％，分别在24、48、72、96、120h取样，12000r/min离心2min，取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并用Tricine-SDSPAGE凝胶电泳检测表达蛋白，并通过灰度分析，检测纯化后的串联重组抗菌肽含量，筛选出高效表达工程菌菌株。如图1所示。
实施例3.串联重组抗菌肽工程菌发酵条件优化及表达产物分析
将上述实施例2中获得的高效表达串联重组抗菌肽的酵母工程菌于25mL BMGY液体培养基中，30℃、220r/min培养18h；将培养液置于预先灭菌的离心管中，6000rpm离心10min，收集沉淀，后转接到100ml BMMY液体培养基中，每24h加一次甲醇，分别在24、48、72、96、120h取样，12000r/min离心2min，取上清液，发酵上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并用Tricine-SDSPAGE凝胶电泳检测表达蛋白，并通过灰度分析，检测纯化后的串联重组抗菌肽含量。
发酵上清液用甲酸进行化学切割，以获得5种抗菌肽单体。切割甲酸浓度为50％，切割温度37℃，切割时间36h。切割后的样品直接冷冻干燥，随后加无菌水溶解后再次冻干，重复3次，尽可能去除样品中的甲酸。最后一次样品用PBS溶解，溶解后的抗菌肽单体采用Tricine-SDS-PAGE检测，并分析抗菌肽单体含量。
如图2、图3所示，平板抑菌实验检测抗菌肽的抑菌效果。在LB培养基上分别涂布200ul培养过夜的大肠杆菌ATCC25922(E.coli ATCC25922)菌液及金黄色葡萄球菌ATCC25923(S.aureu ATCC25923)制得革兰式阴性、阳性菌抑菌平板。用打孔法添加切割前和切割后的抗菌肽100μL(定量至1mmol/L)，37℃恒温培养12h，分析抑菌活性及最小抑菌浓度。
步骤8.发酵条件优化
将筛选到的高效表达菌株活化后接种至BMGY培养基中，30℃、220r/min培养18h进行菌体富集；随后转接于BMMY培养基中进行诱导重组抗菌肽的表达。分别对诱导过程中发酵液起始OD值，培养温度，转速，甲醇添加浓度，诱导时间等条件进行优化，得到最优的培养温度28℃、pH5.5，摇床转速为180-220rpm，诱导起始浓度OD值0.5，甲醇添加量1.5％，诱导时间的第72-96h，重组抗菌肽产物的积累量最高，抑菌活性最强。重组抗菌肽表达量可达81mg/L，是优化前的1.93倍。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 河南城建学院
<120> 一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 452
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcatga agagagcttc tgaaaacggt aagtgtaact tgttgtgttt ggttaagaag 60
aagttgagag ctgtcggtaa tgttattaag actgttgttg gtaagattgc tgatccattt 120
ttttggcatc atattggtca tgctttggat gctgctaaga gagttcatgg tatgttgtct 180
ggtgatccat ttttctttca cattattaag ggtttgtttc atgctggtag aatgattcat 240
ggtttggttg atccattttt tggtcatttg tttagaggta tcattaacgt tggtaagcat 300
attcatggtt tgttgtctgg tgatccaaga agaggtttgt tcaagaagtt gagaagaaag 360
attaagaaag gttttaagaa gattttcaag agattgccac cagttggcgt tggtgtgtct 420
attccattgg ctggtagaag atgagcggcc gc 452
<210> 2
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Arg Ala Ser Glu Asn Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Leu Val Lys
1 5 10 15
Lys Lys Leu Arg Ala Val Gly Asn Val Ile Lys Thr Val Val Gly Lys
20 25 30
Ile Ala Asp Pro Phe Phe Trp His His Ile Gly His Ala Leu Asp Ala
35 40 45
Ala Lys Arg Val His Gly Met Leu Ser Gly Asp Pro Phe Phe Phe His
50 55 60
Ile Ile Lys Gly Leu Phe His Ala Gly Arg Met Ile His Gly Leu Val
65 70 75 80
Asp Pro Phe Phe Gly His Leu Phe Arg Gly Ile Ile Asn Val Gly Lys
85 90 95
His Ile His Gly Leu Leu Ser Gly Asp Pro Arg Arg Gly Leu Phe Lys
100 105 110
Lys Leu Arg Arg Lys Ile Lys Lys Gly Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg
115 120 125
Leu Pro Pro Val Gly Val Gly Val Ser Ile Pro Leu Ala Gly Arg Arg
130 135 140
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ser Glu Asn Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Leu Val Lys Lys Lys
1 5 10 15
Leu Arg Ala Val Gly Asn Val Ile Lys Thr Val Val Gly Lys Ile Ala
20 25 30
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Phe Phe Trp His His Ile Gly His Ala Leu Asp Ala Ala Lys Arg Val
1 5 10 15
His Gly Met Leu Ser Gly
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Phe Phe His Ile Ile Lys Gly Leu Phe His Ala Gly Arg Met Ile
1 5 10 15
His Gly Leu Val
20
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Phe Gly His Leu Phe Arg Gly Ile Ile Asn Val Gly Lys His Ile
1 5 10 15
His Gly Leu Leu Ser Gly
20
<210> 7
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Leu Arg Arg Lys Ile Lys Lys Gly Phe
1 5 10 15
Lys Lys Ile Phe Lys Arg Leu Pro Pro Val Gly Val Gly Val Ser Ile
20 25 30
Pro Leu Ala Gly Arg Arg
35

Claims (4)

1.一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.串联表达抗菌肽基因序列设计
通过文献查阅法筛选到5个广谱高效低毒的抗菌肽，抗菌肽数据库编号分别为AP02901，AP02785，AP02847，AP02786，AP02898；根据抗菌肽的氨基酸序列，利用毕赤酵母偏爱性密码优化其核苷酸序列，不同抗菌肽之间以甲酸切割位点分割，5个抗菌肽进行序列串联，最后首尾两端分别加入酶切位点，串联表达设计顺序为EcoR I+ATG+kex2+抗菌肽AP02901+甲酸切割位点+抗菌肽AP02785+甲酸切割位点+抗菌肽AP02847+甲酸切割位点+抗菌肽AP02786+甲酸切割位点+抗菌肽AP02898+甲酸切割位点+终止子+Not I，具体序列如SEQ：ID：NO:1所示；
翻译的蛋白序列如SEQ：ID：NO:2所示，委托武汉金开瑞生物科技公司进行基因合成；
5个抗菌肽单体氨基酸序列分别为：
AP02901如SEQ：ID：NO:3所示；
AP02785如SEQ：ID：NO:4所示；
AP02847如SEQ：ID：NO:5所示；
AP02786如SEQ：ID：NO:6所示；
AP02898如SEQ：ID：NO:7所示；
步骤2.载体构建
利用限制性酶切将串联表达框通过酶切位点EcoR I和Not I与毕赤酵母表达载体pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，氨苄抗性筛选，结合菌落PCR及测序鉴定重组表达载体；
步骤3.酵母转化
线性化重组质粒电击法转化进毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布MD平板筛选，30℃培养2-3天；
步骤4.转化子筛选鉴定
将MD平板上的转化子转接到G418平板上筛选多拷贝子，筛选浓度3mg/ml；挑取筛选后的多拷贝子，通过提取转化子的基因组进行PCR反应，筛选阳性菌；得到表达串联重组抗菌肽的基因工程菌；
步骤5.串联重组抗菌肽的诱导表达及高效表达工程菌的筛选
挑选将经过G418筛选及PCR鉴定的重组菌20个，分别用1-20号进行编号；于25mL BMGY液体培养基中，30℃、220r/min培养18h；将培养液置于预先灭菌的离心管中，6000rpm离心10min，收集沉淀，后转接到100ml BMMY液体培养基中，每24h加一次甲醇，甲醇终浓度为1％，分别在24、48、72、96、120h取样，12000r/min离心2min，取上清液，发酵上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并用Tricine-SDSPAGE凝胶电泳检测表达蛋白，并通过灰度分析，检测纯化后的串联重组抗菌肽含量，筛选出高效表达工程菌菌株。
2.一种权利要求1所述基因工程菌在制备新型抗菌肽的中的应用。
3.一种制备抗菌肽的方法，其特征在于，采用权利要求1所述基因工程菌生产抗菌肽，步骤如下：
步骤1.切割单体
发酵上清液用甲酸进行化学切割，以获得5种抗菌肽单体；切割甲酸浓度为50％，切割温度37℃，切割时间36h；切割后的样品直接冷冻干燥，随后加无菌水溶解后再次冻干，重复3次，去除样品中的甲酸；最后一次样品用PBS溶解，溶解后的抗菌肽单体采用Tricine-SDS-PAGE检测，并分析抗菌肽单体含量；
步骤2.平板抑菌实验
平板抑菌实验检测抗菌肽的抑菌效果；在LB培养基上分别涂布200ul培养过夜的大肠杆菌ATCC25922菌液及金黄色葡萄球菌ATCC25923制得革兰式阴性、阳性菌抑菌平板；用打孔法添加切割前和切割后的抗菌肽100μL，定量至1mmol/,，37℃恒温培养12h，分析抑菌活性及最小抑菌浓度；
步骤3.发酵条件优化
将筛选到的高效表达菌株活化后接种至BMGY培养基中，30℃、220r/min培养18h进行菌体富集；随后转接于BMMY培养基中进行诱导重组抗菌肽的表达；分别对诱导过程中发酵液起始OD值，培养温度，转速，甲醇添加浓度，诱导时间的条件进行优化，得到最优的培养温度28℃、pH5.5，摇床转速为180-220rpm，诱导起始浓度OD值0.5，甲醇添加量1.5％，诱导时间的第72-96h，重组抗菌肽产物的积累量最高，抑菌活性最强；蛋白表达量达81mg/L，是优化前的1.93倍。
4.权利要求1所述新型5种抗菌肽在提高其发酵表达量过程中的应用。
CN201910589799.5A 2019-07-02 2019-07-02 一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用 Pending CN110305890A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910589799.5A CN110305890A (zh) 2019-07-02 2019-07-02 一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910589799.5A CN110305890A (zh) 2019-07-02 2019-07-02 一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110305890A true CN110305890A (zh) 2019-10-08

Family

ID=68078572

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910589799.5A Pending CN110305890A (zh) 2019-07-02 2019-07-02 一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110305890A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111374169A (zh) * 2019-12-18 2020-07-07 苏州大学 一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用
CN111500608A (zh) * 2020-04-14 2020-08-07 江西省科学院生物资源研究所 一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1662657A (zh) * 2002-04-22 2005-08-31 陶氏环球技术公司 低成本生产肽
CN101450964A (zh) * 2008-09-25 2009-06-10 山东华辰生物科技有限公司 一种基因工程抗菌肽及其制备方法与应用
CN102863539A (zh) * 2012-10-11 2013-01-09 东北农业大学 融合串联抗菌肽及其制备方法
CN105566483A (zh) * 2014-10-15 2016-05-11 深圳大学 马拉巴石斑鱼Piscidin的改造体抗菌肽及其应用
CN106749595A (zh) * 2017-02-24 2017-05-31 昆明医科大学 树蛙防御肽cathelicidin‑PP及其基因和应用
CN107151674A (zh) * 2017-06-08 2017-09-12 中国农业科学院饲料研究所 新型抗菌肽dlp4的制备方法
CN107252475A (zh) * 2017-05-26 2017-10-17 苏州大学 天然宿主防御肽Alligatorin4的应用
CN107267547A (zh) * 2017-06-26 2017-10-20 北京生泰云科技有限公司 新型抗菌肽dlp2的制备方法
CN107750275A (zh) * 2015-05-08 2018-03-02 诺维信公司 α‑淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸
CN108367042A (zh) * 2015-06-05 2018-08-03 加州大学洛杉矶分校医疗中心洛杉矶生物医学研究所 抗微生物融合肽

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1662657A (zh) * 2002-04-22 2005-08-31 陶氏环球技术公司 低成本生产肽
CN101450964A (zh) * 2008-09-25 2009-06-10 山东华辰生物科技有限公司 一种基因工程抗菌肽及其制备方法与应用
CN102863539A (zh) * 2012-10-11 2013-01-09 东北农业大学 融合串联抗菌肽及其制备方法
CN105566483A (zh) * 2014-10-15 2016-05-11 深圳大学 马拉巴石斑鱼Piscidin的改造体抗菌肽及其应用
CN106459163A (zh) * 2014-10-15 2017-02-22 深圳大学 马拉巴石斑鱼Piscidin的改造体抗菌肽及其应用
CN107750275A (zh) * 2015-05-08 2018-03-02 诺维信公司 α‑淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸
CN108367042A (zh) * 2015-06-05 2018-08-03 加州大学洛杉矶分校医疗中心洛杉矶生物医学研究所 抗微生物融合肽
CN106749595A (zh) * 2017-02-24 2017-05-31 昆明医科大学 树蛙防御肽cathelicidin‑PP及其基因和应用
CN107252475A (zh) * 2017-05-26 2017-10-17 苏州大学 天然宿主防御肽Alligatorin4的应用
CN107151674A (zh) * 2017-06-08 2017-09-12 中国农业科学院饲料研究所 新型抗菌肽dlp4的制备方法
CN107267547A (zh) * 2017-06-26 2017-10-20 北京生泰云科技有限公司 新型抗菌肽dlp2的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEUNG CHUL SHIN等: "《Characterization of Two Antimicrobial Peptides from Antarctic Fishes(Notothenia coriiceps and Parachaenichthys charcoti)》", 《PLOS ONE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111374169A (zh) * 2019-12-18 2020-07-07 苏州大学 一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用
CN111374169B (zh) * 2019-12-18 2022-08-30 苏州大学 一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用
CN111500608A (zh) * 2020-04-14 2020-08-07 江西省科学院生物资源研究所 一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用
CN111500608B (zh) * 2020-04-14 2022-01-11 江西省科学院生物资源研究所 一种引入信号肽的抗菌肽串联基因及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111363029A (zh) 重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
CN113831395B (zh) 一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用
CN104402975B (zh) 抗衰老短肽及其制备方法
CN110305890A (zh) 一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用
CN111004317A (zh) 一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用
CN108558992B (zh) 调控金针菇子实体发育的转录因子pdd1及其编码基因与应用
CN114181321A (zh) 花鲈fgf6a、fgf6b以及fgf18重组蛋白及其制备方法和应用
CN108314718B (zh) 一种家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体、其编码基因及其表达和应用
CN112028981B (zh) 重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法
CN109997970B (zh) 一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN102180961A (zh) 黑青斑河鲀干扰素IFNγ2及其制备方法和应用
CN109134662A (zh) 一种可视化抗菌肽融合蛋白及其制备方法和其应用
CN110256570A (zh) 一种重组融合抗菌肽及应用
CN109021088B (zh) 一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法
CN107602686B (zh) 一种对革兰氏阳性菌具有抗性的多肽
CN114316012B (zh) 一种锦鲤用抗菌感染的免疫蛋白和应用
CN110759983A (zh) 一种靶向沉默害虫模式识别蛋白gnbp3基因表达的重组真菌及在害虫防治中的应用
CN110452290A (zh) 来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因在蔬菜生防上的应用
CN102051363A (zh) 文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用
CN108048475B (zh) 缢蛏i型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法
CN103319590B (zh) 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）的应用
CN108251440B (zh) 缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用
CN101565462B (zh) 大黄鱼bpi-bn蛋白质、引物及其在制备抗生素药物中的应用
CN109402144A (zh) 一种潜在防除空心莲子草的除草蛋白Na2-g2057及其应用
CN108441501A (zh) 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900及其蛋白和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191008

RJ01 Rejection of invention patent application after publication