CN102051363A - 文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学中文蛤铁蛋白基因克隆及体外重组表达技术。本发明利用表达序列标签(EST)技术、3’和5’末端快速扩增技术(RACE)从文蛤幼虫中克隆到铁蛋白基因cDNA全长798bp，包括513bp的开放阅读框，编码171个氨基酸，5’非编码区长119bp，3’非编码区长154bp，有一个加尾信号，该基因在文蛤幼虫发育中贝壳形成方面发挥着重要作用。本发明利用体外原核重组表达技术获得了重组的文蛤铁蛋白，该蛋白具有氧化活性，可以参与调控文蛤等贝类幼虫贝壳的形成和生长，可应用于贝类苗种生产中发育调节和免疫增强。

Description

文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用

技术领域

本发明涉及文蛤铁蛋白基因克隆及体外重组表达技术，具体地说是从幼虫cDNA文库中筛选获得铁蛋白基因的EST序列，设计引物，采用RACE技术克隆出文蛤铁蛋白基因的cDNA全序列，并对该序列进行了原核重组表达，还涉及到该基因及其表达产物在文蛤苗种繁育中幼虫生长发育调控和免疫调节中的应用。

背景技术

铁蛋白是典型的细胞内蛋白(Tacchini et al.，1992)，铁离子通过铁吸收机制通过细胞膜进入细胞后就储存在铁蛋白中，当机体需要铁离子时再被释放出来。铁蛋白是由24个结构上等同的亚基组成的中空的球状大分子，中空部分最多可容纳4500个铁原子。铁蛋白亚基分为2种类型，即H型亚基和L型亚基。H亚基和L亚基在结构上是等同的，但是在铁的储存与吸收方面这两种亚基是功能互补的，H亚基上有一个铁氧化酶位点，L亚基缺乏这一位点，但是有一个在内表面的附加的谷氨酰胺位点，这就可以产生一个有利于三价铁离子在H亚基的氧化酶位点反转和矿化的微环境。铁蛋白在生物体内有两种主要作用，其一为储存铁离子，为生物体提供必须的铁离子；另外则是解毒作用，清除二价铁带给机体的毒性作用。归结起来，它涉及两种生理功能：(1)与机体的生长发育有关，Roskams等(1994)发现铁和铁蛋白在大鼠出生后随脑部发育表达上调，推测与脑部发育有很重要的作用，Zhang等(2003)报道铁蛋白与牡蛎壳的形成有关。(2)与动物的免疫相关，Beck等(2002)认为海胆铁蛋白是一种应激蛋白，在棘皮动物的免疫过程中起着重要作用，在对虾类的研究中发现铁蛋白基因在病原感染前后都有明显的上调表达。

文蛤是我国重要的经济贝类，肉味鲜美、营养价值高，在国内外市场都受到广泛欢迎，因而文蛤养殖具有广阔的发展前景。随着我国人民生活水平的提高，贝类等海产品的消费需求日益增长。过去文蛤养殖所用苗种主要依赖自然采捕野生苗种，每年苗量的丰欠严重影响着养殖产业的发展。目前全国文蛤养殖面积约50万亩，年需苗种100亿粒，由于养殖业户对苗种的需求很大，对自然苗种的高强度采捕对文蛤资源造成了很大破坏。文蛤苗种的稳定高效生产，是制约文蛤养殖产业的瓶颈。在苗种繁育过程中，通过人工调控幼虫的发育和生长，对于提高育苗的成功率具有重要的价值。铁蛋白对文蛤等幼虫的发育调节和免疫增强作用，为应用于苗种生产提供了可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用，从文蛤中克隆到铁蛋白的cDNA序列，并对其实现原核表达及重组产物的活性鉴定，为进一步研究文蛤幼虫发育机制提供基础，并为文蛤苗种繁育生产中幼虫发育调控和免疫调节提供技术手段。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种文蛤铁蛋白基因，具有序列表SEQ ID NO.1中碱基序列。其是从文蛤中克隆到铁蛋白的cDNA序列，该序列全长798bp，包括513bp的开放阅读框，编码171个氨基酸，5’非编码区长119bp，3’非编码区长154bp，有一个加尾信号，该基因在文蛤幼虫发育中贝壳形成方面发挥着重要作用。利用pGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达了该蛋白，表达产物具有将Fe²⁺氧化为Fe³⁺的蛋白活性。

其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，分子量为19.9kDa，等电点为5.29。重组铁蛋白具有脊椎动物H型铁蛋白的典型结构，不同亚基通过非共价键结和在一起，包含有一个氧化Fe²⁺的氧化中心，7个氨基酸残基分别是Glu25、Tyr30、Glu59、Glu60、His63、Glu105和Gln139。该蛋白可以参与铁离子的氧化和储运，调控文蛤等贝类幼虫贝壳的形成和生长，可应用于贝类苗种繁育的人工调控。

本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从文蛤中克隆到铁蛋白基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码铁蛋白成熟肽的基因片断并将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了原核体外重组表达。重组产物经GSTrap affinity columns纯化，并进一步将GST切去后对Fe²⁺有氧化作用。本发明可为进一步研究文蛤幼虫发育机制提供理论基础，并为文蛤苗种繁育生产中幼虫发育调控和免疫调节提供技术手段。

附图说明

图1：BCA蛋白检测试剂盒检测文蛤重组铁蛋白浓度，图中1：蛋白标准分子量；2：BSA(0.5mg/ml)；3：重组铁蛋白。

图2：重组铁蛋白MmeFer-GST凝血酶切GST图谱，图中1.蛋白标准分子量  2.铁蛋白  3.GST。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

实施例1.

一种克隆得到的文蛤铁蛋白基因，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明中的文蛤铁蛋白基因的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；

b)文蛤cDNA文库构建；

c)文蛤cDNA文库EST序列的测定；

d)文蛤EST序列的同源性分析及铁蛋白基因片段的筛选；

e)RACE技术获得铁蛋白基因的全序列。

具体操作如下：

a)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化：利用Invitrogen公司的Trizol 试剂从文蛤幼虫中提取总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。

b)文蛤cDNA文库构建：利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和

Synthesis Kit(Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit对大于100bp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector载体连接，利用Stratagene公司的

III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从

XR Vector上体外切割pBluescript成为质粒文库。

c)文蛤cDNA文库EST序列的规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体参见《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。

d)文蛤EST序列的同源性分析及铁蛋白基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTx分析，显示其中的EST序列与珍珠贝铁蛋白相似性达78％，与长牡蛎中两种铁蛋白亚基GF1和GF2分别是78％和77％，根据该相似性分析结果确定了文蛤铁蛋白的EST序列。

e)文蛤铁蛋白基因cDNA全长序列的克隆：根据与铁蛋白基因同源的EST序列设计一对特异性引物，F1：5’-GCAAACATCGCACAAAA-3’和R1：5’-CCATCATCTGGGCATC-3’。利用引物F1和接头引物AP(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’)进行3’末端的扩增；引物R1和T3(5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’)进行5’末端的扩增。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海生工)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌Top10，挑选阳性克隆提取质粒并进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定，测得的序列经CLUSTER分析和拼接后得到全长序列，见SEQ ID NO.1。

3’RACE扩增

25μl反应体系：

扩增所用PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，50℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。

5’RACE扩增

25μl反应体系：

扩增所用PCR反应程序：94℃变性5min，1个循环；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸50s，34个循环；72℃延伸10min，1个循环。

实施例2.

根据SEQ ID NO.1的cDNA序列，设计特异性引物。利用引物F2：GCC GGATCCATGGCAGATTCAAGACC和R2：CGCGTCGAC TTAGGATTGCAGTTCTCTGTC，通过PCR技术扩增编码铁蛋白成熟肽的基因片段，反应在MJ Research PTC-100型中进行，反应条件为：首先94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸40s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。按照《分子克隆第三版》的方法将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经测序确认表达框与SEQ ID NO.1的序列一致。接种阳性克隆到LB.培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀0.6-0.8，加入1mM的IPTG诱导3h，离心保存菌体沉淀。菌体以1mg/mL鸡蛋清溶菌酶处理30min后超声破碎：500W，超声30min，每次1s，间隔2s。离心收集上清和沉淀，从包涵体中纯化目的蛋白参照Kuhelj等(Kuhelj et al.1995)方法进行，主要步骤包括离心收集细胞，细胞沉淀加入PBS悬浮细胞，并加入Triton X-100至终浓度为1％。超声波破碎细胞，收集沉淀。用Bufer A(50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1％Triton X-100，pH 8.0)洗涤沉淀2次，再用Bufer B(50mmol/L Tris-HCI，5mmol/L EDTA，2mol/L urea，pH 8.0)洗涤2次，将洗涤后的沉淀溶于5mL Bufer C(0.1mol/L Tris-HCl，10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，8mol/L urea，pH 8.0)中，37℃快摇40min，用BuferC将样品稀释到500μg/mL，在10倍体积透析液(0.1mol/L Tris-HCI，5mmol/L EDTA，5mmol/L Cysteine，pH 8.0)中透析使蛋白复性，中间换2次透析液。上述复性后的样品经过离心，用GSTrap affinity columns纯化，获得纯化的GST-MmeFer融合蛋白(图1)。经质谱鉴定，三段序列(-RVGAGHGEWHYDRE-，-RVVLQNIQKPDRD-，-KTVNQSLLDLHKI-)与文蛤铁蛋白氨基酸序列一致，因此该重组蛋白为重组文蛤铁蛋白(GST-MmeFer)，用凝血酶直接在柱子上酶切掉GST(4℃裂解过夜)，获得文蛤重组铁蛋白(图2)，用于活性验证。

透析复性后的重组产物体外活性验证：根据Kim的方法(Kim et al.，2002)，将铁蛋白在含1％巯基乙酸的0.1M乙酸钠的溶液(PH5.5)中孵育18h，除去铁蛋白中的铁离子。过量的2，2-联吡啶添加到该溶液中将铁离子螯合掉，并将该溶液在0.1M Hepes(pH 7.0)溶液中透析，然后将20μg/mL铁蛋白和对照蛋白(BSA)在含有1mM硫酸亚铁铵的0.1M Hepes中室温孵育10min，于310nm检测，铁蛋白(20μg/ml)活性达到0.476，见表1。

表1  重组铁蛋白吸收铁离子的活性在310nm下的吸收值，BSA为对照

名称	BSA(20μg/ml)	铁蛋白(20μg/ml)
			310nmOD值	0.028	0.476

本发明利用体外原核重组表达技术获得了重组的文蛤铁蛋白，该蛋白具有氧化活性，可以参与调控文蛤等贝类幼虫贝壳的形成和生长，可应用于贝类苗种生产中发育调节和免疫增强。

实施例3

重组铁蛋白可为文蛤苗种生产中的生长发育调节和免疫增强提供产品和技术。育苗生产中选取成熟的文蛤亲贝，放入28℃的海水中诱导排放。精子和卵子在水体中自然授精后，约20小时发育至D型幼虫。文蛤幼虫密度为5个/ml水体，海水温度为27℃，盐度为25。培育期间每日换水100％，投喂金藻2-5万细胞/ml水体。文蛤培育至第4天后，壳长约180μm。此时在水体中添加实施例2中重组表达产物铁蛋白，能有效提高文蛤幼虫的生长速度和变态率。

文蛤铁蛋白

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院海洋研究所

<120>文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>789

<212>DNA

<213>文蛤(Meretrix Meretrix)

<220>

<221>CDS

<222>(120)..(635)

<400>1

acgctgatca tttgtcttgc tgcgtcagtg aacgtacggg caaacatcgc acaaaaaaac    60

ttgtttaaat acatttttga aaaatttaac atcttacggt caaagcctag gataaagag    119

atg gca gat tca aga cct cgc cag aat ttc cac aag gaa agt gaa gct     167

Met Ala Asp Ser Arg Pro Arg Gln Asn Phe His Lys Glu Ser Glu Ala

1               5                   10                  15

ggg att aac aga cag atc aac atg gag ctg tat gcc agc tat tgc tac     215

Gly Ile Asn Arg Gln Ile Asn Met Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Cys Tyr

            20                  25                  30

atg tca atg gcc tat tac ttc gac cgt gac gat gtt gct ctg aag gga     263

Met Ser Met Ala Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Gly

        35                  40                  45

ttc agc aag ttc ttc aag gag tca tct gag gag gaa cga gag cat gct     311

Phe Ser Lys Phe Phe Lys Glu Ser Ser Glu Glu Glu Arg Glu His Ala

    50                  55                  60

gag aaa ctg atg aaa tat cag aac aag agg ggc ggt cgt gtc gtc ttg     359

Glu Lys Leu Met Lys Tyr Gln Asn Lys Arg Gly Gly Arg Val Val Leu

65                  70                  75                  80

cag aac atc cag aaa cca gat cgt gac gag tgg gga agc gga ctc gag     407

Gln Asn Ile Gln Lys Pro Asp Arg Asp Glu Trp Gly Ser Gly Leu Glu

                85                  90                  95

gca atg gaa act gca ctt cag ttg gag aaa acc gtc aac cag tcc ctt     455

Ala Met Glu Thr Ala Leu Gln Leu Glu Lys Thr Val Asn Gln Ser Leu

            100                 105                 110

ctg gac ctg cac aag att gct gat acc cat ggg gat gcc cag atg atg     503

Leu Asp Leu His Lys Ile Ala Asp Thr His Gly Asp Ala Gln Met Met

        115                 120                 125

gac ttc ctg gag ggt gag tac ctg aag gaa cag gtg gat gct gtc aag     551

Asp Phe Leu Glu Gly Glu Tyr Leu Lys Glu Gln Val Asp Ala Val Lys

    130                 135                 140

gac ctg agc gat cgc atc acc aac ctg aaa cgt gtt ggt gcc ggt cac     599

Asp Leu Ser Asp Arg Ile Thr Asn Leu Lys Arg Val Gly Ala Gly His

145                 150                 155                 160

gga gaa tgg cac tat gac aga gaa ctg caa tcc taa acatgaattc          645

Gly Glu Trp His Tyr Asp Arg Glu Leu Gln Ser

                165                 170

aaaaacaatc tgtcctaatg ttttatctct tttaaaaaga cttttatttt ggtgttaaag   705

agacaggttt ctttttaaaa tctgaagaaa aaatgtttta accaacaaga aataaaggct   765

aaatgaccaa aaaaaaaaaa aaaa                                    789

<210>2

<211>171

<212>PRT

<213>文蛤(Meretrix Meretrix)

<400>2

Met Ala Asp Ser Arg Pro Arg Gln Asn Phe His Lys Glu Ser Glu Ala

1               5                   10                  15

Gly Ile Asn Arg Gln Ile Asn Met Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Cys Tyr

            20                  25                  30

Met Ser Met Ala Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Gly

        35                  40                  45

Phe Ser Lys Phe Phe Lys Glu Ser Ser Glu Glu Glu Arg Glu His Ala

    50                  55                  60

Glu Lys Leu Met Lys Tyr Gln Asn Lys Arg Gly Gly Arg Val Val Leu

65                  70                  75                  80

Gln Asn Ile Gln Lys Pro Asp Arg Asp Glu Trp Gly Ser Gly Leu Glu

                85                  90                  95

Ala Met Glu Thr Ala Leu Gln Leu Glu Lys Thr Val Asn Gln Ser Leu

            100                 105                 110

Leu Asp Leu His Lys Ile Ala Asp Thr His Gly Asp Ala Gln Met Met

        115                 120                 125

Asp Phe Leu Glu Gly Glu Tyr Leu Lys Glu Gln Val Asp Ala Val Lys

    130                 135                 140

Asp Leu Ser Asp Arg Ile Thr Asn Leu Lys Arg Val Gly Ala Gly His

145                 150                 155                 160

Gly Glu Trp His Tyr Asp Arg Glu Leu Gln Ser

                165                 170

Claims (3)

1.文蛤铁蛋白基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列。

2.一种权利要求1所述文蛤铁蛋白基因编码蛋白，其特征在于：具有序列表SEQ ID No：2中氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述文蛤铁蛋白基因体外重组表达产物的应用，其特征在于：文蛤铁蛋白基因的重组表达产物可将Fe²⁺氧化为Fe³⁺，具有铁蛋白活性，可进一步应用于贝类幼虫苗种繁育过程的发育和免疫调控。

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